tavuklarda salmonella tanisinda kÜltÜr ve real …acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/27992/tez.pdf ·...

TÜRKİYE CUMHURİYETİ

ANKARA ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

TAVUKLARDA SALMONELLA TANISINDA KÜLTÜR VE

REAL TİME PCR’IN KULLANIMI

Abdullah Teoman ÜNLÜ

MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI

DOKTORA TEZİ

DANIŞMAN

Prof. Dr. Müjgan İZGÜR

2011- ANKARA

iii

İÇİNDEKİLER

Kabul ve Onay ii Ġçindekiler iii Önsöz vi Simgeler ve Kısaltmalar viii ġekiller x Çizelgeler xi

1. GİRİŞ 1

1.1. Salmonella‟ ların Tarihçesi 2 1.2. Salmonella‟ların Taksonomisi ve Nomenklatürü 3 1.3. Salmonella‟ ların Etiyolojileri 6 1.3.1. Morfoloji ve Boyanma Özellikleri 6 1.3.2. Üreme Ġhtiyaçları 7 1.3.3. Koloni Morfolojileri 7 1.3.4. Biyokimyasal Özellikleri 7 1.3.5. Antijenik Yapı 9 1.3.6. Kimyasal ve Fiziksel Ajanlara Duyarlılığı 11 1.3.7. Salmonella‟ların Bazı Çevresel KoĢullar ve Gıdalarda Canlı Kalma Süreleri 11 1.3.8. Salmonella‟ların Toksinleri 12 1.3.9. Salmonella‟larda Patojenite Adaları 12 1.3.10. Salmonella‟ların Antibiyotik Dirençliliği 14 1.4. Salmonellozis‟ in Epidemiyolojisi 15 1.4.1. Konakçıları 15 1.4.2. BulaĢma 16 1.5. Salmonellozis‟ in Patogenezi 17 1.6. Salmonella Ġnfeksiyonunda Semptomlar 19 1.6.1. Enterik AteĢler 19 1.6.2. Septisemiler 20 1.6.3. Gastroenteritis 20 1.6.4. Kanatlılarda Semptomlar 20 1.7. TeĢhis 21 1.8. Laboratuar Muayenesi 21 1.8.1. Bakteriyoskopi 22 1.8.2. Kültür 22 1.8.3. Biyokimyasal Testler 24 1.8.4. Serolojik Testler 25 1.8.5. Moleküler Teknikler 26 1.8.5.1. PCR 26 1.8.5.2. Real Time PCR 27 1.8.5.3. 16S rRNA Gen Sekans Analizi 29 1.8.6. Alternatif Hızlı Tanı Teknikleri 31 1.9. Korunma ve Kontrol 32

iv

2. GEREÇ VE YÖNTEM

2.1.Gereç 34 2.1.1. Salmonella Ġzolatları 34 2.1.2. Besiyerleri 34 2.1.3. Kullanılan Cihaz ve Gereçler 35 2.1.4. Ticari Biyokimyasal Sistemleri 35 2.1.5. Standart SuĢlar 37 2.1.6. Antiserum 37 2.1.7. Real Time PCR‟da Kullanılan Buffer, Solüsyon, Primer, Enzimler 37 ve Malzemeler 2.1.8. 16s rDNA Salmonella Ġdentifikasyonunda Kullanılan Buffer, 37 Solüsyon, Primer, Enzimler ve Malzemeler 2.2. Yöntem 38 2.2.1. Salmonella Ġzolasyonu 39 2.2.1.1. Tavuk Karkaslarında Ön ZenginleĢtirme 39 2.2.1.2. Selektif ZenginleĢtirme 39 2.2.1.3. Selektif Diferansiyel Besiyerine Ekim 39 2.2.2. Salmonella Ġdentifikasyonu 40 2.2.2.1. Gram Boyama 40 2.2.2.2. ġeker Fermentasyon ve Lizin Kullanım Testleri 40 2.2.2.3. Ticari Biyokimyasal Testler 40 2.2.2.4. Salmonella SuĢlarının Hareket Muayenesi 41 2.2.2.5. Serolojik Testler 41 2.2.3. Antibiyotik Duyarlılık Testleri 42 2.2.4. Real-time-PCR Analizleri ile TamponlanmıĢ Peptonlu Su‟dan 43 Salmonella Belirlenmesi 2.2.4.1. Real time PCR için Salmonella DNA Ġzolasyonu 44 2.2.4.2. Kullanılan Primer ve Probların Validasyonu 44 2.2.4.3. PCR KarıĢımı Hazırlanması 44 2.2.4.4. Amplifikasyon KoĢulları 45 2.2.4.5. Sonuçların Değerlendirilmesi 45 2.2.5. 16s rDNA Salmonella Ġdentifikasyonu 45 2.2.5.1. DNA Dizi Analizi için Salmonella DNA Ġzolasyonu 45 2.2.5.2. PCR AĢaması 46 2.2.5.3. Amplifikasyon KoĢulları 46 2.2.5.4. DNA Agaroz Jel Elektroforezi 46 2.2.5.5. Örneklerin Görüntülenmesi 46 2.2.5.6. Sekanslama için PCR Ürünlerinin SaflaĢtırılması 47 2.2.5.7. Sekanslama 47 2.2.5.8. Amplifikasyon KoĢulları 47 2.2.5.9. Ekstensiyon Ürünlerinin SaflaĢtırılması 47 2.2.5.10. Ekstensiyon Ürünlerinin Sekanslaması ve Elektroforezi 48

3. BULGULAR 49 3.1. Ġzolasyon Bulguları 49 3.2. Ġdentifikasyon Bulguları 50

v

3.3. Serogruplandırma Bulguları 51 3.4. Antibiyotik Dirençlilik Sonuçları 52 3.5. Real Time PCR Bulguları 52 3.6. Sekanslama Sonuçları 54 4. TARTIŞMA 56 5. SONUÇ VE ÖNERİLER 66 ÖZET 67 SUMMARY 68 KAYNAKLAR 69 ÖZGEÇMİŞ 84

vi

ÖNSÖZ

Kanatlı sektörünün karĢılaĢtığı enfeksiyöz hastalıklar arasında Salmonellosiz

önemli bir yer tutmaktadır. ÇeĢitli hayvansal kaynaklı gıdalarda Salmonella

görülme sıklığının fazla olması nedeniyle insan sağlığı olumsuz

etkilenmektedir. Hayvanlarda Salmonella varlığının araĢtırılması ve erken

dönemlerde özellikle enterik türlerin hayvanların sindirim sistemlerine

kolonize olmasının engellenmesi için kontrol programlarının uygulanması bir

zorunluluk haline gelmiĢtir. Bu problem özellikle kanatlı sürüleri için daha

öncelikli bir konudur. Bağırsaklara kolonize olan Salmonella etkenlerinin

kesimhanelerde çapraz kontaminasyonla karkaslara bulaĢma düzeyinin

artmasını ve market zincirinden sonra insanlara ulaĢmasını engellemenin en

önemli yolu, kümeslerin bu etkenlerin kontrolünden geçmesidir.

Salmonella serovarlarının konvansiyonel metotlarla izolasyonu ve

identifikasyonu hem güç olmakta, hem de uzun süre almaktadır. Son yıllarda,

birçok insan ve hayvan hastalığının tanısında oldukça hızlı, duyarlı ve

spesifik bir yöntem olduğu kanıtlanan Real Time Polymerase Chain Reaction

(real-time PCR) tekniği, Salmonella tanısında kullanılmaktadır.

Salmonella serotipleri koruyucu ya da tedavi edici amaçlarla kullanılan

antibiyotiklere karsı direnç kazanabilmekte ve bu direncin insan ve hayvan

suĢlarına kolaylıkla aktarılabildiği bilinmektedir. Bu nedenle kanatlı

Salmonella infeksiyonlarının tedavisinde etkili antibiyotiklerin belirlenmesi

infeksiyonun sağaltımı açısından ve tedavi giderlerinin düĢürülmesine katkıda

bulunması açısından önem taĢımaktadır.

Bu çalıĢmada, kesimhanelerden temin edilen tavuk karkaslarında

Salmonella tanısında kültür ve Real-Time PCR kullanımının araĢtırılması ve

Salmonella tiplerinin karakterizasyonunda MicroSeq 500 16S rDNA

sisteminin kullanılabilirliği araĢtırılmıĢtır. Ayrıca izole edilen Salmonella’lara

antibiyotik dirençlilik testleri de uygulanmıĢtır.

vii

Tez konumun belirlenmesinde ve yürütülmesindeki katkılarından

dolayı danıĢman hocam Prof. Dr. Müjgan ĠZGÜR baĢta olmak üzere her

konuda yardımlarını esirgemeyen öğretim üyeleri; Prof. Dr. K. Serdar DĠKER,

Prof. Dr. Hakan YARDIMCI, Prof. Dr. Ömer M. ESENDAL, Prof. Dr. Mehmet

AKAN, Prof. Dr. Haluk ÇELĠK, Prof. Dr. Aykut ÖZKUL, Prof.Dr. Cengiz

ÇETĠN ve Doç. Dr. BarıĢ SAREYYÜPOĞLU, AraĢ. Gör. Bülent BAġ,

çalıĢmam sırasında büyük bir özveri göstererek yardımlarını esirgemeyen

baĢta Dr.Vet.Hekim Ahmet KOLUMAN olmak üzere, ABI Ankara temsilcisi

Synbio Biyoteknoloji çalıĢanları Yasin ARAS, Meltem DEMĠRCAN, Yörük

DĠVANOĞLU, Rize Ġl Kontrol Laboratuvarında görevli Vet.Hekim Hasan

Orhan ÇETĠN ve adını yazamadığım diğer arkadaĢlarıma, Anabilim Dalı

personeline, moral desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen aileme

teĢekkürlerimi sunarım.

viii

SİMGELER VE KISALTMALAR

ABD Amerika BirleĢik Devletleri

ABI Applied Biosystems

AFNOR Association Francaise de Normalisation,

BLAST Basic Local Alingment Search Tool

bp Base Pair

BPLS Brilliant Green Phenol-red Lactose Sucrose

CDC Center for Disease Control and Prevention

CLSI The Clinical and Laboratory Standards Institute

CSPI Center for Science in the Public Ġnterest

DNA Deoksiribonükleik Asit

dNTP Deoksinükleotid Trifosfatlar

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

H2S Hidrojen Sülfür

IMS Immunomanyetik Seperasyon

KB Kilobase

KCN Potasyum Siyanür

LIA Lysine Iron Agar

MR Metil Red

MRE Multiple-Antibiyotik-Rezistans

MSRV Modifiye Semi-Solid Rappoport Vassiliadis

NA Nutrient Agar

ONPG O–Nitrophenyl–Beta–D–Galaktopyranside

INV Ġnvazyon

MHA Mueller-Hinton Agar

PCR Polymerase Chain Reaction

rRNA Ribozomal Ribonükleik Asit

RPM Revolutions Per Minute

RVS Rappaport Vasiliadis

SPA Salmonella Patojenite Adaları

Taq Thermus Aquaticus

ix

TPS TamponlanmıĢ Peptonlu Su

TSB Tripticase Soy Broth

TSIA Triple Sugar Iron Agar

TTSS Type Three Secretion System

VP Voges-Proskauer

XLD Xylose-Lysine-Desoxycholate

XLT-4 Xylose-Lysine-Tergitol-4

x

ŞEKİLLER

Şekil 1.1. Salmonella‟ların gıdalara bulaĢma zinciri 17

Şekil 1.2. Salmonella‟ların intestinal mukozaya invazyonu 18

Şekil 1.3. Real-time PCR‟da florasan probların iĢlevi 29

Şekil 2.1. Salmonella‟ların analizlerine ait akıĢ Ģeması 38

Şekil 2.2. Salmonella Latex Test aĢamaları 42

Şekil 2.3. Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi ile antibiyotik disklerinin

etrafındaki zon oluĢumu. 43

Şekil 3.1. XLD ve BPLS agarda Salmonella kolonilerinin görünümü 50

Şekil 3.2. TSIA ve LIA agarda Salmonella kolonilerinin görünümü 50

Şekil 3.3. MSRV agarda hareketli Salmonella kolonilerinin görünümü 51

Şekil 3.4. Real-time PCR tekniği ile doğrulanan 100 Salmonella spp.

izolatının antibiyotik dirençlilik tablosu 53

Şekil 3.5. Salmonella spp. Real Time PCR‟daki görüntüsü 53

Şekil 3.6. Sekans analizinde sequence scanner v 1.0 programı

kullanılarak elde edilen ham verilere ait örnek grafik. 54

Şekil 3.7. 16S rRNA geninin amplikasyon ürünlerin Agaroz Jel

Elektroforezindeki görüntüsü. 55

Şekil 3.8. Sekans analizi sonrası elde edilen nükleotid sekansların

BLAST programına verilmesi sonrasında elde edilen görünüm. 55

xi

ÇİZELGELER

Çizelge 1.1. Salmonella türlerinin ve alttürlerinin klasifikasyonu 5

Çizelge 1.2. Salmonella türleri ve alttürlerinin ayırıcı özellikleri 5

Çizelge 1.3. CDC‟de kullanılan Salmonella Nomenklatürü 6

Çizelge 1.4. Salmonella‟ların biyokimyasal ve serolojik özellikleri 8

Çizelge 1.5. Salmonella patojenite adalarına genel bakıĢ 13

Çizelge 2.1. Api 20E test kitlerindeki biyokimyasal reaksiyonları okuma tablosu 36

Çizelge 3.1. Tavuk karkaslarından izole edilen Salmonella‟ların illere göre

dağılımı 49

Çizelge 3.2. Ġzole edilen 100 adet Salmonella spp.‟nin özellikleri 51

Çizelge 3.3. Ġzole edilen Salmonella‟ların serogruplandırma sonuçlarının illere göre dağılımı 52

1

1.GİRİŞ

Doğada yaygın olarak bulunan Salmonella’lar, insan ve hayvanlarda

enfeksiyonlara neden olabildikleri gibi gıda zehirlenmelerinin de sorumlusu

olarak da bilinmektedir. Ayrıca, bazı Salmonella türleri insanlara bulaĢması

nedeniyle zoonotik bir önem taĢımaktadır. Salmonella enfeksiyonlarının

insanlara bulaĢmasında, kontamine yumurta, süt ve et gibi hayvansal

kaynaklı gıdalar önemli rol oynamaktadırlar (Koneman ve ark., 1992; Quinn

ve ark., 1994; Anon, 2005a).

Salmonellozis vakalarında ortaya çıkan tedavi masrafları ve iĢ gücü

kaybı da önemli ekonomik zararlara neden olmaktadır. ABD‟de

Salmonella‟lardan kaynaklanan gıda infeksiyonlarına bağlı tedavi, iĢ gücü,

gıda kaybı ve kontrol masraflarına iliĢkin ekonomik kayıpların yıllık yaklaĢık

3,4 milyar dolar, Kanada‟da ise 1 milyar dolar olduğu bildirilmektedir.

Almanya‟da da yalnızca 1991 yılı için salmonellozisin 1,5 milyar marklık bir

kayba neden olduğu bildirilmektedir (Erol, 2007).

Geçtiğimiz 20-25 yıl içerisinde değiĢik coğrafyalarda farklı serotiplerin

neden olduğu gıda kaynaklı salmonellozis olgularında bir artıĢ

gözlemlenmiĢtir. ABD‟deki Center for Diseases Control‟ün (CDC) verilerinde

(Hastalık Kontrol Merkezi) 2006 yılı raporlarına göre sadece ABD‟de yıllık

tahmini 1.4 milyon Salmonella olgusu rapor edildiği ve olguların 500‟ünden

fazlasının hastalarda ölümle sonuçlandığı belirtilmektedir. Yine ABD‟de

Center for Science in the Public Ġnterest‟in (CSPI) 1990-2003 yılı verilerinde

ABD‟de bakterilerin neden olduğu 554 salgının 111‟inde sorumlu etkenin

Salmonella olduğunu bildirmiĢlerdir. Ayrıca CDC ve CSPI‟in 1990-2001 yılları

arasındaki gıda kaynaklı hastalıklar arasında sadece kanatlıların neden

olduğu 476, yumurtanın neden olduğu ise 329 salgın olduğu ve bu

salgınlarda sırasıyla 14,729 ve 10,487 kiĢinin etkilendiği belirtilmektedir.

(ġireli, 2008).

2

Ülkemizde Salmonella‟lar tarafından meydana getirilen infeksiyonlar

diğer salgın hastalıklar yanında önemli bir yer tutmakta ve önemli bir halk

sağlığı sorunu olarak güncelliğini korumaktadır. Türkiye‟nin birçok bölgesinde

Salmonella infeksiyonları endemik hatta hiperendemik olarak seyretmektedir

(Bilgehan, 1992).

Ġnsanların salmonellozis veya diğer bakteriyel infeksiyonlarının

tedavisinde kullanılan çok sayıdaki antibiyotik, veteriner alanında da

kullanılmaktadır. Bu durum; hayvansal gıdalardan, kontamine olmuĢ gıda ve

gıda ürünlerini tüketen insanlara bulaĢan zoonoz bakterilerin, özellikle

Salmonella ve diğer dirençli türlerin sebep olduğu bir halk sağlığı riski

yaratmaktadır (Gay ve ark., 1994; Wegner ve ark.,1999).

Salmonella‟ları, standard laboratuvar metotları ile izole etmek ve

tanımlamak hem güç olmakta, hem de uzun süre almaktadır (Stone ve ark.,

1994; Oliveira ve ark., 2003). PCR, moleküler teĢhis ve tanımlama yöntemi

olarak özgünlük, hız ve duyarlılığı yüksek olması nedeniyle büyük bir avantaj

sunmakta ve birçok klinik örnek ile gıdalardan mikrobiyel tanımlama için

gittikçe artan bir Ģekilde kullanılmaktadır. (Tuchili ve ark., 1995; Marsiglia ve

ark., 1997; Jenikova ve ark., 2000; Oliveira ve ark., 2002; Cortez ve ark.,

2006). PCR‟ın diğer bir avantajı ise, antijenlerin ekspresyonuna veya bir

substratın kullanımına bağımlı olmamasıdır ve antijenlerin biyokimyasal ve

fenotipik varyasyonlarına rağmen mikroorganizmaları teĢhis edebilmesidir

(Hoorfar ve ark., 1999).

1.1. Salmonella’ların Tarihçesi

Salmonella ilk kez tifoid basili olarak 1880 yılında Alman bakteriyologlar Ebert

ve Koch tarafından tanımlanmıĢ ve 1884 yılında Gaffky Salmonella‟yı kültüre

etmeyi baĢarmıĢtır. 1885 yılında Amerikalı mikrobiyolog D.E.Salmon domuz

vebasına neden olan domuz kolera basilini karakterize ederek Bacterium

3

uipestifer olarak adlandırmıĢtır. Söz konusu bakterinin adı daha sonraki

yıllarda Salmonella choleraesuis olarak değiĢtirilmiĢtir (Bell ve Kyriakides,

2002). Aynı Ģekilde, klinik olarak benzer semptomlardan sorumlu olan

paratifoid basili 1896 yılında Achard ve Bensaud, 1898 yılında ise Gwyn

tarafından izole edilmiĢtir. Salmonella genusu, 1900 yılında Amerikalı

veteriner patolog D.E. Salmon‟a atfen Lignieres tarafından oluĢturulmuĢtur.

Tifoid basili ile paratifoid basilinin kültürel ve serolojik olarak ayrımı 1901

yılında Schottmüller tarafından yapılmıĢtır (Adams ve Moss, 1995).

Salmonella etkeninin ilk defa laboratuvarda doğrulanmasıysa, 1888

yılında Gaertner tarafından sığır eti ve bu eti tüketen bir insanın

organlarından Bacterium enteritidis‟in (S. Enteritidis) izole edilmesiyle

gerçekleĢmiĢtir (Bell ve Kyriakides, 2002).

Salmonella‟nın klasifikasyonu için antijenik Ģema ilk olarak 1926

yılında White tarafından önerilmiĢ ve 1961 yılında Kauffmann tarafından

Kauffmann-White Ģeması olarak geniĢletilmiĢtir (D‟Aoust, 1997).

1.2. Salmonella’ların Taksonomisi ve Nomenklatürü

Salmonella genusunun ilk sınıflandırması bir serotip-bir tür kavramından

köken almıĢ ve her bir serotipin ayrı bir tür olduğu düĢünülmüĢtür. Örneğin;

S. paratyphi A, S. newport, S. enteritidis. Eğer bu kavram günümüzde geçerli

olsaydı Ģu anda 2541 Salmonella türü mevcut olurdu (Brenner ve ark., 2000).

Günümüzde, Salmonella genusunda, S. enterica ve S. bongori olmak

üzere 2 iki tür mevcuttur. S. enterica biyokimyasal özellikleri dikkate alınarak

S. enterica subsp. enterica (subsp. I), S. enterica subsp. salamae (subsp. II),

S. enterica subsp. arizonae (subsp. IIIa), S. enterica subsp. diarizonae

(subsp. IIIb), S. enterica subsp. houtenae (subsp. IV), S. enterica subsp.

indica (subsp. VI) olmak üzere 6 altgrupa ayrılmaktadır (Le Minor ve Popoff,

4

1987; Holt ve ark., 1994; Brenner ve ark., 2000). S. bongori‟nin ise alt türü

bulunmamaktadır (Reeves ve ark., 1989; Popoff ve ark., 2001). Bu

çalıĢmaların sonucunda uzun süredir adlandırılan Salmonella serovarlarını

tür olarak kullanma sistemi artık geçerliliğini yitirmiĢtir. Daha önce Salmonella

typhimurium olarak adlandırılan bir bakteri artık Salmonella enterica subsp.

enterica serovar Typhimurium olarak adlandırılmaktadır (Brenner ve ark.,

2000; Anon, 2004).

Antijenik yönden klasifikasyonu yapılan Salmonella’lar Kauffmann-

White Ģemasında sıralanmıĢtır. Ġdentifiye edilen yeni Salmonella serovarlar

“World Health Organisation (WHO) Collaborating Centre for Reference and

Research on Salmonella” tarafından bu Ģemaya eklenip

güncelleĢtirilmektedir. Bu yeni serovarlar Pasteur Enstitüsü yayını olan

“Research in Microbiology” dergisinde hemen hemen her yıl

yayınlanmaktadır (Popoff ve ark., 2000). 2007 yılı itibariyle toplam

Salmonella serovar sayısı 2579‟a ulaĢmıĢtır, Salmonella içindeki tür ve

alttürler Çizelge 1.1 de gösterilmektedir. (Grimont ve Weill 2007).

Bilinen Salmonella serotiplerinin büyük bir çoğunluğu S. enterica I (S.

Enterica subsp. enterica) alt türüne aittir ve bu alt türün yaklaĢık % 99‟u

insanlarda ve sıcak kanlı hayvanlarda Salmonella infeksiyonlarına neden

olmaktadır (Popoff ve Le Minor, 2005). S. enterica subsp. II (S. enterica

subsp. salamae), IIIa (S. enterica subsp. arizonae), IIIb (S. enterica subsp.

diarizonae), IV (S. enterica subsp. houtenae), VI (S. enterica subsp. indica)

ve S. bongori genellikle soğuk kanlı hayvanlar, çevre ve nadir olarak da

insanlardan izole edilmektedir (Farmer ve ark., 1984). Salmonella türlerinin

ve alttürlerinin farklı özellikleri çizelge 1.2. de verilmiĢtir (Popoff ve Le Minor,

2005).

CDC alttür I‟de bulunan serotipler ( serotip Enteritidis, Typhimurium,

Typhi, ve Choleraesuis gibi) için isimlendirme yapmaktadır. Cins ismi italik

olarak yazılır ve ilk harf büyük harf ile baĢlar, serotip ismi ise italik yazılmaz

5

ve serotip adının ilk harfi büyük harfle baĢlar (Salmonella Typhimurium veya

S. Typhimurium gibi). CDC‟nin kullandığı Salmonella nomenklatürü ile ilgili

Çizelge 1.3. de gösterilmiĢtir (Brenner ve ark., 2000).

Çizelge 1.1. Salmonella türlerinin ve alttürlerinin klasifikasyonu (Grimont ve Weill 2007).

Çizelge 1.2. Salmonella türleri ve alttürlerinin ayırıcı özellikleri (Popoff ve Le Minor ,2005).

Türler S. Enterica S.

Bongori Alttürler

Biyokimyasal özellikleri

I

Enter

ica

II

Salamae

IIIA

Arizonae

IIIB

Diarizonae

IV

Houtenae

V

İndica

Dulcitol + + - - - d +

ONPG (2sa) - - + + - d +

Malonat - + + + - - -

Jelatinaz - + + + + + -

Sorbitol + + + + -/+ - +

KCN - - - - + - +

L(+)-Tartrate + - - - - - -

Galakturonat - + - + + + +

Glutamiltransferaz + - + + + +

Β-Glukoronidaz (MUG) D D - + - D -

Mukat + + + -(%70) - + +

Salisin - - - - + - -

Laktoz - - -(%75) +(%75) - D -

O1 fajıyla lizis + + - + - + D

Habitat Sıcakkanlı hayvanlar +

Soğukkanlı hayvanlar + + + + + +

Semboller: (+): %90 veya çoğu suĢda 1-2 günde pozitif; (-) :SuĢların %0-10‟u 1-2 günde pozitif ,aksi taktirde tabloda

gösterildiği Ģekilde; D: SuĢların 11-89% „unda 1-2 günde pozitif.Bütün reaksiyonlar için sıcaklık 37°C‟ dir. : Typhimurium

d, Dublin -

Salmonella tür ve alt türleri Alt tür içerisindeki serotip sayısı

S. enterica 2557

S.enterica subsp.enterica (I) 1531

S.enterica subsp. salamae (II) 505

S.enterica subsp. arizonae (IIIa) 99

S.enterica subsp. diarizonae (IIIb) 336

S.enterica subsp. houtenae (IV) 73

S.enterica subsp. indica (VI) 13

S. bongori 22

Toplam 2579

6

Ġnsan ve hayvanlardan izole edilen Salmonella‟ların birçoğu S.

enterica subsp. enterica (I) alt grubuna dahil olup bu grup bir serovar veya

serotip içermektedir. Genellikle, ilk izole edildikleri Ģehrin ya da ilk izole

edildikleri canlı türünün adını alırlar. Örneğin S. enterica subsp. enterica

serovar Dublin, ya da S. enterica subsp. enterica serovar Gallinarum

denildiğinde Dublin serovarı ilk kez Dublin‟de, Typhi serovarı tifoid ateĢ

belirtisiyle seyreden bir hastalıktan ve Gallinarum serovarı ise tavuktan izole

edildikleri için bu Ģekilde isimlendirilmiĢlerdir. Ancak çoğu kitap ve yayında

bunlar kısaca Salmonella Dublin, Salmonella Typhi ve Salmonella Gallinarum

diye adlandırılırlar ve tür isimleri de serotipi belirtmek için büyük harfle

yazılırlar (Ġzgür, 2006).

