synthese en enzymatische glycosylering van mono- en

SYNTHESE EN ENZYMATISCHE

GLYCOSYLERING VAN MONO- EN

BICYCLISCHE 3-HYDROXY-Β-

LACTAMEN

Maarten Debruyne Stamnummer: 01305991

Promotor: Prof. dr. ir. Matthias D’hooghe en Prof. Dr. Tom Desmet

Tutor: ir. Lena Decuyper en ir. Jorick Franceus

Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad Master of Science in de bio-ingenieurswetenschappen:

chemie en bioprocestechnologie

Academiejaar: 2017 - 2018

De auteur en de promotoren geven de toelating deze Masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en

delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik.

Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de

verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze Masterproef.

The author and the promoters give the permission to make this Master dissertation available for consultation

and to copy parts of it for personal use.

Every other use is subject to the copyright law, more specifically the source must be extensively specified when

using results from this Master dissertation.

Gent, juni 2018

De promotoren, De auteur,

Prof. dr. ir. M. D’hooghe Prof. dr. T. Desmet Maarten Debruyne

Voorwoord De vijf jaar bio-ingenieur zijn voorbijgevlogen en zitten er nu (bijna) op. Deze Masterproef vormt het

sluitstuk van mijn opleiding. Ik kan eerlijk zeggen dat ik erg tevreden ben met het eindresultaat,

alhoewel de weg ernaar toe niet altijd even makkelijk was. Zonder de bijdrage van enkele personen

was dit niet mogelijk geweest en deze zou ik nu graag bedanken.

Ten eerste zou ik mijn promotors Prof. dr. ir. Matthias D’hooghe en Prof. dr. Tom Desmet willen

bedanken voor de kans om aan dit interessante en multidisciplinaire onderzoek te werken. Prof. dr. ir.

Matthias D’hooghe, dank voor de uitstekende begeleiding, de bemoedigende maandelijkse meetings

en uw lessen in de tweede bachelor die bij mij de interesse voor de organische chemie hebben gewekt.

Mijn begeleiders, Lena en Jorick, enorm bedankt voor de ongelofelijk goede begeleiding. Lena, je stond

steeds klaar om alle vragen, hoe klein ook, te beantwoorden. Jouw werkersmentaliteit heeft mij zeker

ook aangespoord om er het meeste uit te halen. Hoewel ik je verbetergeduld af en toe wel op de proef

zal gesteld hebben, wil ik je zeker ook bedanken om zoveel na te lezen en alle fouten eruit te halen.

Naast organische chemie en biokatalyse werden ook de dt-regels opgefrist! Daarnaast ook bedankt

voor alle praktische tips en ideeën. Jorick, dank om mij met je aanstekelijke enthousiasme in te leiden

in de wereld van de biokatalyse. Je stond altijd klaar om nieuwe dingen met veel geduld aan mij uit te

leggen en dat heb ik zeer geapprecieerd.

Ook aan de andere doctoraatsstudenten een welgemeende dankjewel om vragen te beantwoorden,

te helpen met praktische moeilijkheden en ons gerust te stellen. Speciale dank aan Sari, om ons steeds

op te peppen en aan Tim, om een dosis (soms flauwe) humor met het labowerk te combineren.

Mijn medethesisstudenten, we hebben ongelofelijk veel tijd samen doorgebracht en ik denk dat we

allemaal er niet waren geraakt zonder elkaar. Ik ben blij dat ik jullie heb leren kennen en dat we samen

hebben kunnen lachen (en klagen). Marie en Daan, bedankt voor ons vele gelach en gebabbel, het

labowerk werd veel plezanter (soms te) als we samen waren.

Verder wil ik mijn vrienden (tsjoerels en tsjoerelina’s) bedanken om mijn studententijd zo leuk te

maken. Ook in dit laatste drukke jaar heb ik nog vele mooie momenten kunnen beleven met jullie,

waarvoor ik enorm dankbaar ben.

Mama en Anne, bedankt om er altijd voor mij te zijn en mij te steunen doorheen deze vijf jaar. Als

laatste: dank aan de katjes, omdat jullie zo ongelofelijk leuk zijn.

Maarten Debruyne, 6 juni 2018

Inhoudstabel 1 Situering en doel ............................................................................................................................... 1

1.1 Situering ............................................................................................................................................ 1

1.2 Doel ................................................................................................................................................... 4

2 Literatuurstudie................................................................................................................................. 7

2.1 Inleiding ............................................................................................................................................. 7

2.1.1 Chiraliteit en synthese van optisch zuivere verbindingen.......................................................... 7

2.1.2 Scheiding en analyse van enantiomeren .................................................................................... 9

2.1.2.1 Chromatografie ................................................................................................................. 10

2.1.2.2 Optische methoden ........................................................................................................... 10

2.1.2.3 NMR ................................................................................................................................... 11

2.2 Chirale discriminatie door CAZymes ............................................................................................... 11

2.2.1 Glycosylering door CAZymes .................................................................................................... 11

2.2.2 Enantioselectiviteit van glycosyltransferasen .......................................................................... 12

2.2.2.1 Glucosylering van secundaire alcoholen door GTF-I en GTF-II .......................................... 12

2.2.2.2 Resolutie van abscisinezuur gebruik makend van een Arabidopsis glycosyltransferase .. 13

2.2.2.3 Resolutie van tetrahydroprotoberberinen ........................................................................ 14

2.2.2.4 Enantioselectieve galactosylering door het β-1,4-galactosyltransferase ......................... 14

2.2.3 Enantioselectiviteit van glycosidehydrolasen .......................................................................... 16

2.2.3.1 Enantioselectiviteit bij glycosylering van primaire alcoholen ........................................... 17

2.2.3.2 Enantioselectiviteit bij glycosylering van secundaire alcoholen ....................................... 18

2.2.3.3 Enantioselectiviteit bij galactosylering van diolen ............................................................ 19

2.2.3.4 Stereoselectiviteit bij de galactosylering van mesodiolen ................................................ 20

2.2.3.5 Enantioselectiviteit van glucosidasen ............................................................................... 21

2.2.3.6 Enantioselectiviteit bij de hydrolyse van glycosiden ......................................................... 22

2.2.4 Enantioselectiviteit van glycosidefosforylasen ........................................................................ 24

2.3 Beïnvloeden van de enantioselectiviteit ......................................................................................... 25

2.3.1 Invloed van de temperatuur..................................................................................................... 25

2.3.2 Invloed van solvent en enzymbereiding ................................................................................... 26

2.4 Conclusie ......................................................................................................................................... 27

3 Bespreking van de resultaten ....................................................................................................... 31

3.1 Synthese van monocyclische β-lactamalcoholen ............................................................................ 31

3.1.1 Synthese van (E)-N-(alkyl/arylmethylideen)aminen ................................................................ 32

3.1.2 Synthese van 3-acetoxyazetidin-2-onen .................................................................................. 32

3.1.3 Synthese van monocyclische β-lactamalcoholen ..................................................................... 34

3.2 Synthese van bicyclische β-lactamalcoholen .................................................................................. 35

3.2.1 Synthese van (3R,4R)-3-benzyloxy-1-(2-chloorethyl)-4-formyl-β-lactam ................................ 35

3.2.2 Synthese van (6S,7R)-7-benzyloxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-onen .............................. 37

3.2.3 Synthese van (6S,7R)-7-benzyloxy-4-oxa-1-azabicyclo[4.2.0]octaan-8-on .............................. 38

3.2.4 Debenzylering ter vorming van bicyclische β-lactamalcoholen ............................................... 38

3.3 β-glucosylering van monocyclische β-lactamalcoholen .................................................................. 39

3.3.1 Screening en productie enzym ................................................................................................. 41

3.3.2 Optimalisering van de reactieomstandigheden ....................................................................... 44

3.3.3 Synthese van cis-3-O-β-D-glucopyranosyl-3-hydroxyazetidin-2-onen ..................................... 44

3.3.4 Karakterisatie van cis-3-O-β-D-glucopyranosyl-3-hydroxyazetidin-2-onen.............................. 46

3.3.5 Enantioselectiviteit van de enzymatische glycosylering .......................................................... 47

3.4 Enzymatische glycosylering van bicyclische β-lactamalcoholen ..................................................... 50

3.4.1 α-Glycosylering van bicyclische β-lactamalcoholen ................................................................. 50

3.4.2 β-glycosylering van bicyclische β-lactamalcoholen .................................................................. 52

3.4.2.1 β-glycosylering met UGT-76G1Sr ...................................................................................... 52

3.4.2.2 β glucosylering met OleD .................................................................................................. 52

3.5 Chemische glycosylering van β-lactamalcoholen ............................................................................ 54

3.6 Conclusie en perspectief ................................................................................................................. 59

4 Samenvatting en besluit ................................................................................................................ 60

