tách và xác định một số độc tố nhóm alkaliod trong thực phẩm chức năng bằng...

8/15/2019 Tách và xác định một số độc tố nhóm alkaliod trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

http://slidepdf.com/reader/full/tach-va-xac-dinh-mot-so-doc-to-nhom-alkaliod-trong-thuc-pham 1/100

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------

ĐỖ THỊ THU HẰNG

TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOIDTRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015

WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COMóng góp PDF b ở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú



ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘITRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------

ĐỖ THỊ THU HẰNG

TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOIDTRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG KHỐI PHỔ

Chuyên ngành: Hóa phân tíchMã Số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời Hƣớng Dẫn Khoa Học:PGS TS.Lê Thị Hồng Hảo

Hà Nội – 2015





LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới

PGSTS. Lê Thị Hồng Hảo, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia – Bộ Y tế đã tận tình hƣớng dẫn, đóng góp những ý kiến quý báu và tạo mọi điềkiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học,đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân Tích, đã cho em những kiến thứcquý giá, tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệmAn toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi đƣợc htập và hoàn thành đề tài này.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp tại labo Hóa – Viện kiểmnghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trìnhlàm thực nghiệm.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi.

Hà Nội, năm 2015

Học viên

Đỗ Thị Thu Hằng





MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

BẢ NG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮTMỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1CHƢƠNG 1. TỔ NG QUAN ....................................................................................... 31.1. Tổng quan về nhóm alkaloid.............................................................................. 31.1.1. Lịch sử phát hiện .............................................................................................. 31.1.2. Khái quát về nhóm alkaloid ............................................................................. 31.1.3. Cấu tạo của một số alkaloid độc ...................................................................... 61.1.4. Tác dụng và độc tính của một số alkaloid ........................................................ 71.2. Các phƣơng pháp xác định ............................................................................... 131.2.1. Phƣơng pháp điện di mao quản ...................................................................... 131.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng vớ i detector UV .................................................... 141.2.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng vớ i detector khối phổ............................................ 161.3. Sắc ký lỏng khối phổ ........................................................................................ 18

1.3.1. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng ................................................................. 181.3.2. Detector khối phổ (Mass spectrometry – MS) ............................................... 181.3.2.4. Bộ phận phát hiện ........................................................................................ 221.3.3. Phân tích định tính và định lƣợ ng bằng LC-MS/MS ..................................... 221.4. Lấy mẫu ............................................................................................................ 231.5. Đánh giá phƣơng pháp phân tích...................................................................... 23CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U ........................... 26

2.1 Đối tƣợ ng và mục tiêu nghiên cứu ................................................................... 262.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 262.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu ...................................... 272.3.1 Thiết bị .............................................................................................................. 272.3.2 Dụng cụ ............................................................................................................ 272.3.3 Chất chuẩn ........................................................................................................ 282.3.4 Các loại hóa chất, dung môi khác ................................................................... 29





CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ N ............................................................ 303.1. Tối ƣu điều kiện tách và xác định các alkaloid trên thiết bị LC/MS/MS ......... 303.1.1. Tối ƣu các điều kiện của detector khối phổ (MS/MS) ................................... 303.1.2. Tối ƣu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ...................... 333.2. Tối ƣu quá trình xử lý mẫu ............................................................................... 423.2.1. Khảo sát dung môi chiết............................................................................... 433.2.2. Khảo sát dung dịch kiềm hóa ......................................................................... 453.2.3. Khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa.......................................................... 463.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích...................................................................... 48

3.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc ................................................................................... 483.3.2. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đƣờ ng chuẩn ........................................... 493.3.3. Giớ i hạn phát hiện (LOD), giớ i hạn định lƣợ ng (LOQ) của phƣơng pháp ... 51 3.3.4. Đánh giá độ lặ p lại và độ thu hồi ................................................................... 523.4. Phân tích mẫu thực. .......................................................................................... 57K ẾT LUẬ N VÀ KIẾ N NGHỊ................................................................................... 59K ẾT LUẬ N ............................................................................................................... 59

KIẾ N NGHỊ .............................................................................................................. 60TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 61PHỤ LỤC .................................................................................................................. 65





DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Cấu trúc hoá học của một số alkaloid độc đƣợc xác định trong đề tài. ...... 6

Bảng 1.2. Các giá tr ị LD50của các chất phân tích. ...................................................... 8Bảng3.1: Các mảnh ion định lƣợng và định tính của các alkaloid ........................... 30Bảng 3.2: Các thông số tối ƣu MS/MS đối với chế đô ion dƣơng............................ 33Bảng 3.3: Các hệ dung môi pha động khảo sát ......................................................... 34Bảng 3.4: Diện tích các alkaloid khi sử dụng các hệ dung môi khác nhau .............. 36Bảng3.5: Các chƣơng trình gradient khảo sát ........................................................... 37Bảng3.6:Ảnh hƣở ng nồng độ amoniacetat tớ i diện tích píc các alkaloid ................ 41Bảng 3.7 :Ảnh hƣở ng của dung môi chiết đến hiệu suất chiết các alkaloid ............ 44Bảng 3.8 :Ảnh hƣở ng của dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các alkaloid .... 45Bảng 3.9:Ảnh hƣở ng của thể tích dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết cácalkaloid ...................................................................................................................... 46Bảng 3.10: Đƣờ ng chuẩn các alkaloid ...................................................................... 50Bảng 3.11: Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lƣợ ng của các alkaloid .................. 51

Bảng 3.12: Độ lặ p lại và hiệu suất thu hồi của các Alkaloid trên nền mẫu thực phẩmchức năng tại nồng độ 50-500 µg/kg (0,05-0,5 mg/kg) ........................................... 53Bảng 3.13: Độ lặ p lại và hiệu suất thu hồi của các Alkaloid trên nền mẫu thực phẩmchức năng tại nồng độ 0,1-1 mg/kg .......................................................................... 54Bảng 3.14: Độ lặ p lại và hiệu suất thu hồi của các Alkaloid trên nền mẫu thực phẩmchức năng tại nồng độ 0,2-2 mg/kg .......................................................................... 55Bảng 3.15: Bảng k ết quả phân tích mẫu thực ........................................................... 57





DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI ................................................................................. 19Hình 1.2: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực chậ p ba ....................................................... 21

Hình 3.1: Sắc đồ tỷ lệ các ion của koumin và atropin............................................................. 31

Hình 3.2: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng hệ dung môi pha động 1 ....................................... 34




Hình 3.7: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng chƣơng trình gradient 2 ......................................... 37



Hình 3.10: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng chƣơng trình gradient 5 ...................................... 38

Hình 3.11: Sắc đồ ion tổng tại tốc độ dòng 0,6 mL/phút ....................................................... 40

Hình 3.13: Sắc đồ ion tổng tại tốc độ dòng 0,4 mL/phút ....................................................... 40

Hình 3.14: Biểu đồ sự phụ thuộc diện tích píc của các alkaloid vào nồng độ amoniacetat trong pha động .............................................................................................................. 42

Hình 3.15: Sơ đồ quy tr nh chiết mâ u dƣ kiến ........................................................................... 43

Hình 3.16 : Biểu đồ ảnh hƣở ng của dung môi chiết đến hiệu suất chiết các alkaloid ......................................................................................................................................................................... 44

Hình 3.17 : Biểu đồ ảnh hƣở ng của dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết cácalkaloid......................................................................................................................................................... 46

Hình 3.18 : Quy trình chiết mâ u tối ƣu .......................................................................................... 47Hình 3.19 : Sắc đồ chuẩn alkaloid, mẫu tr ắng và mẫu tr ắng thêm chuẩn ...................... 48

Hình 3.20: Mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ Atropin trong khoảng 0,5-100 ng/mL .................................................................................................................................................. 49

Hình 3.21: Mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ aconitin trong khoảng 5-1000 ng/mL ................................................................................................................................................ 49

Hình 3.22: Đƣờ ng chuẩn Scopolamin (R 2 = 0,9999) .............................................................. 50





Hình 3.23: Sắc đồ của nicotin tại giớ i hạn phát hiện LOD 1,0 µg/kg (S/N = 3,6) .... 51

Hình 3.24: Sắc đồ của Brucin tại giớ i hạn định lƣợ ng LOQ 10 µg/kg (S/N = 11,5) 52

Hình 3.26: Sắc đồ atropin trong mẫu thực phẩm chức năng thêm chuẩn tại mứcnồng độ 0,1 mg/kg .................................................................................................................................. 55

Hình 3.27: Sắc đồ scopolamin trong mẫu thực phẩm chức năng thêm chuẩn tại mứcnồng độ 0,2 mg/kg .................................................................................................................................. 56

Hình 3.28: Sắc đồ mẫu phát hiện brucin ....................................................................................... 58

Hình 3.29: Sắc đồ mẫu phát hiện strychnin ................................................................................. 58





BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

ACN Acetonitrile acetonitril

APCIAtmospheric pressure chemicalionization

Chế độ ion hóaở áp suất khíquyển

CE Collision energy Năng lƣợng va chạm

ESI Eelectrospray ionization Chế độ ion hóa phun điện tử

EU European Union Châu ÂuHPLC High performance liquid

chromatographySắc ký lỏng hiệu năng cao

IUPAC International Union of Pure andApplied Chemistry

Liên minh quốc tế về hóa họccơ bản và ứng dụng

LD50 Lethal Dose Liều gây chết trung bình

LOD Limit of deterction Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantity Giới hạn định lƣợng

MeOH Methanol Methanol

ODS Octadecylsilan Octadecylsilan

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn

UPLC-MS/MS

Ultral performance liquidchromatography tandem massspectrometry

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng kếtnối khối phổ

UV Ultraviolet Tử ngoại





Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Thu Hằng - K23 Hóa h ọc

Trƣờng Đại học KHTN 1

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nƣớc nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự pháttriển của thực vật và đây đƣợc coi là một kho tàng vô giá về nguồn cây thuốc vdƣợc liệu quý. Trong đó alkaloid là những thành phần hoạt tính chính của nhiều câythuốc. Alkaloid là amin nguồn gốc tự nhiên do thực vật tạo ra, nhƣng các amin dođộng vật và nấm tạo ra cũng đƣợc gọi là các alkaloid. Cấu trúc bao gồm carbonhydro, nitơ, và thƣờng có oxy. Các alkaloid là bazơ hữu cơ tƣơng tự nhƣ kiềm (bazvô cơ); tên có nghĩa là nhƣ kiềm. Alkaloid xuất hiện chủ yếu trong các chi khácnhau của thực vật có hạt, chẳng hạn nhƣ cây thuốc phiện và cây thuốc lá, mã tiền…Chúng có thể đƣợc tìm thấy trong hầu hết các bộ phận của các loại thực vật này, bgồm cả lá, rễ, hạt, và vỏ cây. Mỗi một phần của thực vật thƣờng có chứa một chất hóa học liên quan đến alkaloid. Chức năng của alkaloids trong chuyển hóa thựcvật chƣa đƣợc biết, nhƣng hầu hết các alkaloid có ảnh hƣởng rõ rệt đến hệ ththần kinh của ngƣời và động vật khác. Trong số hàng trăm alkaloid đƣợc tìm thấytrong tự nhiên, chỉ có khoảng 30 chất đƣợc sử dụng thƣơng mại. Một sốalkaloid,chẳng hạn nhƣ nicotin, đƣợc sử dụng trong thuốc trừ sâu, và một số khác đƣợc dụng làm thuốc thử hóa học. Tuy nhiên, các alkaloid đƣợc sử dụng chủ yếu trong học, bởi vì chúng có thể tác động một cách nhanh chóng trên các khu vực cụ thể củhệ thần kinh. Alkaloid là những thành phần hoạt tính chính của nhiều thuốc gây mêthuốc an thần, các chất kích thích và thuốc an thần. Chúng đƣợc dùng bằng đƣờn

uống và tiêm. Ngoại trừ dƣới sự giám sát của bác sĩ, sử dụng các alkaloid là nguyhiểm, bởi vì hầu hết hình thành thói quen (ví dụ, gần nhƣ tất cả các chất ma tuý alkaloid) và dùng liều lƣợng lớn có thể là độc hại.

Trong dân gian ta thƣờng sử dụng các cây thảo dƣợc nhƣ cà độc dƣợc, mãtiền, củ ấu tàu… dùng để chữa bệnh nhƣng trong các loại cây này có chứa một hàmlƣợng không nhỏ các chất độc nhóm alkaloid. Hiện nay, một số loại thực phẩm chứ







năng có nguồn gốc thảo dƣợc cũng sử dụng các loại cây này hoặc có thành phầđƣợc chiết xuất từ cây thuốc có các hoạt chất nhƣ các alkaloid, terpenoid phenolic… đƣợc biết đến nhƣ là các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các loại thực phẩchức năng này có thể là con dao hai lƣỡi, dùng với liều lƣợng vừa phải có tác dụnchữa một số bệnh song dùng không đúng cách hoặc quá liều có thể dẫn đến ngộ độhoặc các biến chứng. Vì vậy sử dụng những thực phẩm chức năng có chứa cácalkaloid độc này phải cẩn trọng và phải đƣợc sự quản lý và cho phép của các cơquan chức năng. Tuy nhiên, ở Việt Nam việc xác định đồng thơ i các alkaloidđô ctrong thực phẩm chức năng vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu. Do vậy, để góp phần kiểm

soát các nguy cơ tiềm ẩn để đảm bảo an toàn cho ngƣời tiêu dùng và giúp cơ quanchức năng quản lý đƣa ra các khuyến cáo nhằm giảm nguy cơ ngộ độc do sử dụngcác thực phẩm chức năng có ngồn gốc thảo dƣợc. Chúng tôi đã tiến hành đề tài:“Tách và xác định một số độc tố nhóm alkaloids trong thực phẩm chức năngbằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ ”.







CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về nhóm alkaloid

1.1.1. Lịch sử phát hiện Năm 1804- 1805, các nhà hóa học Pháp và Đức đã phân lập đƣợc morphin

và điều chế đƣợc dạng muối của nó. Đồng thời đã chứng minh đƣợc morphin hoạt chất chính của cây thuốc phiện có tác dụng sinh lý rõ rệt. Năm 1980, từ vỏ câycanhkina, đã chiết và kết tinh đƣợc một chất đặt tên là “cinchonino” sau đó hai nhàhóa học Pháp đã xác định cinchonino là hỗn hợp của hai alkaloid là quinin vàcinchonin. Năm 1918, phát hiện ra alkaloid của hạt mã tiền là strychnin và brucin; phát hiện racafein trong chè, cà phê. Sau đó tiếp tục phát hiện ra nicotin trong thuốclá, atropin trong cà độc dƣợc, theobromin trong cacao, codein trong thuốc phiện,cocain trong lá coca. Giữa năm 1973, ngƣời ta đã xác định đƣợc 4959 alkaloid khácnhau trong đó có 3293 chất đã xác định đƣợc công thức hóa học. Hiện nay đã phát hiện ra đƣợc rất nhiều alkaloid và cũng đã đƣợc đƣa vào ứng dụng trong y học ngàymột tăng [15].

1.1.2. Khái quát về nhóm alkaloid

1.1.2.1. Khái niệm

Alkaloid có nguồn gốc từ chữ: alcali tiếng Ả rập là kiềm. Alkaloid là:

- Những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ thƣờng gặp ởtrong nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật.

- Có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh.

- Có hoạt tính sinh học rất quan trọng.

- Có một số phản ứng chung là tạo “tủa“ cần thiết cho sự xác định chúng.Chúng là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt. Đặc biệt tronglĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo [15] [16].







1.1.2.2. Cấu tạo hóa học

Về mặt hóa học, sự phong phú và đa dạng của alkaloid đã trở thành mộtchuyên nghành, chiếm một vị trí quan tr ọng trong lĩnh vực nghiên cứu và trong tạ pchí thông tin về hóa học. Đối vớ i việc nghiên cứu alkaloid còn quan tr ọng hơn bở ivì chúng có trong hệ thực vật nhiệt đớ i phong phú là nguồn cung cấ p alkaloid chủ yếu. Về mặt cấu trúc hóa học, chúng có ít nhất 1 nguyên tử N trong phân tử, chủ yếu nằm trong vòng. Sự có mặt của nguyên tử của N trong cấu trúc quyết định tính bazơ của alkaloid và là chỗ dựa r ất quan tr ọng cho các nhà hóa học trong nghiêncứu alkaloid [15].