Çizelge 1.3. CDC‟ de kullanılan Salmonella Nomenklatürü (Brenner ve ark., 2000)

1.3. Salmonella’ların Etiyolojileri

1.3.1. Morfoloji ve Boyanma Özellikleri

Salmonella‟lar Gram negatif, kısa ve küçük çomaklar tarzında, boyutları 0.7–

1.5x2.0–5.0 μm‟dır. Salmonella‟lar sporsuz ve kapsülsüz olup S. Pullorum ve

S. Gallinarum hariç hareketlidirler. (Ġzgür, 2006). Paratifoid Salmonella‟lar

Taksonomik durum Güncel Nomenklatür

Cins (İtalik) ......................................... Salmonella

Tür (İtalik)......................................... ● enterica (I, II, IIIa, IIIb, IV ve VI)

● bongori (önceleri alttür V olarak bilinirdi)

Serotip (İlk harf büyük , italik değil)

*.......................................● Serotip metinde ilk kez kullanıldığında; serotip adı

„serotip‟ ya da „ser.‟ kısaltmasından sonra yazılır. ●Alttür I‟ e ait serotipler adları ile; alttür II, III, IV, VI ve S. bongori‟ ye ait serotipler antijenik formülleri ile tanımlanır.(Örnek, Salmonella serotip (ser.) Typhimurium, Salmonella II 50:b:z6, Salmonella IIIb 60:k:z)

● Alttür II, IV, VI ve S. bongori‟ ye ait serotiplerden 1966‟dan önce adlandırılanlar varsa adları da yazılır. (Örnek, Salmonella ser. Marina (IV 48:g:z51:-).

7

peritrik flagellaya sahiptirler. Gram negatif olmalarına rağmen metilen mavisi

ve karbon fuksin boyaları gibi boyalarla boyanabilirler (Gast, 2003).

1.3.2. Üreme İhtiyaçları

Salmonella‟lar fakültatif anaerobiktirler. 2–47°C sıcaklık aralığında

üreyebilirler ve optimal ısı dereceleri 37°C‟dir. Salmonella‟lar yaklaĢık pH

3.6–9.5 aralığında üreyebilmekte ve optimum pH‟ları 6.5-7.5‟dır. Flagella ve

fimbriyalarını uygun olmayan ortam koĢullarında (ph, ısı) kaybedebilirler.

Salmonella‟ların üremesi %2‟den fazla olan tuz konsantrasyonlarında

azalmakta fakat artan ısı dereceleri ile birlikte Salmonella‟ların tuz toleransları

artmaktadır. Salmonella‟lar üremelerini destekleyen karbon ve nitrojen ihtiva

eden çoğu besiyerinde üreyebilirler (D‟Aoust, 1997; Gast, 2003).

1.3.3. Koloni Morfolojileri

Salmonella‟lar 24-48 saatte 37°C‟de Nutrient agarda (NA) yaklaĢık 2–4 mm

çapında, küçük, yuvarlak, S-tipli, hafif kubbeli ve parlak koloni oluĢtururlar.

Buyyonda ise homojen bir Ģekilde, hafif bulanıklık meydana getirerek ürerler

(Gast, 2003; Ġzgür, 2006).

1.3.4. Biyokimyasal Özellikleri

Salmonella izolasyonunda kullanılan besi yerlerinin bileĢimi, önemli iki

özelliklerini ortaya çıkarma esasına dayanmaktadır. Bu özellikler, H2S

(Hidrojen Sülfür) oluĢturmaları (S. Paratyphi ve S. Choleraesuis‟in bazı

suĢları hariç) ve laktozu fermente edememeleridir. Salmonella‟lar genellikle

laktozu kullanmazlar, fakat Arizona grubunun çoğu suĢu laktozu fermente

eder. Salmonella’ların büyük çoğunluğu aerojeniktirler. Ancak Salmonella

8

Typhi ve Salmonella Gallinarum gaz oluĢturmazlar. Lizin dekarboksilaz

reaksiyonu S. Paratyphi A dıĢında Salmonella‟larda pozitiftir. Salmonella

Typhi ve S. Gallinarum‟un ornitin dekarboksilaz reaksiyonu negatif olmasına

karĢın diğer Salmonella‟lar genellikle ornitin dekarboksilaz pozitiftir (Holt ve

ark. 1994; Ġzgür, 2006). Salmonella‟nın bazı biyokimyasal ve serolojik

özellikleri Çizelge 1.4‟de gösterilmiĢtir (Flowers ve ark.,1992).

Çizelge 1.4. Salmonella‟ların biyokimyasal ve serolojik özellikleri (Flowers ve ark., 1992)

Test veya substrat Pozitif Negatif Salmonella Türlerinin

Reaksiyonu

Glikoz TSIA‟da dipte sarı renk

oluĢumu

TSIA‟da dipte kırmızı

renk oluĢumu

+

Lizin dekarboksilaz Lysine Iron Agar‟da (LIA)

dipte mor renk oluĢumu

LIA‟da dipte sarı renk

oluĢumu

+

H2S oluĢumu

(TSIA ve LIA)

SiyahlaĢma SiyahlaĢma yok +

Üreaz Pembe-kırmızı renk Sarı renk -

Lizindekarboksilaz buyyon Mor renk Sarı renk +

Fenol red dulsitol buyyon Sarı renk ve/veya gaz Renk değiĢikliği ve gaz

yok

KCN (Potasyum Siyanür)

buyyon

GeliĢebilir GeliĢemez -

Malonat buyyon Mavi renk Renk değiĢikliği yok

Ġndol test Yüzeyde kırmızı renk Yüzeyde sarı renk -

Polivalan flegellar test Aglütinasyon Aglütinasyon yok +

Polivalan somatik test Aglütinasyon Aglütinasyon yok +

Fenol red laktoz buyyon Sarı renk ve/veya gaz Renk değiĢikliği ve gaz

yok

Fenol red sukroz buyyon Sarı renk ve/veya gaz Renk değiĢikliği ve gaz

yok

-

VP test Pembe kırmızı renk Renk değiĢikliği yok -

MR test Diffuz kırmızı renk Diffuz sarı renk +

Simmons sitrat GeliĢir; mavi renk GeliĢmez;Renk değiĢikliği

yok

v

a+ :1-2 gün içinde %90 veya daha fazlası pozitif - : 1-2 gün içinde %90 veya daha fazlası negatif

b: Salmonella alttürleri 3a,3b,4 ve 6‟nın büyük bir bölümünde negatif, S. Arizonae kültürlerinin çoğunda negatif

c: Salmonella alttürleri 2, 3a,3b‟nin büyük bir bölümünde pozitif, S. arizonae kültürlerinin çoğunda pozitif

d: Salmonella alttürleri 3b‟nin büyük bir bölümünde pozitif, S. Arizonae kültürlerinin çoğunda pozitif

v : değiĢken

9

Dulsitol, mukat, sorbitol, ksiloz, arabinaz, ramnoz, mannoz, mannitol,

maltoz, trehaloz, inositol ve melibiozu asit oluĢturarak fermente ederler.

Adonitol, laktoz, salisin, sukroz, rafinoz, sellobioz, galakturonatI fermente

etmezler. Salmonella‟ların tümü üreaz enzimine sahip olmadıkları için üreyi

ayrıĢtırmazlar. Salmonella‟lar jelatini hidrolize edemezler. Salmonella‟lar

sitratı kullanırlar fakat indol ise negatiftir. Ayrıca MR (Metil–Red) pozitif ve VP

(Voges-Proskauer) negatiftir (Le Minor ve Popoff, 1987; Ġzgür, 2006). S.

Gallinarum ve S. Pullorum‟un ayrımında, S. Pullorum‟un ornitin dekarboksilaz

pozitif olması ve S. Gallinarum‟un dulsitolü fermente etme özelliklerinden

yararlanılır. S. Gallinarum ornitin dekarboksilaz negatiftir, S. Pullorum ise

hem dulsitolü hem de maltozu fermente edemez. (Shivaprasad, 2003).

1.3.5. Antijenik Yapı

Salmonella‟larda önem taĢıyan üç çeĢit antijen bulunmaktadır (Somatik “O”

antijenleri, Flagellar “H” antijenleri ve yüzeysel antijenler) (Bilgehan, 2004).

“O” somatik antijenleri, bütün Salmonella serotiplerinde bulunmakla

birlikte polisakkarit özelliğinde olup, hücre duvarında protein ve lipidlere bağlı

olarak bulunur. Isıya dirençlidir. Formolle aktivitesi azalır ve kaybolur. Bu

antijenik yapı, Salmonella‟ların 60‟dan fazla serogruba ayrılmasını sağlayan

değiĢik faktörler içermektedir. Bu faktörler; 1, 2, 3, 4, 5, …. gibi sayılarla ifade

edilmekte ve ortak antijenik faktörleri içeren Salmonella‟lar aynı grup

içerisinde toplanarak grup adları alfabetik harflerle (A, B, ….Z)

isimlendirilmektedir. ġimdiye kadar 67 grup ortaya konmuĢ olup harfler yeterli

gelmediğinden harf + rakamla belirtilmiĢtir. Örneğin “O” somatik antijenin 9 ve

12 faktörlerini ortak içeren S. Typhi, S. Enteritidis, S. Pullorum ve S.

Gallinarum bu gruplandırmada D1 serogrubunda yer almıĢlardır

Salmonella‟lardaki O antijenlerinin bazıları Escherichia, Citrobacter, Shigella

ve Proteus spp. gibi baĢka bakterilerde de bulunabilirler. Salmonella‟lar O

antijenleri ile gruplara ayrılırlar (Bilgehan, 2004; Ġzgür, 2006).

10

“H” flagellar antijenleri, hareketli Salmonella‟larda bulunan protein

yapısında, ısıya duyarlı (60°C‟de ısıtılmakla inaktive olan) formole dirençli

antijenik yapılardır. “H” antijeninin yapısında birçok faktör bulunmaktadır. Bu

faktörler 2 alt grup altında incelenir. Faz 1 adı verilen antijenik faktörler,

spesifik özellikte olup sadece bir Salmonella türünde veya birbirine yakın

birkaç Salmonella serovarında bulunmaktadır. Bu antijenik faktörler a, b, c,

….z‟ye kadar küçük harflerle ve alfabe harfleri yeterli olmadığından z1, z2,…

olarak adlandırılmıĢlardır. Faz 2 adı verilen ve non-spesifik özellikte olan “H”

antijenik faktörleri ise; birçok Salmonella türünde bulunmaktadır. Bu antijenik

faktörlerde 1, 2, 3, … olarak isimlendirilmiĢtir. Salmonella‟ların “H” antijen

grubundan sadece bir çeĢit Faz antijen faktörlerini içerenler monofazik; hem

Faz–1 ve hem de Faz–2 antijenlerini birlikte taĢıyanlar ise difazik bakteriler

olarak adlandırılmaktadır. Salmonella‟lar H antijenleriyle serovarlara ayrılır

(Bilgehan, 2004; Ġzgür, 2006).

Yüzeysel bir antijen olan “Vi” antijeni, glikolipid yapısında olup somatik

“O” antijeninin dıĢında bulunur (Bilgehan, 2004). “Vi” antijenleri S. Typhi, S.

Paratyphi A ve S. Paratyphi‟nin bazı suĢlarında ve istisna olarak bazı S.

Dublin suĢlarında bulunmaktadır. Bu antijeni taĢıyan suĢlar, anti-O serumları

ile aglütine olamazlar. Çünkü “O” somatik antijenini maskelerler. Bu nedenle

bu tür bakterilerin 60 ° C‟de ısıtılmasıyla “Vi” antijeni ayrılır ve etkisi kaldırılır.

Ancak “Vi” antijeninin kendisi bu ısıda tahrip olmaz . Vi antijeni bazı E. coli ve

Citrobacter suĢlarında da tespit edilmiĢtir (Bekar, 1997; Ġzgür, 2006).

Pilus antijenleri (özellikle “Tip–1 Fimbria” antijenleri) bazı Salmonella

türlerinde bulunmaktadır (Ġzgür, 2006).

Salmonella„ların identifikasyonunda, antijenik özelliklerin dikkate

alınması son derece önemlidir. Bu nedenle öncelikle “O” grubu

antiserumların karıĢımı kabul edilen Salmonella polivalan antiserumu ile

yapılan aglütinasyon testinde pozitif sonuç elde edilir ise, incelenen etkenin

Salmonella spp. olduğu kabul edilip, daha sonra “O” spesifik grup

11

antiserumları ( A, B, C, D,..) ile tekrar aglütinasyona tabi tutulur. Hareketli

Salmonella„ların, bu testlere ilaveten Faz–1 ve Faz–2‟ye ait antiserumlar da

kullanılarak izole edilen etken serotip düzeyinde identifiye edilir (Ġzgür, 2006).

1.3.6. Kimyasal ve Fiziksel Ajanlara Duyarlılığı

Salmonella etkenleri, %70‟lik etanol, %2‟lik gluteraldehit, iyot bazlı

dezenfektanlar, fenolikler ve formaldehitleri de kapsayan birçok dezenfektana

karĢı duyarlıdırlar. Nemli ısıda 121°C‟de 15 dakikada ve kuru hava sıcaklıkta

ise 160-170°C‟de 1 saatte canlılığını yitirir. Rosto ve biftek en az 63°C,

parçalanmıĢ kanatlı kısımları 77°C ve bütün karkas halindeki kanatlı eti de

82°C‟lik minimum iç ısıya ulaĢacak Ģekilde ısıtılarak Salmonella etkenleri yok

edilebilir (Anon, 2005a).

1.3.7. Salmonella’ların Bazı Çevresel Koşulları ve Gıdalarda Canlı

Kalma Süreleri

Salmonella‟lar çevresel koĢullara yüksek direnç göstererek, bazı gıdalarda

uzun süre canlılıklarını koruyabilmektedir. Salmonella‟ların yaklaĢık olarak

bahçe toprağında 9 ay, kanatlı altlığında 4 ay, kanatlı gübresinde 1 ay ve

çeĢme suyunda 2 ay süreyle canlılıklarını koruyabildikleri bildirilmektedir. S.

Gallinarum‟un ise tavukların dıĢkılarında kapalı kümeslerde, 10 gün; açık

kümeslerde 2 günden daha az canlılığını sürdürebilmektedir (Murray, 1991;

Shivaprasad, 2003; Anon, 2003).

Salmonella‟ların taze ette 14 gün, dondurulmuĢ ette 1500 günden

fazla, kurutulmuĢ yumurtada 4700 gün süreyle canlılıklarını koruyabildiği

bildirilmektedir (Erol, 2007). Ayrıca Salmonella‟ların, -37°C‟de dondurulmuĢ

ve -21°C‟de saklanan tavuk karkaslarında 13 ay boyunca canlı kalabildiği

bildirilmiĢtir (Nagaraja ve ark., 1991). Salmonella‟lar ısıya dayanıklı

değillerdir, 55 °C‟de 20 dakikada tahrip olurlar. Ancak düĢük ısıya oldukça

12

dirençlidirler. Özellikle soğukta saklanan yiyeceklerde (-18°C ve altı), uzun

süre canlı kalmaları nedeniyle Salmonella‟lardan ileri gelen gıda

zehirlenmelerinde bu durum unutulmamalıdır (Ġzgür, 2002).

1.3.8. Salmonella’ların Toksinleri

Salmonella‟lar endotoksin, enterotoksin ve sitotoksin sentezlemektedirler.

Sentezledikleri endotoksinler, özellikle, bağırsak mukozasında

harabiyete neden olmakta ve bu tür toksinleri sentezleyen Salmonella‟larla

infekte olan bireylerde Ģiddetli akut toksemi tablosu Ģekillenmektedir (Ġzgür,

2006). Endotoksinler Salmonella‟ların hücre duvarı lipopolisakkaridinin (LPS)

lipit A kısmıdır. Ġnfekte hayvanın kan dolaĢımına geçen etkenler eğer

parçalanırlarsa endotoksin vücutta ateĢ oluĢturur (Gast, 2003).

Salmonella‟ların enterotoksinleri E.coli‟nin Labil Toksinine (LT- ısıya

duyarlı) benzemektedir. Bu toksin mukozal cAMP miktarını arttırarak adenilat

siklazı aktive etmekte ve böylece bağırsak epitellerinden aĢırı sıvı salınımına

neden olduğundan, hayvanlarda elektrolit kaybı Ģekillenmektedir.

Salmonella‟ların sitotoksinleri, Shigella sitotoksinleri ile aynı

özelliktedir. Bağırsak mukozasındaki epitellerde protein sentezini

engelleyerek etkili olmaktadır (Ġzgür, 2006).

1.3.9. Salmonella’larda Patojenite Adaları

Salmonella‟ların virulans genleri sıklıkla kromozom üzerindeki Salmonella

patojenite adaları (SPA) denilen bazı bölgelerde kümelenmiĢ Ģekilde lokalize

olmuĢlardır. (Groisman ve Ochman, 1996). Bu virulans genlerinin horizantal

yolla diğer bakteri cinslerinden edinilmiĢ olduğu düĢünülmektedir. Hatta bazı

13

SPA‟lar cinse spesifik korunaklı bölge olarak kalmakta ve bazıları ise

serovara spesifiktir. Salmonella virulens genleri toplam 12 SPA‟da yer

almaktadır (Çizelge 1.7.). Salmonella infeksiyonunun intestinal kısmında

görevli virulens genleri SPA-I ve SPA-II‟de yer almaktadır. Diğer SPA‟larda

ise sistemik infeksiyon, intrasellüler yaĢam, fimbria oluĢumu, antibiyotik

dirençlilik, magnezyum ve demir tutulumu ile ilgili fonksiyonlar

düzenlenmektedir. (Groisman ve Ochman, 1996; Buhania, 2008).

Çizelge 1.5. SPA‟lara genel bakıĢ (Hensel, M. 2004. Int. J. Med. Microbiol. 294:95-102 den

uyarlanmıĢ).

Adalar Salmonella Serovarları Uzunluk (kb) Fonksiyon

SPA-1 Salmonella enterica ve S.

bongori

43 TTSS (Type 3 Secretion System),

invazyon, Demir tutulumu

SPA-2 Salmonella enterica 40 TTSS, invazyon, Sistemik infeksiyon


bongori

17 Magnezyum tutulumu, Makrofajlarda

canlı kalma


bongori

27 Makrofajlarda canlı kalma


bongori

7,6 Enteropatojenite

SPA-6 Salmonella enterica subs.

enterica serovars

59 Fimbria

SPA-7 Serovars Typhi, Dublin ,

Paratyphi

133 Vi antijeni

SPA-8 Serovar Typhi 6,8 Bilinmiyor


bongori

16,3 Tip I sekresyon sistemi ve RTX

homoloğu

SGA-1 Serovar typhimurium (DT104)

Paratyphi ve Agona

43 Antibiyotik rezistans geni

YPA

S.enterica subs. IIIa, IIIb, IV ? Demir tutulumuna yüksek affinite,

Septisemi

14

1.3.10. Salmonella’ların Antibiyotik Dirençliliği

Tavuklarda, diğer hayvansal gıdalarda ve insanlarda antibiyotiğe dirençli

Salmonella türlerinin ortaya çıkmasının ve yaygınlaĢmasının nedeni; yoğun

hayvan barınaklarında, yemlere ilaç katılımı ile insan ve hayvan

hastalıklarında antibiyotiklerin yüksek dozlarda kullanılmasıdır (D'Aoust ve

ark., 1992; Poppe ve ark., 1995; Van Duijkeren ve Houwers, 2000).

Antibiyotiklere dirençli Salmonella infeksiyonlarının oluĢumunda kontamine

hayvansal gıdaların tüketilmesinin etkisi de fazladır (Tollefson ve ark., 1997).

Antibiyotik katkılı yemle beslenen hayvanlarda antibiyotikler; et, süt ve

yumurta gibi hayvansal ürünlere geçerek, bu ürünleri tüketen insanların

sağlığını olumsuz yönde etkilemektedirler. Besinler yoluyla uzun süre az

miktarda antibiyotiğe maruz kalan tüketicide aynı ilaç daha sonraları tedavi

amaçlı kullanıldığında ilacın iyileĢtirici etkisi azalır. Çünkü çeĢitli

mikroorganizmalar zamanla belli antibiyotiklere karĢı direnç kazanmakta ve

bir antibiyotiğe karĢı dirençli olan bir bakteri suĢu genelde bu antibiyotik

familyasının diğer üyelerine de dirençli duruma geçmektedir. Bu olaya çapraz

rezistans/direnç denir (Greenberg, 1985).

Salmonella kökenlerinde antibiyotik direnci yaygın olarak plazmidlerin

kontrolü altındadır. Direnç plazmidleri üzerinde bakterilerin antibiyotik

direncini kontrol eden genler bulunur ve bu plazmidler baĢka bakterilere de

aktarılarak direncin yayılmasına neden olurlar (Filetici ve ark., 1988; Tünger

ve ark., 2002).

AB (Avrupa Birliği) 1999 yılından itibaren antibiyotiklerin kanatlı hayvan

yemlerine katılmasına iliĢkin geniĢ kapsamlı bir yasaklama getirmiĢ,

Türkiye‟de bu uygulamayı kabul etmiĢtir (Erol, 2007). Avrupa ve Türkiye„de

geriye kalan ve yem içerisinde kullanımı serbest olan son dört antibiyotik;

avilamycin, flavomycin, salinomisin sodyum ve monensin sodyum„un

kullanımı da 2006 tarihinden itibaren tamamen ve kesin olarak yasaklanmıĢtır

(Anon, 2006a).

15

Multiple-antibiyotik-rezistans (MRE) Salmonella enterica serovar

Typhimurium DT104‟ün birçok izolatının ampisiline, kloramfenikole,

streptomisine, sulfonamidlere ve tetrasiklinlere karĢı dirençli olduğu

gösterilmiĢ ve bu durum pentarezistans (beĢli dirençlilik) olarak

tanımlanmıĢtır (Mulwey ve ark., 2005). S. Typhi, S. Paratyphi, S. Infantis, S.

Uganda, S. Agona, S. Newport, S. Hadar ve S. Heidelberg gibi serotiplerle

yapılan son çalıĢmalar S. Typhimurium yanında bu serovarlarda da MRE‟ın

görüldüğünü göstermiĢtir. (Martinez ve ark., 2005; Velge ve ark., 2005;

Pokharel ve ark. 2006; Holt ve ark., 2007; Nogrady ve ark., 2007; Zhao ve

ark., 2007).

1.4. Salmonellozis’in Epidemiyolojisi

1.4.1. Konakçıları

Konakçı dağılımına bazı göre Salmonella‟lar belirli konakçılarda hastalık

oluĢtururken bazı serotipler ise çok sayıda konakçıda kolonize olabilmektedir.

Konakçı spesifik olarak tanımlanan serotipler arasında S. Paratyphi ve S.

Typhi insanlarda, S. Pullorum ve S. Gallinarum kanatlı hayvanlarda, S.

Dublin sığırlarda, S. Cholerasuis domuzlarda, S. Abortusequi atlarda, S.

Abortusovis koyunlarda hastalık oluĢturmaktadır. Konakçı spesifik olmayan

Salmonella serotipler arasında S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Virchow, S.

Hadar, S. Heidelberg, S. Newport, S. Infantis, S. Agona, S. Stanley, S.

Derby, S. Thomson sayılabilir (Akan, 2008).

Kanatlı hayvanlarda S. Pullorum / S. Gallinarum‟un neden olduğu

pullorum hastalığı ve kanatlı tifosu tavuk, hindi, bıldırcın, güvercin, serçe,

papağan ve diğer süs kuĢlarında görülmektedirler (Akan, 2008). Ayrıca

Pullorum infeksiyonlarının kanaryalarda, kanatlı tifosunun da devekuĢlarında

görüldüğü bildirilmiĢtir. Ördeklerin bu patojenlere karĢı dirençli olduğu ortaya

konulmuĢtur (Barrow ve ark., 1999; Bucholz ve Fairbrother, 1992). Pullorum

16

hastalığı genelde gençlerde görülmesine karĢın, erginlerde de ortaya

çıkmaktadır (Akan, 2008).

1.4.2. Bulaşma

Evcil hayvanların sürüler halinde olması, yemlerin, yem katkı maddelerinin

kontamine olması, kontamine sular, mezbaha atıkları, infekte yabani

hayvanlar, kuĢlar, fareler, rodentler ve insektlerin hayvanlarda infeksiyon

zincirini oluĢturdukları bildirilmektedir (ġekil 1.1) (Adams ve Moss, 1995).

Kanatlı ürünleri birçok ülkede Salmonella‟nın baĢlıca rezervuarı kabul

edilirken, domuz, sığır ve koyun etinin de diğer potansiyel kaynaklar olduğu

bildirilmektedir. Kanatlı kümeslerinin yapısının rodentler, insektler ve yabani

kanatlıların girmesine engel olamayabildiği, bununla beraber kanatlı

kümeslerinde sürü bazında yapılan yetiĢtiriciliğin Salmonella‟nın yayılmasına

yol açtığı bildirilmektedir. (D‟Aoust, 1997). Horizantal bulaĢmaya kanatlılar

arası direkt temas (kanibalismus ve infekte derideki yaralarla temas)

kontamine dıĢkı ve su aracılık eder (Gast, 2003). S. Pullorum, S. Gallinarum,

S. Enteritidis‟in yumurtalara vertikal yolla (transovarian) geçtiği de

belirlenmiĢtir (Thiagarajan ve ark., 1994).

Kanatlı hayvan kesiminde haĢlama, tüy yolma, iç organ çıkarma ve

soğutma aĢamalarında, oluĢan çapraz kontaminasyonun et ve yenilebilir

organların kontaminasyonuna neden olduğu belirtilmektedir (Erol, 2007).

Salmonella‟ların kanatlı ürünlerine bulaĢması, kanatlı etlerine

kesimhanelerde dıĢkı-karkas ve yumurtalara dıĢkı-kabuk Ģeklinde olmaktadır.