4.1 Samenvatting ................................................................................................................................... 60

4.2 Besluit .............................................................................................................................................. 63

5 Experimenteel deel ......................................................................................................................... 65

5.1 Analysemethoden ........................................................................................................................... 65

5.1.1 Dunnelaagchromatografie (TLC) .............................................................................................. 65

5.1.2 Preparatieve dunnelaagchromatografie (prep. TLC) ................................................................ 65

5.1.3 Kolomchromatografie .............................................................................................................. 65

5.1.4 Automatische kolomchromatografie ....................................................................................... 65

5.1.5 Vloeistofchromatografie massaspectrometrie (LC-MS) ........................................................... 65

5.1.6 NMR-spectroscopie .................................................................................................................. 66

5.1.7 Massaspectrometrie ................................................................................................................. 66

5.1.8 Infraroodspectroscopie ............................................................................................................ 66

5.1.9 Chirale vloeistofchromatografie ............................................................................................... 66

5.1.10 Optische rotatie ...................................................................................................................... 66

5.1.11 Meten van de celdichtheid ..................................................................................................... 67

5.1.12 SDS-PAGE ................................................................................................................................ 67

5.2 Droge solventen .............................................................................................................................. 67

5.3 Veiligheid ......................................................................................................................................... 68

5.3.1 Algemene veiligheidsaspecten ................................................................................................. 68

5.3.2 Specifieke veiligheidsrisico’s .................................................................................................... 68

5.4 Beschrijving van de experimenten .................................................................................................. 69

5.4.1 Synthese van (6S,7R)-4-benzyl-7-benzyloxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-on 36b ............ 69

5.4.2 Synthese van bicyclische β-lactamalcoholen 20-21b ............................................................... 70

5.4.3 Productie en zuivering van fosforylasen en glycosyltransferasen ........................................... 71

5.4.3.1 Expressie in E. coli .............................................................................................................. 71

5.4.3.2 Productie in Erlenmeyers .................................................................................................. 71

5.4.3.3 Zuivering van de enzymen ................................................................................................. 72

5.4.3.4 Karakterisatie van de enzymen ......................................................................................... 72

5.4.4 Synthese van β-geglucosyleerde monocyclische β-lactamalcoholen 26a-cβG ........................ 73

6 Bronnenlijst ...................................................................................................................................... 75

Situering en doel

1

1 Situering en doel

1.1 Situering

β-Lactamen of azetidin-2-onen vertegenwoordigen één van de belangrijkste klassen antibiotica. Deze

verbindingen stoppen de groei van bacteriën door te binden op hun penicillinebindende proteïnen,

hetgeen crosslinking van de celwand verhindert en zo tot cellyse leidt.1 Hoewel de eerste synthese van

β-lactamen al bekend raakte in 1907,2 werden ze pas belangrijk als chemische klasse na de inmiddels

legendarisch geworden ontdekking van het eerste β-lactamantibioticum, penicilline 1 (R = Bn), door

Alexander Fleming in 1928. Al snel werd achterhaald dat het penicillineskelet een β-lactamring

bevatte. De kernstructuur, 6-aminopenicillaanzuur (6-APA) 2, vormde de basis voor de ontwikkeling

van semisynthetische β-lactamantibiotica.3 Er werd ook verder gezocht naar natuurlijke bronnen van

antimicrobiële verbindingen, hetgeen onder meer leidde tot de ontdekking van cefalosporine C 3 (R1

= (R)-5-amino-5-carboxypentanamido, R2 = CH2OAc), met als basisstructuur 7-aminocefalosporinezuur

(7-ACA) 4.4 Afgeleiden ervan, zowel natuurlijke als synthetische, vormen de klasse van de

cefalosporinen 3.

Eind jaren ’60 vormde resistentie tegen β-lactamantibiotica door β-lactamasen een steeds ernstiger

probleem. Deze enzymen hydrolyseren de β-lactamring, waardoor het antibioticum niet meer actief

is. De zoektocht naar β-lactamase-inhibitoren en β-lactamaseresistente antibiotica leidde uiteindelijk

tot de ontdekking van de clavamen 5 en de carbapenemen 6 eind jaren ’70.5,6 Een micro-organisme

kan echter ook op andere manieren resistentie ontwikkelen. Zo kan de permeabiliteit van het

celmembraan veranderen of kunnen effluxpompen ontwikkeld worden die het antibioticum actief

naar buiten pompen. Ook de biologische structuur waarop het antibioticum moet binden, kan muteren

of zelfs volledig vervangen worden.7 Om de resistentievorming tegen bestaande antibiotica te

omzeilen, werd intensief gezocht naar nieuwe antimicrobiële verbindingen, hetgeen nog tot nieuwe

klassen β-lactamantibiotica zoals de sulbactamen 7 en monobactamen 8 leidde.

Situering en doel

2

β-lactamen vervullen niet enkel een fundamentele rol als antibiotica, maar vertonen daarnaast ook

vele andere interessante biologische activiteiten, zoals antiparkinson-, antidiabetische-, antikanker- en

antiturberculoseactiviteit, het inhiberen van de cholesterolabsorptie, het inhiberen van het menselijk

cytomegalovirusprotease…8,9

Niet alleen vanuit medisch oogpunt zijn β-lactamen belangrijk, ook vanuit de organische chemie is er

veel interesse in deze verbindingen vanwege hun hoge reactiviteit. Vierringen zoals een β-lactam

bezitten een aanzienlijke ringspanning door de afwijking van hun bindingshoeken ten opzichte van het

ideaal. De amidefunctie in een β-lactamring vertoont een hoger ketonkarakter dan in een lineaire

keten en heeft dus een elektrofieler en reactiever carbonyl-koolstofatoom. Dit wordt verklaard door

het geringer mesomeer gevend effect van het N-atoom in de gespannen vierring, aangezien er minder

efficiënte orbitaaloverlap mogelijk is.10 Deze effecten zorgen ervoor dat de β-lactamring ingezet kan

worden als een veelzijdig intermediair of synthon.11,12 Een voorbeeld hiervan betreft de synthese van

taxol 9, een uiterst belangrijk geneesmiddel voor de behandeling van long-, borst- en eierstokkanker.13–

15 Helaas is dit natuurproduct slechts in zeer kleine hoeveelheden beschikbaar. Een partiële chemische

synthese vanuit baccatine 10 vormt echter een oplossing voor dit probleem. Baccatine 10 wordt uit de

taxusplant geïsoleerd en heeft een veel hogere beschikbaarheid dan taxol 9. Baccatine 10 wordt

gekoppeld met (2R,3S)-N-benzoyl-3-fenylisoserine 11, waarvoor een geschikt beschermd β-lactam 12

het synthetisch equivalent vormt.16 Dit β-lactam 12 kan enantioselectief gesynthetiseerd worden door

middel van een cyclocondensatie tussen een imine 13 en een enolaat 14 met behulp van een chirale

hulpbron (R*), hetgeen deze synthetische route zo aantrekkelijk maakt.17,18

In deze Masterproef zullen mono- en bicyclische 3-hydroxy-β-lactamen 15 gesynthetiseerd worden.

Monocyclische β-lactamen vormen een onderbelichte klasse van β-lactamen, hoewel ze een zeer

veelbelovende antimicrobiële activiteit bezitten.19,20 Aztreonam 16 bijvoorbeeld, is een monobactam-

antibioticum dat net zoals penicilline de celwandsynthese verhindert.21 3-Hydroxy-β-lactamen kunnen

eveneens antimicrobiële activiteit bezitten. Een voorbeeld hiervan is tabtoxinine β-lactam 17. Dit

monocyclisch antibioticum is afgeleid uit het dipeptide tabtoxine en inhibeert het enzym glutamine

Situering en doel

3

synthetase, hetgeen de glutaminesynthese stopt en zo ook de groei van gramnegatieve en

grampositieve bacteriën.22,23 Ook kunnen 1,4-diaryl-3-hydroxy-β-lactamen (zoals racemisch 18) een

significante antikankeractiviteit vertonen.24 Deze verbindingen zijn conformationeel beperkte

analogen van (Z)-combretastatine A-4 19, een krachtige, natuurlijk voorkomende inhibitor van

tubulinepolymerase.24

In deze Masterproef zullen er verder ook bicyclische 3-hydroxy-β-lactamen 20 en 21 gesynthetiseerd

worden. (6S,7R)-7-Hydroxy-4-oxa-1-azabicyclo[4.2.0]octaan-8-on 20 vormt niet alleen een nieuw

bicyclisch β-lactamalcohol, maar kan ook beschouwd worden als een intermediair voor de synthese

van nieuwe gesubstitueerde morfolinederivaten, dewelke hun toepassing kennen als

hongeronderdrukkers, antidepressiva, antikankerverbindingen, antioxidantia en antibiotica.25

(6S,7R)-7-Hydroxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-onderivaten 21 vertegenwoordigen naast nieuwe

bicyclische β-lactamen ook bicyclische piperazineafgeleiden, hetgeen hun biologische relevantie nog

doet toenemen. Ze zijn zeer interessant vanwege hun structurele overeenkomsten met de

onverzadigde isodethiaazacefemen. Racemisch 22 is een voorbeeldverbinding van deze klasse, en

hiervan werd reeds aangetoond dat deze een zeer significante antimicrobiële activiteit bezit.26

Piperazineafgeleiden kennen verder nog verschillende toepassingen als antifungale en antibacteriële

verbindingen, serotinereceptorantagonisten of -agonisten…27–30

De chemisch gesynthetiseerde 3-hydroxy-β-lactamen zullen vervolgens geglucosyleerd worden,

hetgeen dus een glycosylering met glucose inhoudt. Glycosylering is het ‘bevestigen’ van een

koolhydraateenheid aan een andere chemische verbinding, het aglycon, via een O-, N-, S- of C-atoom.