1.1.2.3. Phân loại

Các alkaloid đã biết có đến trên 250 dạng cấu trúc khác nhau với hơn 5.500 hợ p chất alkaloid trong tự nhiên. Vì vậy cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản trƣớc đây (khoảng 20 nhóm cấu trúc) chƣa đáp ứng đƣợ c nên ngày càng có xuhƣớ ng chia chúng thành những nhóm nhỏ: nhóm alkaloid Ecgotamia, Harmin,Yohimbin, Strychnin, Echitamin. Nhóm alkaloid có nhân isoquinolin đƣợ c chia

thành các nhóm: Benzyliaoquinolin, Apocphin, Protobecberin,Benzophenanthridin…Có ý kiến xế p các hợ p chất có N ngoài vòng nhƣ Colchicin,Hordenin, là các protoalkaloid [15] [27].

1.1.2.4. Sự phân bố

Cromwell (1995) ƣớ c tính alkaloid phân bố trong khoảng 1 phần 7 loài thựcvật có hoa. Một ƣớ c tính khác (Hegnauer, 1963) cho r ằng alkaloid có từ 12%-20%trong tổng số cây có nhựa. Còn Willaman và Schubert (1955) thì cho r ằng trong hơn300 họ của nghành hạt kín thì 1/3 họ có chứa alkaloid. Nhiều tổng k ết cho thấy đạiđa số cây có chứa alkaloid là cây hai lá mầm. Chỉ có một số ít cây chứa alkaloid làcây 1 lá mầm và nghành hạt tr ần. Theo thống kê đến nay thì cây thuộc thảo và cây bụi có nhiều alkaloid hơn cây gỗ, và tr ọng lƣợ ng phân tử của alkaloid trong cây gỗ thƣờng bé hơn trọng lƣợ ng phân tử cây thuộc thảo. Cây một năm có nhiều alkaloidhơn cây lƣu niên (Levin, 1976). Alkaloid không có trong loài sốngở nƣớ c ngoại tr ừ







1.1.3. Cấu tạo của một số alkaloid độc

Bảng 1.1.Cấu trúc hoá học của một số alkaloid độc đƣợc xác định trong đề tài.

STT Alkaloid Công thứcphân tử

Khốilƣợngphân tử (g/mol)

pK a Công thức cấu tạo

1

Brucin

10,11-Dimethoxystrychnine

C23H26 N2O4 394,46 8,28

2

Strychnin(4aR,5aS,8aR,13aS,15aS,

15bR)-4a,5,5a,7,8,13a,15,15a,15 b,16-decahydro-2H-4,6-

methanoindolo[3,2,1-ij]oxepino[2,3,4-de]pyrrolo[2,3-

h]quinoline-14-one

C21H22 N2O2 334,41 8,26

3Aconitin

AcetylbenzoylaconineC34H47 NO11 645,74 5,88

4

Atropin

(RS)-(8-Methyl-8-azabicyclo[3.2.1]oct-3-yl)

3-hydroxy-2- phenylpropanoate

C17H23 NO3 289,37 4,35







5

Scopolamin

( – )-(S)-3-hydroxy-2- phenylpropionicacid(1R,2R,4S,7S,9S)-9-methyl-3-oxa-9-azatricyclo[3.3.1.02,4]non-7-yl ester

C17H21 NO4 303,35 7,75

6

Koumin

7,20(2H,19H)-Cyclovobasan, 1,2,18,19-tetradehydro-3,17-epoxy-

, (3R,7alpha,20alpha)-

C20H22 N2O 306,41 _

7

Colchicin

N-[(7S)-1,2,3,10-Tetramethoxy-9-oxo-

5,6,7,9-tetrahydrobenzo[a]heptal

en-7-yl]acetamide

C22H25 N O6 399,44 12,35

8

Nicotin

(−)-1-Methyl-2-(3- pyridyl)pyrrolidine,(S)-3-(1-Methyl-2-pyrrolidinyl) pyridine

C10H14 N2 162,23 8,5

1.1.4. Tác dụng và độc tính của một số alkaloid

Các chất trong nghiên cứu này thuộc nhóm alkaloid chúng có tác dụng lên hệthần kinh, tim mạch và hô hấp [3] [12]. Khi dùng với hàm lƣợng nhỏ chúng có tácdụng chữa bệnh nhƣng khi dùng với hàm lƣợng lớn gây ngộ độc có thể dẫn đến vong vì đây đều là các alkaloid độc. Bảng 1.2 giới thiệu giá trị LD50 (liều lƣợngchất độc gây chết cho một nửa số cá thể trong nghiên cứu) [24].







Bảng 1.2.Các giá trị LD50của các chất phân tích.

Tên chất LD50 trên chuột đƣờ nguống (mg/kg)

LD50 trên chuột đƣờ ngtiêm (mg/kg)

Brucin 150 12Strychnin 2,2 0,16Colchicin 5,886 -Koumin 100 -Scopolamin 1270 650 Nicotin 3 -Aconitin 1 0,12Atropin 75 30

1.1.4.1. Brucin và strychnin

Brucin và strychnin đều là alkaloid đắng, brucin có liên quan chặt chẽ vớistrychnin. Hai chất này xuất hiện ở một số loài thực vật, đƣợc biết đến nhiều nhấalkaloid chính trong vỏ, lá, hạt cây mã tiền đƣợc tìm thấy ở Đông Nam Á. Hạt chứakhoảng 1,5% strychnin, còn hoa khô chứa khoảng 1,023 %, ngay cả vỏ cây cũng

chứa các hợp chất độc, bao gồm cả brucin [5]. Strychnin là một alkaloid khôngmàu, ít tan trong dầu lửa và trong nƣớc, không tan trong ethyleter. Strychnin tríchtừ hạt cây mã tiền hay nhân, rất độc, chất strychnin đƣợc ghi vào bảng A của cádƣợc điển

Trong y học dân gian, mã tiền dùng nhƣ thuốc bổ lành bệnh và kích thích sựthèm ăn và là một loại thuốc vi lƣợng đồng căn, đƣợc dùng cho những vấn đề tiêu

hóa thông thƣờng, nhạy cảm với nhiệt độ lạnh, cáu kỉnh khó chịu và sử dụng nhthuốc bổ cho hệ thống tuần hoàn trƣờng hợp bị chứng suy tim.

Strychnin dạng tinh thể sử dụng làm thuốc trừ sâu, đặc biệt là để giết chếđộng vật có xƣơng sống nhỏ nhƣ các loài chim và động vật gặm nhấm. Strychngây co giật cơ bắp và cuối cùng chết vì ngạt.







Đứng trên quan điểm dƣợc lý, strychnin là một chất kích thích chủ yếu vàotủy sống, đây là hệ thống thần kinh trung ƣơng. Nó làm tăng cảm nhận giác quannhƣ: vị giác, khứu giác, thị giác. Với lƣợng vừa phải trung bình, hoạt động tác dụnvào trung tâm hô hấp nằm trong hành tủy ( bulle rachidien ) và gia tăng biên độ hôhấp. Chất strychnin đƣợc sử dụng trong chữa trị những chứng rối loạn chức năng cvòng ( sphinctériens )nhất định, sự suy hô hấp và viêm đa thần kinh nghiện rƣợu.Khi dùng với một liều rất nhỏ, theo Stille ( Système de Madica et thérapeutique,1864 ): dùng trong rối loạn tiêu hóa, để gia tăng bài tiết dịch vị ở dạ dày, ở miệng ởgan và ở tụy tạng. Nhƣng khi dùng quá liều có thể dẫn đến ngộ độc. Khi ngộ độ

strychnin, đƣợc thể hiện bởi những cơn động kinh co giật và đôi khi đƣa đến tvong vì ngạt thở.Vì vậy, strychnin không còn sử dụng trong y học hiện đại, mặc dùnó đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong y học thời trƣớc thế chiến thứ hai. Liêu du ng la mthuôc cu a strychnin sulfat la 1 mg/mL [12] [13].

Chất brucin gần giống nhƣ strychnin trong chức năng, nhƣng nhẹ hơn, ít độchơn, nó chỉ làm tê liệt hệ thần kinh vận động ngoại vi. Cho mục đích y tế, bruci

đƣợc sử dụng chủ yếu trong việc điều tiết huyết áp cao và bệnh tim tƣơng đối làtính khác. Brucin không phải là chất độc hại nhƣng một ngƣời tiêu thụ hơn 2 m brucin tinh khiết gần nhƣ chắc chắn sẽ bị các triệu chứng tƣơng tự nhƣ ngộ đstrychnin và có thể gây tử vong ở liều lƣợng lớn [16] [27] [31].

1.1.4.2. Aconitin

Aconitin là một alkaloid độc có trong củ ấu tàu, còn gọi là củ gấu tàu, là rễcủ của cây ô đầu Việt Nam, tên khoa học là Aconitum fortunei . Cây thƣờng mọchoang ở các vùng núi cao biên giới phía Bắc nƣớc ta: Lào Cai, Tuyên Quang, HàGiang... Ô đầu đƣợc xếp vào loại thuốc rất độc (bảng A). Độc tính của aconitin rấmạnh: Chỉ cần một liều từ 0,02- 0,05 mg cho 1kg thể trọng là có thể gây chếtngƣời. Ở nhiệt độ cao, aconitin bị phân hủy thành benzoylaconin và sau đó làaconin kém độc hơn aconitin khoảng 1.000 đến 2.000 lần. Loại độc tố này thƣờnđƣợc dùng để tẩm vào đầu tên khi săn thú rừng, kể cả…voi.







Trong Đông y, ấu tàu đƣợc dùng ngâm rƣợu để xoa bóp khi bị đau nhức, têmỏi chân tay. Tây y dùng làm thuốc ho, chữa chứng ra mồ hôi nhiều. Thƣờng chỉdùng làm thuốc uống khi đã qua chế biến cẩn thận và đƣợc dùng với liều nhỏ, có schỉ định và theo dõi thận trọng của thầy thuốc.

Củ ấu tàu ngâm rƣợu chỉ dùng để xoa bóp. Nguy cơ bị ngộ độc thƣờng làtrong những trƣờng hợp uống nhầm tƣởng là rƣợu thuốc, để trong tầm với của trẻ,dùng quá liều chỉ định của thầy thuốc. Ở một số tỉnh vùng cao nhƣ Lào Cai, HàGiang,… ngƣời dân thƣờng nấu cháo củ ấu tàu dùng nhƣ món đặc sản vùng cao. Tunhiên nếu ăn những món ăn có củ ấu tàu chế biến chƣa đúng cách sẽ gây ngộ độcBiểu hiện của ngộ độc : Sau khi ăn, aconitin ngấm rất nhanh qua niêm mạc dạ dàyruột để vào máu gây nên các triệu chứng nhƣ tê miệng lƣỡi, nói khó, tê mỏi chân taychuột rút, đau đầu, nhìn mờ, buồn nôn, nôn, ỉa chảy, nặng hơn có thể liệt cơ hô hấploạn nhịp tim,… Nếu không đƣợc điều trị kịp thời bệnh nhân sẽ tử vong [16] [17].1.1.4.3. Atropin

Atropin là một alkaloid tự nhiên chiết xuất từ cây ba ch anh (Atropa

belladonna), cây cà đô c dƣơ c (Datura meterl), giông cây đô c (Mandragoraofficinarum) và các bộ phận của cây họ cà (Solanaceae). Atropin làm giãn đồng tử,tăng nhịp tim, và làm giảm tiết nƣớc bọt và dịch tiết khác. Atropin đƣợc xếp vàthuốc độc bảng A, liều độc atropin tác động lên não làm say có khi phát điên, hôhấp tăng, sốt, cuối cùng thần kinh trung ƣơng bị ức chế và tê liệt.

Atropin là một trong các alkaloid chính trong cây cà độc dƣợc có ở Việt Nam, với hàm lƣợng cao nhất ở lá và hột. Hàm lƣợng toàn phần các alkaloid từ 0,2-

0,5%, chủ yếu là scopolamin, hyoscyamin, atropin và các saponin, flavonoid,tanin... Tác dụng dƣợc lý của cà độc dƣợc chủ yếu là do các alkaloid: làm giãn phquản, giãn đồng tử, giảm nhu động ruột và bao tử nếu những cơ quan này co thắtlàm khô nƣớc bọt, dịch vị, mồ hôi. Theo Đông y, hoa cà độc dƣợc có vị cay, tínhôn, có độc, có tác dụng ngừa suyễn, giảm ho, chống đau, chống co giật, phong thấpđau nhức. Lá là vị thuốc ngừa cơn hen, giảm đau bao tử, chống say tàu xe. Ngoài racòn điều trị phong tê thấp, đau dây thần kinh toạ, đau răng... Ngƣời ta thƣờng dùn



http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Scopolamin&action=edit&redlink=1

http://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90%C3%B4ng_y

http://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90%C3%B4ng_y

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Scopolamin&action=edit&redlink=1





lá cuộn thành điếu hay thái nhỏ vấn thành điếu thuốc để hút (chữa ho, hen suyễn)dùng lá hơ nóng đắp điều trị đau nhức, tê thấp, hoặc phơi khô tán bột mịn.Vì cây cóđộc tính cao nên chỉ dùng theo sự hƣớng dẫn củathầy thuốc. Khi bị ngộ độc, cóhiện tƣợng giãn đồng tử, mờ mắt, tim đập nhanh, giãn phế quản, môi miệng khkhô cổ đến mức không nuốt và không nói đƣợc. Chất độc tác động vào hệ thần kintrung ƣơng, có thể gây tử vong do hôn mê [27] [31].

Atropin là alkaloid kháng thụ thể đối giao cảm M (Muscarin), tác dụng lên cảtrung ƣơng và ngoại biên. Atropin đƣợc dùng để ức chế tác dụng của hệ thần kinh đgiao cảm. Với liều điều trị, Atropin có tác dụng yếu lên thụ thể Nicotin [12] [13].

1.1.4.4. Scopolamin

Scopolaminhay còn gọi là “hơi thở của quỷ” hoặc gọi tên khác làBurundanga là một loạima túy hay ma dƣợc đƣợc bào chế từcây Borracheroở Colombiavà có tác dụng gây mêđồng thời có khả năng làm mấtđi thần trí của con ngƣời và đƣa con ngƣời vào trạng thái bịthôi miên. CâyBorracherothuộc họ cà độc dƣợc và gần giống với cây loa kèn trắng. Scopolamin

có đặc điểm là không màu, không mùivà không vị nhƣng lại có khả năng tạo ranhững giấc mơ kỳ lạ cho con ngƣời khi hít phải thuốc này. Do cấu trúc hoá học,thuốc có thể gây ra tình trạng hoang tƣởng ảo giác rất mạnh. Đặc biệt, Scopolaminsẽ ngăn chặn ngay từ giai đoạn đầu, không để kí ức đƣợc hình thành, những sự kiệxảy ra trong thời gian thuốc ảnh hƣởng tới thần kinh con ngƣời sẽ không đƣợc glại đến khi thuốc hết tác dụng, ngƣời ta vẫn không tài nào nhớ nổi chuyện gì đã xra, nó có thể gây ra tình trạng mất trí nhớ ở mức độ tƣơng tự nhƣ thuốcanthần diazepam. Nếu sử dụng với liều cao thì có thể gây chết ngƣời, Scopolamin cònlàm con timđập nhanh hơn và gây ra tình trạng kích động. Scopolamin có thể biếnngƣời ta thành dạng không có nhận thức giống nhƣ các thây ma sống/xác sốngnênngƣời chịu ảnh hƣởng của thuốc không thể nhớ chuyện gì đã xảy ra [12] [13] [31].

Scopolamin là một loại thuốc kháng cholinergic. Scopolamin có nhiều tácdụng trong cơ thể bao gồm giảm sự tiết dịch, làm chậm dạ dày và ruột, làm giãn



http://vi.wikipedia.org/wiki/Th%E1%BA%A7y_thu%E1%BB%91c

http://vi.wikipedia.org/wiki/Qu%E1%BB%B7


http://vi.wikipedia.org/wiki/Ma_t%C3%BAy

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Ma_d%C6%B0%E1%BB%A3c&action=edit&redlink=1


http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=B%C3%A0o_ch%E1%BA%BF&action=edit&redlink=1


http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Borrachero&action=edit&redlink=1

http://vi.wikipedia.org/wiki/Colombia

http://vi.wikipedia.org/wiki/G%C3%A2y_m%C3%AA

http://vi.wikipedia.org/wiki/Th%C3%B4i_mi%C3%AAn


http://vi.wikipedia.org/wiki/M%C3%A0u

http://vi.wikipedia.org/wiki/M%C3%B9i

http://vi.wikipedia.org/wiki/V%E1%BB%8B



http://vi.wikipedia.org/wiki/Gi%E1%BA%A5c_m%C6%A1



http://vi.wikipedia.org/wiki/Hoang_t%C6%B0%E1%BB%9Fng_%E1%BA%A3o_gi%C3%A1c



http://vi.wikipedia.org/wiki/Thu%E1%BB%91c_an_th%E1%BA%A7n




http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Diazepam&action=edit&redlink=1


http://vi.wikipedia.org/wiki/Tim

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=K%C3%ADch_%C4%91%E1%BB%99ng&action=edit&redlink=1


http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Th%C3%A2y_ma_s%E1%BB%91ng&action=edit&redlink=1


http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=X%C3%A1c_s%E1%BB%91ng&action=edit&redlink=1






http://vi.wikipedia.org/wiki/Tim







http://vi.wikipedia.org/wiki/M%C3%B9i

http://vi.wikipedia.org/wiki/M%C3%A0u


http://vi.wikipedia.org/wiki/Th%C3%B4i_mi%C3%AAn

http://vi.wikipedia.org/wiki/G%C3%A2y_m%C3%AA

http://vi.wikipedia.org/wiki/Colombia




http://vi.wikipedia.org/wiki/Ma_t%C3%BAy


http://vi.wikipedia.org/wiki/Th%E1%BA%A7y_thu%E1%BB%91c





nở con ngƣơi. Scopolamin đƣợc sử dụng để làm giảm buồn nôn, nôn, chóng mặvà liên quan đến say tàu xe và phục hồi từ gây mê sau phẫu thuật. Scopolamincũng có thể đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh Parkinson, hội chứng ruột kích thích,viêm túi thừa [27].

