i

T.C.

SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

İLAÇ NUMUNELERİNDE AMİLORİD HİDROKLORİD VE

HİDROKLOROTİYAZİD KEMOMETRİK YÖNTEMLERLE

TAYİNLERİ

İkbal Demet ÜNLÜ

Danışman: Doç. Dr. Ahmet Hakan AKTAŞ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

KİMYA ANABİLİM DALI

ISPARTA-2012

ii

i

İÇİNDEKİLER

Sayfa

İÇİNDEKİLER .......................................................................................................... i

ÖZET........................................................................................................................ iii

ABSTRACT ............................................................................................................. iv

TEŞEKKÜR .............................................................................................................. v

ŞEKİLLER DİZİNİ .................................................................................................. vi

ÇİZELGELER DİZİNİ ........................................................................................... vii

SİMGELER DİZİNİ............................................................................................... viii

1. GİRİŞ .................................................................................................................... 1

1.1. Hidroklorotiyazidin Genel Özellikleri ............................................................... 3

1.2. Amilorid Hidrokloridin Genel Özellikleri ......................................................... 4

1.3. Kullanılan Yöntem ............................................................................................. 5

1.3.1. Spektrofotometri ............................................................................................. 5

1.3.2. UV ve Görünür Bölge Spektroskopisi ............................................................ 9

1.3.3. UV ve Görünür Bölge Absorpsiyon spektrofotometreleri .............................. 9

1.3.4. UV ve Görünür Bölge Moleküler Absorpsiyon spektroskopisinin

uygulamaları ................................................................................................ 10

1.4. Kemometrik Yöntemler ................................................................................... 11

1.4.1. Çok Değişkenli Kalibrasyon Algoritmaları .................................................. 14

1.4.1.1. Temel Bileşen Analizi Yöntemi (Principal Component Analysis (PCA)

Method) ....................................................................................................... 14

1.4.1.2. Temel Bileşen Regresyon Yöntemi (Principal Component Regression

(PCR) Method) ............................................................................................ 15

1.4.1.3. Kısmi En Küçük Kareler Yöntemi (Partial Least Squares Regression

Method) ....................................................................................................... 17

1.4.2. Kalibrasyon (Derişim) setinin tasarımı ......................................................... 19

1.4.3. Çapraz validasyon işlemi (Cross-validation procedure) ............................... 19

1.4.4. Varyans Analizi (ANOVA)........................................................................... 20

1.4.5. Kemometrik Kalibrasyon Yöntemlerinin Uygulamaları ............................... 21

1.4.5.1. Kemometrik Yöntemlerin Uygulama Alanları........................................... 21

1.4.5.2. Çoklu bileşen analizi (Multicomponent analysis) ..................................... 21

2. KAYNAK ÖZETLERİ ....................................................................................... 23

3. MATERYAL VE METOT ................................................................................. 28

ii

3.1. Materyal ........................................................................................................... 28

3.2. Kullanılan Cihazlar .......................................................................................... 28

3.3 Kullanılan Kimyasal Maddeler ......................................................................... 28

3.3.1 Kullanılan Çözeltiler ...................................................................................... 29

3.4. Yöntem ............................................................................................................. 30

3.4.1. UV/VIS Spektroskopisi Yöntemi .................................................................. 30

4. ARAŞTIRMA BULGULARI ............................................................................. 31

4.1. UV Spektroskopisi ........................................................................................... 31

4.1.1. Saf halde HCT ve AMH‟ın spektrumları ...................................................... 32

4.2. Kalibrasyon setinin hazırlanması ..................................................................... 33

4.3. Spektral Koşulların Optimizasyonu ................................................................. 34

4.3.1. Temel Bileşen Analizi (PCA) ....................................................................... 35

4.3.2. Temel Bileşen Regresyonu Yöntemi (PCR) ................................................ 37

4.3.2.1. Kalibrasyon Yönteminin Validasyonu ....................................................... 41

4.3.2.2. PCR yöntemi için ANOVA testi ................................................................ 42

4.3.2.3. PCR yönteminde istatistiksel analiz ........................................................... 42

4.3.2.4. PCR Yönteminin Farmasotik Preparatlara Uygulanması .......................... 43

4.3.3. Kısmi en küçük kareler yöntemi (PLS) ......................................................... 44

4.3.3.1. Kalibrasyon Yönteminin Validasyonu ....................................................... 45

4.3.3.2. PLS yöntemi için ANOVA testi ................................................................. 46

4.3.3.3. PLS yönteminde istatistiksel analiz ........................................................... 46

4.3.3.4. PLS Yönteminin Farmasotik Preparatlara Uygulanması ........................... 47

5. TARTIŞMA VE SONUÇ ................................................................................... 49

KAYNAKLAR ....................................................................................................... 51

ÖZGEÇMİŞ ............................................................................................................ 53

iii

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

İLAÇ NUMUNELERİNDE AMİLORİD HİDROKLORİD VE

HİDROKLOROTİYAZİD KEMOMETRİK YÖNTEMLERLE TAYİNLERİ

İkbal Demet ÜNLÜ

Süleyman Demirel Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü

Kimya Anabilim Dalı

Danışman: Doç. Dr. Ahmet Hakan AKTAŞ

Bu tez çalışmasında, kemometrik kalibrasyon yöntemleri (temel bileşen analizi

yöntemi (PCA), temel bileşen regresyonu yöntemi (PCR), kısmi en küçük kareler

yöntemi (PLS)), iki farklı farmasötik preparattaki amilorid hidroklorid (AMH) ve

hidroklorotiyazid (HCT)‟nin aynı anda miktar tayinlerine hiç bir ayırma işlemi

kullanmaksızın başarıyla uygulanmıştır ve burada UV/Görünür Bölge Spektroskopisi

yöntemlerinde elde edilen veriler kemometrik olarak değerlendirilmiştir.

Bu kemometrik yöntemlerin validasyonunda, AMH için 0,5-3,5 μg/mL

konsantrasyon aralığında ve HCT için 5-35 μg/mL konsantrasyon aralığında

bileşikleri içeren 28 adet karışımdan oluşan kalibrasyon (konsantrasyon) seti

(MeOH-H2O 1:1,(v/v)) içerisinde hazırlanmıştır. Kalibrasyon setinin 200-400 nm

aralığında absorpsiyon spektrumu kaydedilmiştir. Kalibrasyon seti ve bu sete karşılık

255-385 nm aralığında elde edilen absorpsiyon verileri arasındaki ilişkiden

yararlanılarak üç kemometrik kalibrasyon oluşturulmuştur. PCA, PCR, PLS

yöntemlerinin validasyonu, AMH ve HCT içeren sentetik karışımların analiziyle

gerçekleştirilmiştir. PCR ve PLS yöntemlerinin AMH ve HCT karışımlarının

analizine uygulanmasında, PCR ve PLS için % geri kazanım sonuçları ile karşılık

gelen bağıl standart sapma değerleri sırasıyla AMH için % 99,61 / % 0,56 ve

%100,82 / %2,20; HCT için %100,08 / % 1,72 ve %100,58 / % 6,99 olarak

belirlenmiştir.

Sonraki basamakta PCA, PCR ve PLS yöntemleri, iki farklı ticari farmasötik

preparattaki AMH ve HCT „nin aynı anda miktar tayinlerine uygulanmıştır.

Anahtar Kelimeler: Amilorid hidroklorid, hidroklorotiyazid, PCA, PCR, PLS, UV,

kemometri

2012, 53 sayfa

iv

ABSTRACT

M.Sc.Thesis

SIMULTANEOUS DETERMINATION OF AMILORID HYDROCHLORIDE

AND HYDROCHLOROTHİAZIDE IN PHARMACEUTICALS BY

CHEMOMETRIC METHODS

İkbal Demet ÜNLÜ

Süleyman Demirel University

Graduate Scholl of Applied and Natural Sciences

Department of Chemistry

Supervisor: Assoc. Prof. Dr.Ahmet Hakan AKTAŞ

In this thesis, three different chemometric calibration methods (principle component

analysis (PCA), partial least square (PLS) and principal component regression

(PCR)) were successfully applied to the simultaneous determination of amıloride

hydrochloride (AMH) and hydrochlorothiazide (HCT) in two different

pharmaceutical preparations without using any separation step. The data of UV-

Visible Spectroscopy applied to the chemometric calculations.

For the validation of this chemometric metot, a calibration set of 28 binary mixtures

containing compounds in the working range of 0,5-3,5 μg/mL for AMH and 5-35

μg/ml for HCT was prepared in (MeOH-H2O 1:1,(v/v)). Calibration sets 200-400 nm

range absorption spectra were recorded. Three chemometric calibrations were

constructed by using the relationship between the calibration set and its

corresponding absorption data obtained in the range 255-385 nm. The synthetic

mixtures of two drugs were used for the validity of the calibrations. Means

recoveries (percent) and relative standard deviation of PCR and PLS methods were

found to be % 99,61 / % 0,56 and %100,82 / %2,20 for AMH; %100,08 / % 1,72 ve

%100,58 / % 6,99 for HCT, respectively.

In the next step, the PCA, PCR and PLS methods were applied to the simultaneous

determination of AMH and HCT in two different commercial pharmaceutical

preparations and successful results were obtained.

Key words: Hydrochlorothiazide, Amıloridehydrochloride, PCA, PCR, PLS, UV,

Chemometrics.

2012, 53 pages

v

TEŞEKKÜR

Tez çalışmam boyunca en sıkıntılı zamanlarımda bir kez bile olsun bıkmadan

usanmadan yardımıma koşan, deneyimlerinden her alanda faydalandığım,

deneylerimde gösterdiği ilgi alaka konusunda hakkını ödeyemeyeceğim yegane

hocam; Sayın Doç. Dr. Hakan AKTAŞ’a,

Tez aşamasında beni destekleyip eğitimimden geri kalmamam için destek veren T.

GARANTİ BANKASI Şube Müdürü; Sayın Barış TABAK’a,

Her an bana destek olan ve benim her an ailem kadar destekçim olan biricik NAKİT

YETKİLİM; Sayın Veli TANEL’e,

En zorlu zamanlarda hayatımda varlığıyla beni gerçekten bütünleyen yaşam çınarım

Sayın Tuğba ÇETİNKAYA’ya,

Kullandığım kimyasal maddeleri sağlayan Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel

Araştırma projeleri bölümü görevlilerine 2944-YL-11 nolu proje için,

Eğitim öğretim hayatım boyunca beni maddi manevi her alanda destekleyen

BİRTANECİK AİLEME teşekkürlerimi sunuyorum.

İkbal Demet ÜNLÜ

ISPARTA, 2012

vi

ŞEKİLLER DİZİNİ

Sayfa

Şekil 1.1. Hidroklorotiazitin açık formülü ................................................................ 3

Şekil 1.2. Kaptoprilden Hidroklorotiyazid sentezi .................................................... 4

Şekil 1.3. Amilorid Hidroklorid açık formülü .......................................................... 4

Şekil 1.4. Temel haldeki ve uyarılmış haldeki elektronlar........................................ 6

Şekil 1.5. Numune üzerine gönderilen ve çıkan ışığın şiddeti (l = ışığın numune

içinde aldığı yoldur) ................................................................................. 7

Şekil 1.6. Derişim etkisiyle Lambert – Beer yasasından sapmalar ........................... 8

Şekil 1.7. Bir spektrofotometrenin temel bileşenleri .............................................. 10

Şekil 1.8. UV-Görünür alan spektrofotometresi. .................................................... 10

Şekil 1.9. Kemometrinin ilişkili olduğu disiplinler ................................................. 13

Şekil 1.10. X1 ve X2 olan iki değişken için PC1 ve PC2 olan iki esas bileşeni ..... 15

Şekil 1.11. PLS2 kalibrasyonu ................................................................................ 17

Şekil 4.1. HCT maddesinin absorpsiyon spektrumu ............................................... 32

Şekil 4.2. AMH maddesinin absorpsiyon spektrumu ............................................. 32

Şekil 4.3. Simetrik kalibrasyon setinin iki boyutlu düzlemdeki grafiği .................. 34

Şekil 4.4. HCT (5 μg/mL) ve AMH (2,5 μg/mL) ile iki bileşiğe karşılık gelen

karışımın absorpsiyon spektrumları (Metanol – su içerisinde). ............. 35

Şekil 4.5. Değişkenlerin doğrusal bileşenleri .......................................................... 36

Şekil 4.6. Kemometrik verilerden elde edilen özdeğerlerin grafiği ........................ 37

Şekil 4.7. PCR kalibrasyon basamağında HCT için gerçek ve tahmin edilen

derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar. .............. 43

Şekil 4.8. PCR kalibrasyon basamağında AMH için gerçek ve tahmin edilen

derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar. .............. 43

Şekil 4.9. PLS kalibrasyon basamağında HCT için gerçek ve tahmin edilen

derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar. .............. 47

Şekil 4.10. PLS kalibrasyon basamağında AMH için gerçek ve tahmin edilen

derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar. .............. 47

vii

ÇİZELGELER DİZİNİ

Sayfa

Çizelge 1.1. Varyans analizi çizelgesi (Anova testi çizelgesi: analysis of

varation) ...................................................................................................... 21

Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan kimyasallar. ...................................................... 29

Çizelge 4.1. İlaç aktif maddelerinin spektroskopik özellikleri .............................. 31

Çizelge 4.1. HCT ve AMH analizi için kalibrasyon seti......................................... 33

Çizelge 4.2. HCT ve AMH sentetik karışımlarına PCR kalibrasyon yönteminin

uygulanması ve elde edilen geri kazanım değerleri .................................... 41

Çizelge 4.3. MODURETİC Tablet preparatına PCR yönteminin uygulanmasıyla

elde edilen sonuçlar. .................................................................................... 44

Çizelge 4.4. HCT ve AMH sentetik karışımlarına PLS kalibrasyon yönteminin

uygulanması ve elde edilen geri kazanım değerleri .................................... 45

Çizelge 4.5. MODURETİC Tablet preparatına PLS yönteminin uygulanmasıyla

elde edilen sonuçlar. .................................................................................... 48

viii

SİMGELER DİZİNİ

ANOVA Varyans analizi (Analysis of variance)

BSS % Bağıl standart sapma

AMH Amilorid hidroklorid

HCT Hidroklorotiyazid

GK % Geri Kazanım

PCA Temel bileşen analizi yöntemi( Principal component analysis )

PCR Temel bileşen regresyon yöntemi (Principal component analysis)

PLS Kısmi en küçük kareler yöntemi( Partial least squares regression)

SS Standart sapma

UV- Vis Ultra viyole görünür bölge spektroskopisi

X Ortalama değer

1

1. GİRİŞ

Hastalıkları tedavi etmek için kullanılan maddelere İlaç denir. İlaçlar elde edildikleri

yere göre üçe ayrılırlar:

1- Madenlerden elde edilen ilaçlar

2-Bitkilerden elde edilen ilaçlar

3- Hayvanlardan elde edilen ilaçlar.

Madensel menşeli ilaçlara kimyevi ilaçlar denir. Bunlar kimyevi maddelerden

doğrudan doğruyla yapılırlar. Mesela; İngiliz tuzu, Aspirin, Sülfamitler vs. gibi.

