TAM KANDA INTERFERON GAMA SALINIMININ ARAŞTIRILARAK KONJENİTAL TOKSOPLAZMOZİS TANISI

Danışman:Prof.Dr.Bülent BAYSAL Arş.Gör.Dr.M.Emin DEMİRCİLİ

Toksoplazma gondii

Zorunlu hücre içi protozoon Memelilerden kuşlara kadar geniş bir konak

spektrumu İnsanlara edinsel veya konjenital bulaş Takizoit, bradizoit, ookist

Bradizoit Konak hücre vakuolü içinde gelişen 40 mikron

büyüklükte doku kistlerinde ortalama 1000-3000 bradizoit

Ookist Faelidae ailesi (son konak) bağırsağında

parazitlerin seksüel evrimi sonucu oluşur

Dış ortamda, her ookist içinde ikişer sporokist ve her sporokist içinde de dörder sporozoit gelişir (enfektif form uygun koşullarda 5-8 günde). Oda sıcaklığında aylarca canlı kalabilirler

Konjenital bulaş Plasentadan trofozoit geçişi ve bulaş 3. trimestreye doğru

giderek artar .Bebeğin etkilenmesi en çok ilk trimestrede

Edinsel bulaş Takizoitler (kan transfüzyonu, laboratuvar kazaları) Doku kistleri (sığır, koyun, domuz etlerinin çiğ, az pişmiş

veya dondurulmadan yenmesi) Ookistler (kontamine yiyecek, içecek ve ellerle)

Klinik

Konjenital toksoplazmoz Neonatal hastalık (Hidrosefali,

mikrokalsifikasyonlar, koryoretinit) Yaşamın ilk haftalarında oluşan hafif veya ağır

hastalık Bebeklik, çocukluk veya adolesansta, önceden

tanınmamış infeksiyonun sekel veya relapsı Subklinik infeksiyon

Oküler toksoplazmoz

İmmunokompetan olanlarda Asemptomatik Enfeksiyoz mononükleoz benzeri bir tablo Poliadenopatili ateşsiz şekil Nadiren ağır infeksiyon

Toksoplazmoz tanısı Direkt

Kan, vücut sıvı ve dokularından izolasyon Sitolojik preparatlarda takizoit ve/veya antijenlerin gösterilmesi Plasenta, fetus veya yenidoğanda takizoit veya bradizoitleri

içeren kistlerin gösterilmesi PZR

İndirekt serolojik testler

Serolojik testler

Kullanılan antikorlar IgG IgM IgA (yenidoğanda) IgE (immunkompromize hastalarda)

İFAT İHA Anti-toxoplasma IgM ELISA (özellikle immunocapture) IgM, IgA, IgE Anti-toxoplasma IgG ELISA IgG avidite

Toxoplasma gondii, konjenital infeksiyonlu kişilerde ciddi morbidite ve mortalite nedenidir

İnfekte yenidoğanlar doğumda asemptomatik olabilir fakat adölesan ve çocukluk döneminde retinal hastallıklar gelişme riski vardır

Bu hastalarda hastalığın tanısı çoğunlukla spesifik antikorların tespitine dayanmaktadır

Plesental geçişi olmayan Toxoplasma spesifik IgA

ve IgM konjenital infeksiyon için iyi bir gösterge olarak kabul edilir

Bununla birlikte maternal infeksiyonda gestasyonal yaş testin performansını etkilemektedir ve doğumda test infekte bebeklerin %75 ten fazlasını tespit edememektedir

Toksoplazma spesifik IgG plesentaya geçtiğinden yenidoğan kanındaki varlığı konjenital infeksiyonun bir kanıtı olarak değelendirilmez

Anneden geçen IgG’ler genellikle 6-12 ay içerisinde kaybolmaktadır

Bu yüzden gebeliğinde serokonversiyonu olan annelerden doğan,infekte olmayan bebekler konjenital toxoplazmozis dışlanmadan önce bir yıl boyunca serolojik teslerle düzenli olarak takip edilmelidir

T. gondi infeksiyonu interferon gama üreten T lenfositlerin effektör aktivitesine bağlı olan uzun süreli hücresel immuniteyle sonuçlanmaktadır

Birkaç çalışma hastalığın tanısında hücresel immunitenin potansiyel rolünü araştırmıştır.Fakat literatür bilgileri çelişkilidir

Konjenital infekte çocuklarda ki T. gondi antijenleri tarafından lenfositlerin uyarılmaması daha önceden bildirilmiştir