1.1.4.5. Koumin

Koumin là một trong các alkaloid độc đƣợc tìm thấy trong lá ngón.Độctính của lá ngón là do các alkaloid chứa trong toàn bộ cây, trật tự độc giảm từ rễ,lá, hoa, quả và thân cây. Tới 17 đơn phân alkaloid đã đƣợc chiết ra từ lá ngóntrong đó hàm lƣợng koumin là cao nhất. Ngƣời bị ngộ độc lá ngón có các triệuchứng khát nƣớc, đau họng, chóng mặt, hoa mắt, buồn nôn… sau đó bị mỏi cơ,thân nhiệt hạ, huyết áp hạ, răng cắn chặt, sùi bọt mép, đau bụng dữ dội, tim đậyếu, khó thở, đồng tử giãn và chết rất nhanh do ngừng hô hấp. Tại Trung Quốc, nđƣợc sử dụng để điều trịeczema, bệnh trĩ, nhiễm trùng răng, phong (hủi), nhọtngoài da, chống tổn thƣơng và co thắt, nhƣng do độc tính cao nên chỉ hạn chếtrong các ứng dụng ngoài da [5] [27] [31].

1.1.4.6. Colchicin

Colchicin là chất độc tự nhiên đƣợc chiết xuất từ thực vật thuộc chiColchicum (nghệ tây) và từ cây tỏi độc. Nó đƣợc sử dụng để điều trị các bệnh thấkhớp, đặc biệt là bệnh gút.Ngoài bệnh gút, colchicin đƣợc sử dụng để điều trị sốviêm màng ngoài tim. Hiện nay ngƣời ta thấy conchicin gây hạ nhiệt, tăng huyết áptăng nhu động một cách thái quá. Trên điểm nối thần kinh cơ (jonction neuro-

musculaire), conchicin gây nghẽn biểu hiện bằng tê liệt và nếu kéo dài biểu hiện tecơ xƣơng. Do tác dụng củacolchicin nên dùng tỏi độc có thể có những hiện tƣợngngộ độc nhƣ: nôn mửa, đi lỏng, đau bụng. Liều chết trung bình là 0.03mg đối với kthể trọng, 1centigam đã gây cho ngƣời những hiện tƣợng ngộ độc, sự bài tiết chđộc của conchicin chậm do đó những ngƣời viêm thận hay thiểu năng thận khônnên dùng.Liêu du ng la m thuôc cu a colchicin la 1 mg, khitiêm ha ng nga y liều caohơn1 mg th colchicin se t ch tu ơ mô va co thê dâ n đến ngô đô c.



http://vi.wikipedia.org/wiki/Ch%C3%A0m_%28b%E1%BB%87nh%29







Colchicin đƣợc hấp thu ở ống tiêu hóa và đi vào vòng tuần hoàn ruột-gan. Nồng độ đỉnh huyết tƣơng xuất hiện sau khi uống 2 giờ. Colchicin ngấm vào cá mô, nhất là niêm mạc ruột, gan, thận, lách, trừ cơ tim, cơ vân và phổi. Colchicinđƣợc đào thải chủ yếu theo phân và nƣớc tiểu (10-20%). Khi tiêm hàng ngày liềucao hơn 1 mg thì colchicin sẽ tích tụ ở mô và có thể dẫn đến ngộ độc.

Colchicin có nhiều tác dụng: chống bệnh gout, chống viêm không đặc hiệu,chống phân bào,làm tăng sức bền mao mạch, kích thích tuyến vỏ thƣơng thận, phânhủy tế bào lympho, ức chế phó giao cảm, kích thích giao cảm, chống ngứa, gây ỉachảy, ức chế in vitro khả năng ngƣng tập kết tập tiểu cầu [27] [31].

1.1.4.7. Nicotin

Nicotin là một alkaloid đƣợc tìm thấy trong các họ cây ba ch anh , cây họ Cà(Solanaceae), chủ yếu là trong cây thuốc lá, và với hàm lƣợng thấp hơn trong càchua, khoai tây, cà tím, và tiêu xanh. Nicotin đƣợc tạo ra trong rễ và tích tụ trong lácủa cây. Nó chiếm khoảng 0,6-3,0% trọng lƣợng khô của cây thuốc lá. Nó có chứcnăng nhƣ mộtchất độc thần kinh rất mạnh với ảnh hƣởng rõ rệt đến các loài côn

trùng, do đó nicotin đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ một loại thuốc trừ sâu. Các chất tƣơng tự nicotin nhƣ imidacloprid hiện đang sử dụng rộng rãi làm thuốc bảo vệthực vật. Với liều lƣợng nhỏ hơn (trung bình khoảng 1 mg nicotin hấp thụ), chất nhoạt động nhƣ một chất kích thích trong động vật có vú, trong khi lƣợng cao (30-60mg) có thể gây tử vong. Hiệu ứng kích thích nàycó thể là một yếu tố chính đónggóp vào các thuộc tính phụ thuộc hình thành của ngƣời hút thuốc lá (gâynghiện).Theo Hiệp hội tim mạch Mỹ, nghiện thuốc lá có lịch sử là một trong nhữngthói nghiện ngập khó khăn nhất để phá vỡ, các đặc điểm dƣợc lý và hành vi để xácđịnh nghiện thuốc lá cũng tƣơng tự nhƣ nghiện heroin và cocain [24] [27] [31].

1.2. Các phƣơng pháp xác định

1.2.1. Phương pháp điện di mao quản

Đây là phƣơng pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất khôngion nhƣng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp chứ



http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Ch%E1%BA%A5t_%C4%91%E1%BB%99c_th%E1%BA%A7n_kinh&action=edit&redlink=1


http://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%B4n_tr%C3%B9ng










đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trƣờng. Do độ linh động điện di của các ion khánhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

Tác giảHua-Tao Feng và Sam F.YLi và cộng sự đã phát triển phƣơng pháp xác định 5 alkaloid độc trong hai loại thuốc thảo dƣợc phổ biến bằng phƣơng phđiện di mao quản. Các chất aconitin, mesaconitin, hypaconitin, benzoylaconin, benzoylmesaconinđƣợc phân tích chỉ trong 15 phút bằng đệm có chứa amoniumacetat 40 mM và acid acetic 0,1% acid trong methanol 80%.Khoảng tuyến tính từ2 ÷ 200 mg/L. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp từ 0,85 đến 1,90 mg/L. Độ thuhồi trong khoảng95 ÷ 108,8% [22].

Cũng sử dụng phƣơng pháp điện di mao quản để phân tích alkaloid nhƣngvới kỹ thuật sắc ký điện động micell (micellar electrokinetic chromatography,MEKC). Đây là phƣơng pháp điện di trong đó các chất đƣợc tách ra bởi sự phân bốkhác nhau của chúng trong các micell (đƣợc xem nhƣ là một pha tĩnh giả) và dungdịch đệm (pha động). Trong MEKC, các chất hoạt động bề mặt đƣợc thêm vào dundịch đệm ở nồng độ lớn hơn nồng độ micell tới hạn. Trong phần lớn trƣờng hợ

MEKC đƣợc tiên hành trong môi trƣờng kiềm. Natri dodecyl sulfat (SDS) là chấthoạt động bề mặt thƣờng sử dụng nhất.

Nhóm tác giả Yu L, Xu Y, Feng H đã xây dựng phƣơng pháp xác định các độctố alkaloid nhóm pyrrolizidin trong thuốc thảo dƣợc truyền thống Trung Quốc. Cácchất senkirkin, senecionin, retrorsin và seneciphyllin đƣợc tách bằng dung dịch đệmcó chứa borat 20 mM, SDS 30 mM và methanol 20 % ở pH 9,1. Giới hạn phát hiện

của các chất trong khoảng 1,19 ÷ 2,70 µg/mL; giá trị RSD đều nhỏ hơn 5 %.[34]

1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng với d etector UV

Phƣơng pháp sắc ký lỏng rất phù hợp cho việc xác định các alkaloid nên nóđƣợc sử dụng rộng rãi. Các tác giả nghiên cứu bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng trênhiều loại detector khác nhau trong đó có detector UV. Nguyên lý:chất phân tíchsau khi tách khỏi cột sắc ký bằng hệ pha động đƣợc dẫn vào flowcell đo đƣợc chiế







bởi một chùm tử ngoại. Sự hấp thụ tia bức xạ bởi các chất tan tuân theo định luậLambert-Beer.

Nhóm nghiên cứu Trần Quốc Bình và Đỗ Thị Oanh thuộc bệnh viện Y họccổ truyền Trung ƣơng đã nghiên cứu thành phần cà độc dƣợc trong chế phẩm Camứng dụng trong hỗ trợ cắt cơn nghiện ma túy. Nhóm tác giả đã định tính atropin vàscopolamin trong cà độc dƣợc bằng sắc ký lớp mỏng với bản mỏng Silicagel G254 đãtráng sẵn của Merck và dung môi khai triển là ethylacetat – methanol – amoniacđậm đặc (17:2:1). Định lƣợng alkaloid toàn phần trong mỗi bộ phận cây cà độdƣợc tính theo scopolamin bằng phƣơng pháp acid- bazơ. Định lƣợng scopolamin bằng phƣơng pháp HPLC sử dụng cột Bondapak C18 (150 x 4,6 mm; 5µm), phađộng gồm có: tetrabutylamonium hydrogensulfat, acetonitril và đệm acetat.Detector UV bƣớc sóng 257 nm [1].

Nhóm tác giả Lƣơng Thị Phấn, Nguyễn Tiến Vững, Nguyễn Thị Thuậntrƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã nghiên cứu định lƣợng đồng thời strychnin v brucin trong huyết tƣơng bằng phƣơng pháp HPLC. Quy trình xử lý mẫu 2 mL mẫu

huyết tƣơng thêm 400 µL acid percloric 1N và 50 µL dung dịch NaOH 1M, lắcxoáy trong 15 giây, ly tâm5000 vòng/phút trong 10 phút. Lọc dịch thu đƣợc quamàng 0,45 µm.Sử dụng cột tách Acclaim C18 (4,6x150; 5µm), pha độngACN :đệm K 2HPO4 1M pH9 (38:62;v/v), tốc độ dòng 0,8 ml/phút. Detector Diode Array bƣớc sóng 257 nm [7].

Tác giả Xie Y và các cộng sự đã phát triển phƣơng pháp xác định 6 hợp chất

alkaloid nhóm aconitum thành phần trong thuốc Trung Quốc bằng HPLC vớidetector DAD. Các hợp chất aconitin, mesaconitin, hypaconitin, benzoylaconin, benzoylmesaconin và benzoylhypaconin đƣợc tách trên cột ODS với chƣơng trìnhgradient. Pha động gồm acetonitril và đệm amoni bicacbonat (pH 10,0 ± 0,2). Hiệusuất thu hồi trong khoảng 90 ÷ 103 %, giá trị RSD nhỏ hơn 3,28%.[32]







1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng vớidetector khối phổ

Đây là một phƣơng pháp nhanh, nhạy để xác định đồng thời cácalkaloid.Sau khi qua cột tách, chất phân tích đƣợc hóa hơi, các hợp chất hữu cơ trung hoà bion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dƣơng hoặc âmcác gốc tự do. Sau đó, các ion đựơc đƣa sang bộ phận tách theo khối lƣợng. Từ cátín hiệu thu đƣợc, dựa vào khối lƣợng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào cámảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion vàmảnh ion, ngƣời ta định tính và định lƣợng đƣợc chất phân tích một cách chính xác

Nhóm tác giả Trần Thị Văn Thi và Trần Thanh Minh thuộc trƣờng Đại học

Khoa học, Đại học Huế đã tiến hành nghiên cứu phân lập và nhận dạng cấu trúalkaloid trong dịch chiết từ lá vông nem. Alkaloid toàn phần đƣợc chiết bằngethanol 960 và NH4OH 12,5% và chiết ngâm kiệt bằng ethanol 960. Dịch chiết đƣợccất loại dung môi, hòa tan cặn bằng H2SO4 2%, lọc lấy dịch lọc (các alkaloid lúcnày ở dạng muối, không tan đƣợc tr ong CHCl3). Đem dịch lọc loại tạp bằng CHCl3,rồi đƣa về pH = 9-10 bằng NH4OH đậm đặc (các alkaloid lúc này ở dạng bazơ tựdo, tan đƣợc trong CHCl3) và chiết lấy alkaloid bằng CHCl3. Lọc dịch chiết CHCl3 qua giấy lọc có Na2SO4 khan, rửa giấy lọc và Na2SO4 khan bằng CHCl3, rồi bayhơi CHCl3 (cô khô ở 500 C) thu đƣợc alkaloid toàn phần. Sử dụng các phƣơng pháp: chiết phân đoạn trong các môi trƣờng pH khác nhau, chiết phân đoạn bằngcác dung môi có độ phân cực khác nhau, sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng để phân lậpcác cấu tử alkaloid từ cặn alkaloid toàn phần. Xác định độ tinh khiết và địnhtính bằng sắc ký lỏng- khối phổ (LC-MS); điều kiện sắc ký: dung môi

methanol -nƣớc (85:15), thời gian 35 phút, tốc độ dòng 1 ml/phút, cột ODS-C18,detectorDAD, bƣớc sóng 284 nm; điều kiện ghi phổ khối: Nguồn ion EFI, khí làmkhô N2 (nhiệt độ khí 350o C, áp suất 30 psi, lƣu lƣợng khí 15 lít/phút). Chânkhông 2,5.10-5 mmbar. Điện thế (năng lƣợngdetector) 1118 V. [11]

Tác giảPeihong Qiu và cộng sự đã phát triển phƣơng pháp xác định đồngthời 5 alkaloid trong nƣớc tiểu và máu bằng sắc ký lỏng khối phổ. Trong đó có cáhợp chất brucin, strychnin, aconitin và colchicin. Quy trình xử lý mẫu: 200 µL mẫu







máu và nƣớc tiểu đƣợc trộn với 300µL dung dịch 1 % acid trifluoroacetic trongacetonitril, vortex trong 2 phút và rung siêu âm trong 10 phút. Mẫu sau đó đƣợc làmsạch bằng SPE với cột Oasis MCX và đem đi phân tích trên hệ thống LC-MS/MSvới chế độ ion dƣơng nguồn ESI. Cột tách XBridge C18 (5 µm×3.0 mm×250mm), pha động:acetonitril (kênh A),amoni bicacbonat 10 mM chỉnh pH 10,5 (kênh B)theo chƣơng trình gradient. Giới hạn định lƣợng lần lƣợt là: brucin: 0,03 ng/mL,strychnin: 0,05 ng/mL, ephedrin: 0,20 ng/mL, aconitin: 0,05 ng/mL và colchicin:0,01 ng/mL. Hiệu suất thu hồi trên nền nƣớc tiểu từ96 ÷ 110 %và trên nền máu là94 ÷ 113 %.[28]

Tác giả Huiqin và các cộng sự tại trung tâm nghiên cứu Quốc gia TrungQuốc đã phát triển phƣơng pháp xác định đồng thời 17 alkaloid độc trong dịch cơthể ngƣời bằngLC-MSvới nguồn ESI dƣơng chế độ MRM. Trong đó có 7 alkaloidtrong đề tài là : koumin, atro pin, scopolamin, brucin, strychnin, aconitin vàcolchicin.Mẫu máu đƣợc chiết lỏng – lỏng nhƣ sau: 0,5 mL mẫu đƣợc thêm 1 mLdung dịch đệm borat pH 9, thêm 6 mL chloroform và vortex trong 5 phút, lytâm ở

400 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dung dịch phía dƣới, phần dung dịch phíatrên đƣợc chiết tiếp băng 12 mL hỗn hợp chloroform : ether (2:1, v/v). Gộp dịchchiết và làm bay hơi đến khô bằng nitơ ở 55oC. Hòa cặn bằng 1 mL methanol và phân tích bằng LC-MS. Sử dụng cột tách Ultimate XB-C18 (4,6 x 250 mm, 5µm)chƣơng trình rửa giải gradient hai kênh A (dung dịch acid focmic 0,2 %), kênh B(methanol); tốc độ dòng 0,6 mL/phút. Khoảng tuyến tính của các chất trong khoảng0,5 ÷ 50 µg/L và 0,5 ÷ 500 µg/L, LOD trong khoảng 0,1 ÷ 1 µg/L. Hiệu suất thu hồi

từ 81,7 ÷ 102,3%, giá trị RSD nhỏ hơn 10 % và 15 %.[23]

Nhận xét: Các phƣơng pháp: sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (detectorUV); điện di (CE) thƣờng khá phức tạp và kém chính xác do ảnh hƣởng của nềnmẫu. Việc tách và xác định đồng thời 8 chất trong đối tƣợng thực phẩm chức năngcó nền mẫu phức tạp là khó khănnên chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng8







alkaloid độc này bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS). Đây là phƣơng pháp hiện đại, có độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác cao.