Bitkilerden elde edilen ilaçlar; bitkilerin köklerinden, çiçeklerinden yahut

kabuklarından yapılırlar. Mesela; Hintyağı, Kinin, Dijital vs. gibi.

Hayvansal menşeli ilaçlar ise; hayvanların veya insanların doku ve organlarından

hazırlanırlar. Mesela: İnsülin, Karaciğer hülasası, Aşılar vs. gibi.

İlaç Şekilleri

Bütün ilaçlar genel olarak Katı veya Sıvı halde bulunurlar.

Katı İlaç Şekilleri

1. Toz: Öğütülüp toz haline getirilerek kul anılan ilaçlardır.

2. Hap: Toz halindeki ilacın hamur haline getirilerek yuvarlak şekiller verilmesiyle

yapılan ilaçlardır.

3. Kapsül: Jelatinden yapılmış bir muhafaza içinde bulunan ilaçlardır.

4. Tablet: Toz halindeki ilaçların küçük ve yassı yuvarlaklar şeklinde tazyik

edilmesiyle yapılan ilaçlardır.

5. Draje: Tabletlerin üzerinin şeker ile kaplanmasıyla hazırlanan bir ilaç şeklidir.

2

6. Merhem: İlaçların domuz yağı, vazelin veya diğer bazı yağlar içersine katılması

ile hazırlanan şeklidir.

7. Fitil: İlaçların kakao yağı veya gliserin ile karıştırılarak hamur haline

getirildikten sonra koni şeklinde hazırlanan şeklidir.

Sıvı İlaç Şekilleri

1. Tentür: Herhangi bir ilacın alkoldeki eriyiğidir. Yani ilacı alkol içinde eritmek

suretiyle hazırlanan bir ilaç şeklidir. Mesela: Tentürdiyot, İyodun alkol içindeki

eriyiğidir.

2. Sulu Mahsuller (Solüsyonlar): İlacın suda eritilmiş şeklidir.

3. Şurup: İlacın koyu şekerli suda eritilmiş şeklidir.

4. Ampul: Ampul adı verilen kapalı cam bir muhafaza içersinde saklanan steril ve

sıvı halde olan bir ilaç şeklidir.

İlaç analizlerinin yapılabilmesi için, önemli olan öncelikle analiz için kullanılacak

aletler ve elde edilecek verilerin anlaşılabilir hale getirilebileceği matematiksel

metotlardır. Analitik çalışmalarda tek başına, iki veya daha fazla aktif bileşiği içeren

karışımların kantitatif analizi için spektrofotometri, spektroflorimetri, infrared

spektrofotometrisi, voltametri (polorografi), kromatografi, kütle spektrometresi ve bu

yöntemlerin kombine şekilleri kullanılmaktadır (Kaya, 2007).

Günümüzde analiz için kullanılan UV/Görünür Bölge spektrofotometreler ucuz ve

hassas olmakla birlikte karmaşık sonuçlar vermektedir. UV/Görünür aletlerinin

kullanılması tek etken madde içeren ilaçların analizinde herhangi bir sorun

oluşturmazken birbiri ile çakışan spektrum veren ilaç karışımları analizinde sorunlar

oluşabilir. Analiz işlemlerinde daha kesin, daha doğru, daha hızlı, daha ekonomik ve

daha güvenilir sonuçlara ulaşmak için yeni teknik ve yaklaşımlara ihtiyaç vardır

(Çetin, 2008).

Analitik kimyada hiçbir ön ayırma işlemi yapmaksızın kombine ilaç numunelerinin

aynı anda kantitatif analizi son derece önemlidir. Analitik yöntemler geliştirmek

3

amacıyla, klasik analitik yöntemler ile birlikte değişik matematiksel algoritmalara

dayanan hesaplama teknikleri kombine olarak uygulanmaktadır. Klasik analitik

yöntemler ile kemometrik kalibrasyonların karışım analizlerinde başarılı sonuçlar

vermesi nedeniyle ilaç numunelerinin analizinde artan yoğunlukta kullanılmaktadır

(Kaya, 2008).

Bu çalışmada ilaç etken maddelerinden hidroklorotiyazid ve amilorid hidroklorid

miktar tayinlerini UV spektroskopisi yöntemiyle tayin edip elde edilen verilerin

kemometrik yöntemlerle değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Bu bölümde analizi

yapılacak bu etken maddeler ve uygulanan yöntemler hakkında bilgi verilecektir.

1.1. Hidroklorotiyazidin Genel Özellikleri

Hidroklorotiyazit vücutta sıvı tutulumuna yol açan aşırı miktarda tuzun vücut

tarafından emilimini engellemeye yardımcı olan bir idrar söktürücüdür.

Hidroklorotiyazit, tiazit grubu idrar söktürücüler arasında yer alır.

Hidroklorotiyazitin açık formülü Şekil 1.1 de gösterilmiştir.

Şekil 1.1. Hidroklorotiazitin açık formülü

Hidroklorotiyazit kapalı formülü C7H8ClN3O4S2 olan beyaz renkli bir tozdur ve

sistematik ismi 6- kloro- 3,4 dihidro-2H- 1,2,4-benzotiyadiazin-7- sülfonamid 1,1

dioksid‟tir. Molekül ağırlığı 297,74 g/mol olan maddenin erime noktası 274 o

C ve

suda az çözünürdür.

4

Hidrolorotiyazid birkaç yolla elde edilebildiği gibi kaptopril (1-[(2S)-3-merkapto-2-

metilpropiyonil]-L-prolin ) „den de elde edilebilmektedir.(Şekil 1.2)

Şekil 1.2. Kaptoprilden Hidroklorotiyazid sentezi

İlaçların içeriğinde yaygın olarak kullanılan hidroklorotiyazid yüksek tansiyon

düşürmek için kullanılan bir diğer adı hipertansif olan ilaçlarda çoğunlukla kullanılır.

Hidroklorotiyazid vücutta sodyum, klor ve suyun hızlı bir şekilde atılmasını

sağlayarak tansiyonun çabuk düşmesini ve dengelenmesini sağlar. Bunları yaparken

kan basıncını düşürerek vücudu normale döndürmeye yardımcı olur.

1.2. Amilorid Hidrokloridin Genel Özellikleri

Kapalı formülü C6H8ClN7O.HCl.2H2O olan Amilorid Hidrokloridin açık formülü

Şekil 1.3 de gösterilmiştir.

Şekil 1.3. Amilorid Hidroklorid açık formülü

Kimyasal olarak bilinen diğer tür antikaliüretik veya diüretik ilaçlarla alakası

olmayan bir pirazin-karbonil-guadin karışımı bir ajandır. Orta kuvvette bir baz

tuzudur (pKa: 8,7). Kimyasal formülü 3,5-diamino-6-kloro-N- diaminometilen

5

pirazinkarboksamid monohidroklorid‟dir. Erime noktası 240-242 CO

arasında

değişmektedir. UV/görünür bölgede 285-361 nm‟de absorbans verir (sulu asit

çözeltisi). Amilorid hidroklorid etil asetat ve suda çözünür. Kloroform ve eterde

pratik olarak çözünmez.

Açık formülü Şekil 1.3 de gösterilen amilorid hidrokloridin molekül ağırlığı 302,1

g/mol‟dür. Bu formüle göre susuz ortamda hesaplanan her tablette 5 mg amilorid

hidroklorid (AMH) vardır. Her bir tablet koloidal silikon dioksit, kroskarmelloz

sodyum, D&C yellow, çift bazlı kalsiyum fosfat dihidrat, FD&C yellow, magnezyum

sterat, mikrokristalin selüloz ve silikon dioksid vardır.

Amilorid hidroklorid tıbbi olarak ilaç kullanımında zayıf natriüretik, diüretik ve

antihipertansif etki gösteren sodyum koruyucu ( antikaliüretik) bir ilaçtır. Vücut için

amilorid, tiyazid veya diüretik tek başlarına kullanıldığında idrardaki magnezyum

atılımının azaldığı gösterilmiştir.

Amilorid hidroklorid ilaç olarak oral yoldan alındıktan sonra 2 saat içinde vücutta

etki göstermeye başlar. Elektrolit atılımı üzerindeki etkileşimi 6 ila 10 saat arasında

zirveye ulaşılır ve emilim yaklaşık 24 saat sürer. Amilorid hidroklorid karaciğer

tarafından emilmeden alınır ve böbrekler tarafından değişime uğramadan atılır.

1.3. Kullanılan Yöntem

1.3.1. Spektrofotometri

Işık ile madde arasındaki etkileşmeden yararlanarak gerçekleştirilen analiz

yöntemleri, az sayıda analiz materyali gerektirmesi, seçiciliği, hassaslığı ve doğruluk

derecesinin yüksek ve güvenilir oluşu nedenleriyle kimyacılar tarafından özellikle

analitik amaçlar için sıklıkla kullanılmaktadır.

Bu yöntemlerden biri olan spektrofotometri, ışık enerjisinin absorpsiyonuna dayalı

bir metottur. Işık ise elektromanyetik ışıma olup frekans ve dalga boyu ile

karakterize edilmektedir. Enerji ise;

6

E = h . υ veya E = h .

eşitlikleriyle ifade edilmektedir. Bu eşitliklere göre ışığın dalga boyu büyüdükçe

enerjisinin azalmasına karşılık dalga boyu küçüldükçe enerjisi artar. Işık, atom ve

moleküller tarafından absorbe edilebilir. UV ve görünür bölgedeki ışığın

absorpsiyonu molekülü oluşturan atomların bağ elektronları ile ilgilidir.

Kuantum kuramına göre atomlar, ancak elektron konfigürasyonuna ve dış

elektronlarının belirli enerji düzeyleri arasındaki geçişlerine bağlı belirli potansiyel

enerji düzeylerinde bulunabilirler. Elektronların bir enerji düzeyinden diğerine

geçişleri ile ilgili atomik spektrumlar belirlenmiştir (Şekil 1.4).

Şekil 1.4. Temel haldeki ve uyarılmış haldeki elektronlar

Atomlar, elektromanyetik ışımayı absorbe ederek en düşük enerji düzeyinden (temel

düzey) uyarılmış düzeylere geçerler; bu geçişlerle ilgili olarak söz konusu atomun

absorpsiyon spektrumları da belirlenmiştir. Elektromanyetik ışımayı absorbe

ederek en düşük enerji düzeyinden (temel düzey) uyarılmış düzeylere geçmiş olan

atomlar, temel düzeye dönüş sırasında ultraviyole veya görünür bölge sınırları içinde

ışıma enerjisi yayarlar (emisyon). Her atom için emisyon spektrumu da belirlenir.

Elektronun bir orbitalden diğerine atlamasına elektronik geçiş denir. Elektronik

geçişe dayalı absorpsiyona da elektronik absorpsiyon denir. UV/görünür bölge dış

kabuktaki elektronların enerji düzeyini değiştirir.

7

UV ve görünür bölgedeki ışığın absorpsiyonu aynı zamanda bir molekülün titreşim

ve dönme enerji seviyelerinde de değişikliğe neden olmaktadır. Çünkü bir molekülün

toplam enerjisi;

Bir molekülün toplam enerjisi=Eelektronik+Etitreşim+Edönme dir. (1.1)

Işık absorpsiyonu spektrofotometrelerle ölçülür. Bu ölçüm atom, iyon veya molekül

üzerine gönderilen ışığın şiddeti (Io) ile geçen ışığın şiddeti (I) arasındaki farkın

ölçümü temelleri üzerine kurulmuştur (Şekil 1.5).

Şekil 1.5. Numune üzerine gönderilen ve çıkan ışığın şiddeti (l = ışığın numune

içinde aldığı yoldur)

Işığın absorpsiyonunun üzerine düştüğü atom, iyon veya molekülün derişimi ile

orantılı olarak değiştiği Lambert - Beer tarafından ileri sürülmüştür. Lambert- Beer

yasası olarak adlandırılan aşağıdaki eşitlikte aynı derinlikte bir çözeltiden geçen bir

ışın demetinin şiddeti çözeltinin derişimiyle orantılı olarak azalır.

I = Io . 10-εlC

Burada;

I = Numuneyi terk eden ışığın şiddeti

Io = Numune üzerine gönderilen ışığın şiddeti

ε = Molar absorpsiyon katsayısı

C = Absorpsiyon yapan türlerin derişimi

8

Düşük

derişim

l = Işığın numune kabı içinde aldığı yoldur.

Eğer eşitliğin eksi logaritması alınırsa, log = εlC elde edilir. Burada log

absorbans‟dır ve A ile gösterilir. Bu durumda yukarıdaki eşitlik kısaca;

A = εlC

şeklinde gösterilir ve bu eşitlikten derişim kolaylıkla hesaplanabilir. Bu bağıntıda A

değeri C‟ye karşı grafiğe geçirildiğinde eğimi εl olan bir doğru elde edilir. Ancak bu

doğru her zaman muntazam bir şekilde elde edilemez. Bu olaya Lambert – Beer

yasasından sapma adı verilmektedir. Bu sapmanın en önemli nedenlerinden biri Şekil

1.6‟da gösterilmektedir.

Şekil 1.6. Derişim etkisiyle Lambert – Beer yasasından sapmalar

Lambert - Beer yasası genellikle 0,01 M dan büyük derişimlerde doğrusallıktan

sapar. Yüksek derişimlerde absorpsiyon yapan moleküller arası uzaklık azalır ve

moleküllerin yük dağılımı bozulur. Bu da absorpsiyonu etkiler, çözeltilerin

seyreltilmesi bunu giderir. Analitin ayrışması durumunda ise kimyasal sapma

görülür. Bu genellikle asit/ baz indikatörlerinin sulu çözeltilerinde gözlenir. Ayrıca

monokromatörün dalga boyununda az da olsa sapma görülür. Prizma, mercek ve

filtrelerin yüzeyinde oluşan kaçak ışınlar da sapmalara neden olur. Aletsel

sapmalarda daima düşük absorbans okuması gözlenir.

Yüksek

derişim

9

1.3.2. UV ve Görünür Bölge Spektroskopisi

Her madde üzerine düşürülen ışınlardan bazılarını absorplayabilir. Maddenin hangi

dalga boylarındaki ışınları absorplayacağı kendine özgüdür. Bundan yararlanılarak

nitel analiz yapılabilir. Bir maddenin absorplayacağı ışın şiddeti ise madde miktarı

ile orantılıdır. Bundan yararlanılarak da nicel analiz yapılabilir. Bu amaçla madde

üzerine çok çeşitli enerjilere sahip ışınlar gönderilebilir. Madde ile etkileşen ışının

enerjisi değiştiğinde madde ile etkileşim mekanizması da değişir. Buna bağlı olarak

ölçüm tekniğinin de değişmesi gerekir. Bu nedenle elektromanyetik spektrumun

tümü için ölçüm yapılabilecek tek bir cihazın bulunması mümkün değildir.