De glycosylering van een molecule heeft invloed op zowel de fysicochemische als de biologische

eigenschappen. Ten eerste wordt de wateroplosbaarheid van hydrofobe moleculen drastisch

verhoogd door glycosylering. De wateroplosbaarheid van curcumine, bijvoorbeeld, werd zo 20 miljoen

keer hoger.31 Ten tweede kunnen chemisch labiele moleculen gestabiliseerd worden. Glycosylering

Situering en doel

4

van vitamine C bijvoorbeeld, verhoogt drastisch de oxidatieve stabiliteit.32 Als laatste kunnen ook de

biologische activiteit of eigenschappen van een molecule veranderen door glycosylering. Naringine, de

bitterstof in pompelmoes, verliest zijn bittere smaak wanneer het glycon wordt afgesplitst.33

Glycosylering kan ook het transport door de bloed-hersenbarrière drastisch beïnvloeden.34 Dit effect

komt bijvoorbeeld tot uiting bij morfine-6-glucuronide, hetgeen een veel hogere psychoactiviteit

vertoont dan morfine zelf.35

Glycosyleringsreacties kunnen zowel enzymatisch als chemisch uitgevoerd worden. Chemische

glycosylering wordt bestudeerd in de glycochemie, maar lijdt onder grote beperkingen. De twee

grootste problemen betreffen de regioselectiviteit en de configuratie ter hoogte van het anomere

centrum. Hierdoor zijn er beschermings- en ontschermingsstappen nodig, en de daarmee gepaarde

extra synthetische manipulaties, reagentia, katalysatoren, solventen en chemisch afval.36,37 Anderzijds

zijn glycosyleringsreacties uitermate geschikt om door enzymen gekatalyseerd te worden vanwege

hun inherente regio-, stereo- en enantioselectiviteit.

1.2 Doel

Het doel van deze Masterproef omvat het enzymatisch glycosyleren van 3-hydroxy-β-lactamen. Hierbij

wordt er verder gebouwd op eerder uitgevoerd onderzoek aan de vakgroep Groene Chemie en

Technologie en het Centrum voor Synthetische Biologie (Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen,

Universiteit Gent).38,39

In een eerste deel zullen 3-hydroxy-β-lactamen 26 chemisch worden gesynthetiseerd door middel van

een Staudinger β-lactamsynthese. Deze [2+2]-cyclocondensatie vindt plaats tussen in situ

gegenereerde ketenen en gesubstitueerde iminen 24, gevormd door iminering van aldehyden 23. O-

ontscherming door basische hydrolyse geeft vervolgens de gewenste monocyclische 3-hydroxy-β-

lactamen 26.

Van deze monocyclische 3-hydroxy-β-lactamen 26 werden reeds met behulp van een

sucrosefosforylase (TtSPP_R134A) en sucrose als glucosyldonor de overeenkomstige α-glucosiden

26αG bekomen, en hiervan kon reeds een volledige karakterisatie worden uitgevoerd.38,39 Voor de β-

glycosylering echter was dit nog niet het geval. Het hoofddoel van deze Masterproef zal er dan ook uit

bestaan een voldoende hoeveelheid van deze verbindingen te synthetiseren met een hoge zuiverheid

om zo een volledige karakterisatie toe te laten. De monocyclische 3-hydroxy-β-lactamen 26 zullen

Situering en doel

5

hiertoe enzymatisch worden geglucosyleerd met een glycosyltransferase (UGT-76G1Sr), ter vorming

van de β-glycosiden 26βG. Dit glycosyltransferase gebruikt het dure uridinedifosfaat (UDP)-glucose als

glucosyldonor. Om te vermijden dat dit substraat in stoichiometrische hoeveelheden moet worden

toegevoegd, zal er gebruikt gemaakt worden van een recyclagesysteem met sucrosesynthase (SuSy)

dat in situ UDP-glucose regenereert uit UDP en sucrose. In voorgaand onderzoek werden reeds β-

glucosiden 26βG bekomen, maar deze konden niet gekarakteriseerd worden omwille van de lage

hoeveelheden product en de aanwezigheid van residuele onzuiverheden, voornamelijk het co-solvent

dimethylsulfoxide (DMSO).39 Voor dit hoogkokend solvent zal er dan ook een alternatief gezocht

worden.

Daarnaast zal de scope van de gebruikte acceptoren worden uitgebreid en zal er ook gepoogd worden

nieuwe bicyclische 3-hydroxy-β-lactamen 20 en 21 te glycosyleren. De chemische synthese van deze

moleculen bouwt verder op eerder onderzoek aan de vakgroep Groene Chemie en Technologie

(Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent). Hierbij werden reeds O-

benzylbeschermde bicyclische 3-hydroxy-β-lactamen 36 en 38 gesynthetiseerd.40 Deze syntheseroute

start met de vorming van (R)-glyceraldehyde acetonide 28 door oxidatieve splitsing van 1,2:5,6-di-O-

isopropylideen-D-mannitol 27 met behulp van natriumperjodaat. Dit aldehyde 28 wordt geïmineerd

met 2-chloorethylamine 29. Een Staudingersynthese met het aldus gevormde imine 30 en

benzyloxyacetylchloride 31 leidt tot optisch zuivere β-lactamen 32. Hydrolyse van het acetaal met

para-tolueensulfonzuur gevolgd door oxidatieve splitsing van het diol 33 geeft dan aanleiding tot 4-

geformyleerd β-lactam 34. Enerzijds kan aldehyde 34 met behulp van natriumboorhydride

gereduceerd worden tot het overeenkomstige alcohol 37. Deprotonering van dit alcohol met

natriumhydride leidt tot een ringsluiting, hetgeen aanleiding geeft tot het bicyclische β-lactam 38.

Anderzijds kan in een parallelle route aldehyde 34 geïmineerd worden door behandeling met

verschillende primaire aminen. Reductie van de gevormde iminen 35 met natriumboorhydride leidt

eveneens tot een ringsluitingsreactie, hetgeen aanleiding geeft tot bicyclische β-lactamen 36. In deze

Masterproef zal er gepoogd worden deze bicyclische β-lactamen 36 en 38 via een hydrogenolyse te

ontschermen, hetgeen leidt tot de gewenste 3-hydroxy-β-lactamen 21 en 20. Deze zullen dan als

nieuwe substraten getest worden met de reeds gebruikte methoden voor enzymatische glycosylering

van monocyclische β-lactamen.

Situering en doel

6

Als laatste zal ook de enantioselectiviteit van de gebruikte enzymen onderzocht worden. De

monocyclische β-lactamen worden steeds als racemische mengsels gesynthetiseerd, in tegenstelling

tot de bicyclische die optisch zuiver worden aangemaakt. Bij glycosylering van de racemische β-

lactamalcoholen is het mogelijk dat de gebruikte enzymen kunnen discrimineren tussen één van de

twee enantiomeren, met vorming van één enkel diastereomeer. Er zal gepoogd worden deze mogelijke

discriminatie, en de invloed van bepaalde parameters zoals temperatuur en co-solvent hierop, te

bestuderen.

Literatuurstudie

7

2 Literatuurstudie De enzymatische glycosylering van racemische 3-hydroxy-β-lactamen vormt het hoofddoel van deze

Masterproef. Hierbij wordt een racemisch substraat, een 3-hydroxy-β-lactam, gekoppeld met optisch

zuiver glucose, hetgeen aanleiding kan geven tot twee diastereomeren. Aangezien enzymen chirale

katalysatoren zijn, is het mogelijk dat zij discrimineren tussen de twee enantiomeren van het

3-hydroxy-β-lactam. Deze literatuurstudie geeft een overzicht van de enantiomere selectiviteit van de

koolhydraatactieve enzymen (CAZymes) en hun mogelijkheid tot asymmetrische synthese of

kinetische resolutie. Ook de technieken die aangewend worden om chirale verbindingen te scheiden

of te analyseren en de factoren die de enantioselectiviteit van enzymen kunnen beïnvloeden, zullen

besproken worden.