Ġnsanlara bulaĢmada özellikle bulaĢık yumurta ve tavuk eti önemli rol

oynamaktadır (Akan, 2008).

Kümeslerde çalıĢan kiĢiler ve ziyaretçiler korunma önlemleri

alınmazsa, çizmeleri, elleri ve üzerindeki kıyafetler vasıtasıyla etkenleri bir

17

kümesten diğerine bulaĢtırabilirler. Ayrıca iĢletmelere girip çıkan araçlar,

vahĢi kuĢlar, memeliler ve insektler infeksiyonun taĢınmasına neden olurlar

(Gast, 2003).

1.5. Salmonellozis’in Patogenezi

Mikroorganizmalar vücuda alındığında ve ince bağırsağa ulaĢtığında

enfeksiyon baĢlar. Bakteriler, villilerdeki epitelyum hücrelerine yapıĢır ve

lamina propria tabakasına hücum ederler, böylece konakçının lenfatik

sistemine girerler. Makrofajlar tarafından yutulup makrofaj içinde ürerler.

Makrofajlardan kana geçer ve bu yolla karaciğer, dalak, safra kesesine

ulaĢarak enfeksiyona neden olur (ġekil 1.2. ).

18

Hastalık süreci uzadığında, ince bağırsak mukozasında fokal nekrotik

lezyonların gözlendiği ağır enterit tablosu Ģekillenir. Sekumda peynirimsi

kazeöz eksudat gözlenir. Dalak ve karaciğer genellikle siĢkin ve dolgun,

düzensiz hemorajik veya fokal nekrotik odaklarla kaplıdır. Böbrekler bazı

durumlarda büyümüĢ ve konjesyonlu olabilir. Fibrinoprulent perihepatit ve

perikardit en çok bildirilen bulgulardan birisidir. S. Enteritidis ile infekte kanatlı

yumurtacı sürülerinde infeksiyonun az yangılı döneminde yumurtalıklarda ve

yumurta kanalında heterofil infiltrasyonu fokalden diffuz dağılıma doğru

değiĢim gösterir. EmilmemiĢ ve pıhtılaĢmıĢ sarı kese mevcuttur. Bazen

panoftalmitis, purulent artritis, hava keselerinin yangısı ve omfalitis gibi diğer

lezyonlar da görülebilir (Gast, 2003).

Şekil 1.2. Salmonella‟ların intestinal mukozaya invazyonu (Giannella, 2006)

Salmonella‟lar çoğunlukla intestinal epiteliyal hücrelerde yerleĢseler

de, sekum ve ileumun birleĢme yerine özellikle ilgi duyarlar. Ġntestinal

epiteliyal hücrelerin Salmonella ile invazyonu, intestinal içeriğin akıĢkanlığını

ve elektrolit dengesini değiĢtirerek çesitli anormalliklere yol açmaktadır. Bu

olaylar sonunda Ģiddetli ishal Ģekillenir (Gast, 2003).

Yumurtacı ırklarda etkenin lokalizasyonu seksüel olgunlaĢmanın

baĢlangıcında ovaryum ve oviduktta olmaktadır. Bu nedenle S. Pullorum ve

S. Enteritidis‟in yumurta ile saçılımı önem kazanmakta, yumurtlama sırasında

19

yumurta kabuğunun dıĢkı ile kontaminasyonuna bağlı olarak, yumurta

etkenle bulaĢmaktadır (Gast, 2003).

Gıda yolu ile alınma sonrasında Salmonella‟lar ileum ve kolonda

intestinal epitel villusları yüzeyindeki spesifik adhezyon reseptörlerine

bağlanırlar ve kolonize olurlar, pinositoz ile hücre içine alınırlar. Epitel

hücrelerindeki villus yapısı, elektrolit denge bozuklukları gibi nedenlerle

diyare meydana gelir. Hücre içinde vakuollerde yer alan Salmonella‟lar, bir

hücreden diğerine geçebilirler. Salmonella‟ların lizozomal sindirimden

kurtulabilmeleri daha derin dokulara invaze olabilmelerine fırsat verir. Sağlıklı

bireylerde Salmonella‟ların kana karıĢmaları nötrofiller ve makrofajların

fagositozu ile engellenmektedir. (Çarlı ve ark., 2004; Ġzgür, 2006).

1.6. Salmonella İnfeksiyonunda Semptomlar

Salmonella‟lar insanlarda baĢlıca üç tip klinik belirti oluĢturarak infeksiyon

yapabilirler (Akman ve Gülmezoğlu, 1976).

1.6.1. Enterik Ateşler

Bu grupta tifo ve paratifo infeksiyonları vardır. Bu mikroorganizmalar bulaĢık

besinler ya da içilen içeceklerle vücuda girince ince bağırsaklardan bağırsak

lenf yumrularına geçerler, daha sonra kan dolaĢımına karıĢıp böbrekler ve

bağırsaklar da dâhil olmak üzere birçok organa yayılırlar. Bu tip

infeksiyonlarda görülen en belirgin lezyonlar lenf yumrularında hiperplazi ve

nekrozlar, karaciğerde odaklar Ģeklinde nekrozlar, safra kesesinde bazen

periost ve akciğer gibi organlarda meydana gelen irinleĢmedir (Akman ve

Gülmezoğlu 1976; Bilgehan, 1992).

20

1.6.2. Septisemiler Bu grup infeksiyonlarda mikroorganizmaların ağız yoluyla alınmasından

sonra kan dolaĢımı istilaya uğrar. Mikroorganizmalar bütün organlara

yayılarak odak Ģeklinde irinleĢmeler, apseler, menengitis, osteomiyelitis,

pneumoni ve endokarditis yapabilirler (Akman ve Gülmezoğlu 1976;

Bilgehan, 1992).

1.6.3. Gastroenteritis Buna çoğu kez gıda zehirlenmesi de denilmektedir. Bu tip hastalık S.

Typhimirium, S. Enteritidis baĢta olmak üzere diğer bazı Salmonella

serovarları ile de oluĢturulabilir. Hastalık belirtileri genellikle 1–3 günlük

kuluçka süresinden sonra ortaya çıkar. Hastalığın asıl nedeni

Salmonella‟ların endotoksinleridir (Akman ve Gülmezoğlu1976; Bilgehan,

1992).

1.6.4. Kanatlılarda Semptomlar

Salmonella enfeksiyonlarının bir haftalıktan küçük civcivlerde yüksek

mortalite ile seyrettiği rapor edilmiĢtir (Lister, 1988). Çoğu klinik vakalar çok

genç tavuklarda görülmektedir. ĠĢtahsızlık, uyuĢukluk, diyare, susuzluk ve

merkezi sinir sistemi belirtileri görülebilir (Anon, 2005a). Hastalık, solunum

belirtileri, düĢkünlük ve beyazımtrak bir ishalle seyreden septisemik form

halindedir. Perakut seyrettiği durumlarda artritis ve omfalitis de görülebilir.

Ergin hayvanlarda genellikle semptom görülmemesine karĢın, akut olgularda

iĢtahsızlık, diyare, yumurta veriminde düĢüĢ, ilk günlerde ateĢ izlenebilir

(Ġzgür, 2006).

Kanatlılardaki paratifo infeksiyonunda Salmonella‟ların yumurtayı

infekte etmesi yüksek embriyonik ölümlere yol açar ve yumurtadan yeni çıkan

civcivlerde klinik belirtiler oluĢmaksızın hızlı bir Ģekilde ölümler gözlenir.

21

Paratifo enfeksiyonlarından kaynaklanan civciv ölümleri en çok 6 ve10‟uncu

günler arasında olmaktadır (Gast ve Beard, 1990; Shivaprasad ve ark., 1990;

Nagaraja ve ark., 1991). Paratifo infeksiyonlarındaki iĢtahsızlık, zayıflık,

körlük, halsizlik, titreme, sıcak kısımlarda bir arada toplanma, diyare,

dehidrasyon ve topallık gibi belirtilerinden biri, birkaçı veya hepsi bir arada

bulunabilir (Gast, 2003). S. Gallinarum veya S. Pullorum ile infekte

yumurtalarda kabuk altı ölümler gözlenir. Civcivlerde geliĢme geriliği görülür,

kloakaları beyaz materyalle kaplıdır ve ölümler ikinci veya üçüncü haftada en

yüksek seviyeye ulaĢır. Hayatta kalanlarda geliĢme geriliği gözlenir, taĢıyıcı

olarak kalırlar ve hastalığın bulaĢma kaynağını oluĢtururlar (Shivaprasad,

2003). S. Pullorum infeksiyonlarında tavuklarda körlük ve tibio-tarsal,

humero-radial ve ulnar eklemlerde ĢiĢlik görülebileceği de bildirilmiĢtir.

(Johnson ve ark., 1992; Mayahi ve ark., 1995).

1.9. Teşhis

Günümüzde gıdalardan Salmonella‟ların izolasyon ve identifikasyonu için;

klasik kültür tekniği, immunolojik yöntemler, empedans, DNA-DNA

hibridizasyon, DNA amplifikasyon, immunomagnetic separation (IMS),

enzime bağlı antikor-hidrofobik grid membran filtre (Enzyme Linked Antibody

Hydrophobic Grid Membrane Filter), enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA), immuno-kromotografi, kemiluminesent immunoassay ve bacterial

ice-nucleation tekniği gibi farklı analiz metodlarından yararlanılmaktadır

(Flowers ve ark., 1992; Baylis, 2000).

1.10. Laboratuvar Muayenesi

Gıdalardan Salmonella‟ların izolasyon ve/veya identifikasyonu için ISO (The

International Organization for Standardization), AFNOR (Association

Francaise de Normalisation), AOAC (Association of Official Analytical

22

Chemists), APHA (American Public Health Association), FDA (U.S.Food and

Drug Administration), HPB (Health Protection Branch-Canada), ICMSF

(International Commission on Microbiological Specifications for Foods), NAS

(National Academy of Sciences), USDA (U.S. Department of Agriculture) gibi

çeĢitli uluslararası akredite kuruluĢlar tarafından hazırlanan standartlar

bildirilmektedir. Bu amaçla kullanılan önzenginleĢtirme/selektif zenginleĢtirme

sıvı ve katı besi yerleri de farklılıklar göstermektedir (Tietjen ve Fung, 1995).

1.8.1. Bakteriyoskopi

Gram boyama yapıldıktan sonra mikroskopta incelenen örneklerde Gram

negatif orta boyutta çomaklar görülür. Fakat mikroskoptaki inceleme tek

baĢına yetersizdir. Enterobacteriaceae‟ların birçoğu benzer Ģekle sahiptir

(Quinn ve ark., 1994).

1.8.2. Kültür

Salmonella izolasyonu için genellikle, ön zenginleĢtirme, zenginleĢtirme ve

selektif ekim olmak üzere üç kültürel prosedür aĢaması kullanılmaktadır

(Horrox, 1995). Ön zenginleĢtirme aĢaması ısıtma, dondurma, çözündürme,

ozmotik Ģok, düĢük nemli gıdaların modifiye atmosferde uzun süre

depolanması veya yüksek sıcaklık gibi çevresel faktörler sonucu zarar

görmüĢ Salmonella’ların yenilenmesi amacıyla uygulanmaktadır (Tietjen ve

Fung, 1995). Ön zenginleĢtirmede selektif olmayan besiyerleri

kullanılmaktadır (Horrox, 1995). Bu amaçla en çok kullanlan besi yerleri

TamponlanmıĢ Peptonlu Su (TPS) ve Laktoz Broth (LB)‟dur (Fricker, 1987).

Selektif zenginleĢtirme aĢamasında, diğer mikroorganizmaların geliĢimi

sınırlanırken gıda içinde Salmonella’ların geliĢimi sağlanmaktadır (Amaguana

ve Andrews, 1999). En yaygın kullanılan zenginleĢtirme besiyerleri,

23

Salmonella geliĢimini teĢvik eden sistin içeren Selenite-cystine buyyon,

tetrationat, safra ve brilliant green içeren Muller-Kauffman tetrationate buyyon

(MKTT), malaĢit yeĢili ve magnezyum klorit içeren Rappaport- Vassiliadis

(RVS) buyyondur (Adams ve Moss, 1995).

Salmonella izolasyonunda kullanılan katı besiyerleri XLT4 Agar (Xylose

Lysine Tergitol-4 Agar), BGA Agar (Brilliant Green Agar), XLD Agar (Xylose

Lysine Deoxycolate Agar), HE Agar (Hektoen Enteric Agar), BS Agar

(Bismuth Sulfid Agar), SS Agar (Salmonella Shigella Agar ), DCA Agar

(Deoxycholate Citrate Agar), DCLS Agar (Deoxycholate Citrate Lactose

Sucrose Agar), MSRV (Modifiye Semi-Solid Rappoport Vassiliadis), MLCB

Agar (Mannitol Lysine Crystal Violet Brilliant Green Agar)‟lardır (Bell ve

Kyriakides, 2002).

H2S pozitif Salmonella spp. kolonileri 18–24 saatlik inkübasyondan

sonra siyah veya siyah merkezli periferi pembeden kırmızıya değiĢen siyah

merkezli koloniler oluĢur. XLT4 agar, XLD agardan farklı olarak içinde

sodyum dezoksilat yerine iyonik olmayan surfaktan bir madde olan tergitol–4

bulunan selektif bir agardır. XLT4 agarda tipik Salmonella kolonileri siyah ya

da siyah merkezli pembe-kırmızı koloniler Ģeklinde ürerler. XLT4 agarda

Proteus, Pseudomonas, Providencia, Yersinia enterocolitica, Acinetobacter

calcoaceticus üremez (Bekar, 1997; Koneman ve ark., 2006). XLT4 agar

drag svaplardan ve kümes içi materyalden Salmonella spp. izolasyonunda

baĢarıyla kullanılmaktadır (Miller ve ark.,1991).

BGA laktoz, fenol red ve selektif ajan brilliant green içermektedir.

Salmonella‟lar laktoz negatif olduğundan pembe renkli koloniler

oluĢturmaktadır (Popoff ve Le Minor, 2005). Daha sonraları bu agarın içine

laktoz ve sükroz katılarak BPLS (Brilliant Green Lactose Sucrose Agar)

geliĢtirilmiĢtir. Bu agarda hemen hemen Salmonella‟ların hepsi laktoz ve

sükrozu kullanamamakta ve pembe, kırmızı renkte koloniler oluĢturmakta

http://www.google.com.tr/url?sa=t&source=web&cd=3&ved=0CCoQFjAC&url=http%3A%2F%2Fwww.mikrobiyoloji.org%2FTR%2Fyonlendir.aspx%3FF6E10F8892433CFFAAF6AA849816B2EF44C5498E65CCBF29&ei=e8HiTfLUEIGN-wb6rYXfBg&usg=AFQjCNETTIhoFNMEBpLXn55kbESrpGkDaQ

http://www.google.com.tr/url?sa=t&source=web&cd=3&ved=0CCoQFjAC&url=http%3A%2F%2Fwww.mikrobiyoloji.org%2FTR%2Fyonlendir.aspx%3FF6E10F8892433CFFAAF6AA849816B2EF44C5498E65CCBF29&ei=e8HiTfLUEIGN-wb6rYXfBg&usg=AFQjCNETTIhoFNMEBpLXn55kbESrpGkDaQ

24

olup birçok araĢtırıcı tarafından Salmonella‟laların tespitinde kullanılması

tavsiye edilmiĢtir (Mallinson, 1990; Waltman ve ark., 1995).

Bu besiyerlerine alternatif olarak son yıllarda spesifik enzimler için

substrat olarak görev alan bileĢimler olan kromojenik enzim substratları ile

enzim aktivasyonu sonucu oluĢan renk değiĢiminden faydalanılan kromojenik

agarlar devreye girmiĢtir. Bunlarlara örnek olarak RA (Rambach Agar), CAS

(CHROMagar Salmonella Medium), SCM (Salmonella Chromogenic

Medium), CSE (Chromogenic Ester Agar Medium), ABC Medium (α-β

Chromogenic Medium), SM-ID Medium (Salmonella Detection and

Identification Medium) verilebilir. Kromojenik agarların maliyetleri bir

dezavantaj olarak gözükse de izolasyonda yüksek duyarlılık ve özgünlükleri,

göreceli olarak identifikasyon zamanının kısalması ve harcanan emeğin

azalması göz önünde bulundurulursa, bu besiyerlerinin kullanımı aslında

laboratuvarlar için birer avantaj olarak görülmektedir (Freydiere ve Gille,

1991; Herbert ve Altwegg, 1993; Cooke ve ark., 1999; Perry ve ark.,1999;

Nye ve ark., 2002; Maddocks ve ark., 2002; Cassar ve Chuschieri , 2003).

1.8.3. Biyokimyasal Testler

Selektif katı besiyerinde geliĢen Ģüpheli koloniler kullanılarak Salmonella’ların

identifikasyonu yapılır. Bu amaçla, Triple Sugar Iron Agar (TSIA) ve Lysine

Iron Agar (LIA) kullanılmaktadır. Bu agarlarda Salmonella reaksiyonları

gösteren tüpler, diğer biyokimyasal testlere tabi tutulur. Üreaz testi, lisin

dekarboksilaz testi, dulsitol fermantasyon testi, KCN buyyonda geliĢim,

sodyum malonit kullanımı, indol testi uygulanan diğer testlerdir (Doyle ve

Cliver, 1990).

Salmonella’lar basit olarak TSIA‟da besiyerindeki ile tanınmaktadır.

ġüpheli koloniden Triple Sugar Iron agar besiyerine iğne uçlu öze ile sürme

ve dibe iğne uçlu öze ile daldırma yapılır. Ġnkübasyon sonunda besiyerinin

dip kısmının sarı (glikozun kullanımı) ve siyah olması (H2S oluĢumu), yüzeyin

25

kırmızı olması (laktoz ve sakkarozun kullanılmaması) besiyerinde gaz

delikleri ve/veya yarıkları oluĢması ve/veya besiyerinin dip kısmından yukarı

doğru itilmesi (glikozdan gaz oluĢması) Salmonella‟yı doğrular. Bazı hallerde

siyah renk dipteki sarılığı örtecek kadar baskın olabilir. Salmonella’lar genel

olarak glikoz pozitif, glikozdan gaz oluĢturma pozitif, H2S pozitif, laktoz

negatif, sakkarozdan gaz oluĢumu negatif bir bakteridir. Salmonella

analizinde Proteus kolonilerinin morfolojileri Salmonella‟lara benzemeleri

nedeni ile çoğu zaman yanlıĢ sonuçlara neden olmaktadır. Bu iki bakterinin

kesin ayrımı üre testi ve lizin dekarboksilaz testi ile yapılmaktadır.

Salmonella’lar üre negatif, Proteus ise üre pozitiftir. Ayrıca Salmonella‟larda

lizin dekarboksilaz oluĢumu pozitif olup tüpün dibinde mor renk oluĢumu

gözlemlenirken, Proteus‟larda lizin dekarboksilaz negatiftir ve tüpün dibinde

sarı renk oluĢumu gözlemlenir (Quinn ve ark., 1994; Halkman, 2005).

1.8.4. Serolojik Testler

Biyokimyasal testler sonucunda Salmonella olarak identifiye edilen suĢların

serolojik olarak doğrulanması maksadıyla bütün altgrupların antikorlarını

bulunduran polivalan antiserumlar kullanılır (Koneman ve ark., 2006).

Serotiplendirme için hücre duvarı polisakkarit antijenlerinden hazırlanmıĢ

spesifik „O‟ , flagella antijenlerinden hazırlanmıĢ „H‟ ve yüzey antijenlerinden

hazırlanmıĢ „Vi‟ antiserumları ile serolojik teste tabi tutulurlar. Bunun için,

spesifik “O” antijenine karĢı lam aglütinasyon ve flagellar “H” antijenine karĢı

tüp aglütinasyon testleri uygulanır (Quinn ve ark., 1994; Ġzgür, 2002;

Bilgehan, 2004).

26

1.8.5. Moleküler Teknikler

1.8.5.1. PCR

PCR tekniği, selektif sıvı ve katı besiyerlerine ekim ile biyokimyasal ve

serolojik testlere ihtiyaç duyulmadan, primerler aracılığıyla hedef DNA‟nın

amplifikasyonu yapılarak gıdalardan patojenlerin büyük bir çoğunluğunun

belirlenmesinde kullanılmaktadır (Jones ve ark., 1993; Candrian, 1995). PCR

tekniği ile DNA amplifikasyonunun prensibi; çift sarmallı kalıp DNA‟nın ısı ile

denatürasyonu, tek sarmallı DNA‟lara primerlerin bağlanması ve polimeraz

enzimi yardımıyla primer uzatılması aĢamalarından oluĢmakta ve bu 3

aĢama 1 siklusu oluĢturmaktadır. Saptama süresi de 1-2 güne indirilmektedir

(Candrian, 1995).

PCR tekniği kullanılarak, saf kültürlerden veya seçici zenginleĢtirme

besiyerlerinden (Aabo ve ark., 1993; Stenovicova ve ark., 1998; Bach ve ark.,

2002), ön zenginleĢtirme besiyerlerinden (Rijpens ve ark.,1999) veya

gıdalardan (Lin ve Tsen, 1996) elde edilen izolatlar ile Salmonellaların

tanımlanması yapılabilmektedir.

PCR, nükleik asitlerin istenilen bölgelerinin, bölgeye özel, sentetik

oligonükleotid primerleri kullanılarak, in vitro kopyalanmasını esas alır. Hedef

olarak genomik DNA'nın ayırıcı özellik taĢıyan farklı bölgeleri kullanılabilir.

Yöntemde kopyalama iĢleminin kısa sürmesi büyük bir avantajdır. Yöntemin

bir diğer avantajı ise, az miktarlarda hedef molekül olduğu durumlarda bile

sonuca ulaĢılabilmeyi sağlamasıdır (Sarmiento ve ark., 2003).

DNA‟nın çoğaltılabilmesi için PCR tepkime karıĢımında olması gereken

elemanlar; hedef nükleik asit, primerler, Taq (Thermus aquaticus) DNA

polimeraz enzimi, deoksinükleotid trifosfatlar (dNTPs), Mg++ tamponu ve

sudur. Çoğaltımı yapılan PCR ürünleri, değiĢik yöntemlerle belirlenir. En

yaygın olarak kullanılan yöntem, agaroz jel elektroforezidir. Çoğaltılan DNA

ürünleri, agaroz jel elektroforezinde görülebilmesi için floresans bir boyayla

27

boyanır. OluĢan DNA bantları UV ıĢığı altında görünür hale gelir (Sarmiento

ve ark., 2003).

Salmonella PCR çalıĢmalarında, Salmonella DNA‟sının hedef bölgeleri

olarak rfb geni (Shah ve ark., 2005), OriC geni (replikasyon baslangıç

bölgesi) (Elizaquivel ve Aznar, 2008), invA geni (invazyon A geninin bir

bölgesi) (Jenikova ve ark., 2000; Cortez ve ark., 2006), spvR geni

(Salmonella virülans plazmid genleri) (Caldwell ve Gulig, 1991; Sheehan ve

Dorman, 2002), iroB geni (Fur-regulated gene) (Baumler ve ark., 1997; Leon

ve ark., 2005), OmpC geni (dıĢ membran protein genleri) (Kwang ve ark.,

1996), fliC geni (Aldridge ve ark., 2006), sefA geni (Woodward, 1996;

Ogunniyi ve ark., 1997), IS200 (Botjes ve ark., 1998; Crichton ve ark., 2000),

16S rRNA gen bölgesi (rDNA) dizilimleri (Lin ve ark.,2004) kullanılmıĢtır.

Salmonella’lar bağırsak duvarına yayılarak (invazyon yolu ile) hastalık

yapan bir patojen etkenlerdir. Yapılan çalıĢmalarda Salmonella‟ların

invazyonundan sorumlu olan ve çok iyi korunmuĢ invA gen bölgesini

kodlayan bir gen bölgesi olduğu saptanmıĢtır. Ġnvazin proteini üzerindeki invA

gen bölgesinin çalıĢma esnasında kullanılan sekans dizini sadece

Salmonella türlerine özgüdür (Rahn ve ark., 1992).

Propidium monoazide (PMA) ve ethidium monoazide (EMA) ölü ve

canlı bakteri hücrelerinin ayrımında baĢarı ile kullanılmaktadır. Söz konusu

boyalar ölü hücrelerin içine rahatlıkla girebilmekte ve PCR tekniğinde

gerçekleĢtirilen amplifikasyon iĢlemini inhibe etmektedir. (Nocker ve ark.,

2006).

1.8.5.2. Real-time PCR

Higuchi ve arkadaĢları tarafından 1992 yılında geliĢtirilen real-time

PCR (Polymerase Chain Reaction) (Higuchi ve ark.,1992; Higuchi ve

28

ark.,1993) termal cycler cihazından elde edilen bilgilerin bilgisayara

aktarılması ile PCR ürünlerinin gerçek zamanlı tespitini sağlayarak teĢhis

çalıĢmalarına hız kazandırmıĢ, kullandıkları sistem sayesinde sonuçların

güvenliğini ve tekrarlanabilirliğini arttırmıĢtır (Mackay ve ark., 2002). real-time

PCR, geleneksel PCR‟ın uygulama alanlarını arttırırken PCR‟la iliĢkili pek çok

laboratuvar sorununa da çözüm getirmiĢtir. Bu yöntem sayesinde DNA ve

RNA örnekleri kalitatif ve kantitatif olarak kısa sürede analiz edilebilmekte ve

çok sayıda örnek son derece az bir kontaminasyon riskiyle güvenle

çalıĢılabilmektedir (Ma ve ark., 2006).

Bir florasan boya olan ethidium bromide (EtBr)‟in nükleik asitlere

bağlandığında florasan parlamasının arttığı 1966‟dan beri bilinmektedir ve

bunun yardımı ile jel elektroforez‟de toplanarak bant oluĢturan DNA

parçacıkları ultraviyole (UV) altında görüntülenmekte ve fotoğrafları

çekilmektedir. Ancak PCR ürünlerinin florasan problar yardımı ile gerçek

zamanlı görüntülenmesi 1990‟larda baĢlamıĢtır (Valasek ve Repa, 2005).

real-time PCR nükleik asitlerin miktarlarının belirlenmesinde günümüzde

yaygın olarak kullanılan bir metotdur. “real-time PCR”da oluĢan ürün miktarı

reaksiyon boyunca oluĢan ürün miktarıyla orantılı olarak artan floresan

boyanın verdiği sinyalin izlenmesiyle belirlenir (Günel, 2007). Dolayısıyla

real-time PCR‟da polimeraz zincir reaksiyonu boyunca her amplifikasyon

döngüsünde çoğalan DNA miktarı ile paralel olarak artıĢ gösteren floresans

sinyaller toplanmakta ve bu sinyaller her bir örnek için sayısal değerlere

çevrilmektedir (Leutenegger, 2001; Kubista ve ark., 2006; Adams, 2006).