Elektromanyetik spektrumun farklı bölgeleri için farklı cihazlar kullanılır. Dalga

boyu 110 nm – 1000 nm arasındaki UV ve görünür bölge ışınları ile çalışılabilen

cihazlara UV ve Görünür Bölge Spektrofotometreleri denir. Bu bölgedeki ışınların

absorplanmalarının ölçümlerini temel alan analitik yönteme de UV ve Görünür Bölge

Spektroskopisi denir. UV ve görünür bölge ışınları molekülün en üst enerji

seviyesindeki bir elektronun daha yüksek bir enerji düzeyine geçiş yapmasına sebep

olur. UV ve görünür bölge ışınları, moleküllerde benzer etki yaptığı için

birleştirilmişlerdir. Hem organik hem de anorganik moleküller UV ve görünür bölge

ışınlarını absorplarlar. Her iki grup molekülde de ışın absorpsiyonu elektron geçişi

ile gerçekleşmesine rağmen etkileşim mekanizmaları farklıdır. Organik

moleküllerdeki absorpsiyon molekül orbital teorisine göre, anorganik moleküllerdeki

absorpsiyon ise kristal alan teorisine göre açıklanır.

1.3.3. UV ve Görünür Bölge Absorpsiyon spektrofotometreleri

Maddenin ışığı absorplamasını incelemek için kullanılan düzeneğe absorpsiyon

spektrometresi veya absorpsiyon spektrofotometresi adı verilir. Bir spektrofotometre

düzeneği Şekil 1.7‟de görüldüğü gibi başlıca ışık kaynağı, dalga boyu seçicisi ve

dedektörden oluşur. Dedektörde elektrik sinyaline çevrilen optik sinyal bir kaydedici

veya bir galvanometre ile ölçülür.

10

IŞIK KAYNAĞI DALGABOYU ÖRNEK KABI DEDEKTÖR

SEÇİCİ

Şekil 1.7. Bir spektrofotometrenin temel bileşenleri

Bu ana bileşenlere ek olarak spektrofotometrelerde ışığı toplamak, odaklamak,

yansıtmak, iki demete bölmek ve örnek üzerine belli bir şiddette göndermek

amacıyla mercekler, aynalar, ışık bölücüleri ve giriş ve çıkış aralıkları vardır. Örnek

ise, kullanılan dalga boyu bölgesinde ışığı geçiren maddeden yapılmış örnek

kaplarına konularak ışık yoluna yerleştirilir (Şener, 2006). Deneyler sırasında

araştırma laboratuarımızda kullandığımız UV-Görünür bölge cihazımızın şekli

aşağıda verilmiştir.

Şekil 1.8. UV-Görünür alan spektrofotometresi.

1.3.4. UV ve Görünür Bölge Moleküler Absorpsiyon spektroskopisinin

uygulamaları

Bu yöntemin başlıca uygulama alanları şunlardır.

11

1. Nitel Analiz: Analizi yapılacak olan bilinmeyen madde saflaştırıldıktan sonra

uygun bir çözücüde çözülerek spektrumu alınır. Bu spektrum bilinen bileşiklerin

aynı koşullarda çekilmiş spektrumları ile karşılaştırılır. Bilinmeyen madde

spektrumu kendisininkine tam olarak uygun maddedir. Bu yöntem nitel analiz

için çok uygun bir yöntem değildir. Çünkü moleküllerin absorpsiyon bantları

oldukça geniştir ve bazı kromoforların absorpsiyon bantları birbiri ile örtüşebilir.

Ayrıca moleküllerin UV ve görünür bölge absorpsiyon spektrumlarında çok az

sayıda bant bulunur. Bu az sayıda bandın birbiri ile karşılaştırılarak karar

verilmesi bazen hatalı sonuçlara yol açabilir.

2. Nicel Analiz: Işının absorplamasına dayanan analiz yöntemleri nicel analiz için

oldukça yararlı ve güçlü yöntemlerdir. Bu yöntemlerin klasik yöntemlere göre

önemli avantajları vardır.

a. Analiz süresi kısadır. Sonuç çabuk alınır.

b. Doğruluk derecesi yüksektir. Çoğunlukla analizlerdeki hata binde bir veya iki

civarındadır.

c. Oldukça duyarlı bir yöntemdir. 10–8

M a kadar seyreltik çözeltilerin bile

analizleri yapılabilir.

d. Her maddenin kendine özgü bir absorpsiyon spektrumu olduğu için seçiciliği

yüksektir. Çoğunlukla bir karışımdaki maddeler bir ön ayırma işlemine gerek

kalmaksızın analizleri yapılabilir.

e. Hem organik hem de anorganik pek çok molekül UV ve görünür bölge ışınları

absorpladığından uygulama alanı geniştir (Şener,2006).

1.4. Kemometrik Yöntemler

Kimyada yada Analitik kimyada verilerin işlenmesi ve istatistiksel değerlendirilmesi

ile bu verilerin sağlandığı deney faktörlerinin araştırılması, optimize edilmesi, zaman

tasarrufunun sağlanması ve kantitatif ölçümler için kalibrasyonların

gerçekleştirilmesi için gerekli olan deneysel tasarımların hazırlanması kimyanın

belki de en çok hesaplama ve modelleme çalışmalarına ihtiyaç duyulduğu alanlarıdır.

Temel kimya ve fizik bilgileri ile birlikte mühendislik ve hesaplama tekniklerine,

matematik ve istatistik konularına dayanan kimyada verilerin işlendiği ve

değerlendiği alan kemometri olarak bilinmektedir (Akpolat O, 2004).

12

Günümüzde bilgisayar, yazılım, istatistik ve uygulamalı matematik alanlarındaki

gelişmeler, kimya alanında, özellikle de analitik kimyada karmaşık sistemlerin

çözümü için kemometri adı verilen yeni bir disiplinin doğuşuna neden olmuştur. Bu

gelişmeler, analitik kimya ve komşu dallardaki araştırmacılara, analitik problemlerin

çözümünde yeni olanaklar sağlayan çok boyutlu ve çok değişkenli parametrelerin

kullanıldığı kemometrik yöntemlerle yeni çalışma alanları doğurmuştur. Kemometri,

istatistik ve matematik ile birlikte bilgisayar kullanarak kimyasal verilerin

işlenmesini kapsayan bir kimya disiplindir. Kemometri, kimyasal analizlerde,

kimyasal verilerden gerçek bilginin ektraksiyonunu veya saklı bilgilerin açığa

çıkarılmasına olanak tanıyan güçlü bir araçtır. Kemometrinin temel uygulama

alanlarından biri de analitik kimyadır.

Kemometri kavramı, 1972 yılında İsveçli Svante Wold ve Amerikalı Bruce R.

Kowalski tarafından ileri sürülmüştür ve 1974 yılında uluslararası kemometri derneği

tarafından bu disiplinin ilk resmi açıklaması yapılmıştır. Kemometri içerik olarak,

tanımlayıcı ve açıklayıcı istatistik (descritive and inference statics), sinyal işleme

(signal processing), deneysel tasarım (experimental design), modelleme (modeling),

kalibrasyon (calibration), optimizasyon (optimization), yapı tanıma (pattern

recognition), sınıflandırma (classification), yapay akıl yöntemleri (artificial

intelligience methods), resim işleme (image processing), bilgi ve sistem kuramı

(information and system theory) gibi kavram ve uygulamalarından oluşur.

Günümüzde kemometrik yöntemlerin gelişmesiyle birden fazla etken madde içeren

ürünlerin kantitatif analizi hiçbir kimyasal ön ayırma işlemi ve hiçbir grafik işlemi

gerektirmeksizin hızlı, doğru ve hassas olarak gerçekleştirilmektedir. Bu durum

kemometriye diğer yöntemlere göre büyük bir avantaj kazandırmıştır ve

kemometrinin kullanım alanının geniş bir alana yayılmasını sağlamıştır.

Kemometri; analitik kimya, adli tıp, biyoloji, gıda kimyası, çevre kimyası, arkeoloji

gibi alanlarda kullanılmaktadır. Fizikokimyacılar ve madde bilimciler, sinyal işleme

ve çok değişkenli verilerin analizinde kemometrik yöntemleri uyguladıkları

13

görülmektedir. Organik kimyacılar ve farmasotik kimyacılar, reaksiyon koşullarının

optimizasyonunda deneysel tasarım ve ilaç tasarımında yapı etki ilişkisi

çalışmalarında kemometrinin araçlarını kullanmaktadırlar (Vandeginste ve ark.,

1998).

Şekil 1.9. Kemometrinin ilişkili olduğu disiplinler

Yukarıdaki şekilde de (Şekil 1.9) görüldüğü gibi kemometrik çalışmalarda, analitik

kimyacıların ve diğer ilgili disiplinlerin ihtiyaçları ölçüsünde uygulamalı matematik

ve istatistik bilgisine sahip olmaları gerektiği açıktır. Burada programlama ve

hesaplama çok önemlidir. Kemometrik uygulamaların çoğu kompleks hesaplamalar

içermektedir. Bu hesaplamaları elle veya basit hesap makineleriyle gerçekleştirmek

mümkün olmadığı için bilgisayar programlarına ihtiyaç vardır. Kemometrik

hesaplamalarda genellikle EXCEL, MATLAB, PANORAMA, MİNİTAB, XLSTAT,

SOLO ve diğer paket programlar kullanılmaktadır (Dinç E., 2009).

İki veya daha fazla aktif bileşiği içeren karışımlarda bu aktif bileşiklerin hiçbir

ayırma işlemi kullanmaksızın analizi, analitik kimyanın ve diğer komşu dalların

temel problemlerinden birisidir. Karışım halindeki numunelerin analizi için çeşitli

kromatografik ve spektrofotometrik yöntemlerin yaygın olarak kullanıldığı

çalışmalarda da görülmektedir. Bazı durumlarda bahsedilen bu yöntemlerin de iyi

sonuçlar vermediği de bir gerçektir. Sayılan bu nedenlerden dolayı daha düşük

miktarlarda numunelerin analizi için gelişmiş analitik cihazlar geliştirilmesine

rağmen klasik analitik cihazlardan elde edilen verilerin çeşitli matematiksel

algoritmalara tabi tutularak yöntemlerin hassasiyeti ve sonuçların doğruluğu

artırılmaya çalışılmaktadır.

Uygulama alanları

KEMOMETRİ Analitik

Kimya

Biyoloji

Tıp

İlaç

Gıda

Sanayi

Matematik İstatistik Bilgisayar Programlama

Mühendislik

Organik Kimya

Fizikokimya

14

1.4.1. Çok Değişkenli Kalibrasyon Algoritmaları

1.4.1.1. Temel Bileşen Analizi Yöntemi (Principal Component Analysis (PCA)

Method)

Çok bileşenli verilerle ilgili en önemli sorunlardan biri, orijinal verilerin tamamının

desen ve ilişkilerinin görülmesini engellemesidir. Çok değişkenli analiz

yöntemlerinin birçoğunun temel hedefi verilerin boyutunu küçültmektir. Temel

bileşen analizi daha çok bileşenler arasında korelâsyonun olmadığı durumlarda

verilerin miktarını azaltmak için kullanılan bir tekniktir.

Temel bileşen analizinin dayandığı ana fikir, her bir numuneyi tanımlayan orijinal

değişkenlerin, X1, X2,…, Xn, doğrusal kombinasyonu olan PC1,PC2,…,PCn

şeklindeki temel bileşenleri bulmaktır.

PC1 = a11X1 + a12X2 +……….+a1nXn (1.2)

PC2 = a21X1 + a22X2 +……….+a2nXn

vb.

Esas bileşenler genellikle ortak varyans (kovaryans) matrisinden elde edilir. Ortak

varyans, iki değişkenin birleşik varyansının bir ölçüsüdür. Matematiksel anlamda

temel bileşenler (PC), ortak varyans matrisinin eigenvektör ( özvektör) leridir ve bu

vektörlerin bulunmasında kullanılan tekniğe eigen analizi adı verilir. Her bir esas

bileşene( yani, eigen vektörüne) karşılık gelen eigen değeri, o esas bileşenle

tanımlanan veri takımının varyansının miktarını gösterir. Esas bileşenler birbirine dik

açı oluşturur. Bu özellik diksellik olarak adlandırılır (Uyanık, 2008).

15

Şekil 1.10. X1 ve X2 olan iki değişken için PC1 ve PC2 olan iki esas bileşeni

gösteren diyagram (Uyanık, 2008).

1.4.1.2. Temel Bileşen Regresyon Yöntemi (Principal Component Regression

(PCR) Method)

Kemometrik kalibrasyon yöntemlerden birisi olan temel bileşen regresyon yöntemi,

konsantrasyon seti için ölçülen absorbans verilerinin dekomposizyonu ile birbirine

dik (ortogonal) doğrular elde edilmesi esasına dayanır. Bu elde edilen doğrular

kurulacak kalibrasyonun koordinat sistemidir.

Burada açıklanan PCR algoritması Martens ve Naes (1984) tarafından verilen

şemaya göre açıklanmaktadır. PCR kalibrasyonu kurulmasındaki basamaklar

aşağıdaki biçimdedir:

Analiz edilecek maddenin konsantrasyon ve absorbans verilerinin varyans-

kovaryansı bulunur. Varyans-kovaryans saçılma matriksinin öz vektörleri ve öz

değerleri hesaplanır. Seçilen öz değere (eigenvalue) karşılık gelen öz vektör (eigen

vector) kalibrasyonun lineer bileşenidir.

PCR algoritmasında genel lineer regresyon denklemi aşağıdaki biçimde yazılabilir:

C = a + b . A (1.3)

Burada C analiz edilecek maddenin konsantrasyonudur, a sabit sayı, b ise temel

bileşenlerin ve C- loading matriksinin (q) çarpımından elde edilir:

16

b= P . q (1.4)

Burada P öz vektörlerin matriksidir. Öz vektörler kolon matriksi en uygun öz değere

(faktöre) ya da öz değerlere (faktörlere) karşılık gelmektedir. Burada q vektörü C-

loading olarak adlandırılır ve T (sayı matriksi) üzerinden C‟ nin regresyonu ile tayin

edilir.

q = D . TT . YO (1.5)

Burada D diagonal matriks olup her bir öz değerin tersine eşittir. t1 sayı matriksi

aşağıdaki eşitlikten elde edilebilir:

t1 = Ao . P1 (1.6)

Ortalanmış absorbans ve konsantrasyon, AO ve CO ile gösterilebilir. Burada a sabiti

genel lineer regresyon denklemi kullanılarak aşağıdaki eşitlikten hesaplanabilir:

a = Co - AT

O . b (1.7)

Her bir aşamada elde edilen değerler denklemde yerine konarak numunede

bilinmeyen konsantrasyonu hesaplanabilir.

a. Yöntemin avantajları; i) dalga boyu seçimi gerektirmez, genellikle bütün spektral

alan ya da bu spektral alanın deniş bir bölgesi kullanılabilir, ii) çok bileşen analiz

için kullanılabilir, iii) PCR data işlemleri için ve kalibrasyondaki katsayılarının

hesaplanmasında ILS regresyon işleminin kullanılmasına olanak tanır, iv) analiz

edilecek bileşenlerin bilinmesi şartıyla çok kompleks karışımlar için

kullanılabilir, v) bazen orijinal kalibrasyon karışımlarında bulunan fakat

numunede bulunmayan bileşenli numunelerin miktar tayininde kullanılabilir, vi)

kalibrasyon için ölçülen absorbansların dekomposizyon işleminde sonra uygun

öz vektörlere karşılık seçilen öz değerlerin deneysel ortamdan ve ölçüm

aletlerinden gelen gürültünün eliminasyonuna olanak tanır.