Yakın zamanda (Guglietta et al.) bir çalışmada sentetik peptidleri kullanarak konjenital infeksiyonlardaki parazitik antijenlere karşı spesifik T hücre yanıtının yaş ile ilişkili bozukluğunu saptamışlardır

Buna karşıt olarak başka bir çalışma konjenital toksoplasmozisin erken ve doğru tanısı için T hücre immunite değerlendirmesinin önemli olduğunu bildirmektedir

Flow sitometri ile CD25 ekspresyonunun saptanması ile yenidoğanlarıda içeren hemen hemen tüm hastalarda spesifik hücresel immunitenin saptanabilir olduğu daha önceden gösterilmiştir

Bu çalışmada çalışma konjenital toxoplasmozisin tanısı için tam kanda IFN-gama salınımı analizinin performansı değerlendirilmiştir

Gereç&Yöntem

Grup 1) Grup 1’deki hastalar bebekleri test etmeden önce tekniğin geçerliliğini kontrol etmek için pilot çalışmada kullanılmıştır

Bu çalışma Hoˆpital de la Croix Rousse, Lyon,France başvuran 172 hastadan oluşmaktadır ve toxoplasma serolojisi için test edilen hamile kadınları da içermektedir

58 hastada infeksiyon saptanmamıştır(negatif serolojik test)

114 hasta ya kronik infektedir yada yakın zamanda serokonversiyon göstermiştir(Pozitif test)

Kan hücreleri ile IFN-gama sekresyonu analizini ilk önce final konsantrasyonu 1.5,3,6 µg/ml olacak şekilde T. gondi antijenleri kullanılarak araştırılmıştır

Bu konsantrasyonlar arasında 3 µg/ml sensivite ve spesifite için en iyi sonucu saptamıştır.Çalışmada bu konsantrasyon kullanılmıştır

Serum ayrılmasından 24 saat sonra oluşan örnekler,ayırmadan 24 saat içindeki örneklerle karşılaştırıldığında düşük IFN-gama uyarısı gözlemlenmiş

Çalışmada 479 test uygulanmış.Sonuçların 252’i (%5) PHA stimülasyonuna pozitif yanıt yetersizliği veya IFN-gama spontan sekresyonuna bağlı olarak geçersiz sayılmıştır

Grup2)Grup 2 gebeliği boyunca serokonversiyon gösteren annelerden doğan 1 yaş altı 62 infantı içermektedir

Konjenital toksoplazmozis tanısı; 17 olguda amniyotik sıvıda (+) PCR sonucu olan,perferik kanda IgM veya IgG varlığı,anne ve yenidoğanda karşılaştırılmalı Western blot pozitifliğine,1 yaşından sonra spesifik IgG varlığına dayanarak konmuştur

Çalışmanın protokolüne göre,tüm hastalara hem klinik hemde oftalmolojik muayene yapılmış, hem de hastalara ilk yıl boyunca her 3 ayda bir serolojik testler uygulanmıştır

İnfeksiyon 1 yaşında serolojik tesleri negatif olan, doğumda ve in-utero testleri negatif olan 45 çocukta ekarte edilmiştir

Grup3) Konjenital infeksiyonu olan 1-30 yaşındaki 124 hastayı içermektedir.Hepsi yıllık olarak düzenli klinik ve oftalmolojik muayeneye tabi tutulmuştur.Bunların 31’inde okuler lezyonlar,8’inde serebral kalsifikasyonlar vardı

Serolojik araştırmalar: Toksoplazma spesifik IgG ve IgM antikorları Enzygnost toksoplazmozis ELİSA (ELISA; Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Germany) kullanılarak yapılmıştır

Boya uyumsuz test sonuçları olan örneklerde yapılmıştır

T hücre stimülasyonu; Solubl Toxoplasma gondii antijenlerinin hazırlanması; RH suşunun Toxoplasma gondii parazitleri OF1 farelerinin peritoneal kavitelerinden elde edilmiştir.Asit sıvısı infeksiyondan 2 gün sonra toplanmıştır ve 0.2-µm por genişliği olan membranlardan geçirilerek -20C˚’de saklanmıştır

Kan örnekleri stimülasyonu; Periferik kandan 1ml örnek lityum heparin antikoagülanı içeren vacutainer tüplere koyulmuştur (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ)