2.1 Inleiding

2.1.1 Chiraliteit en synthese van optisch zuivere verbindingen

Enantiomeren zijn stereo-isomeren die elkaars niet-superponeerbare spiegelbeelden vormen. Meestal

betreft dit puntchiraliteit, waarbij het chirale centrum gevormd wordt door een atoom. Ook axiale

chiraliteit, door de aanwezigheid van een chirale as in de verbinding, of planaire chiraliteit, door de

oriëntatie van substituenten met betrekking tot een vlak in de verbinding, kunnen aanleiding geven

tot chirale verbindingen.41,42,43 Bij puntchiraliteit wordt het chirale centrum gevormd door een atoom,

meestal koolstof, met vier verschillende substituenten. Dergelijke moleculen zullen spiegelbeelden,

enantiomeren, hebben die niet gelijk zijn aan elkaar. Wanneer een molecule meerdere chirale centra

heeft en deze allemaal worden gespiegeld, levert dit ook enantiomeren op. Wanneer minstens één

maar niet alle centra worden gespiegeld, wordt er gesproken van diastereomeren.44 Diastereomeren

hebben verschillende fysische en chemische eigenschappen. Enantiomeren daarentegen vertonen

exact dezelfde fysische en chemische eigenschappen, enkel interageren ze verschillend met

gepolariseerd licht en met andere chirale moleculen. Enantiomeren roteren gepolariseerd licht, naar

rechts (dextrorotatoir, (+) of (d)) of naar links (levorotatoir, (-) of (l)).45

Aangezien de natuurlijke wereld opgebouwd is uit chirale bouwstenen zoals aminozuren en

koolhydraten, is het voor de bereiding van biologisch actieve verbindingen vaak zeer belangrijk dat er

met optisch zuivere moleculen gewerkt wordt.46 Een analyse van de medicijnen in ontwikkeling bij drie

farmaceutische bedrijven (GlaxoSmithKline, AstraZeneca en Pfizer) leerde dat 69 van de 128 (54%)

kandidaten minstens één chiraal centrum heeft, en van deze 69 chirale moleculen werden er 67 als

optische zuivere verbinding gesynthetiseerd.47

Om optisch zuivere verbindingen te bekomen, zijn er een aantal mogelijkheden. Ten eerste kan er

uitgegaan worden van optisch zuivere bouwstenen (‘chiral pool approach’) die in de natuur te vinden

Literatuurstudie

8

zijn: organische zuren, aminozuren, koolhydraten, terpenen, sterolen... De chiraliteit van het

beginproduct wordt dan behouden doorheen de synthese. De synthese van de bicyclische β-lactamen

in deze Masterproef vormt een voorbeeld hiervan.40 Dit is bovendien de geprefereerde manier in de

farmaceutische industrie om chirale eindverbindingen te bekomen.47 Ten tweede kan er vanuit een

prochiraal substraat selectief een chirale verbinding gevormd worden, hetgeen het domein van de

asymmetrische synthese vormt. Een laatste optie betreft resolutie. Hierbij worden enantiomeren van

elkaar gescheiden. In conventionele resolutie reageert een mengsel van enantiomeren met een

optisch zuivere resolving agent. Hierbij worden diastereomeren gevormd, die door hun verschillende

fysische en chemische eigenschappen wel op conventionele wijze (kristallisatie, destillatie,

chromatografie) van elkaar gescheiden kunnen worden.45

Kinetische resolutie is een proces waarbij één van de twee enantiomeren in een racemisch mengsel

sneller wordt omgezet tot product dan het andere. De reactie is dan enantioselectief. Kinetische

resolutie vindt plaats wanneer de reactiesnelheidsconstantes voor het (R)- en (S)-enantiomeer (kR en

kS) verschillen en de reactie gestopt wordt voordat 100% omzetting bereikt wordt. De verhoudingen

van de enantiomeren in substraat en product zullen dan niet meer gelijk zijn. In het ideale geval

reageert slechts één van beide enantiomeren, bijvoorbeeld het (R)-enantiomeer. Bij een omzetting van

50% wordt er dan een mengsel van 50% niet-gereageerd (S)-enantiomeer en 50% product (P)

bekomen.

Het verschil tussen kR en kS wordt veroorzaakt door een chiraal element in de reactie, hetgeen onder

andere een katalysator, reagens of solvent kan zijn.48 Het nadeel hierbij is uiteraard dat het maximale

rendement maar 50% bedraagt. Als er echter een mogelijkheid tot in situ racemisatie bestaat, kan er

in theorie wel 100% rendement worden bereikt, hetgeen een dynamische kinetische resolutie vormt.

De reactie weergegeven in de onderstaande figuur is een voorbeeld hiervan. Saccharomyces reduceert

enkel het (R)-enantiomeer van ethyl-2-oxocyclohexaancarboxylaat 40 ter vorming van het alcohol 41.

Via keto-enoltautomerie isomeriseert het niet-gereageerde substraat, hetgeen een rendement hoger

dan 50% toelaat.49

Literatuurstudie

9

2.1.2 Scheiding en analyse van enantiomeren

Zoals reeds aangehaald vertonen chirale verbindingen exact dezelfde fysicochemische eigenschappen,

behalve wanneer ze interageren met andere chirale verbindingen of met gepolariseerd licht. Om

enantiomeren te scheiden of te analyseren zijn er twee mogelijkheden. Oftewel worden ze

gederivatiseerd tot diastereomeren, zodat ze wel verschillende eigenschappen krijgen, oftewel

worden ze in een chirale omgeving gebracht, zoals een chirale stationaire fase in chromatografie. Ook

de interactie met gepolariseerd licht kan gebruikt worden om enantiomeren te analyseren.

De enantiomere zuiverheid van een verbinding wordt uitgedrukt door de enantiomere overmaat

(enantiomeric excess) of ee.50 Deze wordt als volgt gedefinieerd (met CR en CS de concentratie aan (R)-

en (S)-enantiomeer):

𝑒𝑒 (%) =𝐶𝑅 − 𝐶𝑆

𝐶𝑅 + 𝐶𝑆

∗ 100

Analoog wordt ook de diastereomere overmaat (diastereomeric excess) of de gebruikt om de

diastereomere samenstelling van een mengsel aan te duiden (met CM en Cm de concentratie aan major

(M) en minor (m) diastereomeer):

𝑑𝑒 (%) =𝐶𝑀 − 𝐶𝑚

𝐶𝑀 + 𝐶𝑚

∗ 100

De selectiviteit van enzymen wordt vaak uitgedrukt met behulp van de selectiviteitsfactor E, omdat

deze in tegenstelling tot de ee of de niet afhankelijk is van de conversiegraad en dus een inherente

eigenschap vormt van het enzym. De selectiviteitsfactor wordt als volgt gedefinieerd (met kcat de

katalytische constante, Km de Michaelisconstante, C de conversie en eep en ees de enantiomere

overmaat van respectievelijk het product en het substraat):51,52

E =(𝑘𝑐𝑎𝑡

𝐾𝑀⁄ )𝑅

(𝑘𝑐𝑎𝑡

𝐾𝑀⁄ )𝑆

=ln [1 − 𝐶(1 + 𝑒𝑒𝑝)]

ln [1 − 𝐶(1 − 𝑒𝑒𝑝))]=

ln [1 − 𝐶(1 − 𝑒𝑒𝑠)]

ln [1 − 𝐶(1 + 𝑒𝑒𝑠))]