17

b. Yöntemin dezavantajları; i) hesaplamalar klasik yöntemlere göre daha yavaştır,

ii) yöntemin optimizasyonu temel kalibrasyon komponentlerinin bazılarının

bilinmesini gerektirir (anlaşılması ve yorumlanması çok kompleks modeller için),

iii) kalibrasyon için temel alınan vektörler analiz edilecek bileşenlere karşılık

gelmeyebilir, iv) genellikle çok sayıda kalibrasyon numunesinin kullanılması

doğru bir kalibrasyon için gereklidir, v) kalibrasyon numunelerinin hazırlanması

bileşenlerin konsantrasyonları ile doğrusallıktan uzaklaşmaları nedeniyle zordur

(Dinç, 2007).

1.4.1.3. Kısmi En Küçük Kareler Yöntemi (Partial Least Squares Regression

Method)

Kemometrik kalibrasyonlardan en yaygın ve popüler olanı PLS yöntemidir. PLS

yönteminde kalibrasyonun kurulması için kullanılan PLS algoritmalarına göre,

ortogonalize edilmiş PLS algoritması (orthogonalized PLS algorithm) ve

ortogonalize olmayan PLS algoritması (non-ortogonalized PLS algorithm) gibi

ekilleri vardır. Ortogonalize PLS ve ortogonalize olmayan PLS kalibrasyonunun

PLS1 ve PLS2 şeklinde iki tipi söz konusudur. PLS1 de bir bileşik model içerisinde

iken; PLS2 de bütün bileşikler modele dahil edilmektedir.

Wold ve Martens tarafından verilen PLS algoritması en genel olanlarıdır. PLS

kalibrasyonu, sayı vektörleri vasıtasıyla X- ve Y- blokları arasındaki ilişkiye dayanır.

PLS algoritmasına göre sıfır etrafında merkezileştirilmiş X- değişkeninin matrisi ve

sıfır etrafında merkezileştirilmiş Y- değişkeninin parçalanması aşağıdaki biçimde

verilir.

Şekil 1.11. PLS2 kalibrasyonu

18

X = T.PT + E (1.8)

Y = U.QT + F

Y = X.B + F

B = W (PT.W)

-1 . Q

T

Burada X= bağımlı değişken absorbans verileri), Y= bağımsız değişken (örneğin

konsantrasyon), T= X için sayı matrisi, U= Y için sayı matrisi, P= X için yük matrisi,

Q= Y için yük matrisi, E= X-kalıntı matrisi, F= Y-kalıntı matrisi, W=max

(kovaryans (E,F) )

PCR algoritmasında olduğu gibi bu katsayılar (B) linear regresyon denkleminde

yerine konursa analiz edilecek numunenin absorbans değerleri bu eşitlikte yerine

yazılarak hesaplanabilir.

a) Yöntemin avantajları; i) PLS kalibrasyon işlemi CLS ve ILS hesap tekniklerini

kapsamaktadır, ii) tek aşamalı bir dekompozisyon ve regresyon işlemi gerektirir,

kalibrasyonda kullanılan öz vektörler analiz edilen bileşenler ile en geniş ortak

spektral değişimin olduğu bölgede doğrudan ilişkilidir, iii)kalibrasyonlar genellikle

kalibrasyon setinin bilinmeyen numunelerden beklenen değişik konsantrasyonlarını

yansıtması daha fazla güvenirlik sağlayacaktır, iv)yalnızca analiz edilecek

bileşenlerin bilinmesi şartıyla kompleks karışımlar için kullanılabilir, v)bazı

durumlarda orijinal kalibrasyon karışımlarında bulunan fakat numunede olmayan

bileşenli numunelerin miktar tayininde kullanılabilir, vi) bu tekniklerin hepsi spektral

kantitatif analiz için uygulanırken literatürdeki sebepler genellikle PLS‟ nin tahmin

gücünün yüksek olduğunu göstermektedir. Birçok durumda PLS metodları PCR‟ den

daha iyi sonuçlar verir.

b) Yöntemin dezavantajları; i) PLS hesaplamaları klasik metotlardan daha yavaştır,

ii)PLS modellerin anlaşılması ve yorumlanması zor olup son derece soyuttur, iii)

genellikle çok sayıda numune için doğru bir kalibrasyon gereklidir, iv) kalibrasyon

numunelerinin hazırlanması bileşenlerin konsantrasyonları ile doğrusallıktan

uzaklaşmaları nedeniyle zordur (Dinç, 2007).

19

1.4.2. Kalibrasyon (Derişim) setinin tasarımı

Kemometrik (CLS, ILS, PCR, PLS) kalibrasyonlar için kalibrasyon seti ya rasgele

(randomly) yada analizi yapılacak numunede yer alan maddelerin

konsantrasyonlarını içerecek şekilde kalibrasyon (derişim) setinin tasarımı yapılır.

Simetrik kalibrasyon setinin planlanmasında analiz edilecek maddelerin

konsantrasyonları, kalibrasyon setinin içinde ana kümenin permütasyonları şeklinde

alt kümeler oluşturmalıdır. Kemometrik çalışmalarda rastgele kalibrasyon setinin

hazırlanmasından ziyade, analiz edilecek maddelerin konsantrasyonlarına göre

simetrik ve hataların minimize edilmesi açısından tercih edilecek bir durumdur.

Çalışmalarda derişim seti hazırlanmasında, çeşitli tasarım şekilleri verilmekle birlikte

rastgele hazırlanan derişim setleri de kullanılmaktadır.

1.4.3. Çapraz validasyon işlemi (Cross-validation procedure)

Kemometrik kalibrasyonların validasyonu için kalibrasyonu ve tayin basamaklarında

kalibrasyonun standart hatası (Standard error of calibration→ SEC) ve tayinin

(tahminin) standart hatası (Standard error of prediction→ SEP) gibi parametreler

kullanılmaktadır. SEC ve SEP değerlerini minimum yapan kalibrasyon koşulları ve

F-istatistiği kullanılır. Kalibrasyon performanslarını değerlendirmek için,

kemometrik kalibrasyonların SEC ve SEP değerleri yanında, bilinen ve tahmin edilen

derişim değerlerinin lineer regresyon analizi yapılarak, korelasyon katsayısı,

doğrunun eğim (m) ve kesim (n) değerleri kullanılır.

PCR ve PLS kalibrasyonlarının kurulmasında faktör seçimi için çapraz validasyon

işlemi (Cross-validation procedure) kullanılır. Bunun için karelerin tahmin (tayin)

hatalarının toplamı (prediction error sum of squares→PRESS) hesaplanır. Optimal

faktör sayısını bulmak için önerilen kriterler minimum PRESS değeri ve F-

istatistiğidir.

20

1.4.4. Varyans Analizi (ANOVA)

Varyans analizi tekniği kullanılarak grup ortalamaları arasındaki farklılığın veya

farklı analitik yöntemler ile elde edilen analiz sonuçlarının ortalamaları arasındaki

farklılığın önemli olup olmadığına bakılabilir. Bir araştırmada k tane işlemin ( veya k

tane yöntemin) n tekrarının sonunda elde edilen veriler bir tabloda özet haline

getirilir. Sonra kontrol ve karşıt hipotezi aşağıdaki şekilde kurulur.

H0: İşlemlerin temsil ettiği popülasyon ortalamaları arasındaki fark tesadüften ileri

gelmektedir. İşlem ortalamaları arasındaki gözlenen fark sıfır kabul edilebilir:

µ1 = µ2 = µ3 =. . . . . . . .=µk dır.

H1: En az iki muamele grubunun ortalaması arasında gözlenen fark tesadüften ileri

gelmektedir. En az iki işlem grubunun incelenen özellik üzerine olan etkileri

birbirinden farklıdır, yani aralarındaki fark istatistiksel olarak önemlidir.

Karşıt hipotez kurulurken en az iki işlem arasındaki fark önemlidir denilmektedir.

Çünkü kontrol hipotezinin yapılan analiz sonucunda reddedilmesi için denemede

dikkate alınan k tane işlemin birbirinden farklı olması gerekmez. En az iki işlem

arasındaki farklılık kontrol hipotezinin reddedilmesine sebep olabilir.

Yapılan hipotez kontrolü sonucunda karşıt hipotez kabul edilmiş ise bu en az iki grup

ortalaması arasındaki farklılığın önemli olduğu “çoklu karşılaştırma yöntemleri”

kullanılarak araştırılır.

Gruplar arası, gruplar içi serbestlik dereceleri ve gruplar arası- gruplar içi kareler

toplamı hesaplanır. Bu değerlerin oranlanmasıyla F değeri elde edilir. Elde edilen F

değeri F değeri F tablosundan (α:0,05) okunan değerle kıyaslanır.

21

Çizelge 1.1. Varyans analizi çizelgesi (Anova testi çizelgesi: analysis of varation)

(Dinç, 2009).

1.4.5. Kemometrik Kalibrasyon Yöntemlerinin Uygulamaları

1.4.5.1. Kemometrik Yöntemlerin Uygulama Alanları

Analitik kimyadaki miktar tayini çalışmalarında, kemometrik kalibrasyon yöntemleri

ya da çok değişkenli kalibrasyon yöntemleri IR spektrofotometre, UV- görünür alan

spektrofotometre, spektroflorimetre, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ve

kapiler elektroforez gibi analitik cihazlardan elde dilen analitik veriler

uygulanmaktadır. Analitik kimyanın prensip ve yöntemleri çok değişik komşu

disiplin tarafından kullanılmaktadır. Bu da analitik kimyanın biyoloji, tıp, ziraat, gıda

ve eczacılık gibi alanlarda geniş bir uygulama alanı olduğunu göstermektedir.

Analitik çalışmalarda kemometrik yöntemlerin uygulamaları anorganik analiz,

organik analiz, ilaç analizi, klinik ve biyolojik numunelerin analizi, gıda ve su

analizleri, çevre analizleri ve stabilite tayinleri, çözünme hızı testleri şeklinde

özetlenebilir.

1.4.5.2. Çoklu bileşen analizi (Multicomponent analysis)

Son yıllarda, çoklu bileşen analizi, analitik kimyacılar için en önemli konulardan

birisi oldu. Bu bağlamda, aynı anda miktar tayinlerinin klinik kimyası, ilaç analizi,

kirlilik kontrolü vb. gibi değişik disiplinler ile ilgili aktif bileşikleri içeren

karışımların kantitatif analizi için oldukça kullanışlı olduğu kanıtlanmıştır. Çok

22

değişkenli kalibrasyonların absorbans sinyallerine uygulanmasıyla çok bileşen

analizlerinden elde edilen sonuçların doğruluğu, yöntem ve kullanılan analitik

sinyallere bağlıdır.

23

2. KAYNAK ÖZETLERİ

Erk ve Onur (1997) farmasötik preparatlardaki hidroklorotiazid ve amilorid

hidrokloridi tayin etmek için üç spektrofotometrik yöntem kullanmıştır. Bu

yöntemler sırasıyla Vierordt metodu, modifiye Vierordt yöntemi ve absorbans

oranları yöntemleri olup farmasötik preparata uyguladıklarında hidroklorotiazid için

1,7; 1,6 ve 2,8 standart sapma ile, amilorid hidroklorür için 1,5; 1,8; 2,0 ve 1,6

standart sapma ile tablet analizlerini gerçekleştirmişlerdir.

Ferraro, Castellano ve Kaufman (2002), bu çalışmada amilorid hidroklorid (AMH)

ve hidroklorotiyazid (HCT) içeren ticari tablet preparatları ve sentetik örneklerin

eşzamanlı analizleri için çok değişkenli spektrofotometrik kalibrasyon kullanıldığını

bildirmişlerdir. Kısmi kareler yöntemi (PLS-1), hızlı ve doğru karışım

çözünürlüğünde elektronik soğurma spektral verilerinin analizine önceki ayırma

aşamasına gerek kalmadan ve diğer örnek bileşenlerin müdahalesi olmaksızın ki

burada analit oranı yaklaşık 10:1‟dir. Bu metotta, her iki ilacın sentetik karışımlarının

analizi yapılarak onaylanmıştır,

M.R. Khoshayand et al. (2008), bu çalışmada UV spektrofotometresi kullanarak

ilaçlardaki kafein, parasetamol ve ibiprofen miktarının kemometrik yaklaşımlarla eş

zamanlı tayinini diğer yöntemlere göre basit bir alternatif yöntem olarak

bildirmişlerdir. İBU, CAF ve PAR‟ın doğrusal çalışma aralıkları içerisinde çeşitli

konsantrasyondaki spektrumları kaydedildi ve 200-400 nm arasında 1 nm aralıklarla

metanol : 0,1 HCl (3:1)‟ deki karışımlarının kalibrasyon hesaplanmasında kullanıldı.

Verilerin kemometrik analizinde PLS, PLS(GA-PLS) ve PC-ANN yöntemleri

kullanıldı ve kemometrik prosedürlerin parametreleri optimize edildi. Bu

kemometrik yöntemlerin analitik performansları bağıl tahmin hataları ve geri

kazanım(%) ile karakterize edilmiş ve birbirleriyle karşılaştırılmıştır. Tahmin

kapasite kaybı olmadan dalga boyu seçimi nedeniyle GA-PLS uygulanan diğer çok

değişkenli yöntemlere göre üstünlük göstermektedir. Bileşenler önemli derecede

spektral örtüşme göstermelerine rağmen hiçbir ayırma işlemi gerekmeden eş zamanlı

ve hızlı bir şekilde tespit edilmiştir. Bu üç metot ilaç formülasyonlarına ve kapsüllere

24

yardımcı maddelerin girişimi olmadan başarıyla uygulanmıştır. Önerilen metotlar

basit, hızlı ve ilaçların kalite kontrolünde alternatif araç olarak kolayca uygulanabilir.

Dinç et al. (2008), Bu çalışmada paracetamol, propiphenazone, cafein ve thiamine

içeren dörtlü ilaç karışımlarının kantitatif analizleri eş zamanlı olarak fonksiyonel

dalga boyu dönüşümü (FWT) ile PCR, PLS, ANN metotları uygulanarak

gerçekleştirildi. 22 çözelti karışımı içeren kalibrasyon seti ortogoal deneysel tasarım

vasıtasıyla hazırlandı ve 210,0-312,3 nm spektral aralığındaki absorbsiyon

spektrumları kaydedildi. Daha sonra fonksiyonel dalga boyuna aktarıldı ve FWT ile

işlendi. FWT-PCR, FWT-PLS ve FWT-ANN kemometrik kalibrasyonları FTW

metodu tarafından sağlanan katsayılar ve kalibrasyon setinin konsantrasyon verileri

arasındaki ilişki kullanılarak hesaplandı. Doğrulama işlemi ilgili bileşiklerin sentetik

karışımlarının analizi için geliştirilen yöntemler kullanılarak gerçekleştirilmiş ve

başarılı sonuçlar elde edilmiştir. Modeller son olarak ticari ilaç formülasyonlarına

uygulanmıştır.