Tüpler oda ısısında 1600 devirde 15 dakika santrifüj edilmiştir

Serum serolojik araştırmalar için toplanmış ve RPMI medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)’un aynı hacmi ile replese edilmiştir

Dilüe kanın 300µl’si Toxoplasma gondii antijenlerinin farklı konsantrasyonları varlığında steril propilen tüplerde(Eppendorf AG, Hamburg, Germany)kültürü yapılmıştır

Bütün kültürler %5’lik CO2 ortamdac 37C˚’de 24 saat inkübe edilmiştir

IFN-gama analizi ticari ELISA kiti (AbCys, Paris, France) kulanılarak yapılmıştır

SONUÇLAR

Grup1)Şekil 1 grup1’deki 114 infekte hastada ki IFN-gama sekresyonunun, infekte olmayan 58 hastadan anlamlı olarak daha yüksek olduğunu göstermektedir

Testin sesivitesi %96,spesifitesi %91 dir

Negatif serolojisi olan hastalar arasında 5’i 1.5-23.2 arasında değişen zayıf IFN-gama seviyelerini göstermektedir.5 hastanın tamamıda spontan olmayan IFN-gama sekresyonu yapmaktadır ve inflamatuar sendromları yoktu

Bu kişilerden ikisi tekrarlayan testlerde IgG olmadan IgM varlığı ile birlikte atipik serokonversiyon profiline sahip hamile kadınlardı

Her ikisinede IgM varlığına dayanarak yakın zamanda infekte olduğu düşünülmüş ve spiramisin tedavisi verilmiştir

Toxoplasmozis testi pozitif olan hastalar arasından 5’i (+) PHA testine rağmen negatif IFN-gama yanıtı vardı ve hastaların kayıtlarında anerji ve imunsüpresyonun hiçbir kanıtı yoktu

Grup 2)Çalışmada ki ilk testten, 17 infekte infant infekte olmayan infantlardan anlamlı olarak daha yüksek seviyede IFN-gama düzeyi göstermiştir

ROC eğrisine göre 1 pg/ml’nin üzerindeki değerler pozitif olarak kabul edilmiştir

Bu şartlar altında 17 infekte bebeğin 16’sı pozitif IFN-gama düzeylerine sahiptir

Bunlar arasında 5 infant yaşamlarının 3 haftalık ve 3 aylık dönemleri arasında subklinik infeksiyon tanısı almıştır.2 olguda bu konjenital infeksiyonun tek pozitif kriteridir

Anneler gebelik boyunca farklı periyotlarda serokonversiyon göstermişlerdir ve hepsine toxoplasmozis için antenatal tedavi verilmiştir

45 infekte olmayan infant içinde 44’ünde negatif cevap elde edilmiştir.Bu klinik bulgularla testin sensivitesi %94 ve spesifitesi %98 di.

Tedavi altında ki 2 bebekte test sonuçlarının geçici negatifliği dışında 62 bebekte izlem sonuçları tanıyla uyumluydu.Aynı zamanda serolojileri negatifti

Tedavinin bitiminden sonra hem IFN-gama hemde IgG titrelerinin her ikisinde dramatik bir artış göstermişlerdir

Grup 3) Konjenital olarak infekte kişilerin 172’sinin tamamı 2,285-9 pg/ml arasında değişen IFN-gama seviyeleri ile birlikte pozitif test sonuçları elde edilmiştir

IgG titreleri ve IFN-gama seviyeleri arasında anlamlı olmayan bir korelasyon vardı

TARTIŞMA

Çalışmada T hücrelerinin Toxoplasma gondii antijenlerinin stimülasyonuyla oluşan IFN-gama yanıtını ölçmek için invitro bir araştırma yapılmıştır

Test sadece 1 ml kan gerektirmekteydi.Bu nedenle yeni doğanlara uygulanması için uygundu

Bunun yanında pozitif ve negatif kontrolle birlikte IFN-gama analizine ek olarak (PHA- PBS),serolojik testler aynı kan örneği ile yapılabiliyordu

Geçersiz test sonuçları olarak PHA tüplerindeki pozitif yanıt yetersizliğine veya kontrol tüpündeki spontan IFN-gama sekresyonuna bağlı olarak %5 oranındaydı, geçersiz sonuçlar, başlıca yetişkinlerde gözlemlenmiştir

Akut veya kronik infeksiyonu olan seropozitif hastalar infekte olmayan hastalara göre anlamlı olarak daha yüksek IFN-gama düzeyleri göstermiştir