1.3. Sắc ký lỏng khối phổ

1.3.1. Ng uyên tắc chung của sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặcchất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng- rắn, lỏng-lỏng). Mẫu phân tíchđƣợc chuyển lên cột tách dƣới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các ch phân tích đƣợc phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chấ phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khảnăng tƣơng tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển vớitốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [6]. Sau đó các chất phân tích đƣợc đƣa vào bộ phận phát hiện và ghi nhận thành tín hiệu sắc kýdetector . Có rất nhiều loạidetectornhƣ UV, RF, khối phổ….

Hiện nay,detectorcó thể cung cấp thông tin định tính, định lƣợng và cấutrúc của các chất phân tích làdetectorkhối phổ.

1.3.2. Detector khối phổ (Mass spectrometry – M S)

1.3.2.1. Nguyên t ắ c

Khối phổ (Mass spectrometry – MS) là dựa vào chất nghiên cứu đƣợc ionhóa trong pha khí hoặc pha ngƣng tụ dƣới chân không cao, tạo thành các ion có sốkhối khác nhau, các ion này đƣợc phân tách thành các mảnh theo tỉ số khối trên điệntích (m/z)[29].Các ion này có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích nhƣ loại

bỏ electron, proton hóa... Các ion tạo thành theo tỉ số m/z và phát hiện từ đó chothông tin về khối lƣợng hay cấu trúc phân tử của hợp chất.

Cấu tạo của thiết bị khối phổ gồm 3 bộ phận chính: nguồn ion, thiết bị phâtích và detector . Các mẫu đƣợc ion hóa trong nguồn ion sau đó đƣa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z, các tín hiệu thu đƣợc sẽ chuyển vàomáy tính xử lý và lƣu trữ.







1.3.2.2. Bộ nguồn ion (Ion sources)

Chất phân tích ra khỏi cột sắc ký ở dạng lỏng, khó khăn lớn nhất ở đây là

phải chuyển chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi. Theo kỹ thuật ion hoá củaLC/MS, năng lƣợng của máy trực tiếp tác động vào pha lỏng hoặc rắn để tạo thànion ở thể hơi. Có nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau nhƣng hai kỹ thuật hay đƣợc sdụng trong sắc ký lỏng khối phổ bao gồm:

a) Chế độ ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization- ESI)

Kĩ thuật ion hóa phun điện tử bao gồm ba quá trình cơ bản sau:

- Tạo thành các giọt mang điện tích. - Làm giảm kích thƣớc của các hạt, và phân nhỏ các hạt. - Quá trình hình thành pha hơi các ion.

Hình 1.1: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI

Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà ngƣời ta chọn kiểu bắn với chđộ ion dƣơng (+) hoặc ion âm (-). Kiểu bắn phá chế độ ion dƣơng thƣờng cho nhiềuthông tin hơn về ion nghiên cứu nên đƣợc dùng phổ biến hơn.

- Loại hình thành ion dƣơng. o Phù hợp nhất cho phân tích các loại chất phân tích có tính bazơ. o Thƣờng hình thành nên ion [M+H]+. o Cũng có thể hình thành ion [M+nH]n+ , [M+Na+]+

- Loại hình thành ion âm. o Thích hợp nhất cho sự phân tích các loại chất phân tích có tính acid. o Hình thành nên ion [M-H]-, [M-nH]n-







ESI là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao, ESI- MS thích hợp cho cả phân tử có phân tử khối nhỏ (khoảng100-150 amu) cũng nhƣ phân tử khối lớn củacác phân tử sinh học, các hợp chất khó bay hơi, không bền nhiệt, phân cực và không phân cực.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật ion hoá phun điện tử (ESI) bắn phá với chế độ ion dƣơng [29].

b) Chế độ ion hóa hóa học áp suất khí quyển (Atmospheric Presure ChemicalIonization-APCI)

Sự ion hóa trong APCI phụ thuộc vào sự va chạm của dòng ion dƣơng hay âmvới phân tử, mẫu bị ion hóa bởi phản ứng với các ion đƣợc tạo ra từ các chất k hínhƣ methan (ở dạng CH5

+), amoniac (ở dạng NH4+)...

1.3.2.3. Bộ phân tích kh ố i phổ (analyser)

Bộ phân tích khối phổ có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhauthành từng phần riêng biệt. Sau khi đã đƣợc ion hoá, các ion đƣợc đƣa đến bộ phân

tích khối nhằm loại bỏ những ion không cần thiết, lựa chọn các ion phân tử, thựhiện bắn pha thêm để thu đƣợc các ion con. Một số bộ phân tích khối phổ :

Bộ phân tích bẫy ion.

Bộ phân tích thời gian bay.

Bộ phân tích tứ cực.

a) Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole analyser)

Nguyên tắc: tạo ra một trƣờng tần số vô tuyến biến đổi (trƣờng tứ cực).Bộ phtích tứ cực bao gồm 2 loại: Bộ phân tích tứ cực đơn, bộ phân tích tứ cực chập ba.

Bộ phân tích tứ cực đơn (Single focusing magnetic analyser): Có 4 cực bằngkim loại đặt song song và theo hƣớng của chùm ion. Trƣờng tĩnh điện đƣợc tạo rado thế một chiều (DC) và tần số radio (RF) đƣợc đặt vào các thanh. Các tứ cực nh







bộ lọc khối, khi có điện trƣờng thì ion chuyển động trong nó sẽ dao động phthuộc vào tỉ số m/z và từ trƣờng RF. Chỉ những ion phù hợp mới đi qua bộ lọc này.

Bộ phân tích tứ cực chập ba (Triplequad mass spectometry): Bộ phân tích khối

bao gồm ba bộ tứ cực ghép nối với nhau. Trong đó, tứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệmvụ tách các ion, lựa chọn ion mẹ với m/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến đchuyển đến Q2. Ở tứ cực thứ hai (Q2) các ion phân tử mẹ bị phân li do va chạm vớkhí trơ có mặt nhƣ khí N2, Ar, He, bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ioncon. Q2 không đóng vai trò là bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả các ion do Q1chuyển đến. Sau đó tất cả các ion con đƣợc chuyển qua bộ tách Q3. Bộ tứ cực th

ba (Q3) làm nhiệm vụ tách các ion đƣợc chuyển từ Q2 để đi tới bộ phận phát hiện.

Hình 1.2: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực chập ba

Kỹ thuật MS một lần có nhƣợc điểm là không nghiên cứu đƣợc cơ chế phâmảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, chịu ảnh hƣởng rõ rệt của nền mẫu ch

phân tích, trên phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử. Kỹ thuật MS/MS không chỉ khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm trên mà còn tăng độ nhạy phân tích tới hàm lƣợnfemtogram, tăng độ chính xác của kết quả phân tích, loại bỏ ảnh hƣởng của nềmẫu. Hệ MS/MS là hệ hai máy khối phổ độc lập đƣợc nối với nhau cách nhau buồng va chạm (Collision Cell) [29].

b) Bộ phân tích thời gian bay (Time of flight analyser – TOF)







Các ion ra khỏi buồng ion hoá đƣợc gia tốc nhờ thế 10-20 kV bay qua một ống phân tích (không có trƣờng điện từ) có chiều dài đến 2m với cùng động năng. Tuynhiên, tùy thuộc vào tỉ số m/z mà các ion có tốc độ khác nhau tớidetector . Thời

gian bay hết ống này đếndetectortỷ lệ thuận với z m của các ion. Các ion sẽđƣợc phát hiện ở các thời điểm khác nhau. Bộ phân tách này cho phổ tuyến tính vớthang m/z.

c) Bộ phân tích tứ cực bẫy ion (QuadrupoleIon-Trap Mass Analyser)

Bẫy tứ cực hoạt động theo nguyên lý bộ phân tích khối tứ cực, chỉ có một

điểm khác là các ion đƣợc lƣu giữ và đƣa dần ra khỏi bẫy. Bằng cách thay đổi thxoay chiều áp vào các cực các ion có tỷ số m/z khác nhau có thể vƣợt qua khoảngkhông để đếndetector . Các ion này cũng có thể bị bắn phá trong bẫy để thu đƣợccác ion con. Về nguyên tắc, loại phân tích khối phổ bẫy ion có thể làm đến MSnhiều lần.

Bộ phân tích khối ba tứ cực đƣợc sử dụng phổ biến trong kỹ thuật LC-MS/MS và đây chính là kỹ thuật đƣợc chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này.

1.3.2.4. Bộ phận phát hi ện

Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối, các ion đƣợc đƣa tới phần cuối củthiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạra một tín hiệu của các ion tƣơng ứng từ các electron thứ cấp đã đƣợc khuếch đạihoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát hiện ph biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang.

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ phận phát hiện nhân electron. 1.3.3. Phân tích định tính và định lượng bằng LC -MS/MS

Đại lƣợng đặc trƣng cho sự tách sắc ký là thời gian lƣu của các chất do vậdựa vào thời gian lƣu của chất phân tích và sự phân mảnh phổ có thể định tính từnchất trong hỗn hợp. Dùng phƣơng pháp đƣờng chuẩn và thêm chuẩn để định lƣợchất phân tích trong mẫu, đồng thời kiểm soát độ thu hồi của phƣơng pháp.







1.4. Lấy mẫu

Lấy mẫu: Lƣợng mẫu lấy phải đảm bảo nhu cầu phân tích, phù hợp phân tíc

định lƣợng, giữ nguyên hiện trạng và đúng thành phần Cách bảo quản mẫu: Quá trình bảo quản mẫu phải đảm bảo sao cho không làm

nhiễm bẩn hoặc mất chất phân tích. Mục đích để giữ và bảo toàn đƣợc chất phtích do các hiện tƣợng tƣơng tác hóa học, tự phân hủy chất [30].

1.5. Đánh giá phƣơng pháp phân tích Tính đặc hiệu, tính chọn lọc

Tính đặc hiệu: Là khả năng phát hiện đƣợc chất phân tích khi có mặt các tạpchất khác nhƣ các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tƣơng tự, tạp chất.

Tính chọn lọc: Là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phântích một số hoặc nhiều chất chung một qui trình. Nếu chất cần xác định phân biệt rvới chất khác thì phƣơng pháp phân tích có tính chọn lọc.

Có nhiều cách xác định tính đặc hiệu, tính chọn lọc, trong nghiên cứu này dothiết bị sắc ký có kết nối detercter MS nên chúng tôisử dụng các phƣơng pháp:

So sánh phổ của chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn vàmẫu thêm chuẩn. Mẫu trắng không đƣợc lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêmchuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lƣu tƣơng ứng thời gian lƣtrên mẫu chuẩn.

Phƣơng pháp xác nhận (confirmation method). TheoAOAC điểmnhận dạng IP (identification point) đối với kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ 2 lần(LC-MS/MS) là 4, tức là cần 1 ion mẹ bắn phá ra 2 ion con.

Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫucó thể phát hiện đƣợc nhƣng chƣa thể định lƣợng đƣợc.

Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫuthử mà ta có thể định lƣợng và cho kết quả có độ chụm mong muốn.







Xác định LOD, LOQ dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đƣờng (S/N): Phân tíchmẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tíc(n=4). Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio).

LOD là nồng độ mà tại đó S/N = 3, LOQ là nồng độ mà tại đó S/N = 10.

Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đƣờng nền

Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụthuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đƣợc đo và nồng độ các chất phân tích.

Đường chuẩn: là đƣờng biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợngđƣợc đo và nồng độ các chất phân tích.

Để xác định khoảng tuyến tính ngƣời ta thực hiện đo các dung dịch chuẩn cónồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Sau đó vẽđƣờng cong sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu đƣợc vào nồng độ, quan sát sự phthuộc cho đến khi không còn tuyến tính [10][18].

Có thể xây dựng đƣờng chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trảnh hƣởng của nền mẫu đến kết quả phân tích.

Hệ số hồi quy tuyến tính (R): Chỉ số đầu tiên của một đƣờng chuẩn đạt yêcầu và hệ số tƣơng quan hồi quy (Coefficient of corelation), giá trị R phải đạt yêucầu sau: 0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R 2 ≤1.

Độ lặp lại và độ thu hồi.

Độ lặp lại (đánh giá độ chụm) là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ củcác phép đo lặp lại và đƣợc biểu diễn bằng độ lệch chuẩn SD và độ lệch chutƣơng đối RSD (%):







Trong đó:

xi: Nồng độ tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ i.

x : Nồng độ trung bình tính đƣợc của n lần thử nghiệm.

n: Số lần thử nghiệm.

Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực hoặc giá trịđƣợc chấp nhận. Độ đúng là khái niệm định tính và đƣợc biểu diễn định lƣợng dƣdạng độ thu hồi (recovery). Độ thu hồi (đánh giá độ đúng) là tỷ lệ phần trăm giữ

giá trị thu đƣợc so với giá trị lý thuyết [10][18].

R(%) = f

a

.100C

С (3).

Trong đó:

R: độ thu hồi (%)

Cf : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng xác định đƣợc (ng/ml). Ca : Nồng độ chuẩn thêm vào mẫu trắng (ng/ml).







CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu

Nguy cơ tiềm ẩn ngộ độc do các alkaloid độc trong thực phẩm chức năng cónguồn gốc thảo dƣợc đang đặt ra cho cơ quan thanh tra, kiểm tra thực phẩm cần c phƣơng pháp xác định chính xác các alkaloid độc để quản lý và cảnh báo đảm bảoan toàn và sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Phù hợp với thực tiễn, chúng tôi tiến hành xácđịnh hàm lƣợng một số alkaloid độc bao gồm (Brucin, Strychnin, Aconitin,Colchicin, Atropin, Scopolamin, Nicotin, Koumin) trongthực phẩm chức năng cónguồn gốc thảo dƣợc bằng sắc ký lỏng ghép nối khối phổ LC-MS/MS.

Mục tiêu tiến hành nghiên cứu của đề tài: Tối ƣu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để tách và xác định đồng thời

các alkaloid. Khảo sát, tối ƣu hóa quá trình xử lý mẫu. Thẩm định phƣơng pháp phân tích. Ứng dung phƣơng pháp để phân tích trên một số mẫu thực tế.

2.2Phƣơng pháp nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu của luận văn này bao gồm:

Phƣơng pháp tách chiết mẫu:

Qua tham khảo các nghiên cứu ở trên chúng tôi lựa phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng. Mẫu đƣợc thêm dung dịch kiềm để chuyển các alkaloid về dạng bazơ sau đcác alkaloid đƣợ c chiết vào pha dung môi hữu cơ.

Phƣơng phá p LC-MS/MS:

Mẫu sau khi tách chiết đƣợc đem đi phân tích trên hệ thống LC-MS/MS vớichế độ ion dƣơng nguồn ESI, cơ sở lý thuyết đã đƣợc nêu trong phần tổng qua Các kết quả đƣợc tính toán tự động theo phần mềm phân tích của thiết bị (phầmềm Analyst 1.5.1, ABSciex).







Phƣơng pháp thẩm định:

Để đánh giá phƣơng pháp chúng tôi tiến hành theo quy định của AOAC.

Phƣơng pháp thẩm định bao gồm: - Tính đặc hiệu, tính chọn lọc - Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng - Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn - Độ lặp lại và độ thu hồi

Phƣơng pháp lấy mẫu:

Đối tượng mẫu: Một số thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược

Phương pháp lấy mẫu: Ngẫu nhiên

Địa điểm: Một số hiệu thuốc trên địa bàn nội thành Hà Nội

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứ u

2.3.1 Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS bao gồm:+ Máy sắc ký lỏng của Shimadzu.Model 20 AD-UFLC.