Testte; florasan iĢaretli ve iĢaretsiz olmak üzere iki adet prob

kulanılmakta, iĢaretsiz primer, istenen DNA parçasının ucuna, iĢaretli olansa

ortasına bağlanmaktadır. Uca bağlanan iĢaretsiz primerden baĢlayan

polimerizasyon iĢlemi esnasında ortaya bağlanan florasan iĢaretli prob

(quencher) ayrılarak ortama atılmakta ve florasan parlama vermektedir (ġekil

1.3). OluĢan PCR ürünü arttıkça, ayrılarak ortama atılan florasan iĢaretli

primer sayısı da artmakta ve bu artıĢın floarasan parlamaya duyarlı bir video

29

kamera ile tespit edilerek bilgisayara parabol Ģeklinde bir eğri olarak

yansıtılması ile sonuçlar görüntülenmektedir (Lee ve ark., 1993a; Valasek ve

Repa, 2005).

Şekil 1.3. real-time PCR‟da florasan probların iĢlevi (Lee ve ark., 1993a)

Real-time PCR‟da ürünlerin analizi reaksiyon sırasında yapılmaktadır.

Bu nedenle klasik PCR tekniğinde ihtiyaç duyulan agaroz jel elektroforezi,

DNA bantlarının mor ötesi ıĢık altında görüntülenmesi gibi iĢlemlerin

uygulanmasına gerek kalmamaktadır. Real-time PCR ürünlerinin kalitatif ve

kantitatif analizlerinde, diziye özgün olmayan floresan boyalardan ya da

diziye özgün problardan yararlanılmaktadır. Böylece sonuçlar anında

alınmakta, kontaminasyon riski azalarak tüm iĢlemler otomatik olarak devam

etmektedir (Ma ve ark., 2006; Kubista ve ark., 2006).

1.8.5.3. 16S rRNA Gen Sekans Analizi

1980‟lerde bakterilerin identifikasyon için yeni bir standart

geliĢtirilmeye baĢlanmıĢtır. Bakterilerin genetik kodlarının stabil bir parçasının

karĢılaĢtırılmasıyla aralarındaki filogenetik yakınlığının belirlenebileceği

ortaya konmuĢtur (Woese, 1987; Woese ve ark., 1985). Bakteri genetik

bölgesinde bunun için aday genler 5S, 16S ve 23S rRNA ve bu genlerin

arasındaki bölgeleri kapsamaktadır. Günümüzde bakteri taksonomisi

amacıyla en yaygın olarak kullanılan DNA bölümü 16S rRNA genidir (Bottger,

30

1989; Palys ve ark., 1997; Kolbert ve Persing, 1999; Tortoli, 2003; Harmsen

ve Karch, 2004).

16S rRNA yaklaĢımı mikrobiyal taksonomide en geniĢ çapta kullanılan

standart tekniklerden biridir. (Woese, 1987). 16S rRNA sekans analizleri iki

organizma molekülü arasındaki akrabalığı tür düzeyi ve yukarısındaki

kategorilerde ortaya koymaktır. Ancak, aynı türe ait olan organizmalar

arasındaki ayırt ediciliği ortaya koyması için tek baĢına yeterli bir teknik

değildir (O‟Donnell ve ark., 1993).

16S rRNA gen sekansı yaklaĢık 1550 bp (base pair) uzunluktadır ve

değiĢken, korunmuĢ bölgelerden oluĢur. (Chen ve ark., 1989; Relman, 1999).

500 bp uzunluktaki kısım maliyet açısından daha ucuz ve uygulanabilirliği

daha kolay olduğu için sekans analizlerinde daha yaygın olarak

kullanılmaktadır. 16S rRNA gen sekans analiz aĢamaları sırasıyla DNA

ekstraksiyonu, PCR aĢaması, pürifikasyon aĢaması, sekans döngüsü,

pürifikasyon aĢaması, sekans analizi, elektroferogramların değerlendirilmesi

ve verilerin yorumlanması aĢamalarından oluĢmaktadır Nükleotid sekansların

en geniĢ bilgi bankası olan GENBANK, 90000‟nin üzerinde 16S rRNA genine

sahip olan 20 milyonun üzerinde sekans bilgisini barındırmaktadır. Türü

bilinmeyen bir bakteri suĢunun sekansı ile GENBANK‟ta sekans bilgisi

bulunan bakteriler karĢılaĢtırılılarak, bilinmeyen bakterinin identifikasyonu

yapılabilir (Clarridge, 2004).

BLAST (Basic Local Alingment Search Tool), aranan dizi sırasını

(nükleotid veya aminoasit) veri tabanında bulunan mikroorganizmalara ait

baz dizileri ile karĢılaĢtırarak aynı veya en yakın olan dizi sırasının ait

olduğu mikroorganizmayı, % benzerlikle veren bir bilgisayar programıdır.

BLAST, moleküler biyoloji ile ilgili bilgileri bir kaynakta toplamayı ve genom

verilerinin bilgisayar ortamında analiz edilmesi için bilgisayar programları

geliĢtirmeyi amaçlayarak, 1988 yılında kurulan National Center for

Biotechnological Information adlı kuruluĢ tarafından geliĢtirilmiĢ bir veri

31

tabanıdır. Dizi analizi yapılarak aranan bölgenin baz dizisi belirlendikten

sonra, bu dizi internet sayfasında bulunan program kullanılarak veri tabanı ile

karĢılaĢtırılır. Tarama sonucu, aranan dizi sırasının hangi mikroorganizmaya

ait olabileceğini, benzerlik yüzdesi ile verir. BLASTN bir nükleotid dizisi ile

komplementer diziyi ele alarak nükleotid dizisi veri tabanlarıyla

karĢılaĢtırır. Hız amacıyla tasarlanmıĢtır. Yüksek duyarlılık aranan durumlar

için uygun değildir (Polat ve Karahan, 2009).

1.8.6. Alternatif Hızlı Tanı Teknikleri

Salmonella‟ların tanısı için kullanılan en sık kullanılan alternatif teknik

ELISA‟dir (Blais ve ark., 1998). Salmonella antikorları, katı bir substrat

üzerine örneğin ELISA pleytlerindeki kuyucuklara konur ve önzenginleĢtirme

sıvısında bulunan, Salmonella antijenlerini yakalamakla görevlidirler. (Bell ve

Kyriakides, 2002). Günümüzde EIAFoss (Foss Electronics, Hillorod,

Denmark), VIDAS (Biomerieux) ve TECRA Salmonella Visual Assay (TECRA

Diagnostics, UK) gibi birçok ELISA tabanlı sistemler mevcuttur (Bell ve

Kyriakides, 2002).

Salmonella belirlenmesinde kullanılan antikora dayalı olarak çalıĢan bir

baĢka metot ise, IMS (Immunomanyetik Seperasyon)‟dur (Shaw ve

ark.,1998). IMS yönteminde, Salmonella antikorları ile kaplanmıĢ küçük

magnetik boncuklar, önzenginleĢtirme sıvısında bulunan kendisine spesifik

Salmonella antijenlerini yakalamakla görevlidir. (Bell ve Kyriakides, 2002).

Ayrıca alternatif hızlı tekniklere örnek olarak immuno-kromotografi,

kemiluminesent immunoassay, elektrik iletkenliğiyle ilgili teknikler ve

bakteriyofaj ve indikatör boya kapsayan bir yöntem olan bakteriyel ice-

nucleation tekniği verilebilir. (Baylis, 2000).

32

1.9. Koruma ve Kontrol

Tarım ve KöyiĢleri Bakanlığı Koruma ve Kontrol Genel Müdürlüğünce 2007

yılında baĢlatılan ve Ticari Yumurtacı Kümeslerde Salmonella Kontrol

Programı Talimatı ve Broiler Kümeslerinde Salmonella Kontrol Programı

Uygulama Talimatları çerçevesinde yürütülen iki çalıĢma bulunmaktadır

(Akan, 2008).

Ticari iĢletmelerde Salmonella Kontrol Programının uygulanması, son

üründe Salmonella pozitifliğini azaltacağından sağlıklı gıda üretimine katkı

sağlayacaktır. ĠĢletmede Salmonella sıklığı yüksek ( > %40), orta (%10-40)

ve düĢük (< %10) düzeyde olmasına göre program belirlenir. Bu aĢamadan

sonra uygulanacak programla Salmonella azaltılması için hedefler takip

edilmelidir (Akan, 2008).

Sonuç olarak, kanatlı iĢletmeleri için “Salmonella Kontrol Programı”nın

oluĢturulması gereklidir. Bu amaçla; damızlık sürülerin periyodik olarak

izlenmesi ve negatifliğin sağlanması, biyogüvenlik önlemlerinin eksiksiz

olarak yerine getirilmesi, kanatlı ürünlerinde Salmonella varlığının

belirlenmesi ve izole edilen etkenlerin tiplendirilmesi hedeflenmelidir. Ayrıca

ülke düzeyinde “Salmonella Kontrol Programı”nın oluĢturulması ve bu

amaçla; resmi otorite- iĢletme iĢbirliği yapılmalıdır. Bu program kapsamında

yumurtacı sürülerde S. gallinarum/pullorum infeksiyonları çözüme

kavuĢturulmalı ve yumurtacı, broiler sürülerde paratifo infeksiyonlarının

azaltılması sistematik olarak gerçekleĢtirilmelidir. Bir diğer önemli konu ise,

izole edilen Salmonella‟ların tiplendirilmesi ve antibiyotik duyarlılıkların

belirlenmesi, insan sağlığını korumak için kaçınılmazdır (Akan, 2008).

Yumurta, civciv ve tavuklar sadece Salmonella ari damızlık

kümeslerden alınmalıdır. Kuluçkalık yumurtalar tam olarak dezenfekte

edilmeli ve sanitasyon standartlarına göre kuluçkaya konmalıdır. Kümesler

temizlenmeli ve dezenfekte edilmelidir. Rodent ve insekt kontrolleri düzenli

33

olarak yapılmalıdır. Biyogüvenlik tam olarak uygulanmalı, kümesler arası ve

dıĢardan Salmonella‟ların giriĢi engellenmelidir (Ġzgür, 2002).

Damızlık hayvanlara sadece peletlenmiĢ ve hayvansal protein kaynağı

içermeyen yemler verilmelidir. Salmonella infeksiyonlarıyla mücadelede

sağaltıma ek olarak yarıĢla dıĢlama (competitive exclution; CE) kültürleri

veya aĢı uygulanabilir. Bu Ģekilde uygulanan koruma ve kontrol

programlarının hem tavuklarda hem de hindilerde baĢarıya ulaĢtığı

bildirilmiĢtir (Ġzgür, 2002).

Bu çalıĢmada Marmara ve Karadeniz bölgesindeki kesimhanelerden

temin edilen tavuk karkaslarında Salmonella‟ların varlığının araĢtırılması,

Salmonella tanısında kültür ve real-time PCR‟ın kullanımı ile tespit edilecek

Salmonella suĢlarının antibiyotik dirençliliklerinin belirlenmesi ve sekans

analizine tabi tutulması amaçlanmıĢtır.

34

2. GEREÇ VE YÖNTEM

2.1. GEREÇ

2.1.1. Salmonella İzolatları

Bu çalıĢmada Salmonella spp. izolasyonu ve identifikasyonu amacıyla; Ocak

2008–Ocak 2010 tarihleri arasında soğuk zincir koĢulları içerisinde 4‟ncü

Kolordu A tipi Gıda Kontrol Müfreze Komutanlığı‟na ait m ikrobiyoloji

laboratuvarına gönderilen tavuk karkası örnekleri toplanmıĢtır. Bu kapsamda

toplam 721 tavuk karkası konvansiyonel yöntemle incelendi ve doğrulanması

maksadıyla izole edilen Salmonella‟lara real-time PCR yöntemi uygulandı.

2.1.2. Besiyerleri

ÇalıĢmada, aĢağıda sıralanan besiyerleri ve tampon solüsyonlar kullanıldı.

1. TPS (MERCK, 107228)

2. RVS Broth (MERCK, 107700)

3. XLD Agar Base (MERCK, 105287)

4. BPLS Agar Base (MERCK, 107237)

5. TSIA (MERCK, 103915)

6. LIA (OXOID, CM0381)

8. TSB (Tripticase Soy Broth) (MERCK, 100525)

9. NA (MERCK, 105450)

10. Gliserin (MERCK, 104093)

11. Mueller-Hinton Agar (MHA) (Oxoid, CM0337)

12. MSRV Medium (Merck, 109878)

13. Agaroz (Prona, EU)

35

2.1.3. Kullanılan Cihaz ve Gereçler

1. Real-time PCR sistemi (ABI 7500 real-time PCR, ABD )

2. Kuru ısıtıcı blok (Barnstead/Labline, ABD)

3. UV transillüminatörlü bilgisayarlı jel dokümantasyon sistemi (Gene,

Genius, Bio Imaging, system Ġngiltere)

4. Santrifüj (Hettich, Almanya)

5. Vortex (Biosan, Litvanya)

6. Hassas terazi (Precisa 220 M SCS, Ġsviçre)

7. Klas II güvenlik kabini (Esco , Singapur)

8. Isıtmalı karıĢtırıcı cihaz (Velp scientifica, Ġtalya)

9. DNA Thermal Cycler (Biyometra, Almanya)

10. Elektroforez tankı ve güç kaynağı (Wealtec elite 3000 plus, ABD)

11. UV transillüminatörlü bilgisayarlı jel dokümantasyon sistemi (Gene,

Genius, Bio Imaging, system Ġngiltere)

12. GeneAmp PCR System 9700 (ABI, ABD)

2.1.4. Ticari Biyokimyasal sistemler

API 20 E (Biomerioux, Etole, France), standartlaĢtırılmıĢ, minyatür hale

getirilmiĢ 20 adet biyokimyasal test kuyucuğunda gözlemlenen reaksiyonları

bir veri tabanı kullanarak, Enterobacteriaceae ve diğer Gram negatif

çomaklar için kullanılan bir tanımlama sistemidir. API 20 E stripi dehidre

substratlar içeren 20 mikrotüpten oluĢmaktadır. Bu testler ortamın yeniden

hazırlanmasını sağlayan bir bakteriyel süspansiyon ile inoküle edilir.

Ġnkübasyon sırasında bakteri metabolizması sonucu kendiliğinden ya da

reaktiflerin eklenmesiyle ortaya çıkan renk değiĢikleri oluĢtururlar.

Reaksiyonlar, okuma tablosu‟na göre okunur ve tanımlama, Analitik Profil

Ġndeksi ya da bilgisayar tanımlama programı kullanılarak elde edilir. Api 20 E

test kitine özel okuma tablosu Çizelge 2.1‟de gösterilmiĢtir.

36

Çizelge 2.1. Api 20E test kitlerindeki biyokimyasal reaksiyonları okuma tablosu.

TEST SUBSTRAT SONUÇ

NEGATİF POZİTİF

ONPG ONPgalaktozidaz Renksiz Sarı (1)

ADH Arjinin Sarı Kırmızı/Turuncu

LDC Lizin Sarı Kırmızı/Turuncu

ODC Ornitin Sarı Kırmızı/Turuncu

CIT Sitrat Soluk yeĢil-sarı Mavi YeĢil/Mavi

H2S Sodyum tiosülfat Renksiz- gri Siyah

URE Üre Sarı Kırmızı/Turuncu

TDA Triptofan TDA ekle / Derhal sonuç

Sarı Koyu Kahve

IND Triptofan JAMES ekle / Derhal sonuç

Renksiz- soluk yeĢil-sarı Pembe

VP Piruvat VP 1 + VP 2 ekle/ Sonuç 10 dk‟da.

renksiz Pembe – kırmızı

GEL Jelatin Siyah pigment difuze değil Siyah pigment difuze

GLU Glikoz Mavi yeĢil- mavi Sarı

MAN Mannitol Mavi yeĢil- mavi Sarı

INO Ġnozitol Mavi yeĢil- mavi Sarı

SOR Sorbitol Mavi yeĢil- mavi Sarı

RHA Ramnoz Mavi yeĢil- mavi Sarı

SAC Sükroz Mavi yeĢil- mavi Sarı

MEL Melibioz Mavi yeĢil- mavi Sarı

AMY Amigdalin Mavi yeĢil- mavi Sarı

ARA Arabinoz Mavi yeĢil- mavi Sarı

OX Oksidaz (Haricen) OX ekle / sonuç 1-2 dk‟da

renksiz Eflatun

NO3-NO2 NO2 (GLU

kuyucuğunda)

NIT 1 + NIT 2 ekle / Sonuç 2-3 dk‟da

kırmızı Sarı

N2 Zn ekle / sonuç 5 dk‟da

Kırmızı Sarı

MOB Mobilite (Mikroskopta) Sabit Kımıldama

McC MacConkey agar Üreme yok Üreme

OF-F Glikoz fermantasyon YeĢil Sarı

OF-O Glikoz oksidasyon YeĢil Sarı

37

2.1.5. Standart Suşlar

Ġzolasyon, identifikasyon ve PCR çalıĢmaları aĢamalarında Ankara

Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı kültür

koleksiyonundan sağlanan S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Gallinarum, S.

Pullorum kontrol suĢları olarak kullanıldı.

2.1.6. Antiserum

Ġzole edilen etkenlerin cins olarak doğrulanmasında Salmonella Latex

Aglütinasyon Test (Oxoid, FT0203A) kullanıldı. Ayrıca B ve D1

gruplandırması için Salmonella antisera 04 ve 09 Test (Denka Seiken,

Ġngiltere) kullanıldı.

2.1.7. Real-time PCR’da Kullanılan Buffer, Solüsyon, Primer, Enzimler

ve Malzemeler

Ġzole edilen Salmonellaların real-time PCR temelli tekniklerle identifikasyonu

ve tiplendirilmesi amacıyla, TaqMan Salmonella enterica Detection Kit, (ABI

PN 4366104, ABD), MicroAmp™ Optical Adhesive Covers and MicroAmp™

96-Well Optical reaction Plate with Barcode (PN 4314320, ABD), PrepSEQ™

Rapid Spin Sample Preparation Kit (ABI 4407760, ABD) kullanıldı. Bu

kapsamda kullanılan kit ticari olduğundan dolayı primer dizinleri firma

tarafından verilmemiĢtir.

2.1.8. 16s rDNA Salmonella İdentifikasyonunda Kullanılan Buffer,

Solüsyon, Primer, Enzimler ve Malzemeler

MicroSeq® 500 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit (4348228, ABD),

MicroSeq® 500 16S rDNA Bacterial Identification Sequencing Kit (4346479,

https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catProductDetail&productID=4407760&catID=606223&backButton=true

https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catProductDetail&productID=4407760&catID=606223&backButton=true

38

ABD), DNA Extraction PrepMan™ UltraSample Preparation Reagent,

ExoSAP-IT® (USB PN 78200, ABD), Montage PCR Filter Unit (Millipore PN

UFC7 PCR50.ABD), Microcentrifuge tubes DyeEx® 2.0 Spin Kit (Qiagen PN

63204, Almanya), 96-well plates DyeEx 96 Kit (Qiagen PN 63181, Almanya),

ABI Prısm® 3130 Genetic Analyzer (ABD) kullanıldı.

2.2. YÖNTEM

Yapılan analizlere ait akıĢ Ģeması ġekil 2.1‟de gösterilmiĢtir.

Şekil 2.1. Salmonella‟ların analizlerine ait akıĢ Ģeması

Tüm tavuk karkası örnekleri

Sırt, But ve Kanatlardan

Deri ve Et karışımı hazırlandı

Karışımdan 25g steril poşete tartıldı

+ 225ml TPS

37ºC 24 saat

inkübasyon

RVS pasajı

42ºC 24 saat

inkübasyon

BPLS ve XLD inokulasyon

37ºC 24 saat

inkübasyon

TSIA, LIA, TSB, NA

37ºC 24 saat

inkübasyon

API 20E Seroloji

Salmonella suşları

Antibiyogram Real Time PCR ile

Doğrulama

Microseq ile tiplendirme

39

2.2.1. Salmonella İzolasyonu

2.2.1.1. Tavuk Karkaslarında Ön Zenginleştirme

Laboratuvara soğuk zincir altında getirilen tavuk karkaslarından sırasıyla, sırt,

göğüs, but ve kanat bölgelerinden deri ve et örnekleri kesilerek bir grup

oluĢturulmuĢ ve aseptik koĢullar altında steril stomacher poĢetlerine 25 g.

tartılmıĢ ve üzerine 225 ml oda ısısında TPS eklenmiĢtir. Örneğin

homojenizasyonu amacıyla 30 saniye stomacher‟da homojenizasyonu

sağlanmıĢtır. Homojenizat 37°C‟de 24 saat aerobik koĢullarda inkubasyona

bırakılarak ön zenginleĢtirme iĢlemi yapılmıĢtır (Anon, 2005b).

2.2.1.2 . Selektif Zenginleştirme

Ön zenginleĢtirmenin bulunduğu örnek torbaları inkübasyon sonunda hafifçe

çalkalanmıĢ ve içlerinden 0.1‟er ml alınarak selektif zenginleĢtirme amacıyla

10 ml RVS‟ye pasajları yapılmıĢtır. RVS‟ler 42°C‟ye kaldırılarak 24 saat

inkübe edilmiĢtir (Van Schothorst ve Renaud 1983; Anon, 2005b).

2.2.1.3. Selektif- Diferansiyel Besiyerlerine Ekim

RVS‟lerden bir öze dolusu alınarak XLD ve BPLS agara tek koloni düĢecek

Ģekilde çizme plak yöntemi ile ekimler yapıldı. Petriler 37°C‟de 24 saat

aerobik koĢullar altında inkubasyona bırakıldı. Ġnkübasyon sonrası XLD

agarda üreyen H2S pozitif siyah veya periferi besiyerinin kendi renginde

pembeden kırmızıya değiĢen siyah merkezli koloniler Salmonella Ģüpheli

olarak değerlendirildi. Aynı Ģekilde, BPLS agarda inkubasyon sonucunda

besiyerinin Salmonella spp. laktoz kullanmadığından dolayı asitliğin

artmamasına bağlı olarak, besiyerinin renginin kırmızı renkte olup, pembe

renkte, oval, Ģeffaf kolonilerin oluĢtuğu görüldü (Taylor, 1965; Anon, 2005b).

40

2.2.2. Salmonella İdentifikasyonu

2.2.2.1 Gram Boyama

OluĢan koloniler, Gram boyama yöntemi ile boyanarak mikroskopta incelendi

(Quinn ve ark.2004).

2.2.2.2. Şeker Fermentasyon ve Lizin Kullanım Testleri

XLD ve BPLS Agarlarda üreyen Salmonella Ģüpheli kolonilerden, cins

identifikasyonunun doğrulanması için NA, TSIA ve LIA‟ya pasajlanmıĢtır

(Anon, 2005b). Bu besiyerleri 37oC‟de 24 saat aerobik koĢullarda

inkübasyona bırakılmıĢtır. TSIA‟da üstte kırmızı renk dipte sarı renk ve

siyahlaĢma gösteren suĢlar ile LIA‟da dipte ve yatık kısımda (üstte) mor renk

oluĢturarak üreyen suĢlar Salmonella pozitif olarak kabul edilmiĢ ve

doğrulama amacıyla ticari biyokimyasal testlerden faydalanılmıĢtır. (Bilgehan,

2004; Quinn ve ark. 2004; Anon, 2005b).

2.2.2.3. Ticari biyokimyasal testler

NA‟da üremiĢ saf kültürden gereken miktarda steril öze ile alınarak 5 ml API

20 E süspansiyon mediumuna karıĢtırıldı. Firma tarafından sağlanan Mc

Farland skalasına göre prospektüste bildirildiği üzere 3 Mc Farland olacak

Ģekilde ayarlandı. Süspansiyon mediumdaki kültür karıĢımı API 20 E mikro

tüplerine inoküle edildi (CIT, VP, GEL tüpleri tam, diğer tüpler yarım

dolduruldu. ADH, LDC, ODC, H2S ve ÜRE tüpleri 4-5 damla mineral yağ ile

kapatıldı). Bu mikrotüp profili, içindeki kuyucukları su ile doldurulmuĢ saklama

kabına konularak 37 ± 1 °C‟de 18-20 saat inkübe edildi. Ġnkübasyon sonunda

API 20 E prospektüsünde bildirilen değerlendirme koĢulları gerçekleĢtirilerek

okuma tablosunda yer alan mikrotüplerdeki renk değiĢimlerinden ve

41

damlatılan reaktiflerin verdiği renk değiĢimlerine göre sonuçlar +/- Ģeklinde

kaydedildi. Sonuç bilgisayar ortamında değerlendirildi.

2.2.2.4. Salmonella Suşlarının Hareket Muayenesi

TSB‟larda üretilmiĢ Salmonella suĢlarından 0,1 ml alınarak MSRV agarın

farklı üç noktasına damlatılarak 42°C‟de 24 saat inkubasyona bırakılmıĢtır.

Ġnkubasyon sonrası inokulasyon yapılan yerde görülen ve 20 mm den büyük

olan beyazlaĢmıĢ haleler etkenin hareketli olduğunu gösterdi. (Desmedt ve

ark. 1986).

2.2.2.5. Serolojik Testler

Biyokimyasal testlerle Salmonella olarak tanımlanan koloniler, Salmonella

Polivalan “O” Antiserumu ile aglütinasyon testine tabi tutuldu (Bilgehan,

2004; Anon, 2005b; Koneman ve ark., 2006). Bu amaçla Salmonella Latex

Aglütinasyon test kiti içinde bulunan 1 adet Test Latex ve 1 adet Kontrol

Latex oda sıcaklığına getirilerek kuvvetlice çalkalandı.