Markopoulou et al. (2005), ticari tablet örneklerinde ve sentetik örneklerdeki üçlü

karışımların ön ayırma işlemi gerekmeksizin eş zamanlı tayini için UV double

divisor-ratio spektrum türev yöntemini kullanmışlardır. Metot klorofeniramin tuzu ve

kafeinin parasetamol yada asetilsalisilik asit ile kombinasyonu ve asetilsalisilik asitin

parasetamol ve kafein ile kombinasyonunu içeren üçlü karışımların ölçümüne uygun

çözücüdeki absorbsiyon spektrumları kullanılarak başarıyla uygulanmıştır. Beer

yasasına klorofeniramin için 0,84-4,21 μg/ml, kafein için 1,60-15,96 μg/ml,

asetilsalisilik asit için 2,0-20,0 μg/ml ve parasetamol için 1,58-15,93 μg/ml

konsantrasyon aralıklarında uyulmuştur. Tüm prosedür saf ilaçların sentetik

karışımlarına ve ticari tabletlere içerik benzerliği ve çözünme testleri(USP 24)

kullanılarak uygulanmıştır. metodun kesin ve tekrarlanabilir olduğu bulunmuştur.

Çözünme profili testine göre parasetamol ve kafeinin %84‟ünden fazlası 20 dakika

içinde tamamen çözündü. Asetilsalisilik asidin çözünmesi daha yavaş olup 45-60

dakika içinde tamamen çözündü. PLS ve HPLC metotları sonuçları değerlendirmek

için aynı karışımlara uygulanmıştır. Önerilen metodun sonuçları ile PLS ve HPLC

25

metotlarından elde edilen sonuçlar uyum içinde olup çok bileşenli dozaj formlarının

rutin analizinde kullanıma uygundur.

De Luka et al. (2009), farklı kemometrik metorların tahmin yeteneklerini klasik UV

spektrumlarına ve 1-4 dereceden türev spektrumlarına uygulayarak karşılaştırdılar.

Parasetamol, propiphenazone ve kafein içeren ilaç tabletlerinin spektrum verilerine

PCR, PLS-1 ve PLS-2 kemometrik yöntemleri uygulanmıştır. Çok bileşenli

karışımların analizi için çok değişkenli yöntemler uygulanarak örtüşen spektrumların

çözümünde türevlendirme yetenekleri değerlendirildi. Kemometrik modeller harici

doğrulama veri setinde test edildi ve son olarak iki ya da üç ilaç içeren ticari

tabletlerin analizine uygulandı. Yararlı bilgilerin edinilmesini ya da gereksiz ve

gürültülü verilerin çıkartılmasını sağlayan yeni metodun kalibrasyonunda

kullanılmak üzere seçilen dalga boyu aralığında model optimize edildi. Bu prosedür

çok değişkenli regresyonlardan hesaplanan regresyon katsayıları kullanılarak dalga

boylarının analitik verilerinin değerlendirilmesini sağladı. Üçüncü dereceden türev

spektrumlarından oluşan kalibrasyon modellerinde önemli avantajlar bulundu. Bağıl

standart hatalar %1,4‟ den az olup buna karşın diğer türev çeşitleri yüksek varyans

sergiledi ve kullanımları yanlış sonuçlar verdi.

Katalin et al. (2010), bu çalışmada ticari tabletlerdeki parasetamol, kafein,

klorphenamin ve asprinin spektrofotometrik eş zamanlı analzini PCR ve PLS

kemometrik metotlarıyla gerçekleştirmişlerdir. Özgün örneklerden elde edilen çeşitli

derecede parametreler ve geri kazanım değerleri kuramsal modeller ile gerçek veriler

arasında uyum, doğru ve hassas tahmin göstermiştir. Bahsedilen bu dört aktif

bileşenden en az ikisini içeren sekiz ilaç formülasyonu başarıyla analiz edilmiştir.

Elde edilen verilerin doğruluğu HPLC metoduyla kıyaslanmıştır.

Ragno et al. (2004), bu çalışmada parasetamol, kafein, trifenilamin, salisilamid

içeren çok bileşenli karışımların spektrofotometrik analizleri temel bileşen regresyon

(PCR) ve kısmi en küçük kareler (PLS) yöntemleri kullanarak nitelendirmişlerdir.

Kalibrasyon seti dörtlü, üçlü, ikili ve tek bileşenli karışımları içeren 47 referans

örneğe dayandırılmıştır. Ve bu modelin amacı bir ya da dört komponentten oluşan

26

bileşimi bilinmeyen numunenin konsantrasyonunu önceden belirlemektir. PCR ve

PLS modelleri karşılaştırılmıştır ve onların tahmin performansları sentetik karışımlar

ve ilaç formulasyonlarının testlerinde başarılı uygulamalar gösterilmiştir.

Yongnian ve Gong (1997), bu çalışmada tartrazine, sunset yellow, ponceau 4R,

amaranth ve brilliant blue içeren karışımların kimyasal ön ayırması olmaksızın

spektrofotometrik olarak eş zamanlı analizleri bu metotla yapılmışlardır.

Deneylerden elde edilen veriler, CLS, PCR, PLS ve ITTFA gibi kemometrik

yaklaşımlarla incelenmiştir. Bu işlem sırasında normal absorbans spektrumu ve 1. ve

2. türev spektrumları kullanılmıştır. Renklendiricilerin tamamından oluşan farklı

derişimler içeren 16 sentetik karışımı incelenmiştir. Sonuçların farklı kemometrik

yaklaşımlarla karşılaştırılarak uygulaması sağlanmıştır. ITTFA yönteminin PCR,

PLS ve CLS den daha iyi sonuçlar verdiği gözlenmiştir. Kalibrasyonlar ilk türevlere

dayandırılmıştır. Önerilen metotla, bazı ticari gıda ürünlerindeki renk maddelerinin

belirlenmesi sağlanmıştır.

Dinç ve Üstündağ (2003), bu çalışmada tabletlerde bulunan hidroklorothazin ve

spironolaktonun spektrofotometrik eşzamanlı tayinini yaparak sonuçları, CLS, ILS,

PCR ve PLS ile değerlendirmişlerdir. Kemometrik analiz metotları, ön ayırma

gerektirmez. İlaçların ikisini de içeren 25 standart karışımın çalışma seti, karışım

dizaynına göre 2-20 µg/mL derişim aralığında hazırlanmıştır. Çoklu kalibrasyonlar,

çalışma seti kullanılarak 220 den 290 nm ye kadar 15 noktada zero-order ve ilk türev

absorbansları ölçülmüştür. Çok bileşenli analiz metotlarının validasyonu,

hidroklorothazin ve spironolaktonun sentetik karışımları analiz edilerek

incelenmiştir. Sentetik karışımlar ve tabletlerden elde edile sonuçlar, tekyollu

ANOVA testi ile istatistiksel olarak kıyaslanmıştır. Kemometrik analiz metotları,

farmakolojik tablet formülasyonunda, hidroklorothazin ve spironolaktonun eş

zamanlı tayini için uygun görülmüştür.

Liao vd. (2007), bu çalışmada zayıf asit karışımlarının eş zamanlı tayini için

kemometri ile birleştirilen yeni spektrofotometrik titrasyon metodu geliştirilmiştir.

Bu metotta, titrant olarak sodyum hidroksit-asit/baz indikatörü karışımı

27

kullanılmıştır. İndikatör, titrasyon yöntemini denetlemek için kullanılmıştır.

Titrasyon yönteminde, her bir titrasyon noktasında titrant ve çözünen sitin eklenen

hacimleri, least square algoritmasıyla absorbans spektrumundan simultane olarak

hesaplanmıştır. Sonra karışımdaki her bileşenin derişimleri, PCR ile titrasyon

eğrisinden bulunmuştur. Metot, analitik sonuçların elde edilmesi için bilgi gerektirir

ve hacim ölçümlerinden bağımsızdır. Analizler, titrasyonun son noktasından

bağımsızdır. İndikatör ve asitlerin kararlılık sabitlerinin doğru değerlerini

gerektirmektedir. Metot, mükemmel sonuçlarla benzoik asit, salisilik asit

karışımlarının ve fenol, o-klorofenol ve p-klorofenol karışımlarının eş zamanlı

analizi için uygulanmıştır.

28

3. MATERYAL VE METOT

3.1. Materyal

Bu çalışmada, UV/VIS spektrofotometrisi ile iki bileşenli bir ilaç numunesindeki

aktif maddelerin nicel olarak tayini yapılmıştır. Elde edilen veriler, PCA, PCR ve

PLS gibi kemometrik yöntemlerle değerlendirilmiştir. Spektrofotometrik ölçümlerle

çözücü olarak metanol–su karışımı kullanılarak hidroklorotiazid (HCT) ve

amiloridhidroklorid (AMH) çözeltileri hazırlanıp spektrumları okunmuştur. Bu işlem

için önce tek tek sonra farklı oranlarda hazırlanan sentetik karışımların spektrumları

alınmıştır. Son işlem olarak da ilaç örneğinde ölçümler yapılmıştır. Elde edilen

veriler lisansı elimizde bulunan MİNİTAB 16 istatistik programıyla

değerlendirilmiştir.

3.2. Kullanılan Cihazlar

3.2.1. UV-Görünür Spektrofotometre Cihazı

UV-VIS spektrumları, bilgisayar tarafından kontrol edilen 1cm uzunluğundaki hücre

ile donatılan UV 1700 PHARMASPEC SHİMADZU spektrofotometresi kullanılarak

not edilen spektrum değerleri ilaç tabletlerindeki HCT ve AMH miktarını belirlemek

için kemometrik metotlara uygulanmıştır.

3.3 Kullanılan Kimyasal Maddeler

Deneylerde analitik saflıkta olan kimyasallar kullanılmıştır. Bu kimyasallar Çizelge

3.1‟de verilmiştir.

29

Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan kimyasallar.

Bileşiğin Adı Bileşiğin Formülü

Hidroklorotiazid

Amiloridhidroklorid

Metanol MeOH

Su, 0.05 S. cm-1

den düşük kondüktiviteye sahip, Milli – Q su arıtma (Millipore

Corp.) sisteminden sağlanmıştır.

3.3.1 Kullanılan Çözeltiler

Çalışmada spektrofotometrik ölçümler için HCT ve AMH maddelerinin 500 ppm

olacak şekilde stok çözeltileri hazırlanmıştır.

Stok Hidroklorotiazid Çözeltisi : Hidroklorotiazid maddesinden 0,0631g tartılarak

bir miktar metanol – su karışımında çözüldükten sonra son hacim 250 mL‟ye

tamamlanmıştır.

Stok Amiloridhidroklorid Çözeltisi : Amiloridhidroklorid maddesinden 0,0624g

tartılarak bir miktar metanol – su karışımında çözüldükten sonra son hacim 250 mL‟

ye tamamlandı.

Analiz edilen bileşiklerin ticari preparatı : MODURETİC (Tablet)

Hidroklorotiazid:…………… 50 mg

Amiloridhidroklorid :……..... 5 mg

30

Ticari numune

Moduretic

Ticari olarak satın alınan Modeuretic‟den 20 tablet havanda ezilip 1 tablet ağırlığına

karşılık gelen 0,6571g tartılmıştır. Bir miktar metanol – su karışımı ilave edilip yarım

saat manyetik karıştırıcıda karıştırılmış ve son hacim 100 mL‟ye tamamlanmıştır.

Çözelti daha sonra süzülüp süzgeç kâğıdında kalan kısım 3 kez 10 mL metanol - su

ile yıkanmış ve hacim 100 mL‟ ye tamamlanıp daha sonra çalışılacak olan aralığa

seyreltilmiştir.

3.4. Yöntem

3.4.1. UV/VIS Spektroskopisi Yöntemi

Bu çalışmada, spektrofotometrik ölçümlerle ilaç aktif maddelerinin stok

çözeltilerinin spektrumları okunmuştur. Bu işlem için önce tek tek sonra farklı

oranlarda hazırlanan sentetik karışımların spektrumları alınmıştır. Son işlem olarak

da ilaç örneklerinde ölçümler yapılmıştır. Elde edilen veriler, farklı kemometrik

yöntemlerle değerlendirilmiştir. İlk basamakta, UV spektrofotometre cihazının

kalibrasyonu (sıfırlama işlemi) yapılmıştır. Kalibrasyon işlemi önce her iki hücre

boş bırakılarak havaya karşı yapılmıştır. Sonra aynı işlem bu kez her iki ışık yoluna

metanol – su ile hazırlanan kör numunesi konularak yapılmıştır. Bütün okumalarda

hep kör bu şekilde hazırlanmıştır. Kör olarak sadece metanol – su kullanılmasının

nedeni bu çalışmada genel olarak çözücümüz metanol- su karışımı olduğu içindir.

Kör seçimi yapılırken girişim etkilerini yok etmek için, kör olarak çözücü tercih

edilmiştir. İkinci basamakta, saf ilaç aktif maddelerinin tek tek spektrumları

alınmıştır. Bu işlem esnasında stok ilaç aktif maddelerinden derişimleri 0,5- 35 ppm

arasında olacak şekilde 0,5-2,0 mL arasında saf maddeler stoklardan alınarak toplam

hacim 25 mL ye tamamlanarak çözeltileri hazırlanmış ve UV spektroskopisinde

absorbans okumaları yapılmıştır. Üçüncü basamakta, her bir madde ayrı bir dalga

boyunda maksimum verdiğinden saf ilaç maddelerinden oluşturulan sentetik

karışımların UV spektroskopisinde absorbans okumaları yapılmış ve birbiri yanında

herhangi bir ön ayırma işlemine gerek olmaksızın ilaç aktif maddeleri incelenmiştir.

Son basamakta ise, piyasada satılan ilaç numunesindeki ilaç aktif maddelerinin

çözeltileri incelenmiştir.

31

4. ARAŞTIRMA BULGULARI

Kemometrik kalibrasyonların HCT ve AMH bileşiklerinin analizine uygulamasında

üç farklı kemometrik yöntem geliştirilmiştir. Bunlar PCA, PCR ve PLS kalibrasyon

yöntemleridir. Kemometrik yöntemlerin uygulaması için spektral koşullar

optimizasyonu ve optimal kalibrasyon setinin hazırlanması için ön çalışmalar

yapılmıştır.

Saptanan spektral koşullarda kalibrasyon setinin ve numunelerin 200-400 nm dalga

boyu aralığında absorbsiyon spektrumları alınmış ve kemometrik kalibrasyonlar 255-

385 nm dalga boyu bölgesindeki bütün absorbans değerlerinin vektörel ölçümleri

kullanılarak elde edilmiştir. Kemometrik algoritmalarla hesaplanan PCA, PCR ve

PLS kalibrasyonları yapay ve farmosötik numunenin analizine uygulanmıştır.

4.1. UV Spektroskopisi

Önce her bir renk maddesinin saf halde 500 ppm standart çözeltileri hazırlanmıştır.

Daha sonra 0,05-3,5 mL arasında saf maddeler stoklardan alınarak toplam hacim 25

ml‟ye tamamlanmıştır. Bu işlem sonrası absorbanslar ölçülerek kaydedilmiştir. Her

bir ilaç maddesinin derişimleri ppm olarak hesaplanmış ve absorbanslardan

yaralanılarak molar absorpsiyon katsayıları belirlenmiştir.

Çizelge 4.1. İlaç aktif maddelerinin spektroskopik özellikleri

İlaç Aktif

Maddesi

Mak. Abs.