+ Máy khối phổ.Model AB sciex Triplequard 5500

- Cột sắc ký InertSustain C18(150mm × 4,6mm × 5μm). Nƣớc sản xuất NhậtBản

- Máy lắc xoa y ( vortex) VELP.- Máy đồng nhất mẫu. - Máy ly tâm MIKRO 22R có thể đạt đƣợc tốc độ tối thiểu 4000 rpm với ống ly

tâm 50 mL.- Cân phân tích(có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg) (Metter Toledo).- Máy cất quay chân không có bể điều nhiệt EYELA

2.3.2 D ụng c ụ

- Cốc có mỏ dung tích 50, 100, 200mL.







- Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợ p trung gian 1-10 µg/mL trong methanolđể thu đƣợ c các dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 0,5-5; 1-10; 2-20; 5-50;10-100; 20-200; 50-500; 100-1000; 200-2000; 500-5000 ng/mL.

2.3.4 Các lo ại hóa ch ấ t, dung môi khác

- Methanol (Merck 99,9%), Acetonitril (Merck 99,9%), acid formic (Merck98%), acid acetic băng (Merck), amoniacetat (Merck), ethylacetat (Merck),ether (Merck), chloroform (Merck), NaOH (Merck), acid boric, …

- Nƣớ c cất hai lần- Dung dịch NaOH 0,1M: Cân 2g NaOH hòa tan và định mức bằng 500 mLnƣớ c cất hai lần.- Dung dịch KCl 0,1M: Cân 7,455g KCl hòa tan và định mức bằng 1000 mLnƣớ c cất hai lần.- Dung dịch đệm borat pH 9: Cân 3,09 g acid boric hòa tan hòa tan bằng 500mL dung dịch KCl 0,1M. Thêm tiế p 210 mL dung dịch NaOH 0,1M.- Dung dịch NH4OH 5%: hút chính xác 5 mL dung dịch NH4OH vào bình 100mL vàđịnh mức đến vạch bằng nƣớ c cất.







CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tối ƣu điều kiện tách và xác định các alkaloid trên thiết bị LC/MS/MS

3.1.1. Tối ưu các điều ki ện c ủa detector kh ố i ph ổ (M S/MS)

3.1.1.1. Khảo sát ion m ẹ và ion con

Qua tham khảo tài liệu chúng tôi tiến hành khảo sát xác định các alkaloid bằng kĩ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion dƣơng. Để tối ƣu hđiều kiện khối phổ, dùng kim bơm hỗn hợp các chất chuẩn 50 ng/mL tiêm trực tiếpvào detectorkhối phổ để khảo sát. Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng chấđể chọn đƣợc ion mẹ, ion con dùng để định lƣợng và định tính đối với từng chất các điều kiện bắn phá tƣơng ứng của từng mảnh nhƣ trong bảng :

Bảng 3.1: Các mảnh ion định lượng và định tính của các alkaloid

Tên chất phântích

Mảnh mẹ(m/z)

Mảnh con(m/z) CE (eV) CXP (V) Ghi chú

Brucin 395324 41 34 Định lƣợng 244 47 34 Định tính

Strychnin 335,2 184,2 51 18 Định lƣợng 156 53 20 Định tính

Aconitin 646,2586,2 43 34 Định lƣợng 526,2 51 28 Định tính

Atropin 290124 29 20 Định lƣợng 93 37 14 Định tính

Scopolamin 304138 29 18 Định lƣợng

156 21 20 Định tính

Koumin 307180 57 22 Định lƣợng 204 63 24 Định tính

Colchicin 400358 27 46 Định lƣợ ng310 33 20 Định tính

Nicotin 163132 19 18 Định lƣợng 130 29 24 Định tính







Trong đó: + CXP (Collision Cell Exit Potential): Thế áp giữa bộ tứ cực Q2 và Q3. + CE (Collision Energy): Là năng lƣợng va chạm đƣợc tạo ra do thế áp vào bộ

tứ cực Q2, tạo ra năng lƣợng để phân mảnh ion mẹ. Mảnh ion con m/z có cƣờng độ lớn nhất dùng để định lƣợng, mảnh con thứ

có cƣờng độ thấp hơn dùng để xác nhận chất phân tích.

Hình 3. 1: Sắc đồ tỷ lệ các ion của koumin và atropin

Kết luận: Sau khi tiến hành khảo sát, chúng tôi chọn đƣợc ion mẹ và ion conthích hợp cho các độc tố alkaliod tại các điều kiện MS nhƣ ở bảng3.1.

3.1.1.2. T ối ưu hóa các điều ki ện M S

Để tối ƣu hóa điều kiện MS cho từng chất, chúng tôi sử dụng kỹ thuật FIAnghĩa là hỗn hợp chuẩn đƣợc bơm trực tiếp váo máy MS cu ng vơ i do ng pha đô ngmà không qua cô t săc ky với điều kiện nhƣ sau : Pha động là dung dịch amoniacetat







10 mMtrong nƣớc : methanol (80:20), hỗn hợp chuẩn có nồng độ 50ng/mL, thểtích bơm 10µL, thời gian 1 phút.

Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng ion con định lƣợng và định tính củtừng chất.

Các thông số cho bộ phận tạo nguồn ion.

+ IS (IonSpray Voltage): Thế ion hóa, thế này đƣợc áp lên đầu phun và mànchắn của bộ phận phân tích ion. Thế này sẽ quyết định loại ion chuyển đến bộ ph phân tích khối. Đối với loại ion dƣơng 4000 – 5500V.

+ GS1 (Ion Source Gas 1): Tạo áp suất khí hai bên đầu phun, có tác dụnglàm cho sự hình thành nên các giọt đƣợc dễ dàng hơn. Tốc độ khí của Gas 1 thƣờncao hơn so với Gas 2.

+ TEM ( Temperature): Nhiệt độ của nguồn khí nóng thổi vào (Gas2). Nóthúc đẩy quá trình hóa hơi các giọt chất phân tích khi đi ra khỏi đầu phun.

+ GS2 (Ion Source Gas 2): Tạo áp suất của luồng khí nóng, hỗ trợ quá trình

làm bay hơi dung môi, tăng hiệu quả của quátrình ion hóa.+ CUR (Curtain Gas): Luồng khí N2 tinh khiết đƣợc thổi vào khe giữa 2 màn

chắn của bộ phận ion hóa và bộ phận phân tích phổ. Nó có tác dụng đẩy các giọdung môi và các phân tử trung hòa, để giữ cho Q0 (nguồn ion mẹ ) sạch hơn.

Các thôngsố của bộ phận phân phân tích khối: + DP, CE, CXP nhƣ đã giải thích ở trên.

+ EP (Entrance Potential): Thế áp vào nguồn ion mẹ Q0.+ CAD (Collision Gas Pressure): Kiểm soát áp suất khí N2 trong bộ tứ cực Q2,

thúc đẩy quá trình phân mảnh thứ cấp, ngoài ra còn có tác dụng làm mát các ion convà hƣớng chúng đến bộ tứ cực Q3.

Tự động khảo sát các thông số cho từng chất trên với các giá trị nhƣ sau: IS chế đô ion dƣơng(V):5000,0; 4500,0; 4000,0; 3500,0 TEM(oC) : 250,0; 300,0; 350,0; 400,0;450,0







GS1 (psi): 25,0; 30,0; 10,0;15,0 GS2 (psi): 8,0; 9,0; 10,0; 5,0; 2,0; CUR (psi): 15,0;20,0; 5,0; 10,0; DP (V) :110,0; 120,0; 100,0; 90,0; 80,0 EP (V) : 0;7,0; 8,0; 9,0; 10,0; 11,0 CAD (psi): 7,0; 8,0; 9,0; 5,0; 6,0

Qua khảo sát ta thu đƣợc giá trị tối ƣu của từng thông số trên cho cả các chấtnghiên cứu. Giá trị đƣợc liệt kê trong bảng 2

Bảng3.2:Các thông số tối ƣu MS/MS đối với chế đô ion dƣơng

Thông số Gía trị tối ƣu IS (V) 4500

TEM (oC) 500

GS1 (psi) 25

GS2 (psi) 20CUR (psi) 20

DP (V) 130

EP (V) 9CAD (psi) 7

Kết luận: Chúng tôi đã tiến hành khảo sát các điều kiện MS và đƣa ra đƣợc cáđiều kiện tối ƣu nhƣ trong bảng trên.

3.1.2. Tối ưu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

3.1.2.1. Lựa chọn cột tách

Cột tách là bộ phận quan trọng của hệ thống sắc ký, nó đóng góp một phầnquan trọng trong việc quyết định quá trình tách.Qua tham khảo các bài báo nênchúng tôi chọn cột tách là cột pha đảo. Hơn nữa, chất nhồi pha đảo sử dụng hệ dunmôi phân cực có tính kinh tế cao, phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệmTrong nghiên cứu này, chúng tôi chọn cột pha đảo C18 để tách các chất. Để bảo vệ







cột, chúng tôi sử dụng thêm tiền cột. Loại cột sử dụng là InertSustain C18 (5 μm;4,6 x 150mm) và tiền cột tƣơng ứng của hãng GL Sciences( Nhâ t Ba n).

3.1.2.2.

Khảo sát thành phần pha động Trong phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hƣởng

tới quá trình tách các chất mà nó còn ảnh hƣởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu củchất phân tích. Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion dƣơng, quátrình ion hóa tăng khi có thêm các chất nhƣ acid acetic, acid formic, amoni acetatedo vậy các chất này đƣợc sử dụng trong pha động. Bên cạnh đó, cột tách sử dụng lcột C18, ít phân cực nên pha động phải là hệ dung môi phân cực nên chúng tôichọn dung môi pha động là acetonitrile và methanol. Cố định các điều kiện sắc ký:

- Cột C18 (5μm; 4,6 x 150mm) và tiền cột tƣơng ứng - Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút- Mẫu phân tích: hỗn hợp chuẩn nồng độ: 5-50 ng/mL

và tiến hành khảo sát theo chế độ gradient hai kênhA và B theo các hệ sau:

Bảng 3.3: Các hệ dung môi pha động khảo sát Kênh A Kênh B

Hệ 1 Methanol CH3COOH 0,1 %Hệ 2 Methanol HCOOH 0,1 %

Hệ 3 Methanol CH3COONH4 10 mMHệ 4 Acetonitril CH3COONH4 10 mM

XIC of +MRM(18 pairs): 646.200/586.200 Da ID: Anconitine1 fromSample 10 (Std Mix 5-10ppb-MeOH+0.1%CH3COOH) of DataSET1valid.wiff (T... Max. 1.0e6 cps.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5Time, min

0.0

2.0e5

4.0e5

6.0e5

8.0e5

1.0e6

1.2e6

1.4e6

1.6e6

1.8e6

2.0e6

2.2e6

2.4e6

2.6e6

2.8e6

3.0e6

3.2e6

3.4e6

3.6e6

3.8e6

4.0e6

4.2e6

4.4e6

4.6e64.8e6

5.0e6

I n

t e n s

i t y

, c p s

10.75

Hình 3.2: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng hệ dung môi pha động 1







XIC of +MRM(18 pairs): 646.200/586.200 Da ID: Anconitine1 fromSample 8 (Std Mix 5-10ppb-MeOH+0.1%HCOOH) of DataSET1valid.wiff (Turbo... Max. 1.1e6 cps.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5Time, min

0.0

2.0e5

4.0e5

6.0e5

8.0e5

1.0e6

1.2e6

1.4e6

1.6e6

1.8e6

2.0e6

2.2e6

2.4e6

2.6e6

2.8e6

3.0e6

3.2e6

3.4e6

3.6e6

3.8e6

4.0e6

4.2e6

4.4e6

4.6e6

4.8e6

I n

t e n

s i t

y ,

c p s

11.34

Hình 3.3: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng hệ dung môi pha động 2XIC of +MRM(18 pairs): 646.200/586.200 Da ID: Anconitine1 fromSample 14 (Std Mix 5-10ppb-MeOH+CH3COONH4 10mM) of DataSET1valid.wi... Max. 1.8e6 cps.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0Time, min

0.0

5.0e5

1.0e6

1.5e6

2.0e6

2.5e6

3.0e6

3.5e6

4.0e6

4.5e6

5.0e6

5.5e6

I n

t e n s

i t y

, c p s

11.07

Hình 3.4: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng hệ dung môi pha động 3XIC of +MRM(18 pairs): 646.200/586.200 Da ID: Anconitine1 fromSample 16 (Std Mix 5-10ppb-ACN+CH3COONH4 10mM) of DataSET1valid.wiff ... Max. 1.8e6 cps.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5Time, min

0.0

2.0e5

4.0e5

6.0e5

8.0e5

1.0e6

1.2e6

1.4e6

1.6e6

1.8e6

2.0e6

2.2e6

2.4e6

2.6e6

2.8e6

3.0e6

3.2e6

3.4e6

3.6e6

3.8e6

4.0e6

I n

t e n s

i t y

, c p s

10.26

Hình 3.5: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng hệ dung môi pha động 4

Ghi chú:







Bảng 3.4: Diện tích các alkaloid khi sử dụng các hệ dung môi khác nhau

Hệ phađộng

Diện tích píc Anconitin Atropin Brucin Colchicin Koumin Nicotin Scopolamin Strychnin

Hệ 1 5930000 39800000 31800000 20600000 24200000 3840000033400000 34100000Hệ 2 7180000 40200000 28600000 21700000 2470000044900000 29100000 32800000Hệ 3 15700000 52000000 36700000 47600000 388000009000000 14400000 41800000Hệ 4 10600000 27800000 18600000 22900000 15600000 2460000 15300000 2090000

Nhận xét : Khi sử dụng hệ pha động là methanol và acid formic 0,1 % hoặchệ pha động methanol và acid acetic 0,1 % thì các chất tách ra khỏi nhau khá tốt tuy

nhiên một số píc bị chẻ. Sử dụng hệ pha động gồm acetonitril và amoniacetat 10mM các píc nhọn và cân đối nhƣng diện tích các píc nhỏ, do vậy lựa chọn hệ phađộng gồm methanol và amoniacetat 10 mM cho píc cân đối và diện tích píc là lớnnhất cho đa số chất phân tích trừ nicotin và scopolamin.