In dit hoofdstuk zullen de meest voorkomende methoden voor scheiding en analyse van enantiomeren

kort aangehaald worden. Geavanceerde nieuwe methoden zoals enantioselectieve membranen,

amperometrische biosensoren, enzymatische methoden, molecular imprinted polymers (MIP’s),

massaspectrometrie (MS), antilichamen, capillaire elektroforese… maken geen deel uit van dit

overzicht, en hiervoor wordt dan ook verwezen naar de betreffende literatuur.50,53,54 De meest

conventionele methoden betreffen chromatografie, optische methoden en nucleaire magnetische

resonantie (NMR).55

Literatuurstudie

10

2.1.2.1 Chromatografie

Chromatografie wordt al tientallen jaren gebruikt om enantiomeren te scheiden en zo ook de ee te

bepalen. Er zijn twee verschillende manieren om enantiomeren te scheiden via chromatografie: direct

of indirect. Bij directe chirale scheiding wordt het analiet in een chirale omgeving geplaatst. Hiervoor

moet er dus een bepaalde chirale selector in de mobiele of stationaire fase aanwezig zijn. Dit is typisch

een chirale stationaire fase (CSP). Bij indirecte chirale scheiding wordt het analiet gederivatiseerd met

een chiraal reagens om diastereomeren te vormen.54 Chirale chromatografie kan uitgevoerd worden

met een vloeibare, superkritische of een gasvormige mobiele fase: vloeistofchromatografie (LC),

superkritische vloeistofchromatografie (SFC) of gaschromatografie (GC). Chirale high performance

liquid chromatography (HPLC) heeft als nadeel tijdrovend te zijn met een typische analysetijd van tien

minuten per staal. Bovendien zijn er dure kolommen nodig en verliezen de kolommen hun resolutie

met de tijd. Er zijn meerdere kolommen nodig om verschillende klassen verbindingen te analyseren,

en er is methodeontwikkeling of optimalisatie nodig voor elke klasse analiet.54 Chirale SFC is

vergelijkbaar met HPLC, maar gebruikt een superkritisch gas, typisch CO2, als mobiele fase, hetgeen

leidt tot snellere analysen.54 Chirale GC heeft in vergelijking met HPLC een hogere efficiëntie,

gevoeligheid, reproduceerbaarheid en leidt tot snellere analysen. GC is echter minder universeel

toepasbaar want de analieten moeten geëvaporeerd worden, hetgeen enkel mogelijk is voor volatiele

en thermisch stabiele producten. Daarenboven degraderen en racemiseren de chirale stationaire fasen

sneller bij de hogere werkingstemperaturen in GC.54 Ook chirale dunnelaagchromatografie (TLC)

bestaat, hetgeen gebruikt kan worden om snel en goedkoop de enantiomere zuiverheid van een

verbinding te analyseren, met als nadeel de lagere resolutie en hogere detectielimieten in vergelijking

met HPLC, SFC of GC.56

2.1.2.2 Optische methoden

Met bepaalde optische methoden kan onmiddellijk de ee van een mengsel enantiomeren gemeten

worden zonder de enantiomeren te scheiden. Hiervoor kunnen detectoren gebaseerd op optische

rotatie (OR) of circulair dichroïsme (CD) gebruikt worden. Deze kunnen ook als supplementaire

detectoren gebruikt worden in chirale chromatografie, naast de typisch voorkomende UV-detectoren.

CD- en OR-detectoren reageren wel selectief op chirale componenten, in tegenstelling tot UV-

detectoren.57 Detectoren gebaseerd op optische rotatie meten de rotatie van gepolariseerd licht

wanneer dat licht door een oplossing met de chirale verbinding gestuurd wordt. OR-detectoren zijn

universeel. Er is geen chromofoor voor nodig, maar ze zijn wel afhankelijk van

temperatuurschommelingen en solventveranderingen. Detectoren gebaseerd op circulair dichroïsme

meten de absorptieverschillen tussen rechts en links gepolariseerd licht, zijn onafhankelijk van

temperatuurs- of solventveranderingen en meten absorptie, waardoor er dus wel een chromofoor in

het analiet nodig is.57 Geïnduceerd circulair dichroïsme vormt een oplossing hiervoor. Analieten

worden hierbij gederivatiseerd om een sterker signaal te bekomen. Chromofore groepen worden op

Literatuurstudie

11

de chirale molecule geplaatst, hetgeen metingen op zeer kleine hoeveelheden materiaal toelaat. Dit

wordt het meest toegepast bij alcoholen en aminen die dan met sterk absorberende groepen worden

geacyleerd.50

2.1.2.3 NMR

Enantiomeren in een achirale omgeving vertonen dezelfde chemische shift. Daarom moeten ze in een

chirale omgeving worden geplaatst of gederivatiseerd worden opdat hun chirale overmaat via

integratie van de NMR-signalen kan worden bepaald. Dergelijke derivatisering kan door reactie met

optisch zuivere reagentia, waardoor diastereomeren gevormd worden die wel een verschillende

chemische shift hebben. Hierbij is het essentieel dat beide enantiomeren even goed reageren met het

chiraal reagens en er geen racemisatie tijdens de reactie optreedt. Er kunnen echter ook bepaalde

additieven worden toegevoegd die voor een chirale omgeving zorgen. Dit zijn optisch zuivere stoffen

die binden met het substraat door intermoleculaire niet-covalente interacties. De hierdoor gevormde

complexen zijn wederom diastereomeren en dus detecteerbaar via NMR.58

2.2 Chirale discriminatie door CAZymes

Er is nog niet veel onderzoek gevoerd naar de chirale voorkeur van CAZymes bij glycosyleringsreacties.

In dit literatuuroverzicht zal de huidig beschikbare kennis besproken worden. Eerst wordt een

overzicht gegeven van de verschillende CAZymes en dan zal hun enantioselectiviteit besproken

worden.

2.2.1 Glycosylering door CAZymes

Er zijn vier types koolhydraatactieve enzymen (CAZymes) bruikbaar voor glycosyleringsreacties:

glycosidehydrolasen (GH’s), transglycosidasen (TG’s), glycosidefosforylasen (GP’s) en de ‘Leloir’

glycosyltransferasen (GT’s). De GT’s katalyseren in vivo glycosyleringsreacties gebruik makend van

geactiveerde suikers als donor. De GH’s en GP’s hebben in vivo enkel een katabolische functie. In vivo

hydrolyseren GH’s glycosidische bindingen, hetgeen dus de transfer inhoudt van het afgesplitste

glycosyldeel naar water als acceptor. De GP’s doen hetzelfde maar dan met fosfaat als acceptor.

In vitro echter kunnen deze enzymen wel aangewend worden voor synthese, hetgeen verder in meer

detail besproken zal worden.37 TG’s transfereren een glycosylgroep van de ene koolhydraatketen naar

een andere. In vitro kunnen zij ook glycosylgroepen transfereren naar andere acceptoren. TG’s zijn

interessant vanwege hun goedkope donorsubstraten, maar ze hebben echter een kleine

substraatspecificiteit.37,59

Literatuurstudie

12

2.2.2 Enantioselectiviteit van glycosyltransferasen

Glycosyltransferasen zijn de enzymen die in de natuur aangewend worden om substraten te

glycosyleren. GT’s gebruiken geactiveerde glycosyldonors zoals nucleotide-geactiveerde suikers,

bijvoorbeeld UDP-glucose 47. Vaak zijn ze zeer gevoelig voor bepaalde omgevingsomstandigheden. Ze

zijn daarentegen zeer selectief, met hoge regio- en stereoselectiviteiten en geven vaak aanleiding tot

hoge rendementen.37,60 Ook zijn er reacties bekend waarbij GT’s discrimineren tussen enantiomeren

van racemische alcoholen met grote selectiviteit, zoals hieronder in meer detail wordt besproken. In

wat volgt zullen steeds algemene overzichtsschema’s worden gegeven; voor meer details wordt

verwezen naar tabel 2.

2.2.2.1 Glucosylering van secundaire alcoholen door GTF-I en GTF-II

In onderzoek van de groep van Shimoda et al. werden racemische secundaire alcoholen butaan-2-ol

48, octaan-2-ol 49, 1-fenylethanol 50, trans-1,2-cyclohexaandiol 51 en 1,2-trans-2-isopropyl-5-

methylcyclohexanol 52 door twee verschillende glucosyltransferasen geglucosyleerd tot hun (R)- en

(S)-glucosiden (R)-(48-52)βG en (S)-(48-52)βG. De gebruikte GT’s betroffen GTF-I uit Catharanthus

roseus en GTF-II uit Nicotiana tabacum. De diastereomere overmaat en absolute configuratie van het

aglycon werden bepaald door vergelijking van de NMR-integraties van het enzymatisch product met

die van de diastereomeer zuivere producten bekomen door chemische synthese uit optisch zuivere

alcoholen. Voor beide enzymen werden hoge de’s bekomen: 78-99% voor GTF-I en 90-100% voor GTF-

II. Beide enzymen kunnen dus gebruikt worden om de glycosiden van het (R)- (GTF-I) en het (S)- (GTF-

II) alcohol selectief te bekomen.