NA‟da üreyen saf koloniler aglütinasyon testi için kullanıldı. Salmonella

Latex Aglütinasyon test kiti içinde bulunan reaksiyon kartındaki gözlerden

birine bir damla kontrol süspansiyonu, diğerine ise yine bir damla test

süspansiyonu kondu. Daha önce saf olarak üreyen kolonilerden alınarak test

süspansiyonunun üzerine konup, 2 dakika boyunca yuvarlak uçlu öze

yardımıyla karıĢtırıldı. Süre sonunda kontrol süspansiyonu damlatılan gözde

aglütinasyon olmaması; buna karĢılık test süspansiyonu damlatılan gözde

aglütinasyon gözlenmesi Salmonella spp. pozitif olarak değerlendirildi

(Bilgehan, 2004; Koneman ve ark., 2006). (ġekil 2.2.).

42

Ayrıca Grup B ve Grup D1 serotiplendirmesi için O4 ve O9

antiserumları kullanılarak içlerinden bu grubu ait olan Salmonella’lar tespit

edildi.

Şekil 2.2: Salmonella Latex Test aĢamaları

2.2.3. Antibiyotik Duyarlılık Testleri

Tavuk karkaslarından elde edilmiĢ 100 adet Salmonella suĢunun

antibiyotik duyarlılık testleri Kirby-Bauer disk Diffüzyon yöntemine göre

yapıldı. Antibiyogram sonucu oluĢan zonlar CLSI (The Clinical and

Laboratory Standards Institute)‟e standartlarına göre değerlendirildi

(Anon, 2006b).

MHA petrileri hazırlanırken besiyeri 4 mm kalınlığında olacak

Ģekilde döküldü. NA üzerinden alınan koloniler, içerisinde 4-5 ml TSB

bulunan tüplere transfer edilerek, buyyon kültürü 37 oC‟de, turbiditesi 0.5

McFarland standardına gelinceye kadar (genellikle 2-6 saat) inkübe edildi.

Ġnoküle edilen süspansiyonun turbiditesi ayarlandıktan sonra, steril bir pipet

Bir damla

kontrol latex

uuu+

Şüpheli koloni

2 dakika dairesel hareket

sonucunda aglutinasyon

oluşumu

Bir damla test

latex uuu+

Şüpheli koloni

(-)

sonuç

(+) sonuç

K

K

T

T

43

yardımıyla 0,1 ml alınarak, hazırlanan MHA üzerine aktarıldı ve steril

bir drigalski çubuğu yardımıyla, petrilere homojen bir Ģekilde yayılması

sağlandı (Anon, 2006b).

Bir dispenser yardımıyla Metisilin (5 µg) (Oxoid, CT 029 B),

Amoksisilin/Klavulanik asit (30 µg) (Oxoid, CT 223 B), Ampisilin (10

µg) (Oxoid, CT 003 B), Tetrasiklin (10 µg) (Oxoid, CT 053 B),

Sülfametoksazol/Trimetoprim (25 µg) (Oxoid, CT 052 B), Novobiosin

(5 µg) (Oxoid, CT 037 B), Gentamisin (10 µg) (Oxoid, CT 024 B),

Mezlocillin (30 µg) (Oxoid, CT0174B) ve Vankomisin (30 µg) (Oxoid,

CT 058 B) diskleri her bir petriye 10 adet disk ve aralarında da en az

2,4 cm olacak Ģekilde eĢit olarak yerleĢtirilerek 15 dakika içerisinde 37

oC‟de inkübasyona bırakıldı. Ġnkübasyondan 16-18 saat sonra diskler

etrafında oluĢan inhibisyon zonlarının çapı CLSI‟e standartlarına göre

değerlendirildi (ġekil 2.3.).

2.2.4. Real-time PCR Analizleri ile TPS’dan Salmonella Belirlenmesi

Salmonella‟ların real-time PCR ile tespiti için hedef bölgesi olarak invA genini

kapsayan ABI (Applied Biosystems)‟nin identifikasyon kitleri kullanıldı

(Malorny ve ark., 2008).

Şekil 2.3. Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi ile antibiyotik disklerinin

etrafındaki zon oluĢumu.

44

2.2.4.1. Real-Time PCR için Salmonella DNA İzolasyonu

Ġzole edilmiĢ Salmonella suĢlarının 37ºC 24 saat TPS‟da inkubasyonu

sonrasında, içlerine kolon yerleĢtirilmiĢ DNAse free ependorf tüplerine 750 µl

TPS kültürleri alınarak önce kolondan geçirildi. Kolondan geçirilen içerik

14000 Revolutions Per Minute‟de (RPM) 3 dakika santrifüj edildi. Santrifüj

sonrası kolonlar atıldıktan sonra süpernatant (üstte kalan sıvı) atılarak kalan

pelet üzerine 50 µ Lysis Buffer eklendi ve pipetaj ile vorteks yapılarak

homojen halde karıĢmaları sağlandı. Kuru Isıtıcı Blokta 95ºC‟de 10 dakika

süre ısıtıldı ve süre bitiminde örnekler 2 dakika süre oda ısısında bekletildi.

14000 rpm‟de 1 dakika tekrar santrifüj edildi. Üstte kalan süpernatant baĢka

bir DNAse free ependorf tüpe alındı ve üzerine 250 µl distile su ile eklendi.

14000 rpm‟de 1 dakika tekrar santrifüj edildi. Supernatantın 12 µl‟si PCR‟da

template DNA olarak kullanıldı (ABI, Taqman Salmonella Enterica Detection

Kit Protocol, ABD).

2.2.4.2. Kullanılan Primer ve Probların Validasyonları

InvA geninin spesifik segmentini amplifiye eden primerler ile Taqman problar

kullanılmıĢtır. PCR ile kültür tekniğinin kıyaslanması kapsamında AOAC

(Association of Official Analytical Chemists) ve AFNOR tarafından

validasyonu (geçerli kılınması) yapılmıĢ bir kit kullanıldığından dolayı, ilgili

kitin identifikasyonda kullandığı primerlerin kaç baz çifti olduğu ve dizilimi

ticari sır olduğundan dolayı prospektüste paylaĢılmamıĢtır (ABI, Taqman

Salmonella Enterica Detection Kit Protocol, ABD).

2.2.4.3. PCR Karışımı Hazırlanması

PCR 30 µl‟lik karıĢım haciminde, 15 µl 2× master mix, 3 µl 10x Assay master

mix, 12 µl template DNA, Ģekilde eklenerek PCR karıĢımı hazırlandı (ABI

4407760, ABD).

45

2.2.4.4. Amplifikasyon Koşulları

InvA gen sekansına yönelik primer çiftlerinin çoğalttığı bölgeye spesifik

TaqMan probu kullanılarak yapılan real-time PCR analizindeki amplifikasyon;

95°C‟de 15 saniye denaturasyon, 60°C‟de 1 dakika primer bağlanması ve

ekstensiyon aĢamalarını içeren 45 siklustan oluĢmuĢtur.

2.2.4.5. Sonuçların Değerlendirilmesi

Örnekler real-time (eĢ zamanlı) olarak bilgisayar ekranında Rapid Finder

Software programı yardımıyla değerlendirildi.

2.2.5. 16s rDNA Salmonella İdentifikasyonu

Salmonella rDNA identifikasyonu için ABI‟nin Microseq 500 identifikasyon kit

ve sistemleri kullanıldı (Clarridge, 2004).

2.2.5.1. DNA Dizi Analizi için Salmonella DNA İzolasyonu

Ġnkübasyon sonrası PCR için alınmıĢ olan 30 adet Salmonella suĢuna ait NA

kültürlerinden 2-3 mm büyüklüğünde koloniler seçilerek 100 µl PrepMan Ultra

Sample Preparation Reagent (PN 4322547) içlerine koyuldu ve

vortekslenerek karıĢtırıldı. Vorteksleme sonrası kuru ısıtıcı blokta 95º C‟de 10

dakika süre ısıtıldı ve süre bitiminde örnekler 2 dakika süre oda ısısında

bekletildi. 14000 rpm‟de 1 dakika santrifüj edildi. Üstte kalan süpernatant 5 µl

alınarak DNAse free ependorf 500 µl distile su ile dilüe edildi. KarıĢım baĢka

bir tüpe alındı ve üzerine 250 µl distile su ile eklendi. 14000 rpm‟de 1 dakika

tekrar santrifüj edildi. Supernatantın 15 µl‟si PCR‟de template DNA olarak

kullanıldı.

46

2.2.5.2. PCR Aşaması

16S rRNA geninin 500 baz çiftinin ampfilikasyonu GeneAmp PCR System

9700 de aĢağıda açıklanan prosedüre göre gerçekleĢtirildi. PCR 30 µl‟lik

karıĢım haciminde her bir örnek için; 15 µl master mix, 15 µl template DNA;

negatif kontrol amaçlı; 15 µl master mix, 15 µl DNAse free distile su, pozitif

kontrol amaçlı; 15 µl master mix, 15 µl E. coli pozitif kontrol DNA karıĢımları

hazırlanarak PCR tüplerine koyuldu.


BaĢlangıçta DNA polimerazın aktivasyonu için 95°C‟de 10 dakika ısıtma

aĢaması ardından, 95°C 30 saniye denaturasyon, 60°C‟de 30 saniye primer

bağlanması ve 72°C‟de 45 saniye ekstensiyon aĢamasını içeren 30 siklustan

ve son olarak 72°C‟de 10 dakika final ekstensiyondan oluĢtu.

2.2.5.4. DNA Agaroz Jel Elektroforezi

Örneklerdeki PCR ürünlerinin varlığının belirlenmesi için 20 cm‟lik %2‟lik

agaroz (Prona, EU) jelde, 180 Volt‟ta 60 dakika elektroforez edildi.

2.2.5.5. Örneklerin Görüntülenmesi

Jeldeki örnekler biyo–görüntüleme sisteminde görüntülendi ve fotoğrafları

çekilerek termal printer (Sony, Japan)‟dan kopyaları alındı.

47

2.2.5.6. Sekanslama için PCR ürünlerinin saflaştırılması

PCR ürünlerinin görüntülenerek varlığı ortaya konduktan sonra sekanslama

iĢlemine baĢlamadan önce PCR ürününün içinde bulunan kullanılmamıĢ olan

primerleri ve dNTP‟leri uzaklaĢtırılması iĢlemi yapıldı. Bunun için ExoSAP-IT

(USB PN 78200, ABD), Montage PCR Filter Unit (Millipore PN UFC7 PCR50,

Germany) kullanıldı.

2.2.5.7. Sekanslama

SaflaĢtırılmıĢ her bir PCR ürününden 7 µl alındı ve üzerine sekanslama için

hazırlanmıĢ olan master mix‟den 13 µl eklendi.


Hazırlanan PCR karıĢımı, 96°C 10 saniye denaturasyon, 50°C‟de 5 saniye

primer bağlanması ve 60°C‟de 4 dakika ekstensiyon aĢamasını içeren 25

siklustan oluĢtu.

2.2.5.9. Ekstensiyon ürünlerinin saflaştırılması

Sekanslama için yapılan PCR iĢleminden sonra kullanılmamıĢ olan

terminatör boyalarının ve primerlerin uzaklaĢtırılması amacıyla DyeEx® 2.0

Spin Kit (Qiagen PN 63204, Almanya) ve 96-well plates DyeEx 96 Kit(Qiagen

PN 63181, Almanya) ürünleri kullanıldı.

48

2.2.5.10. Ekstensiyon ürünlerinin sekanslaması ve elektroforezi

Ekstensiyon ürünleri sekanslarını belirlemek için genetik analiz cihazına ABI

Prısm® 9700 Genetic Analyzer (ABD) yüklendi ve çıkan sonuçlar PubMed

Blast sisteminde Nükleotide Blast da (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

değerlendirilerek sonuçlandırıldı.

49

3.BULGULAR

Bu çalıĢmada, 2008–2010 tarihleri arasında soğuk zincirde 4‟ncü Kolordu

Gıda Kontrol Müfreze Komutanlığı m ikrobiyoloji laboratuvarına Bolu,

Balıkesir ve Ankara‟daki farklı kesimhanelerden gelen 721 tavuk karkas

örneğinde Salmonella‟ların varlığı, klasik kültür ve real-time PCR teknikleri

kullanılarak analiz edildi. Ġzolatlar invA gen sekansı esas alınan ticari bir real-

time PCR kiti ile doğrulanarak, 10 farklı antibiyotiğe dirençliliği belirlendi. Ġzole

edilen 100 Salmonella suĢu grup B ve D1 antiserumları ile

serogruplandırıldı. 10 adet B Grubuna, 10 adet D1 grubuna ait olan ve 10

adet B ve D1 grubuna ait olmayan Salmonella suĢları DNA dizi analizine tabi

tutulup tiplendirilmeye çalıĢıldı.

3.1. İzolasyon Bulguları

ÇalıĢma sonucunda toplam 721 tavuk karkasından alınan örneklerden 100

adet (% 13,86) Salmonella spp. izole edildi. Ankara (250 adet numune),

Balıkesir (186 adet numune) ve Bolu‟daki (285 adet numune)

kesimhanelerden gelen tavuk karkaslarından sırasıyla 36 (% 14,4), 6 (%

3,22), 58 (% 20,35) adet Salmonella spp. izole edildi. Ġncelenen tavuk

karkaslarından izole edilen Salmonella‟ların illere göre dağılımı Çizelge

3.1.‟de ve izole edilen Salmonella suĢlarının XLD ve BPLS agarda

görünümleri ġekil 3.1.‟de gösterilmiĢtir.

Çizelge 3.1. Tavuk karkaslarından izole edilen Salmonella‟ların illere göre dağılımı

Örneğin geldiği Ģehir Analiz edilen örnek sayısı

Salmonella bulaĢması olan örnek sayısı

Ankara 250 36 (% 14,4)

Balıkesir 186 6 (% 3,22)

Bolu 285 58 (% 20,35)

Toplam 721 100 (% 13,86)

50

Şekil 3.1. XLD ve BPLS agarda Salmonella kolonilerinin görünümü.

3.2. İdentifikasyon Bulguları

Ġzole edilen etkenler Gram yöntemiyle boyandığında Gram negatif, kısa ve

küçük çomaklar gözlemlendi. Ġzole edilen Salmonella suĢlarının TSIA ve LIA

agarda Salmonella kolonilerinin görünümü ġekil 3.2. ve MSRV agarda

hareketli Salmonella kolonilerinin görünümü ġekil 3.3‟de, biyokimyasal

özellikleri ise Çizelge 3.1‟de gösterilmiĢtir. Ticari bir biyokimyasal kit olan API

20 E ile test edilen tüm suĢlar bilgisayar ortamında Salmonella spp. olarak

tespit edildi. Biyokimyasal testlerle Salmonella olarak tanımlanan koloniler,

Salmonella Polivalan “O” Antiserumu ile aglütinasyon testine tabi tutuldu ve

aglütinasyon oluĢumu tüm izolatlarda gözlemlendi.

Şekil 3.2. TSIA ve LIA agarda Salmonella kolonilerinin görünümü

BPLS

XLD

51

Şekil 3.3. MSRV agarda hareketli Salmonella kolonilerinin görünümü.

Çizelge 3.2. Ġzole edilen 100 adet Salmonella spp‟nin özellikleri

Test Özellik

Gram Boyama Gram negatif

Hareket +

Lizin Dekarboksilaz +

Laktoz -

Sukroz -

Glukoz +

H2S +

Gaz +

3.3. Serogruplandırma bulguları

Salmonella spp. oldukları belirlenen bütün suĢlara, grup B ve grup D1

serogruplandırılması için ticari O4 ve O9 antiserumları kullanıldı. 100

Salmonella suĢundan 15 adedi B grubuna, 58 adedinin ise D1 grubuna ait

olduğu tespit edilirken; 27 Salmonella suĢunun B ve D1 grubunun dıĢında bir

serogruptan oldukları gözlendi. Ġzole edilen Salmonella‟ların

52

serogruplandırma sonuçlarının illere göre dağılımı Çizelge 3.3.‟de

gösterilmiĢtir.

Çizelge 3.3. Ġzole edilen Salmonella‟ların serogruplandırma sonuçlarının illere göre dağılımı

Örneğin geldiği Ģehir

Salmonella izolatı sayısı

B grubuna ait Salmonella

D1 grubuna ait Salmonella

B ve D1 grubuna ait olmayan Salmonella

Ankara 36 4

26 6

Balıkesir 6 2 3 1

Bolu 58 9 29 20

Toplam 100 15 58 27

3.4. Antibiyotik Dirençlilik Sonuçları

Real-time PCR ile doğrulanan 100 izolatın 10 farklı antibiyotiğe karĢı

dirençlilikleri araĢtırılmıĢtır. ÇalıĢmanın sonucunda, izolatların tamamı

vankomisin, metisilin, novobiosin‟e dirençli bulunurken, bu antibiyotikleri

sırasıyla % 85 ile tetrasiklin, % 50 ile gentamisin, % 28 ile

amoksisilin+klavulanik asit % 23 ile ampisilin, % 21 ile mezlosillin, % 15 ile

enrofloksasin, % 6 ile sülfametoksazol / trimetoprim izlemiĢtir. (ġekil 3.4.).

Ayrıca enrofloksasine karĢı % 35 oranında intermitans (orta düzeyde)

direnç geliĢtiği bulunurken, amoksisilin+klavunik, ampisilin,

sülfametoksazol/trimetoprim, mezlocillin ve tetrasikline karĢı sırasıyla % 6, %

5, % 3, % 1, % 1 oranınlarında intermitans direnç olduğu saptanmıĢtır.

3.5. Real-time PCR Bulguları

ÇalıĢma sonucunda; klasik kültür ile Salmonella olarak belirlenen izolatların,

invA gen sekansını oluĢturan primer çiftlerine spesifik bir TaqMan probu

53

kullanılarak yapılan real-time PCR analizinde, incelenen 100 izolatın 100‟ü

(%100) Salmonella olarak doğrulanmıĢtır. Real-time PCR amplifikasyon

ürünleri bilgisayar monitöründe izlenmiĢ olup bir izolata ait real-time PCR

grafiği ġekil 3.5.‟de gösterilmiĢtir.

Antibiyotik adı

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Direnç (%)

İntermitans (%)

Duyarlı (%)

Şekil 3.4. Real-time PCR tekniği ile doğrulanan 100 Salmonella spp. izolatının antibiyotik dirençlilik

tablosu.

Şekil 3.5. Salmonella spp. real-time PCR‟daki görüntüsü

Del

ta R

n

Döngü Sayısı

Delta Rn’ye karşılık Döngü

Tet

rasi

kli

n

Am

pis

ilin

En

rofl

ok

sasi

n

Mez

loci

llin

Met

isil

in

No

vo

bio

sin

Van

kom

isin

Am

ok

sisi

lin

+K

lavu

nik

asi

t

Gen

tam

isin

Sü

lfam

eto

ksa

zol

/

Tri

met

op

rim

Yü

zd

e (

%)

54

3.6. Sekanslama Sonuçları

DNA dizi analizi için real time PCR ile doğrulanan toplam 100 izolatın içinden

30 adet Salmonella suĢu serotiplendirme sonucuna göre rastgele

örneklenerek seçildi. 30 Salmonella izolatının seçiminde; B

serogrubundan 10 adet, D1 serogrubundan 10 adet ve B ve D1

serogurubuna ait olmayan 10‟ar adet suĢ alınmıĢtır.

SuĢlardan elde edilen sekans sonuçları, nükleotid veri tabanını

kullanan bir bilgisayar programı olan BLAST‟a verildi ve tüm

izolatların tür düzeyinde Salmonella enterica subsp. enterica olduğu tespit

edilirken, serotip düzeyinde tiplendirme yapılamamıĢtır

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) (Anon, 2011).

16s rDNA Salmonella identifikasyonu amacıyla yapılan sekans

analizinde sequence scanner v 1.0 programı kullanılmıĢ olup elde edilen

ham verilere ait örnek ġekil 3.6.‟da ve 16s rDNA geninin amplikon

ürünlerinin Agaroz Jel Elektroforezindeki görüntüsü ġekil 3.7.‟de

sunulmuĢtur.

Şekil 3.6. Sekans analizinde sequence scanner v 1.0 programı kullanılarak elde edilen ham verilere

ait örnek

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

55

Şekil 3.7. M: marker, (-): Negatif Kontrol, (+): Pozitif Kontrol, 16S rRNA geninin amplikasyonu sonucu

oluĢan ürünlerin varlığının araĢtırılmasında kullanılan Agaroz Jel Elektroforezindeki görüntüsü.

Sekans analizi sonrası elde edilen nükleotid sekansların BLAST

programına verilmesi sonrasında elde edilen görünüm ise ġekil 3.8‟de

sunulmuĢtur.

Şekil 3.8. Sekans analizi sonrası elde edilen nükleotid sekansların BLAST programına verilmesi

sonrasında elde edilen görünüm.

56

4.TARTIŞMA

Salmonellozisin dünyada en yaygın görülen gıda zehirlenmelerinden biri

olduğu, özellikle kanatlı etleri ve bunlardan hazırlanan ürünlerin

Salmonella‟ların en önemli rezervuarı olduğu bildirilmiĢtir. (Capita ve ark.,

2003).

Bu çalıĢmada iki yıllık süreç içinde Bolu, Ankara ve Balıkesir‟deki

kesimhanelerden gelen 721 tavuk karkas örneğinin 100 adedinde (% 13,8)

Salmonella spp. izole ve identifiye edildi. Yapılan analizlerde 100 adet

Salmonella suĢundan 15‟inin B grubuna, 58‟inin ise D1 grubuna ait

olduğu tespit edilirken; 27 Salmonella suĢunun B ve D1 grubunun

dıĢında bir serogruptan oldukları gözlendi. Hem yurt dıĢında hem de

yurdumuzda Salmonella kontaminasyonu üzerine çeĢitli çalıĢmalar

bulunmaktadır.

Yurt dıĢında yapılan çalıĢmalarda; Machado ve Bernardo (1990),

Portekiz‟de yaptıkları bir çalıĢmada 300 adet tavuk karkasının % 57‟sinde

Salmonella kontaminasyonu tespit etmiĢlerdir. Benzer baĢka çalıĢmalarda

ise; Nair ve ark. (1990), Hindistan‟da marketlerde satıĢa sunulan 50 adet

broiler karkas etinde % 4 düzeyinde Salmonella spp. tespit etmiĢlerdir.

Roberts (1991) tavuk ürünleriyle Britanya‟da yaptığı bir araĢtırmada, % 48

oranında Salmonella kontaminasyonu tespit etmiĢtir. Reilly ve ark. (1991)

Ġskoçya‟da yaptıkları çalıĢmada, 477 adet tavuk karkası analiz etmiĢler ve

tavuk karkaslarının % 45 oranında Salmonella spp. ile kontamine olduğunu

rapor etmiĢlerdir. Jerngklinchan ve ark. (1994) Tayland‟da yaptıkları

çalıĢmada 705 tavuk eti örneğinden 467‟sinde (% 66), 221 tavuk iç organları

örneğinden 190 tanesinde (% 86) Salmonella spp. identifiye etmiĢlerdir.

Vorster ve ark. (1994) Güney Afrika‟da 17 farklı süpermarketten aldıkları 43

adet broiler etinde % 19,2 oranında Salmonella spp. identifiye etmiĢlerdir.

Sackey ve ark. (2001) yaptıkları çalıĢmada, 87 tavuk karkas ve parça

57

örneklerini Salmonella yönünden analiz etmiĢler ve % 6,8 oranında

Salmonella spp. tespit ettiklerini bildirmiĢlerdir. Beli ve ark. (2001),

Arnavutluk‟ta 1996-1998 yılları arasında yaptıkları çalısmada, 461 tavuk eti

örneğinin 30‟undan (% 6.5) Salmonella izole edildiğini bildirmiĢlerdir. Wilson

(2002), yapmıĢ olduğu çalıĢmada 1995-2000 yılları arasında çiğ tavuk

etlerinde Salmonella kontaminasyon düzeyini araĢtırmıĢ ve analiz edilen

1127 örneğin 123‟ünde (% 11) Salmonella spp. tespit etmiĢtir. Antunes ve

ark. (2002) tarafından 54 adet tavuk, 6 adet hindi eti ürünleri olmak üzere

toplam 60 adet kanatlı eti analiz edilmiĢ, 36 adedinde (% 60) Salmonella

tespit edildiğini bildirmiĢlerdir. Capita ve ark. (2003), Ġspanya‟da kanatlı eti ve

ürünlerinde Salmonella‟nın insidensini araĢtırmak amacıyla tavuk karkası,

tavuk parçaları ve iç organları (kanat, but, karaciğer ve kalp) ve iĢlenmiĢ

tavuk ürünleri (sosis ve hamburger) üzerine yaptıkları çalıĢmada tüm

örneklerde ortalama % 49 oranında Salmonella spp. saptadıklarını

bildirmiĢlerdir. Durango ve ark. (2004), yaptıkları çalıĢmada, tavuk etlerini

Salmonella varlığı bakımından analiz etmiĢler ve % 4,2 oranında Salmonella

tespit edilmiĢtir. Tavuk karkaslarında Salmonella kontaminasyon oranının

farklı ülkelerde yapılan çalıĢmalarda % 5 ile % 100 arasında değiĢebileceği

belirtilmiĢtir (Chang, 2000).

Yurt içinde yapılan çalıĢmalarda ise; Fidancı ve ark. (1994) toplam

120 adet karkasta %13.3 Salmonella spp. izole etmiĢler, bunların

serotiplendirilmesi sonucu 4‟ünün S. Enteritidis, 4‟ünün Salmonella serogrup

C ve 9‟unun Salmonella serogrup B‟ye dahil olduklarını saptamıĢlardır. Usca

(1996) yapmıĢ olduğu çalıĢmasında 50 adet tavuk etinin mikrobiyolojik

analizini yapmıĢ ve % 38 oranında Salmonella spp. izole etmiĢtir. Kalender

ve Muz (1999) Elazığ Bölgesi‟nde yaptıkları çalıĢmada, 365 adedi tavuk

kesimhanesinden, 162 adedi de Elazığ Veteriner Kontrol ve AraĢtırma

Enstitüsüne hastalık Ģüphesiyle getirilen tavuk olmak üzere toplam 527 adet

tavuk Salmonella spp. yönünden incelemiĢ ve bunlardan 57 adedinde (%

10,81) Salmonella tespit etmiĢler ve 53‟ünü D1 serogrubunda, 4‟ünü B

serogrubunda bulmuĢlardır. Hadimli ve ark. (2002), Konya‟da yaptıkları

58

çalıĢmada, 16 farklı satıĢ noktasında tüketime sunulan 168 tavuk

karkasından 55 adedinde (% 35,72) Salmonella spp. izole ettiklerini

bildirmiĢlerdir. Erol ve ark. (2004), piliç karkaslarında Salmonella‟ların

varlığını belirlemek amacıyla yaptıkları çalıĢmada 69 örneğin 61‟inden (%

88.4) Salmonella izole ettiklerini bildirmiĢlerdir. Yazıcıoğlu ve ark. (2005),

tavuk kesimhanelerinin parçalama ünitelerinden topladıkları 662 boyun ve

kanat örneklerinin 58‟inden (% 8.7) Salmonella izole ettiklerini bildirmiĢlerdir.