Yaptığı

Dalgaboyu

Molar

Absorpsiyon

Katsayısı

Kalibrasyon

Denklemi

Korelasyo

n

Katsayısı

Hidroklorotia

zid (HCT)

272 nm 58.103 y = 0,0599x –

0,0143

0,9969

Amiloridhidro

klorid (AMH)

363 nm

70.103 y = 0,0597x –

0,0457

0,9988

Her bir ilaç aktif maddesinin önce tek tek spektrumları alınmıştır. Bu spektrumlar

alınırken derişim aralıkları HCT için 5 – 35 ppm ve AMH için ise bu değerler 0,5 -

3,5 ppm arasındadır. Bu derişim aralıkları tayini yapılan her bir aktif madde için

lineer doğrusallığın olduğu bölgelerdir.

32

4.1.1. Saf halde HCT ve AMH’ın spektrumları

HCT ve AMH maddeleri Çizelge 4.1‟de de görüldüğü üzere ayrı dalga boylarında

maksimum absorbans vermektedirler. Bu özellikten yararlanılarak bir sonraki

aşamada bu iki etken maddenin sentetik karışımları hazırlanmış ve bunlar birbiri

yanında herhangi bir ön ayırma işlemi yapmaksızın tayin edilmişlerdir. HCT ve

AMH ilaç aktif maddeleri sürekli spektrum göstermekte ve üst üste örtüşen

spektrumlar gözlenmektedir.

Şekil 4.1. HCT maddesinin absorpsiyon spektrumu

Şekil 4.2. AMH maddesinin absorpsiyon spektrumu

33

Kemometrik kalibrasyonların HCT ve AMH bileşiklerinin analizine uygulamasında

üç farklı kemometrik yöntem geliştirilmiştir. Bunlar PCA, PCR ve PLS kalibrasyon

yöntemleridir. Kemometrik yöntemlerin uygulaması için spektral koşullar

optimizasyonu ve optimal kalibrasyon setinin hazırlanması için ön çalışmalar

yapılmıştır. Saptanan spektral koşullarda kalibrasyon setinin ve numunelerin 200-400

nm dalga boyu aralığında absorbsiyon spektrumları alınmış ve kemometrik

kalibrasyonlar 255-385 nm dalga boyu bölgesindeki bütün absorbans değerlerinin

vektörel ölçümleri kullanılarak elde edildi. Kemometrik algoritmalarla hesaplanan

PCA, PCR ve PLS kalibrasyonları yapay ve farmosötik numunenin analizine

uygulanmıştır.

4.2. Kalibrasyon setinin hazırlanması

Kemometrik kalibrasyonlar için metanol – su içerisinde HCT için 5-35 μg/mL ve

AMH için 0,5-3,5 μg/mL derişim aralığında her iki bileşiği içeren 28 değişik

kompozisyonda simetrik bir kalibrasyon seti hazırlanmıştır. Çizelge 4.1. de

hazırlanan kalibrasyon seti sunulmaktadır.

Çizelge 4.1. HCT ve AMH analizi için kalibrasyon seti

Kalibrasyon seti

Derişim (µg/mL) Derişim (µg/mL)

No HCT AMH No HCT AMH

1 5 0,5 15 15 1

2 5 1 16 15 1,5

3 5 1,5 17 15 2

4 5 2 18 15 2,5

5 5 2,5 19 20 0,5

6 5 3 20 20 1

7 5 3,5 21 20 1,5

8 10 0,5 22 20 2

9 10 1 23 25 0,5

10 10 1,5 24 25 1

11 10 2 25 25 1,5

12 10 2,5 26 30 0,5

13 10 3 27 30 1

14 15 0,5 28 35 0,5

34

Kalibrasyonlar için rastgele kalibrasyon seti yerine simetrik kalibrasyon seti tercih

edilmiştir. Bunun sebebi analiz esnasında meydana gelebilecek kalibrasyon hatalarını

minimize etmektir. Çizelge 4.1. deki simetrik kalibrasyon setinin iki boyutlu

düzlemdeki projeksiyon grafiği Şekil 4.3 de görülmektedir.

Şekil 4.3. Simetrik kalibrasyon setinin iki boyutlu düzlemdeki grafiği

4.3. Spektral Koşulların Optimizasyonu

Spektrofotometrik çalışmalarda HCT ve AMH için metanol – su karışımının uygun

çözücü olduğu saptanmıştır. Metanol – su karışımı içerisinde HCT ve AMH

bileşikleri ile karşılık gelen karışımının 200-400 nm dalga boyu aralığında

spektrumları alındı (Şekil 4.4.). Şekil 4.4. den de görüldüğü gibi her iki bileşik aynı

dalga boyu aralığında girişim yapmaktadır. Bu nedenle klasik spektroskopik

yaklaşımlarla her iki bileşiğin aynı anda miktar tayinleri mümkün değildir.

35

Şekil 4.4. HCT (5 μg/mL) ve AMH (2,5 μg/mL) ile iki bileşiğe karşılık gelen

karışımın absorpsiyon spektrumları (Metanol – su içerisinde).

4.3.1. Temel Bileşen Analizi (PCA)

Sentetik çözeltilerde hesap yaparken programın kendi içinde ilk yaptığı işlem temel

bileşen analizi yapmaktır. Temel bileşen analizi uygulanmasının amaçları, bir orijinal

değişkeni temsil eden n sayıda orijinal aksı (doğruyu) yeni akslar haline

dönüştürmektir. Bu dönüşüm işleminde yeni akslar, verilerin maksimum varyans

yönelimleri boyunca uzanır ve yeni aksların özelliği, ortogonal olmalarıdır ve bu

yeni değişkenler arasında korelasyon yoktur. Numune verilerinin varyansının çoğunu

açıklamak için ihtiyaç olan yeni değişkenlerin sayısı (p), n sayıdaki orijinal akslardan

daha azdır. Temel bileşen analizi, çok değişkenli verilerin boyutunu indirgemek veya

verileri azaltmak için bir yöntem olarak kabul edilir. Aynı zamanda değişkenlerin

doğrusal bileşenlerini ortaya çıkarır.

36

0,80,70,60,50,40,30,20,10,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

-0,2

-0,4

-0,6

-0,8

First Component

Se

co

nd

Co

mp

on

en

t

C2

C1

Loading Plot of C1; ...; C2

Şekil 4.5. Değişkenlerin doğrusal bileşenleri

Şekil 4.5. e bakıldığında programa yüklediğimiz verilerden birinci temel aks ve

ikinci temel aks üzerinden doğrusal bileşenler bulunmuştur. İşlemlerin doğruluğu

ölçüsünde doğrusal bileşenler elde edilmiştir. Bu grafik varyans-kovaryans

matrisinin elemanlarının orijinin merkezine olan büyük aks birinci temel bileşeni

(C1) ve bu bileşene 45 ºC lik açı ile ikinci temel bileşen (C2) uzanmaktadır. Bir kare

matris için, varyans-kovaryans matrisinin elemanları koordinat sisteminin orijini

boyunca uzanır. Büyük aksın eğimi, birinci temel bileşen ile birleştirilmiş özvektör

(eigenvector)dür. Bu “özvektöre” karşılık gelen “özdeğer” (eigenvalue) Şekil 4.5.

deki büyük aksın uzunluğudur. Şekil 4.6. de özdeğerlerin grafiği görülmektedir.

Özdeğerlerin simetrik bir veri matrisinden çıkarılması kısmi en küçük kareler

yöntemi ve temel bileşen analizi için önemlidir. Özdeğerler ve özvektörler elde

edildikten sonra yapılacak işlem diğer kemometrik hesaplamalara geçiştir. Temel

bileşen analizi ile elde edilen temel bileşenler yardımıyla oluşturulan korelasyon

matrisi diğer kemometrik regresyonlara (PLS, PCR… ) ışık tutmaktadır.

37

2624222018161412108642

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

Component Number

Eig

en

va

lue

Scree Plot of C3; ...; C29

Şekil 4.6. Kemometrik verilerden elde edilen özdeğerlerin grafiği

Şekil 4.6. de belirgin bir şekilde görüldüğü gibi özdeğerler 1. değerden 2. değere

doğru düşmüştür. İlk iki faktör, toplam varyansın % 99‟undan daha fazla

güvenilirdir.

4.3.2. Temel Bileşen Regresyonu Yöntemi (PCR)

PCR yöntemi kalibrasyon seti için ölçülen absorbans matrisinin parçalanmasıyla elde

edilen temel bileşen regresyonuna dayalı bir yöntemdir. Yöntemin algoritması

Bölüm 1.4.1.2. de ayrıntılı olarak verilmiştir.

PCR kalibrasyon için hazırlanan kalibrasyon setinin 255 – 385 nm dalga boyu

aralığında Δλ= 0,1 nm aralıklarla absorbans değerleri okunmuştur. Bölüm 1.4.1.2. de

açıklanan PCR algoritmasına göre kalibrasyon setinin absorbans ve derişim

değerlerinin varyans-kovaryans matriksleri hesaplanmıştır. Kalibrasyon seti için

absorbansların varyans-kovaryans matriksinin dekompozisyon işlemine tabi

38

tutulmasından sonra derişimleri arasındaki matematiksel ilişkiye dayalı PCR

kalibrasyonu kurulmuştur. İlaç aktif maddelerini içeren karışımların yukarıda

belirtilen dalga boylarındaki absorbans değerleri okunarak PCR kalibrasyonunda bu

etken maddelerin miktar tayinleri gerçekleştirilmiştir. PCR kalibrasyonu için Minitab

16 programında ilk olarak PCA değerleri hesaplanarak aşağıdaki çıktı elde edilmiştir.

Eigenanalysis of the Covariance Matrix

Eigenvalue 1,0025 0,0164 0,0001 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000