De enantioselectiviteit wordt zowel door het enzym als het substraat beïnvloed. Substraten met

grotere R-groepen geven aanleiding tot hogere de’s. Bij gebruik van ruwe enzympreparaten daalde de

enantioselectiviteit. Voor GTF-I bijvoorbeeld werden er dan de’s van 57-65% bekomen. De

aanwezigheid van onzuiverheden zoals glucosidasen of andere glucosyltransferasen in het ruwe

enzympreparaat zouden hiervoor verantwoordelijk zijn. Met dit onderzoek werd aangetoond dat GT’s

gebruikt kunnen worden om diastereomeer zuivere glucosiden en enantiomeer aangerijkte secundaire

Literatuurstudie

13

alcoholen aan te maken.61 Optisch zuiver fenylethanol 50 en derivaten hiervan zijn belangrijke chirale

synthons voor de synthese van farmaceutica, agrochemicaliën en natuurproducten.62,63

2.2.2.2 Resolutie van abscisinezuur gebruik makend van een Arabidopsis glycosyltransferase

Abscisinezuur (ABA) 53 is een plantenhormoon dat fysiologische processen, gerelateerd met

ontwikkeling en stress in planten, regelt.64 Via conventionele chemische synthese wordt een racemisch

mengsel bekomen.65–67 Een enantioselectieve synthese via de resolutie van diastereomere kristallen is

echter ook bekend.68 De vorm die van nature in de plant voorkomt, is het (+)-enantiomeer.69 ABA-

glycosylering is in planta een manier om de hormonale homeostase te controleren, en glycosylering

zou een manier zijn om ABA doorheen de plant te transporteren.70 Lim et al. ontdekten acht enzymen

in Arabidopsis thaliana die in staat waren om in vitro ABA te glucosyleren. Voor alle acht enzymen

werd na enzymatische glucosylering het glucose-ester 54 afgezonderd en terug gehydrolyseerd. Het

aldus bekomen product werd geanalyseerd via chirale HPLC. Zo werd het enzym UGT71B6 ontdekt,

hetgeen in staat was selectief (+)-ABA te glucosyleren. Dit enzym werd dan gebruikt in een whole cell

biokatalysesysteem om (+)-ABA te bekomen met een ee van 84%. Glucosylering met het zuivere enzym

(dus niet in een levende cel) leverde een nog iets hogere ee van op: 92%. Deze synthese vormt met

andere woorden een aantrekkelijk alternatief voor de conventionele resolutie om enantiomeer zuiver

ABA te bekomen.71,72

Literatuurstudie

14

2.2.2.3 Resolutie van tetrahydroprotoberberinen

Tetrahydroprotoberberinen (THPB’s) zijn alkaloïden geïsoleerd uit bepaalde Chinese kruiden. THPB’s

vertonen een unieke activiteit ten opzichte van dopaminereceptoren in het centraal zenuwstelsel en

hebben daarom een groot potentieel naar pijnbestrijding toe.34 Racemisch 55, een THPB, werd door

middel van een whole cell biotransformatie door Gliocladium deliquescens NRRL1086 selectief

geglycosyleerd. Het glycoside van het (S)-enantiomeer, (S)-55βG, werd bekomen met hoge

selectiviteit. Deze glycosylering vormt een nieuwe route naar optisch zuivere THPB’s en hun

glycosiden. De gevormde diastereomeren werden gescheiden via kolomchromatografie en zo werd

een de van 81% bekomen. Opmerkelijk is de invloed van de glucoseconcentratie van het medium op

deze omzetting. Bij hogere concentraties werd meer van het (R)-55βG gevormd en daalde de de. Bij

het gebruik van een 1-2% glucosemedium werd een de van 81% bekomen, bij 2,5-3% daalde deze tot

25%. Dit is de eerste keer dat er werd waargenomen dat de enantioselectiviteit van een glycosylering

afhangt van de suikerconcentratie in het medium. Om na te gaan welk soort enzym verantwoordelijk

is voor deze glycosylering, werden glycosyltransferasen en glycosidasen selectief geïnhibeerd door

respectievelijk natriumdodecylsulfaat (SDS) en imidazool. SDS inhibeerde de glycosylering en

imidazool had geen invloed. Ook werd er bij endogeen toevoegen van de glycosiden (S)-55βG en (R)-

55βG aan het medium geen hydrolyse gedetecteerd. Een GT zou dus verantwoordelijk zijn voor deze

glycosylering, maar het specifieke enzym is nog niet gekarakteriseerd.73

2.2.2.4 Enantioselectieve galactosylering door het β-1,4-galactosyltransferase

Er is al veel onderzoek verricht naar synthetische routes om enantiomeer zuivere conduritolen 56

(5-cycohexeen-1,2,3,4-tetraolen) te bekomen. Deze verbindingen zijn nuttige precursoren voor de

synthese van cyclische polyolen en hun biologisch actieve derivaten.74 Conduritol B epoxide 57,

bijvoorbeeld, is een belangrijke inhibitor van glycosidasen.75 Racemisch conduritol B 59 is eenvoudig

te synthetiseren vanuit myo-inositol 58. De chemische synthese van optisch zuiver conduritol B 59 is

echter minder eenvoudig, vandaar de aanzienlijke interesse om deze verbinding op biokatalytische

wijze enantiomeer zuiver aan te maken.76–78

Literatuurstudie

15

De groep van Yu et al. rapporteerde een enzymatische galactosylering van conduritol B 59 waarbij

enkel de (-)-vorm (-)-59 reageerde. Deze reactie werd gekatalyseerd door het β-1,4-

galactosyltransferase (GalT)/α-lactalbumine complex. De absolute configuratie van het product werd

bepaald door analyse van de optische rotatie na hydrolyse van het glycoside. Deze enzymatische

glycosylering vormt aldus een route naar optisch zuivere glycosidase-inhibitoren en geglycosylereerde

inositolen.79

Met hetzelfde enzymsysteem kon ook N-(2,3-dihydroxypropyl)aceetamide 60 volledig regio- en

stereoselectief gegalactosyleerd worden.80,81

Literatuurstudie

16

2.2.3 Enantioselectiviteit van glycosidehydrolasen

In de natuur katalyseren GH’s enkel katabolische reacties, in vitro daarentegen kunnen GH’s

synthetisch worden gebruikt. In plaats van water wordt dan een andere molecule met een

hydroxylfunctie als acceptor voor de glycosylgroep gebruikt. Deze reactie kan verlopen onder

thermodynamische of kinetische controle.37 Onder thermodynamische controle wordt een suiker,

zoals glucose 61, gecondenseerd met een alcohol 62 met afsplitsing van water 64. Het evenwicht van

deze reactie ligt in fysiologische omstandigheden aan de hydrolysezijde. Dit evenwicht kan echter

verlegd worden naar de synthesezijde door het verwijderen van product, het vermijden van water of

het gebruik van een grote overmaat reagentia (principe van Le Châtelier). Deze reactie wordt een

omgekeerde hydrolyse genoemd.59

Onder kinetische controle worden geactiveerde donorsubstraten gebruikt, deze reacties worden

transglycosyleringen genoemd. De donors zijn dan glycosiden met een goede leaving group 65,

bijvoorbeeld 4-nitrofenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) 75. Dit laat snelle accumulatie van product

toe hoger dan de evenwichtsconcentratie.82 Over het algemeen leidt kinetische controle tot hogere

rendementen dan omgekeerde hydrolyse. Transglycosylering is enkel mogelijk met de retaining GH’s

aangezien deze een covalent enzym-substraatintermediair 66 vormen, hetgeen transglycosylering

toelaat. Nevenreacties zijn primaire hydrolyse, waarbij het intermediair 66 met water reageert, en

secundaire hydrolyse, waarbij het gewenste product 67 terug gehydrolyseerd wordt. Beiden houden

netto een hydrolyse van de donor 65 in.

GH’s zijn robuust, stabiel, hebben een absolute selectiviteit voor het α- of β-anomeer en een brede

substraatspecificiteit. De rendementen van de transglycosyleringsreacties zijn echter laag en de GH’s

zijn vaak niet regioselectief, hetgeen leidt tot mengsels van producten.37,51,59,83

Literatuurstudie

17

Aangezien glycosidehydrolasen zowel een synthetische reactie als een hydrolyse kunnen katalyseren,

kan de discriminatie tussen enantiomeren zowel in de synthetische als lytische richting plaatsvinden.

Ook voor enzymen als lipasen, esterasen, oxidoreductasen, nitrilasen… is dit het geval.84

In dit hoofdstuk zal de enantioselectiviteit bij glycosylering van chirale primaire alcoholen besproken

worden, gevolgd door de selectiviteit bij galactosylering van secundaire alcoholen, diolen en meso-

diolen. Ook de enantioselectiviteit van glucosidasen en de enantioselectiviteit bij de hydrolysereactie

worden nader bekeken.

2.2.3.1 Enantioselectiviteit bij glycosylering van primaire alcoholen

Algemeen geldt dat voor kinetische resolutie van chirale alcoholen glycosidasen typisch veel slechter

presteren dan bijvoorbeeld lipasen.83,85 Eén van de eerste voorbeelden van resolutie door een

glycosidase was dat van racemisch isopropylideenglycerol 69 door het E. coli β-galactosidase. Hierbij

werd enkel het (R)-glucoside bekomen.86 Dit bleek echter het geval door het selectief uitkristalliseren

van dit diastereomeer, en niet door de selectiviteit van het enzym zelf.87,88 Daarom moet ook aandacht

besteed worden aan de wijze van zuivering, aangezien dit de verhouding tussen diastereomeren kan

wijzigen.