Goncagül ve ark. (2005), tavuk etlerinde Salmonella serogruplarının

prevalansını araĢtırmak için toplamıĢ oldukları 315 adet tavuk kanatlarının %

18.9‟undan Salmonella spp. izole etmiĢler ve izole edilen suĢlardan 27‟sinden

(%8.57) serogrup D‟de yer alan S. Enteritidis, 30‟ unda da A, B, C, D

serogruplarına ait olmayan ve tiplendirilemeyen Salmonella izole ettiklerini

bildirmiĢlerdir. Çetinkaya ve ark. (2008) Bursa‟daki süpermarketlerden 168

adet tavuk karkasından (kanat, but, boyun ve göğüs kısımları) sadece bir

adedinde Salmonella (% 0.24) identifiye ettiklerini bildirmiĢlerdir. Yapılan

çalıĢmadaki bulgular yukarıda anılan çalıĢmaların bir kısmı ile paralellik

göstermekte, ancak sonuçlar, bir kısmı ile uyum sağlamamaktadır. Bunun

olası nedenleri, örnek sayısındaki değiĢim, ülkelere göre uygulanan kesim

hijyeni, hayvan kümeslerinde ve küçük çaptaki iĢletmelerde uygulanan farklı

düzeydeki hijyen ve biyogüvenlik önlemleri, yetiĢtirme koĢulları ve

laboratuvarlarda uygulanan farklı izolasyon ve identifikasyon teknikleri

olabilir.

Bu çalıĢmanın sonucunda, izolatlar arasında antibiyotiklere en fazla

dirençlilik % 100 ile vankomisin, metisilin, novobiosin‟e karĢı geliĢirken,

bunları % 85 ile tetrasiklin, % 50 ile gentamisin, % 28 ile

amoksisilin+klavulanik asite % 23 ile ampisilin, % 21 ile mezlosillin, % 15 ile

enrofloksasin, % 6 ile sülfametoksazol / trimetoprim izlemiĢtir. Hem yurt

dıĢında hem de yurdumuzda Salmonella suĢlarının antibiyotiklere duyarlılık

ve dirençlilik profillerinin belirlendiği çalıĢmalar bulunmaktadır. Yurt dıĢında

yapılan çalıĢmalarda; Sojka ve ark. (1986), Ġngiltere ve Galler‟de

kanatlılardan izole ettikleri tüm Salmonella suĢlarını ampisiline % 10 ve

59

gentamisine % 0,2 oranında dirençli, izole edilen S. Typhimurium suĢlarını

ise ampisilin ve trimetoprim + sulfametaksasole duyarlı bulduklarını

bildirmiĢlerdir. Rampling ve ark. (1990), tavuklardan izole ettikleri 38 S.

Enteritidis suĢunun tümünün ampisilin, gentamisin, tetrasiklin ve trimetoprim

+ sulfametaksasole duyarlı olduğunu belirtmiĢlerdir. Singer ve ark. (1992),

yaptıkları bir çalıĢmada; tavuklardan izole ettikleri tüm S. Enteritidis suĢlarının

ampisilin, gentamisin, enrofloksasin ve trimetoprim + sulfametaksasole

duyarlı olduklarını tespit etmiĢlerdir. Lee ve ark. (1993b), broyler piliçlerden

izole ettikleri S. Enteritidis suĢlarının ampisiline % 79 dirençli olduklarını

bildirmiĢlerdir. Chang (2000), broyler tavuklardan izole ettiği bütün S.

Enteritidis suĢlarının vankomisine dirençli olduğunu bildirmiĢtir. Hernandez ve

ark. (2002), Ġspanya‟da yaptıkları bir çalıĢmada, 112 Salmonella serovarının

% 34,8‟ini ampisiline ve % 33,9‟unu tetrasikline dirençli bulmuĢlardır. Antunes

ve ark. (2002), tavuk ve hindi karkaslarından izole ettikleri Salmonella

suĢlarının enrofloksasine % 50 ve tetrasikline % 36 dirençli; amoksisilin ve

gentamisine ise tüm izolatların duyarlı olduklarını saptamıĢlardır.

Carraminana ve ark. (2004), Ġspanya‟da kanatlı mezbahalarında yaptıkları bir

çalıĢmada, Salmonella‟larda tetrasikline karĢı % 21,8 oranında dirençlilik

belirlemiĢlerdir. Oliveira ve ark. (2005), broiler karkas, bazı gıdalar, insan ve

çeĢitli kanatlı ürünlerinden izole ettikleri S. Enteridis‟in tetrasiklin (% 15,4),

gentamisin (% 5,5), ampisilin (% 1,1) düzeyde direnç gösterdiğini ortaya

koymuĢlardır. Yurdumuzda yapılan çalıĢmalarda; Boynukara ve Aydın

(1990), izole ettikleri 33 Salmonella suĢunun trimetoprim-sulfametoksazola %

61,7, gentamisine % 21,2, enrofloksasine % 2,1 dirençli olduğunu tespit

etmiĢlerdir. Özdemir (1996), kanatlı hayvanlardan izole ettiği S. Enteritidis

suĢlarının, gentamisin ve ampisiline % 22,2 duyarlı olduğunu; S.

Typhimurium suĢlarının ise gentamisine % 50 duyarlı olduğunu tespit

etmiĢtir. Kalender ve Muz (1999), tavuklardan izole ettikleri S. Enteritidis

suĢlarının; enrofloksasine % 100, gentamisine % 74,36, trimetoprim-

sulfametaksasole % 53,85, tetrasikline % 12,82, ampisiline % 2,57 duyarlı

olduklarını; S. Typhimurium suĢlarının ise enrofloksasine % 100, gentamisine

% 75, trimetoprim-sulfametaksasole % 50, tetrasikline % 25, ampisiline % 50

60

duyarlı olduklarını bildirmiĢlerdir. Aksakal (2003), Van yöresinde yapmıĢ

olduğu çalıĢmada tavuk (400 adet), hindi (400 adet) ve bıldırcın (200 adet )

dıĢkılarından izole edilen 49 adet Salmonella suĢunun enrofloksasine %

92,83, ampisilin ve gentamisin ve tetrasikline % 67,34, trimetoprim-

sulfametaksasole % 51,02, oranında duyarlı oldukları tespit etmiĢtir. Kılınç

(2005) Kayseri yöresindeki 15 adet tavukçuluk iĢletmesinden toplanan, 473

tavuk ve 105 civciv olmak üzere toplam 578 kanatlı örneğinden izole edilen

toplam 61 adet izolatın 12 (% 20)‟sini ampisilin‟e dirençli bulmuĢtur.

Çetinkaya ve ark. (2008) kanatlı karkasından izole ettiği 1 adet Salmonella

suĢunun tetrasiklin ve trimetoprim-sülfometaksazole karĢı dirençli olduğunu

tespit etmiĢtir. Yazıcıoğlu ve ark. (2005) kesimhanelerden toplanan

örneklerden izole edilen 58 Salmonella suĢundan 3‟ünün (% 5,2) tetrasiklin

ve ampisiline, 2‟sinin (% 3,4) gentamisine ve 1‟inin (% 1,7) sulfametoksazol-

trimetoprim dirençli bulunduğunu bildirmiĢlerdir. Oral ve Türkyılmaz (2008)

yaptıkları çalıĢmada Aydın ve Ġzmir illerindeki iĢletmelerden getirilen 422

broyler ve broyler damızlığa ait iç organ materyallerinden 47 Salmonella

izolatının enrofloksasine, gentamisine, amoksisiline ve trimetoprim-

sulfamethoksazole duyarlılık oranlarını sırasıyla % 97,9, % 76,6, % 38,3 ve

% 10,6 olarak bulduklarını bildirmiĢlerdir. Tayan (2008), kanatlılardan izole

edilen Salmonella suĢlarının, metisilin, novobiosin ve vankomisin‟e % 100,

gentamisin‟e % 90.91 ve enrofloksasin‟e % 9.09 oranında dirençli; ampisilin‟e

% 36.37, tetrasiklin‟e % 27.28, enrofloksasin‟e % 18.19,

amoksisilin/klavulanik asit, gentamisin ve sülfametoksazol/ trimetoprim‟e %

9.09 oranında orta duyarlı; amoksisilin/klavulanik asit ve

sülfametoksazol/trimetoprim‟e % 90.91, tetrasiklin ve enrofloksasin‟e % 72.72

ve ampisilin‟e % 63.63 oranında duyarlı bulunduğunu bildirmiĢtir.Türkiye‟de

ve diğer ülkelerde yapılan araĢtırmalarda insanlardan, kanatlı hayvanlardan

ve kanatlı ürünlerinden izole edilen Salmonella‟ların antibiyotik

dirençliliklerinin ülkelere ve hatta coğrafi bölgelere göre farklı dağılım

göstermektedir. Ülkelerde ve coğrafi bölgelerde görülen bu farklılık kullanılan

farklı bölge ve ülkelerde uygulanan antibiyotik çeĢitliği ve kullanım sıklığı ile

iliĢkilendirilebilinir. Ġnsanlarda görülen antibiyotiklere dirençli Salmonella‟ların

61

birçoğun kaynağı hayvansal orijinli gıdalardır. Bundan dolayı çiftlik

hayvanlarında mümkün olduğunca ve zorunlu kalmadıkça antibiyotik

kullanılmamalıdır. Çiftliklerde hijyen ve sanitasyon koĢullarının oluĢturulması

ve arttırılması ile antibiyotik dirençli patojenlerin oluĢumu ve yayılması büyük

oranda azaltılabilir (Angulo ve ark., 2000).

Yapılan çalıĢmada konvansiyonel yöntemlerle Salmonella olarak

belirlenen 100 izolatın 100 (%100)'ü de real-time PCR ile Salmonella olarak

saptandı. Kanatlı hayvanların ve insanların zaman zaman sağlığını tehdit

eden Salmonella‟ların bakteriyolojik tanı süreleri oldukça uzun sürmektedir.

Bu nedenle de optimize edilmiĢ bir bakteriyolojik sistem kadar güvenilir, fakat

daha kısa sürede sonuç alınan yöntemler geliĢtirilmeye ve kullanılmaya

baĢlanmıĢtır. Bu yöntemlerden biri PCR tabanlı testlerdir. Bu testlerde temel

olarak Salmonella‟ların spesifik DNA segmenti aranmaktadır (Bäumler ve

ark., 1997; Çarlı ve ark., 2001; Feder ve ark., 2001; Cotter ve ark., 1995;

Woodward ve Kirwan, 1996; Oliveria ve ark., 2002; Oliveria ve ark., 2003).

Tuchili ve ark. (1996), kabuk altı ölümlerin Ģekillendiği 45 adet

embriyolu yumurtadan direkt PCR ile 20‟sinde (% 44.4) Salmonella spp.

saptarken, zenginleĢtirme ve ardından PCR uyguladıklarında 23‟ünde (%

51.1) Salmonella spp. tespit etmiĢlerdir. Bailey ve arkadaĢları (1998), 150

tavuk etini, PCR ve kültürel metotla analiz ettiklerinde Salmonella

kontaminasyon oranını sırasıyla, % 15 ve % 12 olarak belirlemiĢlerdir.

Kimura ve ark. (1999) Tokyo‟da marketlerde satıĢa sunulan toplam 100 adet

et ve tavuk örneğine aynı anda kültür metodu ve TaqMan PCR Metodu

uyguladığını ve kültürel yöntemle 10 adet örnekte Salmonella spp. tespit

edilirken TaqMan PCR Metodu ile 11 adet örnekte Salmonella spp. tespit

edildiğini bildirmiĢtir. Kawasaki ve ark. (2001) 16 sığır eti, 31 domuz eti ve 51

adet tavuk etinden oluĢan toplam 98 adet çiğ etten yaptığı çalıĢmada klasik

yöntemle 37, TaqMan PCR metoduyla ise 42 adet örnekte Salmonella spp.

tespit ettiğini bildirmiĢtir. Eyigör ve ark. (2002), 47 kanatlı sürüsünden

aldıkları 492 bağırsak homojenatı ve 27 svabın LightCycler real-time PCR ve

62

kültür ile sırasıyla 65 (%12,5) ve 35 (%6,8)‟ini Salmonella pozitif bulmuĢlardır.

Whyte ve ark. (2002), broyler sürülerinden topladıkları toplam 198 boyun

derisi örneğini konvansiyonel kültür metodu ve PCR ile incelemiĢler;

örneklerin kültür metodu ile 32 (%16)‟sini, PCR ile 38 (%19)‟ini Salmonella

yönünden pozitif bulmuĢlardır. Fratamico (2003), perakende tavuk etinde

Salmonella saptanmasında kültür, PCR, Taqman Salmonella ve Transia

Card Salmonella assay‟i denemiĢ ve kültürle tavuk etlerinin %18‟ini, PCR ile

%28,5‟ini , TaqMan PCR ile %35,5‟ini ve Transia Card Salmonella assay ile

34,9‟unu pozitif olarak saptamıĢlardır. Uyttendaele ve ark. (2003), doğal ve

yapay kontamine kanatlı ve domuz etlerinde Salmonella saptanmasında real-

time PCR, Vidas ELISA ve DIASALM kullandıkları konvansiyonel kültür

metodunu karĢılaĢtırmıĢlardır. DIASALM metodu ile doğal olarak kontamine

olan 120 örneğin 45‟ini Salmonella yönünden pozitif bulurlarken, real-time

PCR ile %92‟sini, Vidas ELISA ile %95‟ini pozitif saptamıĢlardır. Malkawi ve

arkadaĢları (2003), tavuk, koyun, sığır etlerinin ön zenginleĢtirme kültürlerine

PCR uyguladıklarında Salmonella yönünden toplam 300 örneğin 93‟ünü PCR

ile, 67‟sini klasik kültür ile pozitif bulduklarını rapor etmiĢlerdir. Erol ve ark.

(2004)‟nın piliç karkaslarında Salmonella‟ların varlığının klasik kültür ve

immunomanyetik PCR teknikleriyle karĢılaĢtırmalı olarak saptanmasına iliĢkin

yaptıkları çalıĢmada, oriC geni esas alınarak yapılan PCR analizi sonucunda

örneklerin % 86.9‟unda, kültür tekniğiyle ise % 88.4‟ünde Salmonella

saptamıĢlardır. Eyigör ve ark. (2005), Marmara bölgesinde 2000-2003 yılları

arasında 191 tavuk sürüsünden bağırsak, klokal svap, drag svap ve altlıktan

alınan 1785 adet örneği Salmonella yönünde incelemiĢlerdir. 1242 örneğin

SYBR green-based real-time polymerase chain reaction (SGBRT–PCR) ile

%5,87‟ini, bakteriyolojik metotla ise %4,10‟unu Salmonella pozitif bulmuĢlar,

Haziran 2001 den Aralık 2003 yıIına kadar toplanan 543 örneğin ise, probe-

specific real-time polymerase chain reaction (PSRT-PCR) ile %11,42‟sini,

bakteriyolojik metodla ise %5,52‟sinde Salmonella saptadıklarını

bildirmiĢlerdir. Günaydın (2005) Bursa‟da marketlerde satıĢa sunulan 100

adet tavuk eti örneğinin; kapiller PCR ile Salmonella kontaminasyon oranı, %

8 bulunurken, kültür yöntemi ile tavuk etlerindeki Salmonella yükünün % 6

63

olarak tespit edildiğini bildirmiĢtir. Fakhr ve ark. (2006), doğal kontamine hindi

etlerinden Salmonella saptanmasında real-time PCR, immunnocapture assay

RapidCheck ve konvansiyonel kültür metodunu karĢılaĢtırmıĢlardır. Real-time

PCR ile ön zenginleĢtirme aĢamasından sonra 99 örneğin 56‟sını,

konvansiyonel kültür metodu ile 49‟unu, immunnocapture assay RapidCheck

metodu ile de 38‟ini Salmonella yönünden pozitif bulmuĢlardır. Cheng ve ark.

(2008) kuru gıda, deniz ürünleri, meyve ve sebzeden oluĢan toplam 420 gıda

örneğini konvansiyonel, Vidas ve TaqMan PCR metodu ile incelemiĢ ve

kültür, real-time PCR ve Vidas yöntemi ile sırasıyla % 100, % 100 ve % 96.2

oranlarında Salmonella spp. izole edildiğini bildirmiĢlerdir. Rojo ve Chavolla

(2007) XLD agar ve BGA‟dan aldığı Proteus ile kontamine Salmonella

kolonilerini, 37° C‟de 6 saat % 1 peptonlu suda süspanse ettikten sonra PCR

uygulayarak, kolonilerin Salmonella olduğunu çok kısa bir sürede baĢka bir

teste gerek kalmadan doğrulamıĢtır

Enterobactericae familyası (özellikle Proteus spp.) gibi etkenlerle

kontamine olan Salmonella’ların saf olarak izolasyonu zahmetli ve zaman

alıcı olup biyokimyasal test sonuçlarında yanılgılara neden olabilmektedir.

Bundan dolayı Proteus gibi etkenlerle kontamine Salmonella kolonilerinin

bazı özel durumlarda, biyokimyasal testlere gerek kalmadan ve hızlı olarak

doğrulanması için PCR‟ın kullanılabileceği değerlendirilmektedir. Ayrıca

klasik kültür tekniği ve doğrulama testleri ile Salmonella izolasyonu 5 gün

kadar sürdüğünden bazı tanının hızlı konması gereken özel durumlarda real-

time PCR‟ın klasik kültür yöntemiyle birlikte eĢ zamanlı uygulanmasının yarar

sağlayabileceği değerlendirilmektedir.

Bu çalıĢmada Salmonella suĢlarına DNA dizi analizi ile serotiplendirme

yapılıp yapılamayacağını araĢtırmak için real-time PCR ile Salmonella spp.

olarak doğrulanan toplam 100 izolatın içinden toplam 30 adet Salmonella

suĢu; B serogrubundan, D1 serogrubundan ve bu iki serogrupta yer

almayan 10‟ar adet suĢ alınacak Ģekilde rastgele seçildi. 16S rRNA ile

yapılan sekanslama sonucunda tüm suĢların S. enterica türü olduğu tespit

64

edilmiĢtir fakat serotip düzeyinde tiplendirme yapılamamıĢtır. Christensen ve

ark. (1998) 16S rRNA ile yaptıkları sekanslama sonucunda S. enterica ve S.

bongori ayrımını yapabildiklerini bildirmiĢlerdir. Tang ve ark. (1998)

konvansiyonal yöntemle eĢ zamanlı toplam 72 adet aerobik Gram negatif

etkenlere 16S rRNA kısımları ile yaptığı sekanslama sonucu fermentasyon

özelliğine sahip 25 etkenin (Enterobactericae familyasına ait 8 suĢ içermekte)

cins düzeyinde % 92‟sini ve tür düzeyinde ise % 72‟sini identifiye ettiklerini

bildirmiĢlerdir. Woo ve ark. (2001) biyokimyasal yöntemlerle ve 3 ayrı ticari

kitle yaptıkları çalıĢmada S.Typhi olarak identifiye ettikleri bir izolata 16S

rRNA kısımlarıyla (1381bp ) yaptıkları sekanslama sonucu etkenin S.

enterica olduğunun tespit edildiğini fakat GENBANK bilgi sistemine

verildiğinde serotip olarak tespit edilemediğini ve Salmonella türleri arasında

16S rRNA kısmındaki baz farklılıklarının minimal düzeyde olduğunu,

dolayısıyla Salmonella‟ların tiplendirilmesinde 16S rRNA ile yapılan

sekanslamanın sınırlı bir yarar sağlayabileceğini bildirmiĢlerdir. Woo ve ark.

(2009) 16S rRNA ile yapılan sekanslamanın tür tespitinde güvenirliğinin az

olmasına karĢın fenotipik yöntemlerle identifiye edilmesi zor olan Gram pozitif

kok grubunda yer alan Granulicatella, Abiotrophia, Gemella, Helcococcus gibi

bakterilerle birbirinden fenotipik olarak ayrımı zor olan Mycobacterium ve

Nocardia gibi etkenleri cins düzeyinde tespit etmekte 16S rRNA ile yapılan

sekanslamanın baĢarılı olduğunu tespit etmiĢlerdir. Fakat tür tespiti yaparken

16S rRNA ile yapılan sekanslamanın yapılmasının yanı sıra fenotipik

tiplendirme yapan diğer teknikler ile baĢka gen hedeflerinin tespitinin eĢ

zamanlı olarak yapılması gerektiğini bildirmiĢlerdir. Han (1998) bakterilerde

cins içinde yer alan bazı türlerin ve hatta bazı bakteri cinslerinin benzer 16S

rRNA sekans dizimlerine sahip olduğunu (E.coli ve Shigella gibi), hatta alt

türler arasındaki 16S rRNA sekans dizilim benzerliğinin çok daha fazla

olduğunu ve sekans dizilimlerinde benzerliğin çok fazla olduğu bakterilerde

kültür ve fenotipik özelliklere de bakılması gerektiğini bildirmiĢlerdir. Han

(1998) sekanslama yaptıkları 35 suĢ koleksiyonunun identifikasyonunda tek

baĢına sekanslamanın iyi sonuçlar vermediğini (< %97) ancak hücresel yağ

asit analiziyle birlikte yapıldığında identifikasyon yapılabildiğini bildirmiĢlerdir.

65

Ayrıca sekans analizi yapılırken birçok laboratuarlarda sadece forward

sekans analizi yapılmakta olup forward ve reverse sekans analizlerinin

birlikte yapılmasıyla çok daha baĢarılı sonuçlar alınabileceği bildirilmektedir.

Bununla birlikte, sekans analizi uygulanması zor ve yetiĢmiĢ personel

gerektiren bir test olduğundan analiz sonucunda sekans okunmasının zayıf

olduğu kısımlarda meydana gelen N, R, Y, W, M, S, veya K (bilinmeyen baz,

A veya G, C veya T, A veya T, A veya C, G veya C, G veya T ) gibi 2 farklı

bazdan biri olabileceği anlamına gelen veya B, D, H ve V harfleri gibi 3 farklı

bazdan biri olabileceği anlamına gelen harf ifadeleri görülebilir. Konuyla ilgili

bir diğer husus ise; 500 bp içeren sekans dizisi günümüzde sıklıkla bakteri

identifikasyonu için hazır kitleri de kapsayan geniĢ bir kullanım alanı

bulmasına karĢılık, 16S rRNA geninin 1550 bp uzunluğunda sekans bilgisi

içeren farklı uzunlukların seçilmesi gerekebilir. Son olarak mevcut nükleotid

sekansların en geniĢ bilgi bankası olan GENBANK‟ta eski girilen sekans

dizilimlerinden yanlıĢ ve eksik girilmiĢ olanların mevcut olduğu bildirilmektedir

(Clarridge, 2004).

16S rRNA sekans analiziyle ilgili olarak Salmonella‟ların

serotiplendirilmesi için 500 bp'lik sekans analizinin kullanımının tek baĢına

yeterli olmayacağı ve 16S rRNA sekans analizinin identifikasyon için yetersiz

kaldığı durumlarda 16S rRNA geninin 1550 bp uzunluğundaki sekans

dizilimiyle yapılan bakteri identifikasyonunlarında denenebileceği ve Pasteur

Enstitüsü tarafından önerilen antiserumlar kullanılarak Kauffman–White

sınıflandırma Ģemasına göre yapılan serotiplendirmenin hala en geçerli

yöntem olduğu değerlendirilmektedir.

66

5. SONUÇ VE ÖNERİLER

Bu çalıĢmada, 721 tavuk karkas örneğinin 100 adedinde (% 13,8) Salmonella

spp. izole ve identifiye edildi. Halk sağlığını korumak amacıyla, entegrasyon

düzeyinde Salmonella varlığının devamlı olarak izlenerek, iĢletmeler için

Salmonella kontrol programının uygulanması yararlı olacaktır. Ayrıca, konu

ile ilgili geniĢ çaplı çalıĢmalar yapılması, konunun değerlendirilmesi ve kontrol

önlemlerinin düzenlenmesi bakımından da önem arz etmektedir.

Tavuk karkaslarında Salmonella varlığının kültür yöntemi ile

araĢtırılması önemli bilgiler sağlamaktadır. Ancak, doğrulama testlerininde

zahmetli ve zaman alıcı olduğu da bir gerçektir. Bu nedenle, tavuk

karkaslarından izole edilen Salmonella‟ların doğrulanması amacıyla bazı özel

durumlarda real-time PCR yönteminin kullanılabileceği hususu

değerlendirilmelidir. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda kanatlı hayvan

kümeslerinde mutlaka hijyen ve biyogüvenlik önlemleri alınmalıdır.

ĠĢletmelerdeki Salmonella kontaminasyonu gözle görülür bir olgu olmadığı

için, iĢletmelerde yapılan biyogüvenlik iĢlemlerinin kalitesini ölçmek ve

tamamlamak amacıyla, bu konuda çalıĢan iyi bir laboratuvar tarafından

uygulanan iyi düzenlenmiĢ bir bakteriyolojik izlemeye ihtiyaç vardır.

Tavuk karkaslarında, diğer hayvansal gıdalarda ve insanlarda

antibiyotiğe dirençli Salmonella türlerinin ortaya çıkmasının ve

yaygınlaĢmasının nedenleri araĢtırılmalı ve azaltma için programlar

geliĢtirilmelidir.

Ayrıca Salmonella‟ların serotiplendirilmesi için sekans analizinin

kullanımının tek baĢına yeterli olmayacağı ve Pasteur Enstitüsü tarafından

önerilen antiserumlar kullanılarak Kauffman–White sınıflandırma Ģemasına

göre yapılan tiplendirmenin, sekans analiz ile yapılan tiplendirmeden daha

etkin olduğu değerlendirilmektedir.

67

ÖZET

Tavuklarda Salmonella tanısında kültür ve Real-Time PCR’ın kullanımı

Bu çalıĢmanın amacı, Marmara ve Karadeniz bölgesindeki kesimhanelerden temin edilen

tavuk karkaslarında Salmonella‟ların varlığının araĢtırılması, Salmonella tanısında kültür,

Real-Time PCR'ın kullanımı ve Salmonella suĢlarının moleküler tiplendirilmesinde sekans

analizinin uygulanabilirliğinin araĢtırılması amaçlanmıĢtır.