Proportion 0,984 0,016 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

Cumulative 0,984 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000

Variable PC1 PC2 PC3 PC4 PC5 PC6 PC7 PC8 PC9

C3 0,163 0,017 -0,193 0,153 0,327 -0,216 -0,297 0,227 -0,312

C4 0,276 -0,042 -0,039 0,280 0,448 -0,032 0,417 0,233 0,128

C5 0,418 -0,115 0,094 0,288 0,076 0,089 -0,120 0,090 -0,030

C6 0,520 -0,157 0,166 0,133 0,016 0,192 0,106 -0,192 0,064

C7 0,501 -0,095 0,123 -0,107 -0,289 -0,217 -0,163 -0,125 -0,108

C8 0,331 0,074 0,085 -0,461 -0,263 0,020 0,105 -0,087 0,028

C9 0,164 0,220 0,034 -0,390 0,198 -0,240 -0,279 0,361 0,155

C10 0,094 0,252 0,014 -0,313 0,322 -0,080 -0,131 -0,118 0,065

C11 0,073 0,167 -0,161 -0,244 0,253 0,303 0,137 -0,027 0,085

C12 0,066 0,048 -0,329 -0,167 0,228 0,072 0,156 -0,270 -0,140

C13 0,070 0,000 -0,397 -0,051 0,139 -0,003 0,101 -0,311 -0,025

C14 0,078 -0,009 -0,352 0,062 -0,181 0,030 -0,083 -0,021 -0,056

C15 0,085 -0,003 -0,319 0,057 -0,138 0,050 0,137 0,113 0,011

C16 0,086 0,015 -0,299 0,012 -0,179 -0,041 -0,004 0,219 0,541

C17 0,080 0,044 -0,272 0,033 -0,207 -0,023 -0,106 0,047 -0,191

C18 0,070 0,080 -0,221 0,023 -0,200 0,201 0,152 0,204 -0,202

C19 0,053 0,130 -0,183 -0,009 -0,164 0,138 -0,008 0,127 0,162

C20 0,035 0,187 -0,110 -0,025 -0,089 0,171 -0,135 0,186 -0,297

C21 0,026 0,244 0,001 0,208 0,086 0,415 -0,460 -0,296 0,078

C22 0,025 0,288 0,045 0,313 -0,057 -0,038 -0,189 0,019 0,350

C23 0,028 0,327 0,098 0,067 -0,073 0,289 -0,017 0,247 -0,167

C24 0,029 0,347 0,139 0,003 -0,114 0,043 0,332 0,089 0,166

C25 0,029 0,347 0,146 0,070 -0,009 0,061 0,104 -0,320 -0,021

C26 0,027 0,329 0,120 0,135 -0,068 -0,231 0,222 0,035 -0,235

C27 0,024 0,287 0,039 0,059 0,062 -0,160 0,049 -0,010 -0,141

C28 0,018 0,216 -0,076 0,149 -0,122 -0,354 0,139 -0,152 -0,132

C29 0,010 0,126 -0,228 0,171 -0,046 -0,370 -0,095 -0,269 0,220

Variable PC10 PC11 PC12 PC13 PC14 PC15 PC16 PC17

C3 -0,279 0,225 -0,078 0,043 0,123 0,152 -0,331 -0,063

C4 0,153 -0,177 0,327 0,079 -0,036 -0,073 -0,252 -0,113

C5 -0,314 -0,301 -0,209 -0,003 -0,326 -0,086 0,473 -0,113

C6 0,142 0,531 -0,183 0,016 0,032 0,059 0,001 0,127

39

C7 0,103 -0,183 0,179 -0,141 0,401 -0,023 -0,034 0,305

C8 -0,035 -0,157 0,078 0,229 -0,307 -0,081 -0,310 -0,453

C9 0,219 0,150 0,006 -0,143 -0,125 0,047 0,206 0,068

C10 -0,106 -0,091 0,089 -0,123 0,002 0,086 0,001 0,000

C11 -0,037 -0,035 -0,326 0,208 0,095 -0,266 -0,179 0,370

C12 -0,003 -0,149 0,060 -0,176 0,054 0,032 0,228 0,021

C13 0,156 -0,120 -0,096 0,059 0,106 0,098 0,270 -0,056

C14 -0,003 0,091 0,307 0,522 0,083 0,147 0,135 -0,013

C15 0,118 0,038 -0,067 -0,582 -0,094 0,117 -0,062 -0,222

C16 -0,313 -0,060 0,018 0,131 0,123 0,219 -0,028 0,113

C17 -0,216 -0,210 -0,338 -0,094 0,132 -0,042 -0,235 -0,086

C18 0,174 0,148 0,173 -0,186 -0,056 -0,083 -0,145 0,089

C19 0,085 0,172 0,123 -0,038 -0,077 0,114 0,243 -0,007

C20 0,209 0,120 -0,239 0,186 -0,086 -0,204 0,098 -0,124

C21 0,135 -0,120 0,153 -0,036 -0,102 0,043 -0,234 -0,005

C22 0,393 -0,221 -0,217 0,019 0,142 0,049 -0,081 -0,123

C23 -0,239 -0,092 0,374 -0,072 -0,016 -0,169 0,130 0,255

C24 -0,210 0,106 -0,276 -0,024 0,144 -0,016 0,030 0,025

C25 -0,346 0,199 0,119 -0,156 0,058 0,285 -0,032 -0,170

C26 0,137 -0,216 -0,009 0,064 0,301 -0,090 0,121 -0,058

C27 0,083 0,216 -0,006 0,219 0,065 0,134 0,155 -0,249

C28 0,080 -0,084 -0,101 0,079 -0,598 0,263 -0,142 0,490

C29 -0,133 0,267 0,135 -0,084 -0,101 -0,712 0,011 -0,049

Variable PC18 PC19 PC20 PC21 PC22 PC23 PC24 PC25

C3 -0,339 -0,208 0,144 0,083 -0,161 -0,074 -0,004 -0,091

C4 0,323 -0,097 -0,079 0,046 0,075 0,025 0,076 -0,082

C5 -0,130 0,132 0,105 0,104 0,144 0,143 0,031 0,011

C6 -0,045 0,097 -0,303 -0,226 -0,174 -0,130 -0,073 0,066

C7 0,187 -0,119 0,310 0,081 0,060 0,097 0,070 -0,066

C8 -0,193 -0,083 0,033 0,031 -0,126 -0,151 -0,029 0,039

C9 0,085 0,008 -0,272 0,294 0,209 -0,109 -0,197 0,145

C10 -0,063 0,269 -0,054 -0,569 0,018 0,268 0,185 -0,334

C11 -0,118 -0,079 0,231 0,053 0,206 0,136 0,089 0,355

C12 0,069 -0,085 -0,110 0,137 -0,308 0,025 -0,180 0,022

C13 -0,108 0,017 0,058 0,062 0,063 -0,444 0,104 -0,154

C14 -0,082 -0,096 -0,152 -0,175 0,419 0,218 -0,312 -0,019

C15 -0,039 -0,148 0,237 -0,292 0,085 0,174 -0,304 0,265

C16 0,105 0,280 0,004 0,032 -0,398 0,086 0,020 0,170

C17 0,362 0,102 -0,412 -0,037 0,167 -0,247 0,093 -0,035

C18 -0,268 0,562 0,019 0,251 0,170 0,049 0,205 -0,190

C19 -0,078 -0,402 0,031 0,126 -0,181 0,026 0,464 -0,196

C20 0,383 -0,137 -0,017 -0,117 -0,220 0,318 0,153 -0,073

C21 0,096 0,098 0,026 0,264 -0,165 0,077 -0,300 -0,093

C22 -0,222 -0,093 -0,000 -0,184 0,152 -0,154 0,160 0,037

C23 -0,019 -0,114 -0,008 -0,322 -0,076 -0,468 -0,064 0,142

C24 0,030 -0,122 0,115 0,127 0,089 -0,002 -0,398 -0,576

C25 0,102 -0,118 -0,142 0,205 0,288 0,151 0,301 0,268

40

C26 -0,333 0,078 -0,300 0,084 -0,290 0,246 -0,089 0,208

C27 0,299 0,359 0,503 -0,036 -0,039 -0,203 -0,027 0,185

C28 0,045 -0,048 0,007 -0,041 -0,044 0,001 -0,002 -0,011

C29 -0,000 0,000 0,000 -0,000 -0,000 -0,000 -0,000 -0,000

Variable PC26 PC27

C3 0,005 0,090

C4 -0,056 -0,036

C5 0,038 -0,017

C6 0,029 -0,040

C7 -0,026 0,052

C8 0,019 0,046

C9 -0,064 0,009

C10 -0,016 -0,111

C11 0,034 -0,160

C12 0,559 0,292

C13 -0,548 0,058

C14 0,096 -0,020

C15 -0,150 -0,113

C16 -0,145 0,162

C17 0,158 -0,303

C18 0,089 0,170

C19 0,176 -0,473

C20 -0,240 0,366

C21 -0,129 -0,221

C22 0,291 0,327

C23 -0,055 0,099

C24 -0,004 0,042

C25 -0,124 0,231

C26 -0,169 -0,265

C27 0,227 -0,221

C28 -0,006 0,009

C29 0,000 0,000

Bu çizelge ilk üç esas bileşenin absorbansdaki değişmenin %99,99 kadarından

sorumlu olduğunu göstermektedir. Bu nedenle regresyon işlemi bu üç bileşen esas

alınarak yapılabilir. Ancak yaptığımız bu çalışmada diğer bileşenleri de işin içine

katarak bir regresyon eşitliği türettik. Türetilen regresyon eşitlikleri aşağıda

verilmiştir.

CHCT = 3,70336 + 10,7889 Z1 - 3,24774 Z2 + 25,5205 Z3 - 20,6816 Z4 + 154,421

Z5

- 342,915 Z6 + 199,964 Z7 - 162,13 Z8 + 99,4124 Z9 + 733,678 Z10 + 1184,9 Z11 +

1166,63 Z12 + 1073,46 Z13 -1912,33 - 888075 Z14 + 1,66204e+006 Z15 -

41

1,32722e+006 Z16 + 1,35413e+006 Z17 + 2,00751e+006 Z18 - 892930 Z19 +

633695 Z20 – 573625 Z21 + 1,34236e+006 Z22 - 1,85106e+006 Z24 + 895718 Z27

CAMH = 1,6906 + 0,364229 Z1 + 4,43811 Z2 + 3,56847 Z3 - 48,7075 Z4 - 43,332

Z5

- 18,775 Z6 - 60,843 Z7 - 102,368 Z8 - 44,3312 Z9 - 10,7868 Z10 - 58,3336 Z11 -

83,6196 Z12 - 185,796 Z13 -1469,44 - 411359 Z14 + 204518 Z15 + 348373 Z16 -

208636 Z17 - 91965,9 Z18 + 44143,8 Z19 + 244677 Z20 + 166124 Z21 - 95249,7

Z22 + 266871 Z24 - 200188 Z27

4.3.2.1. Kalibrasyon Yönteminin Validasyonu

PCR yöntemini valide etmek için HCT için 5-35 μg/mL ve AMH için 0,5-3,5 μg/mL

çalışma aralığı içinde olacak şekilde farklı derişimlerde 14 adet yapay karışım

çözeltisinden ibaret olan bir set hazırlanmıştır. Hazırlanan bu validasyon seti (çizelge

4.2.) kullanılarak kurulan PCR kalibrasyonun kesinlik ve doğruluğu test edilmiştir.

Geri kazanım (GK) değerleri; HCT için % 100,08 ve AMH için % 99,61 olarak

bulunmuştur. Standart sapma değerleri HCT için % 1,72 AMH için ise % 0,56 olarak

hesaplanmıştır. PCR kalibrasyon yönteminin sentetik karışımlara uygulanması ile

elde edilen sonuçlar Çizelge 4.2. de gösterilmiştir.

Çizelge 4.2. HCT ve AMH sentetik karışımlarına PCR kalibrasyon yönteminin

uygulanması ve elde edilen geri kazanım değerleri

Karışım (µg/mL) Bulunan (µg/mL) Geri kazanım (%)

HCT AMH HCT AMH HCT AMH

5 3,2 4,94 3,19 98,80 99,69

10 3,2 10,01 3,19 100,10 99,69

15 3,2 15,06 3,20 100,40 100,00

20 3,2 20,15 3,18 100,75 99,38

25 3,2 24,98 3,20 99,92 100,00

30 3,2 30,02 3,20 100,07 100,00

35 3,2 34,99 3,19 99,97 99,69

8 0,5 8,05 0,49 99,80 98,00

8 1,0 7,78 0,99 97,25 99,00

8 1,5 8,01 1,49 100,13 99,33

8 2,0 8,15 2,00 101,88 100,00

8 2,5 8,22 2,50 102,75 100,00

8 3,0 8,21 3,00 102,63 100,00

8 3,5 7,74 3,49 96,75 99,71

X 100,08 99,61

SS 1,72 0,56

42

4.3.2.2. PCR yöntemi için ANOVA testi

PCR kalibrasyon yönteminin doğruluk ve kesinliğini valide etmek amacıyla elde

edilen sonuçlara ANOVA testi uygulanmıştır. Gruplar arası serbestlik derecesi=1,

grup içi serbestlik derecesi=27 % 95 güven aralığında F-tablo değeri 4,22 olmasına

karşılık HCT için hesaplanan F-test değeri 3,7.10-5

ve p-değeri 0,99 ve AMH için

hesaplanan F-test değeri 3,12.10-4

ve p-değeri 0,98 olarak bulunmuştur.

ANOVA testinde F-hesaplanan< F-tablo ve p-değeri> p=0,05 olduğu için % 95 güven

aralığında elde edilen sonuçlar arasında anlamlı bir fark olmadığı bulunmuştur.

Varyans analizinde iki serbestlik derecesi kullanılır. Gruplar arası serbestlik

derecesi=1 Grup içi serbestlik derecesi=27. F-hesaplanan< F-tablo ve p-değeri> p=0,05

olduğu için bu kalibrasyon modeli ticari numunenin incelenmesinde kullanılabilir

olduğuna karar verilmiştir.

4.3.2.3. PCR yönteminde istatistiksel analiz

HCT ve AMH içeren karışımlarda bu maddelerin miktar tayini için PCR

kalibrasyonun kurulmasında çapraz validasyon işleminde tahmin edilen hataların

karelerinin toplamının (Predicted Resudiual Error Some of Squares→ PRESS)

minimal değerleri elde edilmiştir. Kurulan PCR kalibrasyonunda PRESS değeri HCT

ve AMH için sırasıyla 0,2643 ve 0,0900 olarak hesaplanmıştır. PRESS değerinin

sıfıra yakın olması doğruluk derecesini arttırmaktadır. Elde edilen PRESS değerleri

yeterince küçüktür.

Kalibrasyonun standart hatası (Standard error of calibration →SEC), gerçek ve

tahmin edilen derişimler arasındaki ilişkiye dayalı olarak hesaplandı ve HCT ve

AMH için sırasıyla 0,01888 ve 0,08018 olarak bulunmuştur. Gerçek ve tahmin edilen

derişim için lineer regresyon analiz sonuçları HCT için Şekil 4.7‟de ve AMH için

Şekil 4.8‟de verilmiştir.

43

Şekil 4.7. PCR kalibrasyon basamağında HCT için gerçek ve tahmin edilen

derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar.

Şekil 4.8. PCR kalibrasyon basamağında AMH için gerçek ve tahmin edilen

derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar.

4.3.2.4. PCR Yönteminin Farmasotik Preparatlara Uygulanması

PCR yönteminin farmasotik preparata uygulanmasında 20 tablet doğru bir şekilde

tartılmıştır. Havanda iyice toz edildikten sonra Moduretic için 1 tablete karşılık gelen

miktar olan 0,2480g tartılarak 100 mL‟lik balon jojede üzerine bir miktar metanol –

44

su eklenerek yarım saat manyetik karıştırıcıda karıştırılmış ve son hacim 100 ml‟ ye

tamamlanmıştır. Çözelti daha sonra süzülüp süzgeç kâğıdında kalan kısım 3 kez 10

mL metanol –su ile yıkandı ve hacim 100 mL‟ ye tamamlanıp daha sonra çalışılacak

olan aralığa seyreltilmiştir. Bu analiz çözeltilerinin 220- 265 nm dalga boyu

bölgesinde Δλ= 1,0 nm aralıklarla ölçülen absorbans değerleri Bölüm 1.4.1.2. de

açıklanan PCR algoritması uygulanmış ve tablet içeriğindeki HCT ve AMH

hesaplandı. Bu işlem 5 kez tekrarlanmıştır.

Yukarıda açıklanan tablet analiz işlemi MODURETİC Tablet preparatı için ayrı ayrı

tekrar edilmiştir. Sonuçlar Çizelge 4.3‟de verilmiştir.

Çizelge 4.3. MODURETİC Tablet preparatına PCR yönteminin uygulanmasıyla elde

edilen sonuçlar.

MODURETİC

Deney No HCT AMH

1 49,99 4,99

2 49,99 4,99

3 49,99 4,99

4 49,99 4,98

5 49,99 4,97

6 49,98 4,97

X = 49,99 4,98

4.3.3. Kısmi en küçük kareler yöntemi (PLS)

Bölüm 1.4.1.3‟de ayrıntılı olarak algoritması verilen kısmi en küçük kareler

yönteminde Çizelge 4.2‟ye göre hazırlanan kalibrasyon seti kullanılmıştır. Ölçümler

200–350 nm arasında yapılmıştır. Daha sonra aralık kalibrasyon seti için ve

kullanılacak olan istatistik programı doğrultusunda dalga boyu aralığı 255 – 385 nm

olarak daraltılmıştır. 255; 260; 265; 270; 275; 280; 285; 290; 295; 300; 305; 310;

315; 320; 325; 330; 335; 340; 345; 350; 355; 360; 365; 370; 375; 380 ve 385 e

karşılık gelen 27 noktada absorbans okunmuştur. PLS kalibrasyon için hazırlanan

kalibrasyon setinin 255-385 nm dalga boyu aralığında Δλ= 0,1 nm aralıklarla

absorbanslar okunmuştur. Kullanılan istatistik program ile kalibrasyon setinin

absorbans ve derişim değerlerinin varyans-kovaryans matriksleri hesaplanmıştır.

45

Derişimler arasındaki matematiksel ilişkiye dayalı PLS kalibrasyonu kurulmuştur.

İlaç aktif maddelerini içeren ticari farmasotik preparatda yukarıda belirtilen dalga

boylarındaki absorbans değerleri okunarak PLS kalibrasyonunda bu maddelerinin

miktar tayinleri gerçekleştirilmiştir.

4.3.3.1. Kalibrasyon Yönteminin Validasyonu

PLS yöntemini valide etmek için HCT için 5-35 μg/mL ve AMH için 0,5-3,5 μg/mL

çalışma aralığı içinde olacak şekilde farklı derişimlerde 14 adet yapay karışım

çözeltisinden ibaret olan bir set hazırlanmıştır. Hazırlanan bu validasyon seti

(Çizelge 4.2.) kullanılarak kurulan PLS kalibrasyonun kesinlik ve doğruluğu test

edilmiştir. Geri kazanım (GK) değerleri; HCT için % 100,58 AMH için % 100,82

olarak bulunmuştur. Standart sapma değerleri HCT için %6,99 AMH için % 2,20

olarak hesaplanmıştır. PLS kalibrasyon yönteminin sentetik karışımlara uygulanması

ile elde edilen sonuçlar Çizelge 4.4. de verilmiştir.

Çizelge 4.4. HCT ve AMH sentetik karışımlarına PLS kalibrasyon yönteminin

uygulanması ve elde edilen geri kazanım değerleri

Karışım (µg/mL) Bulunan (µg/mL) Geri kazanım (%)

Karışım (µg/mL) Bulunan (µg/mL) Geri kazanım (%)

HCT AMH HCT AMH HCT AMH

5 3,2 5,64 3,17 112,80 99,06

10 3,2 9,67 3,15 96,70 98,44

15 3,2 15,21 3,19 101,40 99,69

20 3,2 19,70 3,23 98,50 100,94

25 3,2 24,97 3,17 99,88 99,06

30 3,2 29,50 3,26 98,33 101,88

35 3,2 35,49 3,19 101,40 99,69

8 0,5 8,22 0,45 102,75 102,75

8 1,0 8,06 1,03 100,75 103,00

8 1,5 7,49 1,58 93,63 105,33

8 2,0 7,78 2,03 97,25 101,50

8 2,5 8,22 2,48 102,75 99,20

8 3,0 9,20 3,10 115,00 103,33

8 3,5 6,96 3,42 87,00 97,71

X 100,58 100,82

SS 6,99 2,20

46

4.3.3.2. PLS yöntemi için ANOVA testi

PLS kalibrasyon yönteminin doğruluk ve kesinliğini valide etmek amacıyla elde

edilen sonuçlara ANOVA testi uygulanmıştır. Gruplar arası serbestlik derecesi=1,

grup içi serbestlik derecesi=27 % 95 güven aralığında F-tablo değeri 4,22 olmasına

karşılık HCT için hesaplanan F-test değeri 4,67.10-6

ve p-değeri 0,998 ve AMH için

hesaplanan F-test değeri 9,71.10-5

ve p-değeri 0,992 olarak bulunmuştur.