Doorheen de loop van de reactie wordt er vaak een afname van de de waargenomen, hetgeen wordt

toegeschreven aan de snellere hydrolyse van het preferentieel gevormde diastereomeer.83,89

Daarentegen zou een geactiveerde donor zoals ONPG secundaire hydrolyse moeten verhinderen en

dus de enantioselectiviteit moeten verhogen. Bij galactosylering van de primaire alcoholen 69 en 70

werd dit fenomeen ook waargenomen. Glycosyleringen onder thermodynamische controle gaan door

tot een thermodynamisch evenwicht wordt bereikt, en dus wordt er hierbij minder enantioselectiviteit

verwacht.83

De enantioselectiviteit van glycosidasen bij glycosylering van primaire hydroxylgroepen is over het

algemeen zeer klein. In de literatuur zijn glycosyleringsreacties van isopropylideenglycerol 69,

1,2-propaandiol 72, glycerol 94 en 2,3-epoxypropanol 70 bekend, elk met verwaarloosbare

enantioselectiviteit.83 Björcklink en Godtfredsen namen bij de galactosylering van

isopropylideenglycerol 69 en 2,3-epoxypropanol 70 verschillende enantioselectiviteiten waar

naargelang de donor. Voor ONPG werd wel een zekere selectiviteit waargenomen (de = 50%), lactose

echter gaf aanleiding tot een 1/1-diastereomeer mengsel.87 Dit wijst erop dat de stereochemische

uitkomst van de reactie kinetisch gecontroleerd is, aangezien beide β-galactosyldonoren verschillende

kinetische eigenschappen (Km, Vmax) vertonen.60

Literatuurstudie

18

2.2.3.2 Enantioselectiviteit bij glycosylering van secundaire alcoholen

In onderzoek van Matsumura et al. werden verschillende secundaire alcoholen 48-50 en 71-74c

geglycosyleerd onder kinetische controle met ONPG 75 als geactiveerde donor. Vergelijking van de

chemische shift met deze van de zuivere (R)- of (S)-glycosiden en integraties van de NMR-signalen liet

toe de de’s te bepalen. De selectiviteit voor het (R)-enantiomeer steeg en het rendement daalde

wanneer de substituent op het secundaire alcohol groter werd. Bij hydroxybutanoaten echter, daalden

zowel de rendementen als de de’s wanneer de zijketens sterisch meer gehinderd waren. Deze waarden

waren maximaal na één uur en daalden daarna terug. De secundaire hydrolyse is namelijk ook

enantioselectief: het (R)-enantiomeer wordt sneller gehydrolyseerd. Ook de oorsprong van het enzym

blijkt een invloed te hebben op de enantioselectiviteit: het Aspergillus oryzae galactosidase vertoont

een vergelijkbare, maar minder uitgesproken enantioselectiviteit. Zo werd bijvoorbeeld voor

galactosylering van butaan-2-ol 48 een de van 21% bekomen, terwijl deze voor het E. coli

β-galactosidase 64% bedroeg.90

Literatuurstudie

19

2.2.3.3 Enantioselectiviteit bij galactosylering van diolen

De stereochemie van de transgalactosylering werd bestudeerd door Trincone et al. met propaan-1,2-

diol 72 als modelverbinding. Aangezien diolen twee reactieve hydroxylgroepen hebben, werden er

steeds mengsels bekomen. Voor galactosylering van de primaire hydroxylgroep werd er geen

enantioselectiviteit waargenomen. De secundaire hydroxylgroep daarentegen werd selectief

gegalactosyleerd met hoge selectiviteit voor het (S)-enantiomeer met het β-galactosidase van

Sulfolobus solfataricus (de = 90%).91 In analoog onderzoek door Crout et al. werd een lage selectiviteit

voor het (R)-enantiomeer waargenomen met het E. coli β-galactosidase en lactose als donor, zowel

voor het primaire als secundaire alcohol.88 Verder werd in het reeds aangehaalde onderzoek door

Matsumura et al., waarbij ook het β-galactosidase van E. coli werd gebruikt maar ONPG 75 als donor

voor het secundaire alcohol, een selectiviteit voor het (R)-enantiomeer waargenomen (de = 49%).90

Zoals eerder bevonden, is de enantioselectiviteit bij glycosylering van primaire alcoholen laag tot

onbestaande.

Trincone et al. galactosyleerden ook andere diolen 51, 72, 77-82 in dezelfde reactieomstandigheden.

Bij 1,2-diolen werden beide hydroxylgroepen steeds gegalactosyleerd en was er nooit

enantioselectiviteit voor galactosylering van het primaire alcohol.92

Literatuurstudie

20

Tot slot onderzochten Crout et al. de stereoselectiviteit van het E. coli β-galactosidase. Preferentie

voor galactosyltransfer naar de (R)-enantiomeren van chirale alcoholen werd geobserveerd, maar de

selectiviteit was niet erg uitgesproken. Er werd hier wel enige enantioselectiviteit bij galactosyltransfer

naar het primaire alcohol bekomen, maar deze was zeer klein (de = <1-8%). Butaan-1,3-diol 79 werd in

deze omstandigheden wel met enige selectiviteit gegalactosyleerd (de = 33%), terwijl de selectiviteit

voor propaan-1,2-diol 72 zeer laag was (de = 13%).88

2.2.3.4 Stereoselectiviteit bij de galactosylering van mesodiolen

Mesovormen of meso-isomeren zijn moleculen die niet chiraal zijn, hoewel ze wel over chirale centra

beschikken. Mesovormen zijn enantiotoop: bij reactie ervan ontstaan enantiomeren of

diastereomeren. Gais et al. galactosyleerden mesodiolen 83-87 tot hun overeenkomstige galactosiden,

hetgeen aanleiding gaf tot diastereomeren met een vrij grote diastereomere overmaat (50-90%).

Verschillende enzymen (het β-galactosidase van Aspergillus oryzae (AOβG) en E. coli (ECβG)), donoren

(lactose of fenyl-β-D-galactopyranoside (PhGal)) en solventsystemen (water of water/aceton (1/1))

werden gebruikt. De diastereomere overmaat werd bepaald door integratie van de NMR-signalen van

de anomere protonen of koolstofatomen.

Glycosylering van 83-85 met het AOβG in water gaf geen aanleiding tot enige stereoselectiviteit. Diol

85 bijvoorbeeld werd geglycosyleerd met een rendement van 45% en een de van 0%. Bij gebruik van

een water/acetonmengsel (1/1) werd er echter wel selectiviteit waargenomen.

Reactieomstandigheden zoals het solvent kunnen dus een grote invloed uitoefenen op de

enantioselectiviteit. Voor het ECβG werd er wel selectiviteit waargenomen bij gebruik van water als

solvent. De selectiviteit was echter voor het andere diastereomeer in vergelijking met het AOβG.

Verder werd er geen verschil waargenomen tussen geïmmobiliseerd of niet-geïmmobiliseerd ECβG.93

Literatuurstudie

21

2.2.3.5 Enantioselectiviteit van glucosidasen

Vic et al. onderzochten de enantioselectiviteit van het amandel-β-glucosidase onder

thermodynamische controle. Een racemisch mengsel van 1-fenylethanol 50 werd geglycosyleerd in

een rendement van 5% en een de van 43%. Glycosylering van racemisch trans-1,2-cyclohexaandiol 51

in dezelfde omstandigheden gaf echter geen aanleiding tot enige selectiviteit. De waargenomen

selectiviteit zou afkomstig zijn van hydrofobe interacties tussen de fenylgroep in 1-fenylethanol en een

aromatische bindingsplaats in het katalytisch centrum. Er werd echter ook selectiviteit voor één van

de diol-enantiomeren 51 verwacht aangezien het (1R,2R)-diolsysteem overeenkomt met de 3,4-

diolgroep van glucose. Dit werd hier echter niet waargenomen, terwijl bij andere enzymen wel

selectiviteit geïnduceerd wordt door de configuratie van de diolgroep, zoals verder wordt besproken.82

Itano et al. glucosyleerden racemisch trans-cyclohexaan-1,2-diol 51 met verschillende ruwe

enzympreparaten die commercieel beschikbaar zijn of gebruikt worden in de voedingsindustrie.