Ankara, Bolu ve Balıkesir'deki kesimhanelerden gelen, 721 tavuk karkas örneğinden,

100 adedinin (% 13,8) Salmonella içerdiği saptandı. 100 Salmonella suĢu grup B ve grup D1

antiserumları ile serogruplandırıldı ve 15 adedinin B grubuna, 58 adedinin ise D1 grubuna ait

olduğu tespit edilirken; 27 Salmonella suĢunun B ve D1 grubunda olmadığı tespit edildi.

Ġzolatlar öncelikle invA gen sekansı esas alınıp Real-Time PCR ile doğrulandı ve

sonrasında 10 farklı antibiyotiğe karĢı dirençlilikleri araĢtırıldı. ÇalıĢma sonucunda izolatların

tümü vankomisin, metisilin ve novobiosine dirençli bulunurken, bu antibiyotikleri sırasıyla %

85 ile tetrasiklin, % 50 ile gentamisin, % 28 ile amoksisilin+klavulanik asit % 23 ile ampisilin,

% 21 ile mezlocillin, % 15 ile enrofloksasin, % 6 ile sülfametoksazol / trimetoprim izledi.

Bu çalıĢmada, tavuk karkaslarından izole edilen Salmonella etkenlerinin

doğrulanması amacıyla Real-Time PCR yönteminin kullanılabileceği görülmüĢtür. Ayrıca 24

saat gibi kısa bir sürede sonuç veren real-time PCR‟ın rutin teĢhis amacıyla da

kullanılabileceği de değerlendirilmektedir.

DNA dizi analizi yapılan B serogrubuna ait olan 10 Salmonella, D1 serogrubuna ait

olan 10 Salmonella ve B ve D1 serogrubuna ait olmayan 10 Salmonella suĢlarının tümünün

tür düzeyinde Salmonella enterica subsp. enterica olduğu tespit edilirken, serotiplendirme

yapılamadı.

Anahtar Sözcükler: Antibiyotik Dirençlilik, real-time PCR, Salmonella, Sekanslama, Tavuk

Karkas.

68

SUMMARY

Use of culturel method and real-time PCR in diagnosis of Salmonella in

poultry

In this study, the presence of Salmonella spp. in chicken carcasses which are supplied from

abattoirs situated in Marmara and Black Sea regions, are investigated by real-time PCR and

culture method. The usability of molecular typing of isolated Salmonella spp. by sequence

analysis is also investigated.

In conclusion, 100 (13.8%) Salmonella spp. were detected from 721 chicken

carcasses provided from the abattoirs situated in Ankara, Bolu and Balıkesir. 100 Salmonella

strains are serogrouped with Group B and Group D1 antisera and 15 Salmonella strains are

detected as group B, 58 Salmonella strains are detected as group D1 and 27 Salmonella

strains are detected as neither group B nor group D1.

Isolates are formerly confirmed by real-time PCR with invA gene sequence and

afterwards tested for 10 different antibiotics to detect their resistance. In conclusion of the

study; among the isolates, the highest resistance developed against vancomycin, meticilin,

novobiocin by 100%, followed by 85% for tetracycline, 50% for gentamicin, 28% for

amoxicillin + clavulanic acid, 23% for ampicillin, 21% for mezlocillin, 15% for enrofloxacin,

6% for sulphamethoxazol/trimetoprim.

In the study, it is determined that Salmonella isolated from chicken carcasses can

be verified by real-time PCR method, which gives results in less than 24 hours, can also be

used for routine diagnosis.

10 Salmonella group B strains, 10 Salmonella group D1 strains and 10 neither group

B nor group D1 Salmonella strains are sequence analyzed. It is found that all of the strains

are Salmonella enterica subsp. enterica. by sequence analysis but none of those isolates

can be serotyped.

Key words: Antibiotic Resistance, Chicken Carcasses, real-time PCR, Salmonella,

Sequencing.

69

KAYNAKLAR

AABO, S., RASMUSSEN, O.F., ROSSEN, L., SORENSEN, P.D., OLSEN, J.E.

(1993). Salmonella identification by the polymerase chain reaction. Mol. Cell. Probes., 7: 171-178.

ADAMS, M.R., MOSS, M.O. (1995). Salmonella. In : Food Microbiology. The Royal

Society of Chemistry, Cambridge, p.: 192-200. ADAMS, P.S. (2006). Data analysis and reporting. In: Real-time PCR. Ed: M.T.

Dorak, Taylor & Francis Group, UK., p.: 39 – 62. AKAN, M. (2008). Kanatlılarda Salmonella infeksiyonları ve kontrolünde temel

prensipler. Veteriner Tavukçuluk Derneği Mektup Ankara Dergisi. 6(2): 2-3. AKMAN, M.Ü., GÜLMEZOĞLU, E. (1976). Tıbbi Mikrobiyoloji, 12. Baskı Ders Kitabı,

Ankara. s.: 347–352. AKSAKAL, A. (2003). Bazı kanatlıların dıĢkılarında Salmonella türlerinin varlığı ve

yaygınlığı ile antibiyotiklere duyarlılıkları, YYÜ, Vet. Fak. Derg., 14(1): 95-101. ALDRIDGE, P., GNERER, J., KARLINSEY, J.E., HUGHES, K.T. (2006).

Transcriptional and translational control of the Salmonella fliC gene, J.of Bact., 188(12): 4487-4496.

AMAGUANA, R.M., ANDREWS, W.H. (1999). Detection by Classical Cultural

Techniques In: Encylopedia of food microbiology, Edit by; Robinson, R.K., Academic Pres, USA, p.: 1928-1984.

ANGULO, F.J., JOHNSON, K., TAUXE, R.V., COHEN, M.L. (2000). Significance

and sources of antimicrobial-resistant nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Microb. Drug Res., 6: 77-83.

ANON, (2003). Salmonella. U:S: Food and Drug Administration Bacteriological

Analytical Manual. Chapter 5. ANON, (2004). Salmonella standart ve ileri tanı. ISBN975-98452-0-2.4 Ġstanbul. ANON, (2005a). Salmonellosis. Institute for International Cooperation in Animal

Biologics. EriĢim: [http://www.cfsph.iastate.edu/Factsheets/nontyphoidal_ salmonellosis. pdf.]. EriĢim Tarihi: 30.03.2011.

ANON, (2005b). TS EN ISO 6579: Mikrobiyoloji - Gıda ve hayvan yemleri -

Salmonella türlerinin belirlenmesi için yatay yöntem. Türk Standartları Enstitüsü Standartları.

ANON, (2006a). Yem Katkıları ve Premikslerin Üretimi, Ġthalatı, Ġhracatı, SatıĢı ve

Kullanımı Hakkında Tebliğde DeğiĢiklik Yapılmasına Dair Tebliğ. Tarım ve KöyiĢleri Bakanlığından. 21 Ocak 2006. Sayı: 26056 Tebliğ No: 2006/1 Resmi Gazete.

70

ANON, (2006b). CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 16 th Informational Supplement. CLSI Document M100–S16, 26. Wayne, Pennsylvania, USA.

ANON, (2011). Nucleotid BLAST. EriĢim: [http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ].

EriĢim Tarihi: 09.01.2011. ANTUNES, P., REU, C., SOUSA, J.C., PEIXE, L., PESTANA, N. (2002). Incidence

of Salmonella from poultry products and their susceptibility to antimicrobial agents, I. J. Food Microbiol., 82(2): 97-103.

BACH, H.J., TOMANOVA, J., SCHLOTER, M., MUNCH. J.C. (2002). Enumeration

of total bacteria and bacteria with genes for proteolytic activity in pure cultures and in environmental samples by quantitative PCR mediated amplification, J. of Microbiol. Meth., 49: 235–245.

BAILEY, J.S. (1998). Detection of Salmonella cells within 24 to 26 hours in poultry

samples with the polymersae chain reaction BAX system. J.of Food Protect., 61: 792-795.

BARROW, P.A., LOWELL, M.A., MURPHY, C.K., PAGE, K. (1999). Salmonella

infection in a commercial line of ducks; Experimental studies in virulence, intestinal colonization and immune protection. Epidemiol. Infect., 123: 121-132.

BAUMLER, A.J., HEFFRON, F., REISSBRODT, R. (1997). Rapid Detection of Salmonella enterica with Primers Specific for iroB. J. Clin. Microbiol., 35: 1224-1230. BAYLIS, C. (2000). The Catalogue of Rapid Microbiological Methods, Review No. 1,

4th ed., Campden and Chorleywood Food Research Association, Chipping Campden, UK.

BEKAR, M. (1997) Enterobacteriaceae Familyası Mikroorganizmaların Genel

Karakterleri ve Tanı Yöntemleri. Veteriner Kontrol ve AraĢtırma Enstitüsü Müdürlüğü Etlik-Ankara, Yayın No: 97-1.

BELI, E., DURAKU, E., TELO, A. (2001). Salmonella serotypes isolated from

chicken meat in Albania. Int. J. Food Microbiol., 71(2-3): 263-266. BELL, C., KYRIAKIDES, A. (2002). Salmonella. In: Foodborne Pathogens. Ed.:

C.D.W. Blackburn, P.J. Mcclure, Woodhead Publishing, Boca Raton, p.: 283-331.

BĠLGEHAN, H. (1992) Klinik Mikrobiyoloji. Özel Bakteriyoloji ve Bakteri

İnfeksiyonları. BarıĢ Yayınları, Fakülteler Kitabevi, Ġzmir. BĠLGEHAN, H. (2004). Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Ġzmir: Fakülteler Kitabevi BarıĢ

Yayınları., p: 425-455. BLAIS, B.V., PIETRZAK, E.,OUDIT, D., WILSON, C., PHILLIPPE, L.M., HOWLETT, J. (1998). Polymacron enzyme immunoassay system for detection of naturally

71

contaminated salmonella in foods, feeds and environmental studies. J. Food Prot., 61: 1187-1190. BOTJES, M.W., KOBE, B., LANGE, C., SCHWARZ, S. (1998). Molecular typing of

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Hadar: evaluation and application of different typing methods, Vet. Microbiol., 61: 215- 227.

BOTTGER, E.C. (1989). Rapid determination of bacterial ribosomal RNA sequences by direct sequencing of enzymatically amplified DNA. FEMS Microbiol. Lett., 65: 171– 176. BOYNUKARA, B., AYDIN, F. (1990). Tavuklardan izole edilen Salmonella suĢlarının

antibiyotiklere duyarlılıkları üzerinde bir araĢtırma. Türk Vet. Hek. Derg., 90(6): 21-23.

BRENNER, F.W., VILLAR, R.G., ANGULO, F.J., TAUXE, R., SWAMINATHAN, B.

(2000). Salmonella Nomenclature. J. Clin. Microbiol., 38: 2465-2467. BUCHOLZ, P.S., FAIRBROTHER, A. (1992). Pathogenicity of Salmonella pullorum

in northern bobwhite quail and mallard ducks. Avian Dis., 36: 304-312. BUHANIA, A.K. (2008). Foodborne Microbial Pathogens. Springer

Science+Business Media, New York. 11: 201-216. CALDWELL, A.L., GULIG, P.A. (1991). The Salmonella typhimurium virulence

plasmid encodes a positive regulator of a plasmid-encoded virulence gene, Journal of Bacteriology., 173(22): 7176-7185.

CANDRIAN, U. (1995). Polymerase chain reaction in food microbiology. J. Microbiol. Meth., 23: 89–103. CAPITA, R., ALVAREZ-ASTORGA, M., ALONSO-CALLEJA, C., MORENO, B., DEL

CAMINO GARCIA-FERNANDEZ, M. (2003). Occurrence of Salmonella in retail chicken carcasses and their products in Spain. Int. J. Food. Microbiol., 81(2): 169-173.

CARRAMINANA, J.J., ROTA, C., AGUSTIN, I., HERRERA, A. (2004). High prevalence of multiple resistance to antibiotics in Salmonella serovars isolated from a poultry slaughterhouse in Spain, Vet. Microbiol., 104: 133-139.

CASSAR, R., CUSCHIERI, P. (2003). Comparasion of Salmonella chromogenic medium with DCLS agar for the isolation of Salmonella species from stool samples. J.of Clin. Microbiol., 41: 3229-3232.

CETINKAYA, F., CIBIK, R., SOYUTEMIZ, G.E., OZAKIN, C., KAYALI, R., LEVENT,

B. (2008). Shigella and Salmonella contamination in various foodstuffs in Turkey. Food Contr., 19: 1059-1063.

CHANG, Y.H. (2000). Prevalence of Salmonella spp. in poultry broilers and

shell eggs in Korea. J. Food Prot., 63(5): 655-658.

72

CHEN, K., NEIMARK, H., RUMORE, P., STEINMAN, C.R., (1989). Broad-range DNA probes for detecting and amplifying eubacterial nucleic acids. FEMS Microbiol. Lett., 57: 19–24. CHENG, C.G., LIN, W., VAN, K.T., PHAN, L., TRAN N.N., FARMER, D. (2008).

Rapid Detection of Salmonella in Foods Using Real-Time PCR. J.of Food Protect., 12: 2436–2441.

CHRISTENSEN, H., NORDENTOFT, S., OLSEN J.E. (1998). Phylogenetic

relationships of Salmonella based on rRNA sequences. Int.J.Syst.Bact., 48: 605-610.

CLARRIDGE, J.E. (2004). Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Clin. Microbiol. Rev., 17: 840-862. COOKE, V.A., MILES, R.J., PRICE, R.G., RICHARDSON, A.C. (1999). A novel

choromogenic ester agar medium for the detection of Salmonellae. Appl. and Envir. Microbiol., 65: 807-812.

CORTEZ, A.L.L., CARVALHO, A.C.F.B., IKUNO, A.A., BURGER, K.P., VIDAL-

MARTINS, A.M.C. (2006). Identification of Salmonella spp. isolates from chicken abattoirs by multiplex-PCR, Vet. Sci., 81: 340-344.

COTTER, P.F., MURPHY, J.E., KLINGER, J.D., TAYLOR, R.L. (1995). Identification

Salmonella enteritidis from experimentally infected hens using a colorimetric DNA hybridization method. Avian Dis., 39: 873-878.

CRICHTON, P.B., HENRY, M.S., OLD, D.C. (2000). Strain discrimination of a novel

serotype of Salmonella from harbour porpoises (Phocoena phocoena) by molecular techniques, Vet. Microbiol., 76: 61-69.

ÇARLI, K.T., UNAL, C.B., CANER, V., EYIGOR, A. (2001). Detection of Chicken Feces by a Combination of Tetrathionate Broth Enrichment, Capillary PCR, and Capillary Gel electrophhoresis. J. Clin. Microbiol., 39(5): 1871-1876. ÇARLI, K.T., EYĠGÖR, A., GONCAGÜL, G., GÜNAYDIN, E. (2004). Salmonella

Standart ve İleri Tanı Yöntemleri, Ġstanbul, Türkiye. D'AOUST, J.Y, SEWELL, A.M., DALEY, E., GRECO P. (1992). Antibiotic

resistance of agricultural and foodborne Salmonella isolates in Canada. J. Food Prot., 55: 428-434.

D‟AOUST, J. Y. (1997). Salmonella species. In: Food Microbiology, Fundamentals

and Frontiers. Ed.: M.P. Doyle, L.R. Beuchat, T.J. Montville ASM Press, Washington D.C., p.: 129-157.

DESMEDT, J.M., BOLDERDIJK, R.F., RAPPOLD, H.F., LAUTENSCHLAEGER, D.

(1986). Rapid Salmonella Detection in Foods by Motility Enrichment on a Modified Semi-Solid Rappaport-Vassiliadis Medium. J. Food Protect., Vol. 49: 510-514.

73

DOYLE, M.P., CLIVER, D.O. (1990). Salmonella. In: Foodborne Disease, Ed.: Cliver, D. O. Food Research Inst., Academic Pres Inc., San Diego, California, p.: 185-205.

DURANGO, J., ARRIETA, G., MATTAR, S. (2004). Presence of Salmonella as a

risk to public health in the Caribbean zone of Colombia, Biomed., 24(1): 89-96. ELIZAQUIVEL, P., AZNAR, R. (2008). A multiplex RT-PCR reaction for

simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp. and Staphylococcus aureus on fresh, minimally processed vegetables, Food Microbiol., 25(5): 705-13.

EROL, Ġ. (2007). Salmonella. In : Gıda Hijyeni ve Mikrobiyolojisi. Pozitif Matbaacılık Ltd. ġti., s.: 60-70. EROL, Ġ., YURTYERI, A., HILDEBRANDT, G., KLEER, J., BILIR ORMANCI, F.S.,

KOLUMAN, A. (2004). Salmonella‟ların piliç karkaslarından kültür tekniği ve immunomanyetik PCR ile karsılastırmalı olarak saptanması. 1.Ulusal Veteriner Gıda Hijyeni Kongresi, 29 Eylül-1 Ekim 2004. s.: 29-38.

EYIGOR, A., CARLI, K.T., UNAL, C.B. (2002). Implementation of real-time PCR to

tetrathionate broth enrichment step of Salmonella detection in poultry. Lett. Appl.Microbiol., 34: 37-41.

EYIGOR, A., GONCAGUL, G., GUNAYDIN, E., ÇARLI, K.T. (2005). Salmonella

profile in chickens determined by real-time polymerase chain reaction and bacteriology from years 2000 to 2003 in Turkey. Avian Pathol., 34: 101-105.

FAKHR, M.K., MCEVOY, J.M., SHERWOOD, J.S., LONGUE, C.M. (2006) Adding a

selective enrichment step to the 4Q-Check real- time PCR improves the detection of Salmonella in naturally contaminated retail turkey meat products. Lett. Appl. Microbiol., 43: 78-83.

FARMER, J.J., McWHORTER, A.C., BRENNER, D.J., MORRIS, G.K. (1984). The

Salmonella Arizona group of Enterobacteriaceae: nomenclature, classification, and reporting. Clin. Microbiol.Newsl., 6: 63-66.

FEDER, I., NIETFELD, J.C., GALLAND, J., YEARY, T., SARGEANT, J.M.,

OBERST, R., TAMPLIN, M.L., LUNCHANSKY, J.B. (2001). Comparison of Cultivation and PCR-Hybridization for Detection of Salmonella in Porcine Fecal and Water Samples. J. Clin. Microbiol., 39: 2477-2484.

FILETICI, E., MARTINI, A., MAGNI, L., FANTASIA, M. (1988). R-plasmid in

Salmonella isolates from sporadic cases of gastroenteritis. Eur.J. Epidemiol., 4(3): 366-370.

FĠDANCI, H.A., BEKAR, M., DULKAN, B., TUTLUER, H. (1994). Ankara‟da tüketime

sunulan Broyler karkas parçalarında Salmonella insidensi. I. Ulusal Veteriner Mikrobiyoloji Kongresi. 27-29 Eylül 1994, ANKARA.

FLOWERS, R.S., D‟AOUST, J.Y., ANDREWS, W.H., BAILEY, J.S. (1992). Salmonella. In : Compendium of the The Methods for the Microbiological

74

Examinations of Food. Ed.: Vanderzant, C., Splittsoesser, D.F. American Public Health Assoc. 3rd.ed., p.: 371-404. FRATAMICO, P.M. (2003). Comparison of culture, polymerase chain reaction (PCR)

TaqMan Salmonella and Transia card Salmonella assays for detection of Salmonella spp. in naturally-contaminated ground chicken, ground turkey and ground beef. Mol. Cell. Probes. 17: 215-221.

FREYDIERE, A.M., GILLE, Y. (1991). Detection of salmonellae by using Rambach

Agar and by a C8 Esterase Spot Test. J.of Clin. Microbiol., 29: 2357-2359. FRICKER, C. R. (1987). The Isolation of Salmonellas and Campylobacters. J. Appl. Bacteriol., 63: 99 -116. GAST, R.K. (2003). Salmonella Infections. In: Diseases of poultry 11. Ed. Ed: SAĠF, Y.M. Iowa State Press p.: 567-613. GAST, R.K., BEARD, C.W. (1990). Production of Salmonella enteritidis-

contaminated eggs by experimentally infected hens. Avian Dis., 34: 438-446. GAY, J.M., RICE, D.H., STEIGER, J.H. (1994). Prevalence of faecal

Salmonella shedding by cull dairy cattle marketed in Washington State. J.Food Prot., 57: 195-197.

GIANNELLA, R.A. (2006). Salmonella. In : Medical Microbiology, 4th edition Ed:

BARON, S., The University of Texas Medical Branch at Galveston. EriĢim: [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8435/ ]. EriĢim Tarihi: 26.04.2011.

GONCAGÜL, G., GÜNAYDIN, E., ÇARLI, K.T. (2005). Prevalence of Salmonella

serogroups in chicken meat. Turk. J. Vet. Anim. Sci., 29: 103-106. GREENBERG, R.A. (1985). Antibiotics in animal feed. This report was written by

Greenberg, R.A. “May 1985”, p:2, cover. Bibliography; p.: 24-27. GRIMONT, P.A.D., WEILL, F.X. (2007). Antigenic formulas of the Salmonella

serovars, 9th edition. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Pasteur Institute, Paris, France.

GROISMAN, E.A., OCHMAN, H. (1996). Pathogenicity islands: bacterial evolution in quantum leaps. Cell., 87: 791–794. GÜNEL, T. (2007). Gen Anlatımının Kantitatif Analizi “Real-Time PCR”. Türkiye

Klinikleri J. Med. Sci., 27: 763-767. GÜNAYDIN, E. (2005). Kanatlı etlerinde Salmonella aranması için kapiller polimeraz

zincir reaksiyonu. Doktora Tezi, Uludağ Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü. HADĠMLĠ, H.H., ERGANĠġ, O., GÜNER, A., DOĞRUER, Y., KAV, K., ÖZTÜRK, D.

(2002) Tavuk etlerinde Salmonella, Campylobacter ve E. coli O157‟nin varlığı üzerine araĢtırmalar, 5. Ulusal Veteriner Mikrobiyoloji Kongresi, 24-26 Eylül, Konya.

75

HALKMAN, K. (2005). Merck Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları, BaĢak Mat. Ltd. ġti., Ankara, s.: 187-192.

HAN, X.Y. (1998). Microbiology Bacterial Ġdentification Based on 16S Ribosomal

RNA Gene Sequence Analysis. In : Advanced Techniques in Diagnostic Microbiology, Ed.: Y. W. Tang, C. W. Stratton. New York Springer Science+Business Media, p.: 323-330.

HARMSEN, D., KARCH. H. (2004). 16S rDNA for diagnosing pathogens: a living

tree. ASM News 70: 19–24. HENSEL, M. (2004). Evolution of pathogenicity islands of Salmonella enterica. Int.J.

Med. Microbiol. 294:95–102. HERBERT, D., ALTWEGG, M. (1993). Comparasion of Rambach Agar, SM-ID

Medium and Hectoen Enteric Agar for primary isolation of non-typhi salmonellae from stool samples. Journal of Clinical Microbiology., 31: 410-412.

HERNANDEZ, T., RODRIGUEZ, C., AREVALO, M.P. (2002). Antimicrobial-resistant

Salmonella enterica serovars isolated from chickens in Spain. J. Chemother., 14: 346–350.

HIGUCHI, R., DOLLINGER, G., WALSH, P.S, GRIFFITH, R. (1992). Simultaneous

amplification and detection of specific DNA sequences. Biotech., 10: 413–417. HIGUCHI, R., FOCKLER, C., DOLLINGER, G., WATSON, R. (1993). Kinetic PCR

analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotech., 11: 1026– 1030.

HOLT, J.G., KRĠEG, N.R., SNEATH, P.H.A., STALEY, J.T., WILLIAMS, S.T. (1994). Bergey‟s Manual of Determinative Bacteriology., 9th Edition. HOLT, K.E., THOMSON, N.R., WAIN, J., PHAN, M.D., NAIR, S., HASAN, R.,

BHUTTA, Z.A., QUAIL, M.A., NORBERTCZAK, H., WALKER, D., DOUGAN, G., PARKHILL, J. (2007). Multidrug resistant Salmonella enterica serovar paratyphi A harbors IncHI1 plasmids similar to those found in serovar typhi. J.of Bacteriol., 189: 4257-4264.

HOORFAR, J., BAGGESEN, D.L., PORTING, P.H. (1999). A PCR-based strategy for simple and rapid identification ofrough presumptive Salmonella isolates. J. Microbiol. Meth., 35: 7–84. HORROX, N. (1995) Salmonella: All you want to know, but were afraid to ask. Int.

Hatch. Prac., 10: 1-16. ĠZGÜR, M. (2002). Salmonella Ġnfeksiyonları. In : Kanatlı Hayvan Hastalıkları, Ed.:

M. Ġzgür, M. Akan, Ankara: Medisan Yayınevi, p.: 41-53. ĠZGÜR, M. (2006). Salmonella Ġnfeksiyonları. In : Veteriner Mikrobiyoloji (Bakteriyel

Hastalıklar), Ed.: N. Aydın, J. Paracıkoğlu, Ankara: Ġlke-Emek Yayınları, p.: 116-121.

76

JENIKOVA, G., PAZLAROVA, J., DEMNEROVA, K. (2000). Detection of Salmonella in food samples by the combination of immunomagnetic separation and PCR assay, Int. Microbiol., 3: 225-229.

JERNGKLINCHAN, J., KOOWATANANKUL, C., DAENGPROM, K., SAITANU, K.

(1994). Occurence of Salmonella in raw broilers and their products in Thailand, J.Food Prot., 57(9): 808-810.

JOHNSON, D.C., DAVID, M., GOLDSMITH, S. (1992). Epizootiological investigation

of an outbreak of pullorum disease in an integral broiler operation. Avian Dis., 36: 770-775.

JONES, D.D., LAW, R., BEJ, A.K. (1993). Detection of Salmonella spp. in oyster

using polymerase chain reactions (PCR) and gene probes. J. Food Sci., 58: 1191.

KALENDER, H., MUZ, A. (1999). Elazığ bölgesindeki tavuklardan izole edilen

Salmonella türlerinin tiplendirilmesi, Tr.J.Vet.and Anim.Sci., 23(2): 297-303.