3.1.2.3. Khảo sát chương trình gradient

Thực hiện tách và xác định đồng thời 8 hợp chất sử dụng chế độ rửa giả

đẳng dòng (isocractic) là không phù hợp. Hơn nữa để có thể vừa tách đƣợc các chất,vừa tiết kiệm đƣợc thời gian phân tích và dung môi, chúng tôi tiến hành chạy phađộng với chế độ gradient. Chúng tôi tiến hành khảo sát một số chƣơng trình rửgiải gradient. Cố định các điều kiện sắc ký:

- Cột C18 (5μm; 4,6 x 150mm) và tiền cột tƣơng ứng - Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút

- Mẫu phân tích: hỗn hợp chuẩn nồng độ: 5-50 ng/mL- Dung môi pha động kênh A: CH3COONH4 (10mM), kênh B: MeOH

Khảo sát một số chƣơng trình gradient nhƣ trong bảng:







XIC of +MRM (18 pai rs): 646.200/586.200 Da I D: Anconi ti ne1 f rom Sampl e 2 (Std Mi x5-50ppb-Grad2) of DataSET1. wi ff (Turbo Spray) Max. 1.2e6 cps.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0Time, min

0.0

2.0e5

4.0e5

6.0e5

8.0e5

1.0e6

1.2e6

1.4e6

1.6e6

1.8e6

2.0e6

2.2e6

2.4e6

2.6e6

2.8e6

3.0e6

3.2e6

3.4e6

3.6e6

3.8e6

4.0e6

4.2e6

4.4e6

4.6e6

4.8e6

5.0e6

I n

t e n s

i t y

, c p s

11.66

12.70

XIC of +MRM (18 pai rs): 646.200/ 586. 200 Da ID: Anconi ti ne1 f rom Sampl e 3 (Std Mi x5-50ppb-Grad3) of Dat aSET1.wi ff ( Tur bo Spray) Max. 1.3e6 cps.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0Time, min

0.0

5.0e5

1.0e6

1.5e6

2.0e6

2.5e6

3.0e6

3.5e6

4.0e6

4.5e6

5.0e6

5.5e6

I n

t e n s

i t y ,

c p s

10.98

Bảng 3.5: Các chương trình gradient khảo sát

Grad1 Grad2 Grad3

t(phút)

%kênh B

%kênh A

t(phút

)%

kênh B% kênh

A

t(phút

)% kênh

B% kênh

A0,01 5 95 0,01 20 80 0,01 20 801,5 5 95 1,5 20 80 1,5 20 808,0 100 0 8,0 100 0 6,5 100 013,0 100 0 13,0 100 0 10,5 100 013,01 5 95 13,01 20 80 10,51 20 8016,5 5 95 16,5 20 80 13,0 20 80

Grad4 Grad5

t (phút)% kênh

B% kênh

At

(phút)% kênh

B% kênh

A0,01 20 80 0,01 20 801,5 20 80 1,0 20 806,5 80 20 3,5 80 20

10,5 80 20 4,5 80 2010,51 20 80 5,51 100 013,0 20 80 10,0 100 0

10,01 20 8013,0 20 80

Hình 3.6: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng chương trình gradient 1








XIC of +MRM (18 pai rs): 646. 200/ 586. 200 Da ID: Anconi ti ne1 f rom Sampl e 5 (Std Mi x5-50ppb-Grad7) of DataSET2.wi ff (Turbo Spray) Max. 2.0e5 cps.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5Time, min

0.00

5.00e4

1.00e5

1.50e5

2.00e5

2.50e5

3.00e5

3.50e5

4.00e5

4.50e5

5.00e5

5.50e5

6.00e5

6.50e5

7.00e5

7.50e5

8.00e5

8.50e5

9.00e5

9.50e5

1.00e6

1.05e6

I n

t e n s

i t y

, c p s

9.70

XI C of +MRM (18 pai rs): 646.200/586.200 Da ID: Anconi ti ne1 f rom Sampl e 10 (Std Mi x5-50ppb- Gr ad6) of DataSET1.wi ff (Tur bo Spray) Max. 1.1e6 cps.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5Time, min

0.0

5.0e5

1.0e6

1.5e6

2.0e6

2.5e6

3.0e6

3.5e6

4.0e6

4.5e6

5.0e6

5.5e6

I n

t e n s

i t y

, c p s

10.48

11.52

Hình 3.8: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng chương trình gradient 3 XI C of +MRM (18 pai rs): 646.200/586.200 Da ID: Anconi ti ne1 f rom Sampl e 8 ( Std Mi x5-50ppb-Grad5) of DataSET1.wi ff (Turbo Spray) Max. 1.4e6 cps.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5Time, min

0.0

2.0e5

4.0e5

6.0e5

8.0e5

1.0e6

1.2e6

1.4e6

1.6e6

1.8e6

2.0e6

2.2e6

2.4e6

2.6e6

2.8e6

3.0e6

3.2e6

3.4e6

3.6e6

3.8e6

4.0e6

4.2e6

4.4e6

4.6e64.7e6

I n

t e n s

i t y

, c p s

11.63



Ghi chú:







Nhận xét : Khi sử dụng chƣơng trình chạy gradient 1 thì thời gian chất phântích ra muộn, các chất phân tích bắt đầu rửa giải ở 11 phút. Do vậy chúng tôi tiếnhành ngắt bớt quá trình gradient giai đoạn đầu, tăng nhanh nồng độ methanol tronggradient 2 và 3. Khi tăng nhanh nồng độ methanol thì các chất phân tích ra sớm hơntuy nhiên các pic sắc ký bị vai, không sắc nhọn, rõ nét. Chúng tôi tiếp tục khảo sátgradient 4 giảm nồng độ methanol cho kết quả các pic sắc ký nhọn rõ nét hơn tuynhiên thời gian chất phân tích ra lại giảm. Tiếp tục khảo sát kéo dài thời gian tăngnồng độ methanol lên theo chƣơng trìnhgradient 5.Kết quả cho tín hiệu pic đẹp,các chất đƣợc tách ra khỏi nhau khá tốt , pic thu đƣợc không bị tù, không bị chẻ píc

và thời gian lƣu của các chất không quá dài. Nhƣ vậy, việc thay đổi thành phầnACN trong pha động cần phải tiến hành chậm. Chúng tôi quyết định chọn chƣơntrình rửa giải gradient 5. Cácalkaloidđƣợc rửa giải trong khoảng từ 8-10 phút.Toàn bộ quá trình tách và xác định đƣợc thực hiện trong 13 phút.

3.1.2.4. Khảo sát tốc độdòng pha động

Tốc độ pha động ảnh hƣởng đến thời gian rửa giải và lƣợng dung môi tiêu

tốn. Đặc biệt, với kỹ thuật LC-MS/MS, tốc độ dòng ảnh hƣởng rất nhiều. Nếu tốcđộ dòng lớn thì quá trình bay hơi dung môi để tạo ion sẽ kém hiệu quả ảnh hƣởnđến độ nhạy của chất phân tíchgiảm. Nếu tốc độ dòng quá nhỏ, thời gian phân tíchkéo dàihơn nữa chƣơng trình gradient có thể kém ổn định ảnh hƣởng đến độ lặp lạicủa phƣơng pháp. Do vậy chúng tôi tiến hành khảo sát ở tốc độ pha động 0,4mL/phút; 0,5 mL/phút; 0,6 mL/phút và cố định các điều kiện:

-

Cột C18 (5μm; 4,6 x 150mm) và tiền cột tƣơng ứng- Dung môi pha động kênh A: CH3COONH4 (10mM), kênh B: MeOH- Chƣơng trình gradient nhƣ trên - Mẫu phân tích: hỗn hợp chuẩn nồng độ: 5-50 ng/mL







XIC of +MRM(18 pairs): 646.200/586.200 Da ID: Anconitine1 fromSample 12 (Std Mix 5-50ppb-CH3COONH4-TF 0.4ml/phut) of DataSET2.wiff (T... Max. 2.0e5 cps.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5Time, min

0.00

5.00e4

1.00e5

1.50e5

2.00e5

2.50e5

3.00e5

3.50e5

4.00e5

4.50e5

5.00e5

5.50e5

6.00e5

6.50e5

7.00e5

7.50e5

8.00e5

8.50e59.00e5

9.50e5

1.00e6

1.05e6

1.10e6

I n

t e n s

i t y

, c p s

11.00

XIC of +MRM(18 pai rs): 646.200/586.200 Da ID: Anconi tine1 f romSample 5 (Std Mix5-50ppb-Grad7) of DataSET2.wi ff (Turbo Spray) Max. 2.0e5 cps.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0Time, min

0.00

5.00e4

1.00e5

1.50e5

2.00e5

2.50e5

3.00e5

3.50e5

4.00e5

4.50e5

5.00e5

5.50e5

6.00e5

6.50e5

7.00e5

7.50e5

8.00e5

8.50e5

9.00e5

9.50e5

1.00e6

1.05e6

I n

t e n s

i t y

, c p s

9.70

XIC of +MRM(18 pairs): 646.200/586.200 Da ID: Anconitine1 fromSample 11 (Std Mix 5-50ppb-CH3COONH4-TF 0.6ml/phut) of DataSET2.wiff (T... Max. 1.5e5 cps.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5Time, min

0.0

5.0e4

1.0e5

1.5e5

2.0e5

2.5e5

3.0e5

3.5e5

4.0e5

4.5e5

5.0e5

5.5e5

6.0e5

6.5e5

7.0e5

7.5e5

8.0e5

8.5e5

9.0e59.3e5

I n

t e n s

i t y

, c p s

8.78

Hình 3.11: Sắc đồ ion tổng tại tốc độ dòng 0,6 m L/phút

Hình 3.12:Sắc đồ ion tổng tại tốc độ dòng 0,5 mL/phút

Hình 3.13: Sắc đồ ion tổng tại tốc độ dòng 0,4 m L/phút

Ghi chú:







Nhận xét : Khi tăng tốc độ dòng của pha động, các pic sắc ký có xu hƣớng nhọn vàrõ nét nhƣng diện tích píc lại giảm. Do quá trình bay hơi dung môi để tạo ion kémhiệu quả khi tăng tốc độ dòng. Tại tốc độ dòng 0,4mL/phútdiện tích píc của cácchất lớn nhất nhƣng các pic bị kéo chân về phía sau. Do đó, chúng tôi quyết địnhlựa chọn tốc độ dòng 0,5 mL/phút. Tại tốc độ này, các alkaloid bắt đầu đƣợc rửagiải từ 8 phút.

3.1.2.5. Khảo sát thành phần amoniacetat trong pha động

Trong phƣơng pháp sắc k ý lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hƣởng tớiquá trình tách các chất mà nó còn ảnh hƣởng tới quá trình ion hóa do đó ảnh hƣởngđến tín hiệu của chất phân tích. Pha động trong phƣơng pháp sử dụng amoniacetatgiúp quá trình ion hóa của chất phân tích hiệu quả hơn tuy nhiên với hàm lƣợngamoniacetat quá cao có thể làm giảm tuổi thọ cột phân tích. Do vậychúng tôi khảosát nồng độ amoniacetat trong kênh A, với hàm lƣợng 5 mM, 10 mM, 20 Mm. Cốđịnh các điều kiện sắc ký:

- Cột C18 (5μm; 4,6 x 150mm) và tiền cột tƣơng ứng

- Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút- Chƣơng trình gradient nhƣ trên - Mẫu phân tích: hỗn hợp chuẩn nồng độ: 5-50 ng/mL

Bảng 3.6 : Ảnh hưởng nồng độ amoniacetat tới diện tích píc các alkaloid

Nồng độ

Diện tích píc

Anconitin Atropin Brucin Colchicin Koumin Nicotin Scopolamin Strychnin5 mM 1370000 7910000 3260000 5710000 7650000 749000 3280000 831000010 mM 1440000 7770000 4390000 6640000 7340000 359000 3810000 910000020 mM 1370000 6740000 6320000 6110000 6080000 319000 3180000 9040000







Hình 3.14 : Biểu đồ sự phụ thuộc diện tích píc của các alkaloid vào nồng độamoniacetat trong pha động

Nhận xét: Kết quả cho thấy ở nồng độ 10 mM cho diện tích píc sắc ký cácakaloid lớn nhất, ở nồng độ 5 mM cũng cho diện tích píc sắc ký của một số chấ phân tích lớn tuy nhiên hình dạng các píc sắc ký không cân đối. Do vậy chúng tôi

lựa chọn nồng độ amoniacetat là 10 mM. 3.2. Tối ƣu quá trình xử lý mẫu

Alkaloid là các bazơ yếu, do sự có mặt của nguyên tử N. Nhƣng độ kiềm củaalkaloid không giống nhau do ảnh hƣởng khác nhau của lớp điện tích nguyên tử Ngây ra và ảnh hƣởng của các nhóm chức khác.Tính bazơ giảm dần theo thứ tựamoni bậc 4, amoni bậc 1,amoni bậc 2,amoni bậc 3. Tính bazơ phản ánh ở pKa

khác nhau của các alkaloid, các bazơ yếu có trị số pKa thấp. Một số alkaloid có tính bazơ mạnh có thể tồn tại ở dạng muối trong môi trƣờng acid. Các muốialkaloid nóichung tan đƣợc trong nƣớc và cồn nhƣng hầu nhƣ không tan trong dung môi hữu cnhƣ: chloroform, eter, benzen. Ngƣợc lại hầu hết cácalkaloiddạng bazơ thực tếkhông tan trong nƣớc nhƣng tan trong các dung môi hữu cơ nhƣ CHCl3, eter và cácancol bậc thấp (MeOH, EtOH, PrOH, BuOH). Dựa vào đặc điểm này có thể táchchiết các alkaloid.







Qua tham kha o chu ng tôi l ựa chọn chiết mẫu theo phƣơng pháp lỏng – lỏng,dựa trên nguyên tắc: Các alkaloid đƣợc kiềm hóa sau đó đƣợc chiết bằng dung môhữu cơ và đem đi phân tích, quá trình chiết mẫu theo qui trình dự kiến nhƣ sau:

+ 1 ml đệm acid boric pH 9

+ 10 ml dun môi chi ết

Lắc votex 5 phút

Cân 0,5 g m ẫu/ống ly tâm 50 ml

Hòa c n b ng 5ml methanol

Ly tâm 5 phút, t ốc độ 6000 vòng/phút

Gạn d ịch vào bình cô, cô quay ở 50 C

Vial, LC-MS/MS

Lọc qua màng 0,2 µm

Hình 3.15: Sơ đồ quy tr nh chiết mâ u dư kiến

Từ qui trình dự kiến ở trên, chúng tôi thấy cần phải khảo sát dung môi chiết

và dung dịch kiềm hóa phù hợp để thu đƣợc hiệu suất chiết tối ƣu. Chúng tôi tiếhành khảo sát một số điều kiện chiết nhƣ sau:

3.2.1. Khảo sát dung môi chiết

Dung môi chiết là một yếu tố vô cùng quan trọng quyết định hiệu suất củaquá trình xử lý mẫu.Do cácalkaloid ở đây đƣợc đƣa về dạng bazơ bằng dung dịchđệm borat pH 9 nên chúng tôi tiến hành khảo sát trên các dung môi hữu cơ ít phân







cực: eter, ethylacetat, chloroform, methanol và acetonitril.Cố đi nh ca c bƣơ c chiêtkhác nhƣ quy trình trên s ử dụng nền mẫu thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảdƣợc không phát hiện ca c alkaloid. Sau khi cân mẫu, thêm25 µLdung dịch chuẩnhỗn hợp1-10 µg/mL các alkaloid (để thu đƣợc nồng độalkaloidtrong dịch cuối là 5 ng/mL đối vớinicotin, scopolamin, atropin và 50 ng/mLđối với brucin, strychnin,koumin, aconitin, colchicintrong dịch chiết cuối cùng trƣớc khi bơm vào máyLC/MS/MS). Để yên 5 phút. Tiến hành chiết lặp hai lần theo qui trình trên thu đƣơ ckêt qua trung bìnhnhƣ bảngsau:

Bảng 3.7 : Ảnh hƣởng của dung môi chiết đến hiệu suất chiết các alkaloid

Hiệu suất (%) Anconitin Atropin Brucin Colchicin Koumin Nicotin Scopolamin Strychnieter+1mLđệm pH9 97,8 4,08 1,52 22,1 47,9 50,4 42,6 19,3

ethylacetat+1mLđệm H9 79,9 25,0 49,3 76,2 72,9 106 71,8 63,2

CHCl3+1mLđệm pH9 19,4 64,5 49,3 30,4 41,9 109 55,9 31,4

ACN+1mLđệm pH9 8,1 59,6 47,4 28,5 30,5 84,5 50,4 25,8

MeOH+1mLđệm pH9 7,8 34,6 29,7 21,7 27,7 63,8 46,0 20,1

Hình 3.16 :Biểu đồ ảnh hƣởng củadung môichiết đến hiệu suất chiết cácalkaloid







Nhận xét : Sử dụng dung môi chiết là ethylacetat cho hiệu suất chiết cao đốivới đa số các alkaloid trừ atropin trong khi sử dụng dung môi chiết là chloroform thìcho hiệu suất chiết của atropin cao nhất. Do vậy chúng tôi sử dụng cả hai loại dunmôi chiết này để có thể thu đƣợc hiệu suất chiết cao nhất đối với tất cả các alkalonghiên cứu. Nhƣ vậy mẫu sau khi đƣợc kiềm hóa đƣợc chiết bằng 10 mLethylacetat, thu phần dung môi hữu cơ phía trên, phần dịch phía dƣới đƣợc chiết lặpnhƣ trên với 10 mL chloroform. Gộp dịch chiết hai lần đem cô quay chân không và phân tích.

3.2.2. Khảo sát dung dịch kiềm hóa

Dung dịch kiềm hóa đóng vai trò chuyển các alkaloid về dạng bazơ do vậy ảnh hƣởng đến hiệu suất chiết của các alkaloid vào pha hữu cơ . Do vậy chúng tôitiến hành khảo sát một số dung dịch kiềm phổ biến dùng trong chiết alkaloid từdƣợc liệu: dung dịch NaOH 0,1 N, dung dịch NH4OH 5%và dung dịch đệm borat pH 9.Cô đi nh các bƣớc chiết khác nhƣ quy trình trên s ử dụng nền mẫu thực phẩmchức năng có nguồn gốc thảo dƣợc không phát hiện ca c alkaloid . Sau khi cân mẫu,

thêm 25 µLdung dịch chuẩn hỗn hợp 1-10 µg/mLcác alkaloid (để thu đƣợc nồng độalkaloid trong dịch cuối là 5 ng/mLđối với nicotin, scopolamin, atropin và 50ng/mLđối với brucin, strychnin, koumin, aconitin, colchicin trong dịch chiết cuốicùng trƣớc khi bơm vào máy LC/MS/MS). Để yên 5 phút. Thêm 1 mLcác dung dịchkiềm hóa. Tiến hành chiết lặp hai lần theo qui trình trên thu đƣơ c kêt qua trung bình nhƣ bảng sau:

Bảng 3.8 :Ảnh hƣởng của dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các alkaloid Hiệu suất

(%) Anconitin Atropin Brucin Colchicin Koumin Nicotin Scopolamin Strychnin

NaOH 0,1N 33 45 54 80 56 50 73 39

NH4OH 5% 83 74 80 116 112 103 120 95Acid boric

pH9 79 60 68 106 103 115 112 80







Hình 3.17 :Biểu đồ ảnh hƣởng của dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết cácalkaloid

Nhận xét : So sánhhiệu suất chiết của các chất phân tích cho thấy hiệu suấtchiết của hầu hết các alkaloid trừ nicotin đều cao hơn khi sử dụng dung dịch kiềmhóa là dung dịch NH4OH 5%. Do vậy chúng tôi lựa chọn dung dịch kiềm hóa làdung dịch NH4OH 5%.