ANOVA testinde F-hesaplanan< F-tablo ve p-değeri> p=0,05 olduğu için % 95 güven

aralığında elde edilen sonuçlar arasında anlamlı bir fark olmadığı bulunmuştur.

Varyans analizinde iki serbestlik derecesi kullanılır. Gruplar arası serbestlik

derecesi=1 Grup içi serbestlik derecesi=27. F-hesaplanan< F-tablo ve p-değeri> p=0,05

olduğu için bu kalibrasyon modeli ticari numunenin incelenmesinde kullanılabilir

olduğuna karar verilmiştir.

4.3.3.3. PLS yönteminde istatistiksel analiz

HCT ve AMH içeren karışımlarda bu maddelerin miktar tayini için PLS

kalibrasyonun kurulmasında çapraz validasyon işleminde tahmin edilen hataların

karelerinin toplamının (Predicted Resudiual Error Some of Squares→ PRESS)

minimal değerleri elde edilmiştir. Kurulan PLS kalibrasyonunda PRESS değeri HCT

ve AMH için sırasıyla 0,2910 ve 0,0026 olarak hesaplanmıştır. PRESS değerinin

sıfıra yakın olması doğruluk derecesini arttırmaktadır. Elde edilen PRESS değerleri

yeterince küçüktür.

Kalibrasyonun standart hatası (Standard error of calibration → SEC), gerçek ve

tahmin edilen derişimler arasındaki ilişkiye dayalı olarak hesaplanmış ve HCT ve

AMH için sırasıyla 0,5395 ve 0,0510 olarak bulunmuştur. Gerçek ve tahmin edilen

derişim için lineer regresyon analiz sonuçları HCT için Şekil 4.9‟da ve AMH için

Şekil 4.10‟da verilmiştir.

47

Şekil 4.9. PLS kalibrasyon basamağında HCT için gerçek ve tahmin edilen

derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar.

Şekil 4.10. PLS kalibrasyon basamağında AMH için gerçek ve tahmin edilen

derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar.

4.3.3.4. PLS Yönteminin Farmasotik Preparatlara Uygulanması

PLS yönteminin farmasotik preparata uygulanmasında 20 tablet doğru bir şekilde

tartıldı. Havanda iyice toz edildikten sonra Moduretic için 1 tablete karşılık gelen

miktar olan 0,2480g tartılarak 100 mL‟lik balon jojede üzerine bir miktar metanol –

48

su karışımı ile yarım saat manyetik karıştırıcıda karıştırılmış ve son hacim 100 mL‟

ye tamamlanmıştır. Çözelti daha sonra süzülüp süzgeç kâğıdında kalan kısım 3 kez

10 mL metanol – su ile yıkandı ve hacim 100 mL‟ ye tamamlanıp daha sonra

çalışılacak olan aralığa seyreltildi. Bu analiz çözeltilerinin 220- 265 nm dalga boyu

bölgesinde Δλ= 0,1 nm aralıklarla ölçülen absorbans değerleri Bölüm 1.4.1.3. de

açıklanan PLS algoritması uygulandı ve tablet içeriğindeki HCT ve AMH

hesaplandı. Bu işlem 5 kez tekrarlanmıştır.

Yukarıda açıklanan tablet analiz işlemi MODURETİC Tablet preparatı için ayrı ayrı

tekrar edildi. Sonuçlar Çizelge 4,5‟de verilmiştir.

Çizelge 4.5. MODURETİC Tablet preparatına PLS yönteminin uygulanmasıyla elde

edilen sonuçlar.

MODURETİC

Deney No HCT AMH

1 50,09 5,02

2 50,17 5,00

3 49,76 4,99

4 50,12 5,01

5 49,25 4,90

6 50,30 4,86

X = 49,95 4,96

49

5. TARTIŞMA VE SONUÇ

Günümüzde insanların hastalıklardan kurtulmak amacıyla sık olarak tükettikleri en

etkili maddeler ilaçlardır. İlaçlar canlı bünyesinde içerdikleri etken maddeler

sayesinde etki gösterebilmektedir. Bu etken maddeler ise giriş kısmında da

belirtildiği üzere belirli miktarlarda alındıklarında canlı bünyesinde olumlu etki

gösterirken aşırı alınması durumunda tehlikeli boyutlarda zararlar veren kimyasal

maddelerdir. Bu nedenle ilaç analizlerinde etken madde analizi önemli yer

tutmaktadır. Bu analizlerde genel olarak spektroskopik ve kromatografik yöntemler

tercih edilmesine rağmen pahalı yöntemler olması ve çok uzun süren ön ayırma

işlemleri bu yöntemlerin kullanımını sınırlamaktadır.

Bu tez çalışmasında kemometrik kalibrasyonların ilaç etken maddelerinden HCT ve

AMH bileşiklerinin hiçbir ön ayırma işlemi yapmaksızın aynı anda analizine

uygulanmasında üç farklı kemometrik yöntem geliştirilmiştir. Bunlar PCA, PCR ve

PLS kalibrasyon yöntemleridir.

Öncelikle ilaç etken maddelerinin saf haldeki spektrumları alınıp Çizelge 4.1. de

görüldüğü üzere ayrı dalga boylarında absorbans vermelerinden yararlanarak bu

etken maddelerin sentetik karışımları hazırlanmıştır. Şekil 4.4. de görüldüğü gibi her

iki bileşik aynı dalga boyu aralığında girişim yapmaktadır bu durumda her iki

bileşiğin klasik spektroskopik yaklaşımlarla aynı anda miktar tayinlerinin mümkün

olmadığı görülmüştür.

Geliştirilen PCR ve PLS kemometrik yöntemlerinin kesinlik ve doğruluğu test

edilmiştir. Kesinliğin sayısal ölçütü olan bağıl standart sapmanın düşük olması

kesinliğin yüksek olduğunu göstermektedir. Çizelge 4.3. ve Çizelge 4.5. de

görüldüğü üzere bağıl standart sapmaların düşük olduğu görülmektedir. Doğruluğun

sayısal ölçütü olan PRESS (Tahmin edilen hataların kareleri toplamı) değerinin sıfıra

yakın olması doğruluk derecesinin yüksek olduğunun göstergesidir. PCR yöntemi ile

elde edilen PRESS değeri HCT için 0,2643 ve AMH için 0,0900 olarak hesaplanıp

50

PLS yöntemi ile elde edilen PRESS değeri HCT için 0,2910 ve AMH için 0,0026

olarak hesaplanmıştır ve bu değerlerin yeterince küçük olduğu görülmüştür.

PCR ve PLS yöntemlerinin doğruluk ve kesinliğini valide etmek için elde edilen

sonuçlara ANOVA testi uygulanıp grup içi ve gruplar arası serbestlik derecesi ile

tablodan okunan F değerine karşın hesaplanan F değerleri kıyaslanmıştır. Tablodan

okunan F değeri 4,20 olup PCR yönteminde HCT için hesaplanan F değeri 3,7.10-5

ve AMH için 3,12.10-4

bulunmuş; PLS yönteminde HCT için 4,67.10

-2 ve AMH için

9,71.10-5

olarak bulunmuştur. Elde ettiğimiz sonuçlar Fhesaplanan<Ftablo olduğu için bu

kalibrasyon modellerinin ticari numunelerinin incelenmesinde kullanılabilir olduğu

görülmüştür.

PCR kalibrasyon basamağında Şekil 4.7‟de HCT için ve Şekil 4.8‟de AMH için

gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiklerinde görüldüğü üzere

çalışılan aralıklarda doğrusal sonuçların elde edildiği görülmektedir. Aynı şekilde

PLS yöntemi için de Şekil 4.9‟da HCT için ve Şekil 4.10‟da AMH için de aynı

durum görülmektedir.

PCR ve PLS yöntemlerinin uygulanmasıyla HCT ve AMH için elde edilen geri

kazanım değerleri Çizelge 4.3. ve 4.5‟de gösterilmiştir ve iki yöntem de elde edilen

geri kazanımlar yüksek değerlerde bulunmuştur.

Son olarak PCR ve PLS yöntemleri analiz edilen maddelerin ticari preparatlarına

uygulanmış ve tabletlerde belirtilen HCT ve AMH miktarları ile Çizelge 4.4. ve

Çizelge 4.6‟da bulunan bu aktif maddelerin miktarının birbiriyle uyumlu olduğu

gözlenmiştir.

Sonuç olarak, geliştirilen kemometrik yöntemlerin birbiri ile uyumlu olduğu

görülmüştür ve bu yöntemlerin tekrarlanabilirliğinin yüksek olup duyarlı ve doğru

sonuçlar verdiği gözlemlenmiştir. Elde edilen sonuçlar geliştirilen bu kemometrik

yöntemlerin HCT ve AMH içeren ilaç tabletlerinin analizinde kullanılabileceğini

göstermektedir.

51

KAYNAKLAR

Akpolat, O., F, Kartal., 2009. Kimyacılar İçin Bilişim Teknolojileri, 3-4.

Çetin, A., 2008. Çoklu İlaç Karışımlarının Spektrofotometrik Olarak Kantitatif

Analizi İçin Kemometrik ve Grafiksel Metot Geliştirme. Sakarya Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 86s, Sakarya.

De Luca, M., Oliverio, F., Ioele, G., Ragno,G., 2009. Multivariate calibration

techniques applied to derivative spectroscopy data for the analysis of

pharmaceutical mixtures. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems,

96, 14–21.

Dinç, E., 2007. Kemometri çok değişkenli kalibrasyon yöntemleri, 27(1), 61-92.

Dinç, E., 2009. Kemometrik İşlem ve Yöntemlerin Analştik Kimyadaki Tipik

Uygulamaları, Uygulamalı Kemometri Yaz okulu Notları, 1-5

Dinç, E., Üstündağ, Ö., 2003. Spectrophotometric quantitative resolution of

hydrochlorothiazide and spirolactone in tablets by chemometric analysis

methods. II Farmaco, 58, 1151-1161.

Dinç, E., Baleanu,D., Joele,G., De Luca, M., Ragno, G., 2008. Multivariate analysis

of paracetamol, propiphenazone, caffeine and thiamine in quaternary

mixtures by PCR, PLS and ANN calibrations applied on wavelet transform

data. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 48, 1471–1475.

Erk N.and Onur F. 1997. Three new spectrophotometric methods for sımultaneous

determination of hydrochlorothiazide ans amıloride hydrochlorıde ın sugar-

coated tablets. Faculty of Pharmacy Unıversıty of Ankara. Analytical Letters,

30, 1503-1515

Ferraro C.F. Monica, Castellano M.P. , Kaufman S.T. , 2002. Simultaneous

determination of amiloride hydrochloride and hydrochlorothiazide in syntetic

samples ans pharmaceutical formulations by multivarivate analysis of

spectrophotometric data. Pharmaceutical And Biomedical Analysis, 30, 1121-

1131.

Kaya, B., 2007. Kombine Farmasötik Preparatlardan Telmisartan ve

Hidroklorotiyazid‟in kemometrik Kemometrik Kalibrasyon Yöntemleriyle

Aynı Anda Miktar Tayinleri. Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü,

Yüksek Lisans Tezi, 104s, Ankara.

Kartal M., and Erk N., 1998. Simultaneous of hydrochlorothiazide and amiloride

hydrochloride by ratio spectra derivative spectrophotometry and high-

performance liquid chromatography. Pharmaceutical and Biomedical

Analysis, 19, 477-485.

Khoshayand, M.R., Abdollahi, H., Shariatpanahi, M., Saadatfard, A., Mohammadi.,

A., 2008. Simultaneous spectrophotometric determination of paracetamol,

ibuprofen and caffeine in pharmaceuticals by chemometric methods.

Spectrochimica Acta Part A, 70, 491–499.

52

Liao, L., Yang, J., Yuan, J., 2007. Process monitored spectrophotometric titration

coupled with chemometrics for simultaneous determination of mixtures of

weak acids. Analytica Chimica Acta, 591, 123-131.

Markopoulou, C.K., Malliou, E.T., Koundourellis, J.E., 2005. Content uniformity

and dissolution tests of triplicate mixtures by a double divisor-ratio spectra

derivative method. Il Farmaco, 60, 755–762.

Martin M.E., Hernandez O.M., Jimenez A.I- F., Arias J.J., 1998. Partial least-squares

method in analysis by differential pulse polography. Simultaneous

determination of amiloride and hydochlorothiazide in pharmaceutical

preparations Analytica Chimica Acta, 381, 247-256.

Mot, A.C., S, Soponar, F., Medvedovici, A., Sarbu, C., 2010. Sımultaneous

Spectrophotometrıc Determınatıon Of Aspırın, Paracetamol, Caffeıne, And

Chlorphenamıne From Pharmaceutıcal Formulatıons Usıng Multıvarıate

Regressıon Methods. Analytical Letters, 43, 804–813.

Ragno, G., Ioele, G., Risoli, A., 2004. Multivariate calibration techniques applied to

the spectrophotometric analysis of one-to-four component systems. Analytica

Chimica Acta, 512, 173–180.

Roggo, Y., Chalus, P., Maurer, L., Lema-Martinez, C., Edmond, A., Jend,N., 2007.

A review of near infrared spectroscopy and chemometrics in pharmaceutical

technologies. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 44, 683–

700.

Skoog, D.A., Holler,F.J., Nieman, T.A., 1998. Enstrümantal Analiz İlkeleri. Bilim

Yayıncılık, Özkan Matbaacılık, 849, Ankara.

Şener, M., 2006. İçme Sularında Kalsiyum ve Magnezyumun Spektrofotometrik

Metotla Simultane Tayini ve Yapay Sinir Ağları İle Kemometrik Analizi.

Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi,

49s, Isparta.

Uyanık, A., 2008. Analitik Kimyacılar için İstatistik ve Kemometri, 254-259.

Vandegınste B. M. G., Massart D. L., Buydens L. M. C., De Jong S., Lew_ P. J. And

Smeyers-Verbeke. J. (1998). Handbook Of Chemometrics And Qualimetrics

Part B, Elsevier, Amsterdam.

53

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı : İkbal Demet ÜNLÜ

Doğum Yeri ve Yılı: Isparta-1988

Medeni Hali : Bekar

Yabancı Dili : İngilizce

Eğitim Durumu

Lise : Isparta Gazi Lisesi 2002-2005

Lisans : Süleyman Demirel Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Bölümü

2006-2010

Yüksek Lisans : Süleyman Demirel Üniversitesi Kimya Anabilim Dalı, Analitik

Kimya 2010- devam ediyor.

Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Yıl: T. Garanti Bankası A.Ş – Haziran 2011- devam

ediyor.