KAWASAKI, S., KIMURA, B., FUJII, T. (2001). Comparison of TaqMan Salmonella amplification/detection kit with standard culture procedure for detection of Salmonella in meat samples. Shokuhin Eiseigaku Zasshi., 42(1): 33-9.

KILINÇ, Ü. (2005). Kayseri yöresindeki tavukçuluk iĢletmelerinden toplanan tavuklardan izole edilen Salmonella türlerinin antibiyotiklere duyarlılıkları. Yüksek Lisans Tezi, Erciyes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü.

KIMURA, B., KAWASAKI, S., FUJII, T., KUSUNOKI, J., ITOH, T., FLOOD, S.J.,

(1999). Evaluation of TaqMan PCR assay for detecting Salmonella in raw meat and shrimp. J.Food Prot., 62(4): 329-335.

KOLBERT, C.P., PERSING. D.H., (1999). Ribosomal DNA sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens. Curr.Opin.Microbiol., 2: 299– 305. KONEMAN, E.W., ALLEN, S.D., JANDA, W.M., SCHRECKENBERGER, P.C.,

WINN, W.C. (1992) Diagnostic Microbiology Fourth Edition. J.B. Lippincott Company. Philadelphia. p.: 105-184.

KONEMAN, E.W, WASHINGTON, W.J., ALLEN, S., JANDA, W., PROCOP, G.,

SCHRECKENBERGER, P., WOODS, G. (2006). Koneman’ s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology sixth edition. USA: Lippincott Willams & Wilkins, Chapter 6.

KUBISTA, M., ANDRADE, M., FOROOTAN, A., JONAK, J., LIND, K. (2006). The

real-time polymerase chain reaction. Mol.Aspects Med., 27: 95-125. KWANG, J., LITTLEDIKE, E.T., KEEN, J.E. (1996). Use of polymerase chain

reaction for Salmonella detection. Lett. in Appl. Microbiol., 22: 46-51. LE MINOR, L., POPOFF, M.Y. (1987) Designation of Salmonella enterica sp. nov.,

nom. Rev. As the type and only species of the genus Salmonella. Int.J.Syst. Bacteriol., 37: 465-468.

77

LEE, L.G., CONNELL, C.R., BLOCH, W. (1993a). Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes. Nucl.Acids Res., 21: 3761-3766.

LEE, L.A., THREATT, V.L., PUHR, N.D., LEVINE, P., FERRIS, K., TAUXE,

R.V. (1993b). Antimicrobial-resistant Salmonella spp. isolated from healty broiler chickens after slaughter. J.Am.Vet.Med.Assoc., 202(5): 752-755.

LEON, S.H., SACO, M., SILVESTRE, A.M., SILVEIRA, L., ECHEITA, A., USERA,

M.A. (2005). Molecular characterization of a new serovar of Salmonella bongori 13,22:z39:– isolated from a lizard, Res. in Microbiol., 156: 597-602.

LEUTENEGGER, C.M. (2001). The Real-Time TaqMan PCR and Applications in

Veterinary Medicine. Vet. Sci. Tomorrow., 1 LIN, C.K., HUNG, C.L., HSU, S.C., TSAI, C.C., TSEN, H.Y. (2004). An improved

PCR primer pair based on 16S rDNA for the specific detection of Salmonella serovars in food samples. J.of Food Protect., 67: 1335-1343.

LIN, C.K., TSEN, HY. (1996). Use of two targeted oligonucleotides as PCR primers

for the specific detection of Salmonella in foods. J.of Appl. Bacteriol., 80: 659-666.

LISTER, S.A. (1988) Salmonella enteritidis infection in broilers and broiler breeders.

Vet. Rec., 123: 350. MA, H., SHIEH, K.J., CHEN, G., QIAO, XT., CHUANG M.Y. (2006). Application of

Real-time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) . The J.of American Sci., 2(3): 1-15.

MACHADO, J., BERNARDO, F. (1990). Prevelance of Salmonella in chicken

carcasses in Portugal, J.Appl.Bacteriol., 69: 477- 480. MACKAY M.I., ARDEN, E.K., NITSCHE, A. (2002). Real-time PCR in virology. Nucl.

Acids Res., 6: 1292-1305. MADDOCKS, S., OLMA, T., CHEN, S. (2002). Comparasion of CHROMagar

SalmonellaMedium and Xylose-Lysine-Desoxycholate and Salmonella-Shigella Agars forisolation of Salmonella strains from stool samples. J.of Clin.Microbiol., 40: 2999-3003.

MALKAWII, H.I., GHARAIBEH, R. (2003). Multiplex PCR for the direct detection of

Salmonella enterica from chicken, lamb, and beef food products. J.of Basic Microbiol., 43: 328-336.

MALLINSON, E.T. (1990). Salmonella monitoring system simplifies evaluation of

farms. Poult. Digest., September p.: 46-47. MALORNY, B., HUEHN, S., DIECKMANN R., NADĠNE KRAMER N., HELMUTH, R.

(2008). Polymerase Chain Reaction for the Rapid Detection and Serovar Identification of Salmonella in Food and Feeding Stuff. Food Anal. Method., 2: 81–95.

78

MARSIGLIA, M. L., IKUTA, N., FONSECA, A. K., SCHUCH, D.T., HOTZEL, I., OZAKI, L.S., MARQUES, E.K., LUNGE, V.R. (1997). Development of a combined selective method and polymerase chain reaction (PCR) assay for sensitive detection of Salmonella in food samples, World J.of Microbiol. & Biotech., 13: 649-654.

MARTINEZ, N., MENDOZA, M.C., GUERRA, B., GONZALEZ-HEVIA M.A.,

RODICIO, M.R. (2005). Genetic basis of antimicrobial resistance in clinical isolates of Salmonella enterica serotype Hadar from a Spanish region. Microbiol. Drug Resis.-Mech. Epidemiol. and Dis., 11: 185-193.

MAYAHI, M., SHARMA, R.N., MAKTABI, S. (1995). An outbreak of blindes in chicks

associted with Salmonella pullorum infection. Indian Vet. J., 72: 922-925. MILLER, R.G., TATE, C.R., MALLĠNSON, E.T., SCHERRER, J.A. (1991). Xylose-

lysine-tergitol 4: An improved selective agar medium for the isolation of Salmonella. Poult. Sci., 70: 2429-2432.

MULWEY, M. R., BOYD, D. A., OLSON, A. B., DOUBLET, B., CLOECKAERT, A.

(2005). The genetics of Salmonella genomic island 1. Microbes and Infect., 8: 1915-1922.

MURRAY, C.J. (1991). Salmonella in the environment. Rev.Sci.Tech.Off.Int.Epiz.,

10: 765-785. NAGARAJA, K.V., POMEROY, B.S., WILLIAMS, J.E. (1991) Paratyphoid Infections,

Diseases of Poultry, 9nd Ed., Iowa State University Pres, Iowa, USA, p.: 99-130.

NAIR, K.K.S., RAO, D.N., HALEM, M.A. (1990). Bacteriological quality of dressed

chicken, Indian Vet., 67: 55-58. NOCKER, A., CHEUNG, C.Y., CAMPER, A.K. (2006). Comparison of propidium

monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. J.of Microbiol. Meth., 67: 310-320.

NOGRADY, N., TOTH, A., KOSTYAK, A., PASZTI, J., NAGY, B. (2007). Emergence

of multidrug resistant clones of Salmonella Infantis in broiler chickens and humans in Hungary. J.Antimicrob. Chemother., 60(3): 645-648.

NYE, K.J., FALLON, D., FRODSHAM, D., GEE, B., GRAHAM, C., HOWE, S.,

MESSER, S., TURNER, T., WARREN, R.E. (2002). An evaluation of the performance of XLD, DCA, MLCB and ABC agars as direct plating media for the isolation of Salmonella enterica from faeces. J.of Clin. Pathol., 55: 286-288.

O‟DONNELL, A.G., FALCONER, C., GOODFELLOW, M., WARD, A.C., WILLIAMS,

E. (1993). Biosystematics and diversity amongst novel carboxydotrophic actinomycetes. Antonie van Leewenhoek, 64: 325-340.

79

OGUNNIYI, A.D., KOTLARSKI, I., MORONA, R., MANNING, P.A. (1997). Role of SefA Subunit Protein of SEF14 Fimbriae in the Pathogenesis of Salmonella enterica serovar Enteritidis, Infect. and Immunity., 65(2): 708–717.

OLIVEIRA, S.D., RODENBUSCH, C.R., ROCHA, S.L.S., CANAL, C.W. (2003).

Evaluation of selective and non-selective enrichment PCR procedures for Salmonella detection. Lett.Appl.Microbiol., 36: 217-221.

OLIVEIRA, S.D., FLORES, F.S., SANTOS, L.R.S., BRANDELLI, A. (2005).

Antimicrobial resistance in Salmonella enteridis strains isolated from broiler carcasses, food, human, and poultry-related samples, I. J.Food Microbiol., 97: 297-305.

OLIVEIRA, S.D., SANTOSA, L.R., SCHUCHA, D.M.T., B, SILVAA, A.B., SALLEA C.T.P., CANALA, C.W. (2002). Detection and identification of salmonellas from poultry-related samples by PCR. Vet.Microbiol., 87: 25-35. ORAL, A.Ġ., TÜRKYILMAZ, S. (2008). Broyler Ġç Organlarından Salmonella enterica

subsp. enterica serovar Enteritidis‟in Ġzolasyonu ve Ġzole Edilen SuĢların Antibiyotiklere Duyarlılıklarının Belirlenmesi. Erciyes Üniv.Vet.Fak.Derg. 5(1): 27-33.

ÖZDEMĠR, Ü. (1996). Kanatlılardan izole edilen Salmonella suĢlarının

identifikasyonunda kullanılan metotlar üzerine araĢtırmalar. Pendik Vet. Mikrobiyol. Derg., 27(2): 143-162.

PALYS, T., NAKAMURA, L.K., COHAN, F.M., (1997). Discovery and classification of

ecological diversity in the bacterial world: the role of DNA sequence data. Int.J.Syst.Bacteriol., 47: 1145–1156.

PERRY, J.D., FORD, M., TAYLOR, J., JONES, A.L., FREEMAN, R., GOULD F.K.

(1999). ABC Medium, A new chromogenic agar for selective isolation of Salmonella spp. J.of Clin.l Microbiol., 37: 766-768.

POKHAREL, B.M., KOIRALA, J., DAHAL, R.K., MISHRA, S.K., KHADGA, P.K.,

TULADHAR, N.R. (2006). Multidrug resistant and extended spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Salmonella enterica (serotypes Typhi and Paratyphi A) from blood isolates in Nepal: surveillance of resistance an a search for newer alternatives. Int.J.of Infect.Dis., 10: 434-438.

POLAT, M., KARAHAN A.G. (2009). Multidisipliner yeni bir bilim dalı: biyoinformatik

ve tıpta Uygulamaları. S.D.Ü. Tıp Fak. Derg., 16(3): 41-50. POPOFF, M.Y., BOCKEMÜHL, J., BRENNER, F.W. (2000). Supplement 1998

(No:2) to the Kaufmann-White scheme. Res. Microbiol., 151: 63-65. POPOFF, M.Y., BOCKEMUHL, J., BRENNER, F.W., GHEESLING, L.L. (2001)

Supplement 2000 (no. 44) to the Kauffmann-White scheme. Res. Microbiol., 152: 907-909.

POPOFF, M.Y., LE MINOR, L. (2005). Genus XXXIII. Salmonella In: Bergey‟s

Manual of Systematic Bacteriology. Ed.:Garrity, G.M., Brenner, D.J., Krieg, N.R., Staley, J.T. Springer Science_Business Media, New York, 1: 764-799.

80

POPPE, C., KOLAR, J.J., DEMEZUK, W.H.B., HARRIS, J.E. (1995). Drug resistance and biochemical characteristics of Salmonella from turkeys. Can.J.Vet.Res., 59: 241-248.

ROJO, R.G., CHAVOLLA, E.T.(2007). Confirmation of presumptive

Salmonella colonies contaminated with Proteus swarming using the Polymerase Chain Reaction (PCR) method. Rev. Latinoam Microbiol. 49 (1-2): 19-24

QUINN, P.J., CARTER, M.E., MARKEY, B.K., CARTER, G.R. (1994) Clinical

Veterinary Microbiology. Mosby-Year Book Europe Limited, Lynton House, London WC1H9LB, England. p.: 226-234.

QUINN, P.J., MARKEY, B.K., CARTER, M.E., DONNELLY, W.J., LEONARD, F.C.

(2004). Veterinary Microbiology and Microbial Disease. India Replica Press Ptv. Ltd., Chapter 18.

RAHN, K., DE GRANDIS, S.A., CLARKE, R.C. (1992). Amplification of invA gene

sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as specific method of detection of Salmonella. Mol. and Cel.Probes., 6: 271-279.

RAMPLING, A., UPSON, R., BROWN, D.F.J. (1990). Nitrofurantoin

resistance in isolates of Salmonella enteritidis phage type 4 from poultry and humans. J.Antimicrob.Chemother., 25: 285-290.

REEVES, M.V., EVĠNS, G.B., HEBIA, A.A. (1989). Clonal nature of Salmonella tyhpi

and its genetic relatedness to other salmonellae as shown by multilocus enzyme electrophoresis and proposal of Salmonella bongori comb. nov. J.Clin.Microbiol., 27: 313-320.

REILLY, W.J., OBOEGBULEM, S.I., MUNRO, D.S., FORBES, G.I. (1991). The

epidemiolgical relationship between Salmonella isolated from poultry meat and sewage effluents at a long-stay hospital, Epidem. Infect., 106: 1-10.

RELMAN, D.A. (1999). The search for unrecognized pathogens. Sci., 284: 1308–1310. RIJPENS, N., HERMAN, L., VEREECKEN, F., JANNES, G., DE SMEDT, J., DE

ZUTTER, L., (1999). Rapid detection of stressed Salmonella spp. in dairy and egg products using immunomagnetic separation and PCR, International J.of Food Microbiol., 46: 37-44.

ROBERTS, D. (1991). Salmonella in chilled and frozen chicken, Lancet., 337: 984-

985. SACKEY, B.A., MENSAH, P., COLLISON, E., DAWSON-SAKYI, E. (2001)

Campylobacter, Salmonella, Shigella and Escherichia coli in live and dressed poultry from metropolitan Accra, I.J.Food Microbiol., 71: 21-28.

SARMIENTO O. L., WEIGLE K. A., ALEXANDER J., WEBER D. J., MILLER W. C.,

(2003). Assessment by Meta-Analysis of PCR for Diagnosis of Smear-Negative Pulmonary Tuberculosis. J.of Clin.Microbiol., 41: 3233-3240.

81

SHAH, D.H., PARK, J.H., CHO, M.R., KĠM, M.C., CHAE, J.S. (2005). Allele-specific PCR method based on rfbS sequence for distinguishing Salmonella gallinarum from Salmonella pullorum: serotype-specific rfbS sequence polymorphism, J.of Microbiol. Methods., 60: 169-177.

SHAW, S.J., BLAIS, B.V., NUNDY, D.C. (1998). Performance of the Dynabeads

anti-Salmonella system in the detection of Salmonella species in food, animal feeds, and environmental samples. J.Food Protect., 61: 1507-1510.

SHEEHAN, B.J., DORMAN, C.J. (2002). In vivo analysis of the interactions of the

LysR-like regulator SpvR with the operator sequences of the spvA and spvR virulence genes of Salmonella typhimurium, Mol. Microbiol.., 31(1): 91-105.

SHIVAPRASAD, H.L. (2003). Salmonella Infections. In: Diseases of poultry 11. Ed. Ed: SAĠF, Y.M. Iowa State Press, p,: 568-582. SHIVAPRASAD, H.L., TIMONEY, J.F., MORALES, S., LUCIO, B., BAKER, R.C.

(1990). Pathogenesis of Salmnella enteritidis infection in laying chickens. I. Studies on egg transmission, clinical sings, fecal shedding, and serologic responses. Avian Dis., 34: 548-557.

SINGER, J.T., OPITZ, H.M., GERSHMAN, M., HALL, M.M., MUNIZ, I.G.,

RAO, S.V.(1992). Moleculer characterization of Salmonella enteritidis isolates from maine poultry and poltry farm environments. Avian Dis., 36: 324-33.

SOJKA, W.J., WRAY, C., MCLAREN, I. (1986). A survey of drug resistance in

Salmonellae isolated from animals in England and Wales in 1982 and 1983. Br.Vet.J., 142 (4): 371-380.

STENOVICOVA, A., REHACOVA, H., SKARKOVA, A., RIJPENS, N., KUCHTA, T.

(1998). Confirmation of presumptive Salmonella colonies by the polymerase chain reaction. J.of Food Protect., 61: 1381-1383.

STONE, G.G., OBERST, R.D., HAYS, M.P., MCVEY, S., CHENGAPPA, M.M. (1994). Detection of Salmonella serovars from clinical samples by enrichment broth cultivation-PCR procedure. J.Clin.Microbiol., 32: 1742– 1749. ġĠRELĠ, U.T. (2008). Türkiye‟de Kanatlılarda Salmonella Ġnsidensi ve Mevzuatı.

Veteriner Tavukç. Der.Derg.., 6(2) : 10-12. TANG, Y.W., ELLĠS, N.M., HOPKINS, M.K., SMITH, D.H., DODGE, D.E.,

PERSING. D.H. (1998). Comparison of phenotypic and genotypic techniques for identification of unusual aerobic pathogenic gram-negative bacilli. J.Clin. Microbiol., 36: 3674-3679.

TAYAN, U. (2008). Tavuklardan izole edilen Salmonella etkenlerinin çoklu antibiyotik

dirençliliği. Yüksek Lisans Tezi, Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü. TAYLOR, W.J. (1965). Isolation of Shigellae. I. Xylose lysine agars: new media for

isolation of enteric pathogens. Am.J.Clin.Path., 44: 471-475.

82

THIAGARAJAN, D., SAEED, A.M., ASEM, E.K. (1994). Mechanism of transovarian transmission of Salmonella enteritidis in laying hens. Poult.Sci., 73: 89–98.

TIETJEN, M., FUNG, D.Y.C. (1995). Salmonellae and food safety. Crit.Rev. Microbiol., 21(1): 53-83. TOLLEFSON, L., ALTEKRUSE, S.F., POTTER, M.E. (1997). Therapeutic antibiotics in animal feeds and antibiotic resistance. Rev.Sci.Tech., 16: 709-715. TORTOLI, E. (2003). Impact of genotypic studies on mycobacterial taxonomy: the new mycobacteria of the 1990s. Clin.Microbiol.Rev., 16: 319–354. TUCHILI, L. M., KODAMA, H., IZUMOTO, Y., MUKAMOTO, M., FUKATA T., BABA, T. (1995). Detection of Salmonella gallinarum and S. typhimurium DNA in experimentally infected chicks by polymerase chain reaction. J.Vet. Med.Sci., 57: 59–63. TUCHILI, L.M., KODAMA, H., SHARMA, R.N., TAKATORI, I., PANDEY, G.S., KABILIKA, S., MUKAMOTO, M., TSUJI, S., BABA, T. (1996). Detection of Salmonella DNA chicken embryos and environmental samples by PCR. J. Vet.Med.Sci., 58: 881-884. TÜNGER, A., ÇAVUġOĞLU, C., KORKMAZ, M. (2002). Asya Mikrobiyoloji,

Ġzmir: Asya Tıp Yayıncılık Ltd.ġti. USCA, A. (1996). Ankara‟daki askeri birliklerin ihtiyacı için alınan tavuk etlerinin

mikrobiyolojik kaliteleri üzerine araĢtırmalar, Yüksek lisans Tezi, Ank.Ünv. Sağlık Bilm.Enst. Ankara.

UYTTENDAELE, M., VANWILDEMEERSCH, K., DEBEVERE, J. (2003). Evaluation

of reel-time PCR vs automated ELISA and a conventional culture method using a semi-solid medium for detection of Salmonella. Lett.Appl.Microbiol., 37: 386-391.

VALASEK, M.A., REPA, J.J. (2005). The power of real-time PCR. Adv.Physiol.

Educ., 29: 151–159. VAN DUIJKEREN, E., HOUWERS, D.J. (2000). A critical assessment of

antimicrobial treatment in uncomplicated Salmonella enteritidis. Vet. Microbiol., 73: 61-75.

VAN SCHOTHORST, M., A. RENAUD, A.M. (1983). Dynamics of salmonellae isolation with modified Rappaport's medium (R 10). J.Appl.Bact., 54: 209- 215.

VELGE, P., CLOECKAERT, A., BARROW, P. (2005). Emergence of Salmonella epidemics: The problems related to Salmonella enterica serotype Enteritidis and multiple antibiotic resistance in other major serotypes. Vet. Res., 36: 267-288.

VORSTER, S.M., GREEBE, R.P., NORTJE, G.L. (1994). Incidence of

Staphylococcus aureus and Escherichia coli in ground beef, broilers and processed meats in Pretoria, South Africa. J.Food Prot., 57(4): 305-310.

83

WALTMAN, W.D., HORNE, A.M., PIRKLE, C. (1995). Comparative analysis of media and methods for isolating Salmonella from poultry and environmental samples. In : Proceeding of Symp.Diag.S.Infec., US Animal Health Association,Reno, Nevada, p.:1-14

WEGNER, H.C., AARESTRUP, F.M., GERNER-SMIDT, P. BAGER, F.

(1999). Transfer of antibiotic resistant bacteria from animals to man. Acta Vet.Scand.Suppl., 92: 51-57.

WHYTE, P., MC GILL, K., COLLINS, J.D., GORMLEY, E. (2002). The prevalence

and PCR detection of Salmonella contamination in raw poultry. Vet.Microbiol., 89: 53-60.

WILSON, L.G. (2002) Salmonella and campylobacter contamination of raw retail

chickens from different producers: a six year survey, Epidem.Inf., 129: 635-645.

WOESE, C. R. (1987). Bacterial evolution. Microbiol.Rev., 51: 221–271. WOESE, C.R., STACKEBRANDT, E., MACKE, T.J., FOX. G.E., (1985). A

phylogenetic definition of the major eubacterial taxa. Syst.Appl.Microbiol., 6: 143–151.

WOO, P.C., FUNG, A.M., WONG, S.Y., TSOI, H.H., YUEN, K.Y. (2001). Isolation

and Characterization of a Salmonella enterica Serotype Typhi Variant and Its Clinical and Public Health Implications. J.Clin.Microbiol., 39 (3): 1190-1194.

WOO, P.C., TENG, J.L., WU, J.K.L., LEUNG, F.P.S., TSE, H., FUNG, A.M., LAU,

S.K., YUEN, K.Y. (2009). Guidelines for interpretation of 16S rRNA gene sequence-based results for identification of medically important aerobic Gram-positive bacteria. J.Med.Microbiol., 58: 1030-1036.

WOODWARD, M.J., KIRWAN, S.E. (1996). Detection of Salmonella enteritidis in

eggs by the polymerase chain reaction. Vet. Rec., 138: 411-413. YAZICIOGLU, N., KAYA, K., AYAZ, Y., SEN, S., ÖZKÖK, S., AKSOY, M., YAVUZ,

M. K., KAPLAN, Y. Z., TUNCA, S. T., VURAL, S., EVGĠN, N., KARAKOÇ, S. R., MĠROĞLU, M., TURUT, N. (2005). Kanatlı kesimhanelerinin parçalama ünitelerinden alınan boyun ve kanat örneklerinden Salmonella izolasyonu, serotiplendirilmesi ve antibiyotik dirençliliğinin arastırılması. Etlik Vet. Mikrobiyol. Derg., 16(1-2): 23-36.

ZHAO, S., MCDERMOTT, P.F., WHĠTE, D.G., QAĠYUMĠ, S., FRĠEDMAN, S. L.,

ABBOTT, J.W., GLENN, A., AYERS, S.L., POST, K.W., FALES, W. H., WILSON, R.B., REGGĠARDO, C., WALKER, R.D. (2007). Characterization of multidrug resistant Salmonella recovered from diseased animals. Vet. Microbiol., 123: 122-132.

84

ÖZGEÇMİŞ

I- Bireysel Bilgiler

Adı: : Teoman

Soyadı: : ÜNLÜ

Doğum yeri ve tarihi: : AkĢehir; 06/06/1976

Uyruğu: : T.C.

Medeni durumu: : Evli

İletişim adresi ve telefonu: : EDOK Komutanlığı ANKARA.

Tlf: 0 531 7923476

II- Eğitimi

Askeri Veteriner Okulu ve Eğitim Merkezi Komutanlığı: Subay Stajı

(2001-2002)

Kara Harp Okulu: Subay Eğitimi (2001-2002)

Lisans: Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi (1995-2000)

Lise: Ankara Atatürk Anadolu Lisesi(1991–1994)

Ortaokul: BeĢiktaĢ Atatürk Anadolu Lisesi (1988-1991)

İlkokul: 100. Yıl Ġlköğretim Okulu(1985-1988)

Yabancı Dili: Ġngilizce

III- Ünvanları

Veteriner Hekim

IV- Mesleki Deneyimi

2000 yılından itibaren Veteriner Hekim Subay

V- Bilimsel Etkinlikleri

Seminer:

Enterokokal Ġnfeksiyonlar (2007)

Patojen Salmonellaların Moleküler Tiplendirme Metoduyla Ayrımı (2008)

85

VI- Bilimsel İlgi Alanları

Yayınlar ve Posterler

1. ÜNLÜ, T., KOLUMAN, A., BURKAN, Z.T., TEZEL, A., AKÇELIK, N.,

ÇALIM H.D., ATA, Z. (2011). Incidence and Antibiotic Resistance

of Escherichia coli Isolated from Different Kinds of Cheese.

Journal of Foof Safety 31(1): 54-60.

2. KOLUMAN, A., ÜNLÜ, T., DĠKĠCĠ, A., TEZEL, A., AKÇELIK, N.,

BURKAN, Z.T. (2011). Presence of Staphylococcus aureus and

Staphylococcal Enterotoxins in Different Foods. Kafkas Univ. Vet.

Fak. Derg. 17 (Suppl A): 55-60

3. ÜNLÜ, T. (2010). Tavuklarda Salmonella Tanısında Kültür ve Real-Time

PCR‟ın Kullanımı. Poster. 1. Uluslararası Katılımlı Veteriner Hekimliği

Kongresi & Expo-Vet (Uluslararası Katılımlı) Ġstanbul.

tavuklarda salmonella tanisinda kÜltÜr ve real …acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/27992/tez.pdf ·...

Documents