3.2.3. Khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa

Đê kha o sa t a nh hƣơ ng của thể tích dung dịch kiềm hóa NH4OH 5% lênhiệu suất chiết các chất phân tích chúng tôi cố định các điều kiện chiết ở trên vàthay đổi thể tích dung dịch NH4OH 5%thêm vào lần lƣợt là 0,5; 1,0 và 2 mL. Tiến

hành làm lặp hai lần và lấy kết quả trung bình thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.9: Ảnh hƣởng của thể tích dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các alkaloi

Hiệusuất(%) Anconitin Atropin Brucin Colchicin Koumin Nicotin Scopolamin Strychn

0,5 L 32 83 48 79 52 55 84 381 mL 83 112 72 108 108 97 108 892 mL 29 60 51 73 52 49 76 39







Nhận xét : Từ bảng trên cho thấy khi sử dụng 0,5 mLdung dịch kiềm hóa chohiệu suất chiết một số chất thấp do chƣa đƣợc kiềm hóa hoàn toàn. Khi sử dụngmL dung dịch kiềm hóa thì hiệu suất chiết giảm đi rõ dệt do thể tích pha nƣớc lúcnày tăng lên làm giảm hiệu suất chiết vào pha hữu cơ. Khi dùng1 mL dung dịchkiềm hóa cho hiệu suất chiết của tất cả các chất là cao nhất do vậy chúng tôi sdụng 1mL dung dịch NH4OH 5% để kiềm hóa.

Kết luận: Vậy quy trình chiết tối ƣu của các alkaloid nhƣ sau:

C h i ế

t l ầ n 2

+ 1 ml NH4OH 5%

+ 10 ml ethylacetat

Lắc votex 5 phút

Cân 0,5g m ẫu/ống ly tâm 50 ml

Hòa cắn bằng 5ml methanol

Ly tâm 5 phút, t ốc độ 6000 vòng/phút

Gạn dịch vào bình cô, cô quay ở 50 C

Bã + 10 ml CHCl 3

Vial, LC-MS/MS

Lọc qua màng 0,2 µm

Hình 3.18 : Quy trình chiết mâ u tối ƣu







3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích

3.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc

Để khẳng định phƣơng pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu/chọn lọc cao, chúngtôi đã tiến hành phân tích các mẫu trắng. Kết quả cho thấy mẫu trắng không có tínhiệu tại thời gian lƣu của chất phân tích. Mặt khác từ bảng 3.1 cho thấy tất cả cácalkaloid nghiên cứu đều có 1 ion mẹ bắn phá ra 2 ion con nên số điểm IP là 4 đạt theoyêu cầu của AOAC về điểm nhận dạng IP đối với kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ 2 l. Nhƣ vậy, phƣơng pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu đáp ứng đƣợc yêu cầu.

Hình 3.19: Sắc đồ chuẩn alkaloid, mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn







3.3.2. Kh ảo sát kho ảng tuy ế n tính vàl ập đườ ng chu ẩ n3.3.2.1. Khảo sát kho ảng tuyế n tính

Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợ p trung gian 1-10 µg/mL trong methanolđểthu đƣợc các dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 0,5-5; 1-10; 2-20; 5-50; 10-100; 20-200; 50-500; 100-1000 ng/mL; 200-2000 ng/mL; 500-5000 ng/mL. Tiến hành chạymáy với các điều kiện tối ƣu ở trên. Vẽ đồ thị mối tƣơng quan tuyến tính giữa diệntích pic và nồng độ chuẩn, thu đƣợc các kết quả sau :

Hình 3.20: Mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độAtropintrong khoảng 0,5-100ng/mL

Hình 3.21: Mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độaconitin trongkhoảng 5-1000 ng/mL

Kết luận : Khoảng tuyến tính từ5÷1000 ng/mLvới các chất brucin,strychnin, koumin, aconitin, colchicin;khoảng tuyến tính từ0,5 ÷ 100 ng/mLvới







các chấtnicotin, atropin và scopolamin. Tất cả đều cho hệ số tƣơng quan R >0,9990, khoảng tuyến của cácalkaloid làrộng. Do đó, chúng tôi tiến hành lậpđƣờng chuẩn cácalkaloidnằm trong khoảng tuyến tính của các chất.

3.3.2.2. Đườ ng chu ẩ n

Lập mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ cácalkaloid, thuđƣợc kết quả sau:

Bảng 3.10: Đƣờng chuẩn cácalkaloid

Chất phân tích Khoảng nồng độ (ng/mL) Phƣơng trình hồi quy Hệ số tƣơng quan R Brucin 10 ÷ 500 y = 15200x + 70700 1,0000

Strychnin 10 ÷ 500 y = 15100x + 9930 0,9999

Aconitin 10 ÷ 500 y = 1640x +2670 0,9996Atropin 1 ÷ 50 y = 12600x - 5780 0,9999

Scopolamin 1 ÷ 50 y = 72500x +59300 0,9999

Koumin 10 ÷ 500 y = 14200x + 27800 0,9999

Colchicin 10 ÷ 500 y = 9250x - 8460 0,9997 Nicotin 1 ÷ 50 y = 40400x + 35000 0,9998

Nhận xét : Diện tíchAlkaloidtỉ lệ tuyến tính với nồng độ trong khoảng tuyếntínhvới hệ số tƣơng quan R 2 > 0,999đối vơ i tất ca ca c chất.

Hình 3.22: Đƣờng chuẩnScopolamin (R 2 = 0,9999)







3.3.3. Giớ i hạn phát hiện (LOD), giớ i hạn định lƣợ ng (LOQ) củaphƣơng pháp

Thêm các nồng độ nhỏ dần của hỗn hợp8 Alkaloidvào dịch chiết mẫu trắng(mẫu thực không phát hiện chất phân tích cho đến khi thu đƣợc tỷ số tín hiệu/nhiễ(S/N) = 3, thu đƣợc kết quả LOD, LOQ của cácAlkaloidnhƣ sau:

Bảng 3.11: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các alkaloid

Chất phân tích LOD

trên dịch chiết

(ng/mL)

LOD của phƣơng pháp

(µg/kg)

LOQtrên dịch chiết

(ng/mL)

LOQ của phƣơng pháp

(µg/kg)Brucin 0,3 3,0 1,0 10

Strychnin 1,0 10 3,3 33Aconitin 1,0 10 3,3 33

Atropin 0,1 1,0 0,3 3,3

Scopolamin 0,1 1,0 0,3 3,3Koumin 1,0 10 3,3 33

Colchicin 1,0 10 3,3 33

Nicotin 0,1 1,0 0,3 3,3 Nhận xét: Giới hạn phát hiện của cácAlkaloidtƣơng đối thấp (1 ÷ 10 µg/kg)

giá trị LOD của các chất là nhỏ so với giá trị LD50 của các alkaloid( bảng1.20)vànhỏ hơn liều dùng làm thuốc đố i vơ i colchicin va strychnin do vâ y phƣơng pháp cóđộ nhạy đáp ứng yêu cầu phân tích.

Hình 3.23: Sắc đồ của nicotin tại giới hạn phát hiện LOD 1,0 µg/kg (S/N = 3,6)







Hình 3.24: Sắc đồ của Brucin tại giới hạn định lƣợng LOQ 10 µg/kg (S/N = 11,5)

3.3.4. Đánh giá độ lặp lại và độ thu hồi

Để đánh giá hiệu quả của phƣơng pháp phân tích chúng tôi tiến hành xácđịnh độ lặp lại và độ thu hồi của phƣơng pháp. Để tiến hành xác định hai yếu tnày, chúng tôi tiến hành thêm chuẩn trên nền mẫu thực phẩm chức năng không pháthiệnAlkaloid, thêm chuẩn tại 3 mức nồng độ 5-50 ng/mL, 10-100 ng/mL và 20-200ng/ml tƣơng ứng trên nền mẫu là:0,05-0,5 mg/kg; 0,1-1 mg/kg; 0,2-2 mg/kg. Mỗimức chúng tôi tiến hành làm lặp lại 6 lần. Độ thu hồi tính theo công thức (3) và độlặp lại đƣợc xác định theo các đại lƣợng SD và RSD theo công thức (1),(2) kết quả

thu đƣợc nhƣ bảng dƣới đây.







Bảng 3.12:Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các Alkaloid trên nền mẫu thực phẩmchức năng tại nồng độ50-500 µg/kg (0,05-0,5 mg/kg)

Chất PT Thôngsố M 1 M 2 M3 M 4 M 5 M 6 Trungbình SD RSD

AnconitinC

(µg/kg) 460,5 418,9 453,1 435,7 439,7 434,5 440,4 14,7 3,3

H (%) 92,1 83,8 90,6 87,1 87,9 86,9

AtropinC

(µg/kg) 42,3 43,7 45,8 43,1 42,8 44,5 43,0 2,0 4,5

H (%) 80,6 83,4 91,6 86,2 85,6 89

BrucinC

(µg/kg) 501,0 482,5 481,2 490 468,1 401,0 470,6 35,8 7,6

H (%) 100,2 96,5 96,2 98,0 93,6 80,2

ColchicinC

(µg/kg) 474,0 405,0 426,8 481,3 457,3 475,5 453,3 30,8 6,8

H (%) 94,8 81,0 85,4 96,3 91,5 95,1

KouminC

(µg/kg) 507,0 496,1 490,4 487,1 480,8 485,4 491,1 9,3 1,9

H (%) 101,4 99,2 98,1 97,4 96,2 97,1

NicotinC

(µg/kg) 46,0 43,4 40,5 41,6 43,5 44,5 43,3 2,0 4,6

H (%) 92,0 86,8 81,0 83,2 87,0 89,0Scopolamin

C(µg/kg) 40,5 48,1 41,1 40,0 43,2 44,4 42,9 3,1 7,1

H (%) 81,0 96,2 82,2 80,0 86,4 88,8

StrychninC

(µg/kg) 480,6 458,5 400,7 415,5 437,5 483,2 446,0 34,0 7,6

H (%) 96,1 91,7 80,1 83,1 87,5 96,6







Hình 3.25: Sắc đồ brucin trongmẫu thực phẩm chức năng thêm chuẩn tại mức nồngđộ 500 µg/kg

Bảng 3.13: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của cácAlkaloidtrên nền mẫu thực phẩmchức năng tại nồng độ0,1-1 mg/kg

Chất PT Thông

số M 1 M 2 M3 M 4 M 5 M 6 Trung

bìnhSD RSD

AnconitinC

(mg/kg) 1,03 0,86 0,91 0,95 0,94 0,81 0,92 0,08 8,5

H (%) 103,0 85,9 91,0 95,2 94,0 80,6

AtropinC

(mg/kg) 0,088 0,093 0,090 0,096 0,098 0,098 0,09 0,004 4,5

H (%) 88,0 93,0 90,0 95,7 98,4 97,5

BrucinC

(mg/kg) 1,06 1,05 1,00 1,03 0,94 0,81 0,98 0,09 9,6

H (%) 106 105 100 103 94,2 81,0

Colchicin C(mg/kg) 1,09 0,99 1,04 0,99 0,99 0,85 0,99 0,08 8,1

H (%) 109 98,5 104 99,0 98,8 84,9

KouminC

(mg/kg) 0,84 1,02 0,92 0,98 0,93 0,92 0,93 0,06 6,6

H (%) 83,9 102 92,0 98,0 92,5 91,7

NicotinC

(mg/kg) 0,095 0,095 0,087 0,087 0,100 0,084 0,09 0,01 6,7

H (%) 94,7 95,3 87,2 87,1 100 84,2







ScopolaminC

(mg/kg) 0,105 0,101 0,092 0,098 0,104 0,094 0,10 0,01 5,5

H (%) 105 101 91,9 97,6 104 93,6

StrychninC

(mg/kg) 1,10 0,90 0,99 0,99 1,07 0,92 1,00 0,08 7,9H (%) 110 90,0 99,0 99,4 107 92,0

Hình 3.26: Sắc đồ atropin trongmẫu thực phẩm chức năng thêm chuẩn tại mức nồng

độ 0,1 mg/kgBảng 3.14: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các Alkaloid trên nền mẫu thực phẩm

chức năng tại nồng độ 0,2-2 mg/kg

Chất PT Thôngsố M 1 M 2 M3 M 4 M 5 M 6 Trung

bình SD RSD

AnconitinC

(mg/kg) 1,89 1,96 1,84 1,96 2,02 1,79 1,91 0,09 4,5

H (%) 94,7 98,0 92,1 97,9 101 89,3

AtropinC

(mg/kg) 0,168 0,163 0,166 0,188 0,168 0,171 0,171 0,01 5,3

H (%) 84,0 81,3 83,0 94,0 83,9 85,7

BrucinC

(mg/kg) 2,06 2,00 2,16 1,96 2,00 1,89 2,01 0,09 4,5

H (%) 103 99,8 108 98,0 100 94,7

ColchicinC

(mg/kg) 1,74 1,82 1,71 1,94 2,16 1,86 1,87 0,16 8,8

H (%) 87,0 91,0 85,3 97,0 108 92,8







KouminC

(mg/kg) 1,75 2,08 1,80 1,92 1,75 1,87 1,86 0,13 6,8

H (%) 87,4 104 90,0 96,1 87,7 93,4

NicotinC

(mg/kg) 0,162 0,166 0,179 0,178 0,167 0,172 0,171 0,01 4,0H (%) 81,1 83,0 89,5 89,0 83,6 86,1

ScopolaminC

(mg/kg) 0,184 0,198 0,202 0,212 0,172 0,182 0,192 0,01 7,8

H (%) 91,9 99,2 101 106 85,8 91,0

StrychninC

(mg/kg) 1,64 2,08 1,96 1,80 1,76 2,00 1,87 0,17 9,0

H (%) 81,8 104 98 89,8 87,9 99,8

Hình 3.27: Sắc đồscopolamin trongmẫu thực phẩm chức năng thêm chuẩntại mức nồng độ0,2 mg/kg

Nhận xét : Theo qui định củaAOAC, độ đúng và độ chụm phụ thuộc nồng độchất bảngP3.1 và P3.2 (phụ lục): tại cấp độ từ 100 – 1000 µg/kg, hệ số biến thiênCV ≤ 15% và tại cấp độ ≥ 1000 µg/kg, hệ số biến thiên CV ≤ 10%; hiệu suất thuhồi tại cấp độ ≥10 µg/kg phải nằm trong khoảng 80 – 110%. Nhƣ vậy, phƣơng phápcó độ đúng và độ chụm đạt yêu cầu của AOAC [19].







3.4. Phân tích mẫu thự c.

Sau khi hoàn thành quá trình khảo sát và đánh giá phƣơng pháp, chúng tôi

đã ứng dụng phƣơng pháp để phân tích một số mẫu thực phẩm chức năng mua ở cáhiệu thuốc tại Hà nội. Các mẫu đƣợc đồng nhất và phân tích theo quy trình chiếmẫu đã đƣợc tối ƣu, kết quả thu đƣợc trong bảng 3.15:

Bảng 3.15: Bảng kết quả phân tích mẫu thực

Mẫu Aconitin Atropin Brucin Colchicin Koumin Nicotin Scopolamin Strychnimg/viên mg/viên mg/viên mg/viên mg/viên mg/viên mg/viên mg/viên

Gout Kingphar KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH

Gout Hoàng Tiên Đan KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPHGout Tâm Bình KPH KPH 0,12 KPH KPH KPH KPH 0,23Gout Thanh Bình KPH KPH 0,019 KPH KPH KPH KPH 0,035Artrex DS KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPHJex KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPHCốt thoái vƣơng KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPHXƣơng khớp Su Tong KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPHKiện cốt hoàn KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPHXƣơng khớp Makong KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH

Thấp khớp Tuệ Linh KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPHXƣơng khớp Bạch Xà KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPHViên khớp Tâm Bình KPH KPH 0,079 KPH KPH KPH KPH 0,14

Ghi chú: ký hiệu KPH là không phát hiện chất phân tích







Hình 3.28: Sắc đồ mẫu phát hiện brucin

Hình 3.29: Sắc đồ mẫu phát hiện strychnin

Nhận xét : Trong 13 mẫu thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dƣợc đƣợ cmua tại các hiệu thuốc tại Hà Nội thì có 3 mẫu có chứa brucin và strychnin là haichất của cây mã tiền. Hàm lƣợ ng cao nhất là trong viên guot Tâm Bình vớ i hàmlƣợ ng brucin 0,12 mg/viên và strychnin 0,23 mg/viên vớ i liều dùng 2 lần/ ngày mỗilần 3 viên thì hàm lƣợ ng nàyở mức an toàn.