IFN-gama’nın spontan sekresyonu olmayan 5 örnek sonuçları IgG serolojisiyle karşılaştırıldığında yanlış pozitiflikler belirlenmiştir

IFN-gama değerlendirilmesi gebe kadınlarda karşılaşılabilen belirsiz serolojik düzeyin yorumlanmasına sağlayabilir

Daha önceden T. gondii antijeninin seronegatif kişilerdeki işaretlenmiş T hücre proliferasyonunu ortaya çıkarabildiği gösterilmiştir .Bu proliferasyonun poliklonal olduğu görünmektedir ve coccidan bir patojen ile birlikte çapraz reaksiyonla sonuçlanabilir.Antijen pürifikasyonu testin spesifikliğini arttırabilir

Yanlış negatif sonuçları olan beş hasta immunsüprese değildi ve hepsi PHA’ya pozitif yanıt verdi

Lenfosit sayıları normal seviyelere düşmüştü fakat CD4 fenotiplemesi oluşmamıştı

Bunların hepsinde kr. toksoplazma infeksiyonu vardı ve yanıt yetersizliği daha önceden bildirilen tüberküloz hastaları gibi aktif hastalıkla ilişkili imunsüpresyona bağlı değildi

Gebeliği sırasında infekte olan annelerden doğan 1 yaş altı bebekler için ilk testin sonuçları %94 sensivite,%98 spesifite göstermektedir

Test infekte olmayan bebeğin 44’ünde hastalığı ekarte etmiştir

Yaşamın ilk yılında IgG taraması gereksiz bulunmuştur

Tek yanlış pozitiflik klinik inflamatuar hastalığı olmayan geçici pozitif test sonucu olan 6 aylık bir bebekte gösterilmiştir.Bu hastanın daha sonraki testleri negatif çıkmıştır

İnfekte olmayan 17 bebeğin 16’sı testle teşhis edilmiştir

3 ayın altındaki 2 bebekte IFN-gama sekresyonu infeksiyonun tek işaretiydi ve tedavi kararını etkilemekteydi

Bu veriler göstermiştir ki bebekler için IFN-gama salınımı konjenital toksoplazmozisin iyi bir göstergesidir

Tek yanlış negatif sonuç tedavi bitiminden sonra IFN-gama yüksekliği gösteren 8 aylık bir bebekte belirlenmiştir

Şekil 4’te gösterildiği gibi IgG titreleri IFN gama titreleriyle paraleldir

Bu antikor profili tedavi alan hastalarda yaygın olarak gösterilmektedir

Bu patern parazit kistlerinden orijin alan antijenlerin azalmasına veya primetamin ve sulfanomidin mitokondriyal apopitotik yolun aktivasyonu için aktif lenfositler üzerinde direkt etkisine bağlıdır

Bebeklerde gözlenen ilaç düzeylerindeki büyük farklılık bu fenomenin tüm bebeklerde neden gözlenmediğini açıklamaktadır

İnfeksiyondan 30 yıl sonra grup 3’teki subklinik hastalarda yeterli IFN-gama yanıtı kan dolaşımındaki spesifik effektör T hücrelerini belirleyen kistler tarafından üretilen devamlı parazitik antijenin bir belirtecidir

Hastalığın akut fazı özellikle Th1 yanıtı gibi immunsistemin baskısı alındaki yavaş replike olabilen bradozoitlerden farklılık gösteren hızlı replike olan takizoitlerin varlığı ile karakterizedir

Bradozoitler farklı dokularda kistlere dönüşür ve hayat boyu persiste kalır

Her iki parazitik durumda da spesifik antijenler eksprese edilir

Sonuç olarak toksoplazmik antijenler ile tam kanın stümülasyonundan sonra IFN-gama yanıtının değerlendirilmesinin yenidoğanlarda konjenital toksoplazmozis tanısı için kolay uygulanabilir basit bir test olduğu gösterilmiştir

Bu test doğumda konjenital infeksiyonu güvenilir bir şekilde ekarte etmektedir ve gereksiz anksiyete ve serolojik takiplerden kaçınılmaktadır

Tersine pozitif sonuç verildiğinde infeksiyon sekelini azalttığına inanılan erken tedavi kararına neden olmaktadır

Testin performansını arttırmak için pürifiye antijenlerin veya sentetik peptidlerin kullanımı araştırılmalıdır

Testin sensivitesini tam olarak değerlendirmek için ek vakalara ihtiyaç vardır

teşekkürler