K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

K ẾT LUẬN

Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm đã nghiên cứu xác định hàm lƣợng nhómAlkaloid độc trong thực phẩm chức năng cầm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khố phổ, chúng tôi đã thu đƣợc các kết quả sau:

1. Nghiên cứu và tối ƣu đƣợc các điều kiện chạy sắc ký lỏng khối phổ để xđịnh 8 Alkaloid bao gồm:

- Tối ƣu các điều kiện khối phổ (xác định thế đầu phun, năng lƣợng bắn

tốc độ khí...) để thu đƣợc các mảnh phổ đặc trƣng của từng Alkaloid. - Tối ƣu các điều kiện sắc ký lỏng: cột sắc ký Cột sắc ký InertSustain

C18 (150mm × 4,6mm × 5μm); pha động: kênh A amoniacetat 10 mM trongnƣớc, kênh B là acetonitril; chƣơng trình rửa giải gradient; tốc độ dòng 0,5ml/phút.

2. Tối ƣu điều kiện để tách chiết các Alkaloid ra khỏi nền mẫu: dung môi chiế

ethylacetat và chlorofom, kiềm hóa bằng 1mL NH4OH 5%3. Xây dựng khoảng tuyến tính từ 5÷1000 ng/mL với các chất brucin, strychnin,

koumin, aconitin, colchicin,khoảng tuyến tính từ 0,5 ÷ 100 ng/mL với cácchất nicotin, atropin, scopolamin và đƣờng chuẩn xác định 8 Alkaloid đều cóhệ số tƣơng quan tuyến tính R 2 > 0,99. Phƣơng pháp có giới hạn phát hiệnnhỏ 1÷ 10µg/kg, độ thu hồi từ 80,1÷ 110 %và RSD từ 1,9÷ 9,6đều đạt yêucầu của Châu Âu.

4. Ứng dụng phƣơng pháp để phân tích 13 mẫu thực phẩm chức năng trên địa bàn Hà Nội phát hiện 3 mẫu có chứa brucin và strychnin không có mẫu nàonhiễm các Alkaloid còn lại.

Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi nhận thấy phƣơng pháp phân tích có độnhạy cao, phân tích nhanh và chính xác, có thể áp dụng phân tích hàm lƣợng 8







Alkaloid với độ tin cậy cao. Chúng tôi sẽ tiếp tục mở rộng phƣơng pháp để phântích đƣợc thêm các độc tố nhóm Alkaloid.

KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu thêm quy trình phân tích đồng thời các alkaloid độc

khác trong thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dƣợc trên hệ thống LC-MS/MS.

Hiện nay tại Việt Nam chƣa có quy định về hàm lƣợng cũng nhƣ giới hạncác alkaloid độc này. Cơ quan quản lý nên có các quy định về hàm lƣợng cácalkaloid độc này trong thực phẩm chức năng.







TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Trần Quốc Bình, Đỗ Thị Oanh (2011), "Góp phần nghiên cứu xây dựng tiêuchuẩn nguyên liệu và bán thành phẩm cà độc dƣợc sử dụng trong chế phẩmCamat", tạp chí Dƣợc học,421,tr.45-49.

2. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hóa học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà xuất bảnKhoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

3. Khoa dƣợc (2008), "Giáo trình dƣợ c liệu", tập II, NXB ĐH Y Dƣợ c TP.HCM.4. Phạm Thanh K ỳ (1998), "Bài giảng dƣợ c liệu", tập II, NXB Đại học Dƣợ c Hà

Nội.5. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học.6. Phạm Luận (1998),Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao, ĐH

Quốc Gia Hà Nội. 7. Lƣơng Thị Phấn (2014), Nghiên c ứu định lượng đồng thờ i strychnin và brucin

trong huy ết tương bằng phương pháp HPLC , khóa luận tốt nghiệp, Trƣờ ngĐại học Dƣợ c Hà nội.

8. Nguyễn Văn Ri (2009),Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa họctrƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

9. Nguyễn Đình Thành (2011),Cơ sở các phương pháp phổ ứng dụng trong hóahọc, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

10. Tạ Thị Thảo (2010),Giáo trình Thống kê trong Hóa học phân tích,khoa Hóahọc trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

11. Trần Thị Văn Thi, Trần Thanh Minh (2011)," Nghiên cứu phân lập và nhậndạng cấu trúc alkaloid trong dịch chiết từ lá vông nem Thừa Thiên Huế", tạpchí Khoa học Đại học Huế, 65, tr.225-230.

12. Mai Tất Tố, Nguyễn Thị Trâm (2007), Dược lý học tập 1, NXB Y học. 13. Mai Tất Tố, Nguyễn Thị Trâm (2007), Dược lý học tập 2, NXB Y học.







14. Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội (2001), Dược liệu, Nhà xuất bản Y học 15. TS. Đỗ Thị Tuyên Viện CNSH Việt Nam, Bài giảng công nghệ tách chiết các

hơ p chât thư sinh. 16. Viện dƣợ c liệu (2004),Cây thu ốc và động vật làm thu ố c ở Việt Nam , tậ p I,

NXB khoa học k ỹ thuật.17. Viện dƣợ c liệu (2004),Cây thu ốc và động vật làm thu ố c ở Việt Nam , tậ p II,

NXB khoa học k ỹ thuật.18. Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), "Thẩm định

phƣơng pháp trong phân tích hóa học & vi sinh vật", NXB Khoa học và K ỹ

thuật.Tiếng Anh19. AOAC International (2007), How to meet ISO 17025 requirements for method

verification , USA20. Borbla Boros, Agnes Farkas, Silvia Jakabova, Ivett Bacskay (2000), “LC-MS

Quantitative Deterrmination of Atropine and Scopolamine in the Floral Nectarof Datura Species”, Journal of Chromatographia , 58, 1 – 37.

21. Dirk Steinmann, Markus Ganzera (2011), “Recent advances on HPLC/MS inmedicinal plant analysis”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis , 55, 744-757.22. Hua-Tao Feng, Sam F.Y Li (2002), “Deterrmination of five toxic alkaloids in

two common herbal medicines with capillary electrophoresis”, Journal of

Chromatography A , 1-2, 243 – 24723. Huiqin Wu, Xiaoting Xiong, Xiaolan Huang, Zhixin Zhu (2013), “

Simultaneous deterrmination of 17 toxic alcaloids in human fluids by liquidchromatography coupled whith electrospray ionization tandem massspectrometry”, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies ,36:9, 1149-1162.

24. Goodman, L. (2006), “Goodman & Gilman's the pharmacological basis of

therapeutics ” (11 ed.), New York: McGraw-Hill







25. José Diana Di Mavungu, Svetlana V. Malysheva, Melanie Sanders, DariaLarionova (2012), “Development and validation of a new LC– MS/MS methodfor the simultaneous deterrmination of six major ergot alcaloids and theircorresponding epimers. Application to some food and feedcommodities”,

Food Chemistry , 135, 292 – 303.26. Miao Li, Xiao-Fang Holi, Jie Zhang, Si-Cen Wang, Qiang Fu, Lang-Chong He

(2011), “Applications of HPLC/MS in the analysis of traditional Chinesemedicines”, Journal of Pharmacertical Analysis , 1:2, 81- 91.

27. Lounasmaa M.; Tamminem T.(1993),The Alkaloids , Academic Press: New

York , 114.28. Peihong Qiu, Xiaohong Chen, Xiang Chen (2008), “Simultaneous

deterrmination of five toxic alkaloids in body fluids by high-performanceliquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem massspectrometry”, Journal of Chromatography B , 875(2), 471 – 477

29. R.E. Ardrey (2003), “Liquid chromatography-mass spectrometry: anintroduction”, New York, J. Wiley .

30. Somenath Mitra (2003), “Sample Preparation Techniques in AnalyticalChemistry’’, John Wiley & Sons .

31. Tadeusz Aniszewski (2012), Alcaloids - Secrets of Life , Alkaloid Chemistry,Biological Significance and applications and ecological Role, ElsevierScience.

32. Xie Y, Jiang ZH, Zhou H, Xu HX, Liu L (2005), “ Simultaneousdeterrmination of six Aconitum alkaloids in proprietary Chinese medicines byhigh-performance liquid chromatography’’, Journal Chromatography A ,1093(1-2), 195-203.

33. Kang XQ1, Fan ZC, Zhang ZQ(2010),“Simultaneous deterrmination of threeAconitum alkaloids in six herbal medicines by high-performance liquidchromatography”, Journal Chromatography Science , 48(10),860-865.



http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1570023208007228




http://www.sciencedirect.com/science/journal/15700232



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Xie%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16233884


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jiang%20ZH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16233884

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhou%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16233884

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Xu%20HX%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16233884

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liu%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16233884

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kang%20XQ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21044419


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fan%20ZC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21044419

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20ZQ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21044419

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20ZQ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21044419

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fan%20ZC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21044419


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liu%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16233884

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Xu%20HX%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16233884

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhou%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16233884

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jiang%20ZH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16233884










34. Yu L, Xu Y, Feng H, Li SF (2005), “Separation and deterrmination of toxic pyrrolizidine alkaloids in traditional Chinese herbal medicines by micellarelectrokinetic chromatography with organic modifier’’, Electrophoresis ,26(17), 397-404.



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yu%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16080213


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Xu%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16080213

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Feng%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16080213

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Li%20SF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16080213

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Li%20SF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16080213

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Feng%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16080213

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Xu%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16080213






PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Khảo sát pha động

Hình P1.1: Kết quả diện tích píc của các alkaloid khi sử dụng các hệ pha động khác nhau

Hình P1.2: Kết quả diện tích píc của các alkaloid khi nồng độ amoniacetat trong phađộng khác nhau







XIC of +MRM (18 pairs): 646.200/586.200 Da ID: Anconitine1 from Sample 7 (Std Mix5-50ppb-CH3COONH4-5mM) of DataSET2.wiff (Turbo Spray... Max. 1.7e5 cps.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0Time, min

0.00

5.00e4

1.00e5

1.50e5

2.00e5

2.50e5

3.00e5

3.50e5

4.00e5

4.50e5

5.00e5

5.50e5

6.00e5

6.50e5

7.00e5

7.50e5

8.00e5

8.50e5

9.00e5

9.50e5

1.00e6

1.05e6

1.09e6

I n

t e n s

i t y

, c p s

9.63

Hình P1.3: Sắc đồ các alkaloid tại nồng độ amoniacetat trong pha động là 5mM XIC of +MRM(18 pai rs) : 646.200/586.200 Da ID: Anconi tine1 f romSample 5 (Std Mix5-50ppb-Grad7) of DataSET2.wi ff (Turbo Spray) Max. 2.0e5 cps.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0Time, min

0.00

5.00e4

1.00e5

1.50e5

2.00e5

2.50e5

3.00e5

3.50e5

4.00e5

4.50e5

5.00e5

5.50e5

6.00e5

6.50e5

7.00e5

7.50e5

8.00e5

8.50e5

9.00e5

9.50e5

1.00e6

1.05e6

I n

t e n s

i t

y ,

c p

s

9.70

Hình P1.4: Sắc đồ các alkaloid tại nồng độ amoniacetat trong pha động là 10mM XIC of +MRM(18 pairs): 646.200/586.200 Da ID: Anconitine1 fromSample 9 (Std Mix 5-50ppb-CH3COONH4-20mM) of DataSET2.wiff (Turbo Spra... Max. 2.0e5 cps.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5Time, min

0.0

5.0e4

1.0e5

1.5e5

2.0e5

2.5e5

3.0e5

3.5e5

4.0e5

4.5e5

5.0e5

5.5e5

6.0e5

6.5e5

7.0e5

7.5e5

8.0e5

8.5e5

9.0e5

9.5e5

I n

t e n s

i t y

, c p s

9.81

Hình P1.5: Sắc đồ các alkaloid tại nồng độ amoniacetat trong pha động là 20mM







Phụ lục 2: Tối ƣu quá trình xử lý mẫu

Hình P2.1: Sắc đồ atropin khi khảo sát dung môi chiết

Hình P2.2: Sắc đồ brucin khi khảo sát dung môi chiết







Hình P2.3: Sắc đồ colchicin khi khảo sát dung môi chiết

Hình P2.4: Sắc đồ koumin khi khảo sát dung môi chiết







HìnhP2.5: Sắc đồ scopolamin khi khảo sát dung môi chiết

Hình P2.6: Sắc đồ strychnin khi khảo sát dung môi chiết







Hình P2.7: Sắc đồ aconitin khi khảo sát dung dịch kiềm hóa

Hình P2.8: Sắc đồ atropin khi khảo sát dung dịch kiềm hóa







Hình P2.9: Sắc đồ brucin khi khảo sát dung dịch kiềm hóa

Hình P2.10: Sắc đồ colchicin khi khảo sát dung dịch kiềm hóa







Hình P2.11: Sắc đồ koumin khi khảo sát dung dịch kiềm hóa

Hình P2.12: Sắc đồ nicotin khi khảo sát dung dịch kiềm hóa







Hình P2.13: Sắc đồ scopolamin khi khảo sát dung dịch kiềm hóa

Hình P2.14: Sắc đồ strychnin khi khảo sát dung dịch kiềm hóa







Hình P2.15: Sắc đồ aconitin khi khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa

Hình P2.16: Sắc đồ atropin khi khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa







Hình P2.17: Sắc đồ brucin khi khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa

Hình P2.18: Sắc đồ colchicin khi khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa







Hình P2.19: Sắc đồ koumin khi khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa

Hình P2.20: Sắc đồ nicotin khi khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa







Phụ lục 3: Đánh giá phƣơng pháp phân tích

Hình P3.1:Sắc đồ aconitin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 500 µg/kg

Hình P3.2:Sắc đồ atropin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 50 µg/kg







Hình P3.3:Sắc đồ colchicin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 500 µg/kg

Hình P3.4:Sắc đồ koumin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 500 µg/kg







Hình P3.5:Sắc đồ nicotin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 50 µg/kg

Hình P3.6:Sắc đồ scopolamin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 500 µg/kg







Hình P3.7:Sắc đồ strychnin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 500 µg/kg

Hình P3.8:Sắc đồ aconitin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 1 mg/kg







Hình P3.9:Sắc đồ brucin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 1 mg/kg

Hình P3.10:Sắc đồ colchicin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 1 mg/kg







Hình P3.11:Sắc đồ koumin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 1 mg/kg

Hình P3.12:Sắc đồ scopolamin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 0,1 mg/kg







Hình P3.13:Sắc đồ strychnin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 1 mg/kg

Hình P3.14:Sắc đồ aconitin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 2 mg/kg







Hình P3.15:Sắc đồ brucin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 2 mg/kg

Hình P3.16:Sắc đồ colchicin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 2 mg/kg







Hình P3.17:Sắc đồ koumin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 2 mg/kg

Hình P3.18:Sắc đồ strychnin trong mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 2 mg/kg







Bảng P3.1: Độ lệch chuẩn tƣơng đối lặp lại tối đa theo từng khoảng nồng độ

Hàm lƣợng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%)

100 1 100% 1,3

10 10-1 10% 1,8

1 10-2 1% 2,7

0,1 10-3 0,1 % 3,7

0,01 10-4 100 ppm 5,3

0,001 10-5 10 ppm 7,3

0,0001 10-6 1 ppm 11

0,00001 10-7 100 ppb 15

0,000001 10-8 10 ppb 21

0,0000001 10-9 1 ppb 30

Bảng P3.2: Khoảng chấp nhận của độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau

Hàm lƣợng [%] Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi [%]

100 1 100% 98-102

10 10-1 10% 98-102

1 10-2 1% 97-103

0,1 10-3 0,1 % 95-105

0,01 10-4 100 ppm 90-107

0,001 10-5 10 ppm 80-110

0,0001 10-6 1 ppm 80-110

0,00001 10-7 100 ppb 80-110

0,000001 10-8 10 ppb 60-115

0,0000001 10-9 1 ppb 40-120







Phụ lục 4: Phân tích mẫu thực

Hình P4.1:Kết quả mẫu không phát hiện alkaloid







Hình P4.2: Sắc đồ mẫu Gout Hoàng Tiên Đan không phát hiện alkaloid

Hình P4.3: Kết quả mẫu phát hiện strychnin

Hình P4.4: Kết quả mẫu phát hiện brucin



tách và xác định một số độc tố nhóm alkaliod trong thực phẩm chức năng bằng...

Documents