Voorbeelden zijn takadiastase, een ruw enzymmengsel geproduceerd door A. oryzae dat zijn

toepassing vindt als geneesmiddel om de koolhydraatvertering te bevorderen en hesperidinase en

naringinase, enzymmengsels geproduceerd door A. niger. Glycosylering van trans-cyclohexaan-1,2-diol

51 met takadiastase en maltose als donor gaf exclusief aanleiding tot één glucoside. Zuivering en

hydrolyse van dit glycoside gaf het (R,R)-51 in 21% rendement. Glycosylering met naringinase leverde

hetzelfde resultaat op. Met hesperidinase werden er echter twee glycosiden gevormd, dewelke niet

volledig gescheiden werden, en waarvan de de dus niet bepaald kon worden. Met cellobiose als donor

werden β-glycosiden 51βG gevormd, en werd er ook voor takadiastase en naringinase een selectiviteit

voor het (R)-enantiomeer waargenomen. Bij deze reacties werd er dus wel selectiviteit geïnduceerd

door de configuratie van de diolgroep. De configuratie van het glycolsysteem in het (R)-glucoside komt

overeen met het 3,4-glycol van het reducerend D-glucosedeel van de donor (cellobiose of maltose).94

Literatuurstudie

22

2.2.3.6 Enantioselectiviteit bij de hydrolyse van glycosiden

De voorbeelden hierboven tonen aan dat glycosidasen discrimineren tussen de verschillende stereo-

omgevingen van de te glycosyleren hydroxylgroep. Analoog betekent dit dat stereodiscriminatie ook

kan optreden tijdens de hydrolysereactie.60 In een studie door Werschkun et al. werden chemisch

gesynthetiseerde β-galactosiden (48, 69, 79, 88-90)βGal van verschillende racemische alcoholen 48,

69, 79, 88-90 onderworpen aan een enzymatische hydrolyse door β-galactosidasen van meerdere

bronnen, namelijk E. coli, Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis en Bacillus circulans. Het

hydrolyseproduct was steeds enantiomeer aangerijkt en het β-galactosidase van E. coli vertoonde de

hoogste stereoselectiviteit. De selectiviteit steeg met hogere temperaturen en kortere reactietijden.

De galactosiden werden bereid via een Koenigs-Knorrglycosylering, hetgeen aanleiding geeft tot

diastereomeren in verschillende verhoudingen, waarmee dan ook moet rekening gehouden worden

om de enantioselectiviteit van de enzymen te bepalen.95

Tabel 1: Enantioselectiviteit bij de hydrolyse van galactosiden.

Aglycon dec (%) Geprefereerde

enantiomeer ee (%)

Gecorrigeerde

selectiviteit (Ecorr) Omzetting (%)

Isopropylideenglycerol 69 22 (S) R 46 7 40

Butaan-2-ol 48 20 (S) R 51 4,8 14

Pentaan-2-ol 88 11 (R) R 22 1,3 8

Propaan-2-ol 89 23 (R) R 5 0,5 63

Butaan-1,3-diola 79 9 (R) S 56 5,0 22

Butaan-1,3-diolb 79 23 (R) R 76 5,5 23

Pentaan-1,3-diola 90 0 R 24 1,9 41

Pentaan-1,3-diolb 90 8 (S) R 16 1,7 16 a en b Galactoside van respectievelijk het primaire en secundaire alcohol. c Van het chemisch gesynthetiseerde galactoside.

Een veelgebruikte strategie om optisch zuivere alcoholen of esters te bekomen is de kinetische

resolutie van alcoholen door lipasen. Analoog kan ook de resolutie van glycosiden door glycosidasen

toegepast worden.96 Een algemene strategie hiervoor zou zijn om een racemisch alcohol 91 chemisch

of enzymatisch te glycosyleren. De aldus bekomen glycosiden 92 kunnen dan met behulp van

glycosidasen gehydrolyseerd worden. In het ideale geval, met een volledig selectief enzym, wordt dan

het alcohol 91 en het glycoside 92 in respectievelijk optisch en diastereomeer zuivere vorm bekomen.

Literatuurstudie

23

Deze strategie werd uitgetest door Zarevúcka et al. om te trachten diastereomeer zuivere glycosidische

juvenogens te bekomen. Juvenogens zijn een klasse verbindingen die na activatie door in vivo

biochemische routes of omgevingsomstandigheden (vochtigheid, zuur, UV…) juveniel

hormoonactiviteit vertonen.97,98 Hiertoe werd het racemisch cis-alcohol 93 chemisch geglycosyleerd

via de Koenigs-Knorrsynthese, hetgeen na alkalische ontscherming van de acylgroepen glycosiden

93βGal en 93βG gaf. Deze werden dan gehydrolyseerd met een glycosidase, hetgeen resulteerde in

glycosiden (S,S)-93βGal, (R,R)-93βGal en (S,S)-93βG en alcoholen (R,R)-93 en (S,S)-93. De ee’s en de’s

werden bepaald door scheiding van de enantiomeren op een chirale kolom na hydrolyse van de

glycosiden. De bekomen de’s en ee’s waren te laag om optisch zuivere juvenogens 93βGal en 93βG te

synthetiseren.96

Literatuurstudie

24

2.2.4 Enantioselectiviteit van glycosidefosforylasen

Glycosidefosforylasen zijn vergelijkbaar met GH’s, maar ze gebruiken fosfaat in plaats van water als

acceptor. In vivo heeft dit als voordeel dat de energie van de glycosidische binding geconserveerd

wordt en zo één ATP molecule extra oplevert. In vitro is dit ook voordelig aangezien de hogere energie-

inhoud van de fosfaatbinding toelaat de reactie om te keren en te gebruiken voor synthese.59 Binnen

deze enzymklasse is enkel onderzoek gevoerd naar de enantioselectiviteit van sucrosefosforylase.

Nidetzky et al. toonden aan dat glycerol 94 regioselectief en met hoge rendementen met

sucrosefosforylase uit Leuconostoc mesenteroides omgezet kan worden tot 2-(α-glucosyl)glycerol

94αG. Dit natuurlijk voorkomend osmoliet wordt verkocht onder de handelsnaam Glycoin® en vindt

toepassing in cosmetische crèmes.99

Om de scope en selectiviteit van sucrosefosforylase te bepalen, glucosyleerden Renirie et al. een reeks

verbindingen gerelateerd aan glycerol. De glucosylering van propaan-1,2-diol 72, butaan-1,2-diol 77

en 3-methoxypropaan-1,2-diol 95 vertoonde interessante regio- en stereoselectiviteiten. De diolen

werden preferentieel op de 2-plaats geglucosyleerd. Een opmerkelijke vaststelling was echter dat deze

regioselectiviteit ook afhangt van de configuratie van het alcohol. Racemisch propaan-1,2-diol 72 werd

voornamelijk geglucosyleerd op de 2-plaats, net zoals het zuiver (S)-enantiomeer. Het zuivere (R)-

enantiomeer daarentegen werd preferentieel op de 1-plaats geglucosyleerd. Voor racemisch propaan-

1,2-diol 72 en butaan-1,2-diol 77 werd het (S)-enantiomeer preferentieel geglucosyleerd, voor 3-

methoxypropaan-1,2-diol 95 werd het (R)-enantiomeer verkozen. Er werden redelijk hoge de’s (71-

83%) bekomen. Sucrosefosforylase uit Leuconostoc mesenteroides en Bifidobacterium adolescentis

leidden tot dezelfde resultaten.100

Literatuurstudie

25

2.3 Beïnvloeden van de enantioselectiviteit

De enantioselectiviteit van enzymen hangt af van een aantal factoren: het substraat, het enzym, het

(co)solvent, de temperatuur…101,102 De factoren die de enantioselectiviteit van enzymen beïnvloeden

werden bijna uitsluitend bij lipasen, de meest gebruikte enzymen in de organische synthese,85,103

onderzocht. Daarom zullen zij hier ook besproken worden, hoewel ze geen glycosyleringsreacties

katalyseren.

2.3.1 Invloed van de temperatuur

Bij het bestuderen van de invloed van de temperatuur op de enantioselectiviteit zijn er niet alleen

omgekeerd evenredig en evenredige relaties, maar ook combinaties van de twee waargenomen. De

enantioselectiviteit bij de kinetische resolutie van methyl-2-amino-4-fenylbutyraat 100 gekatalyseerd

door het Thermomyces lanuginosus lipase, hing bijvoorbeeld af van de temperatuur. Hierbij steeg de

enantioselectiviteit drastisch bij het verlagen van de temperatuur. De selectiviteitsfactor bedroeg 13

bij 40 °C, bij -20 ˚C was deze tot 84 gestegen.104

Voor de lipasegekatalyseerde verestering van 2-(4-methoxyfenoxy)propaanzuur 102 met n-butanol

namen Wattanabe et al. een andere relatie waar. De selectiviteitsfactor steeg van 13 naar 120 bij het

verhogen van de temperatuur van 37 °C naar 57 °C. Dit werd gerationaliseerd doordat bij hogere

temperatuur het lipase flexibeler is, hetgeen de oriëntatie van de zijketens van de aminozuren van het

lipase nog voordeliger maakt voor het geprefereerde enantiomeer. Deze hypothese werd nog gesterkt

doordat de enantioselectiviteit voor verbinding 102 groter is dan voor 2-aryloxypropionzuren met

minder elektronengevende substituenten. Dit effect wijst erop dat de elektronendichtheid van de

aromatische ring, en dus π-π stacking met aromatische residuen van het enzym, een rol speelt voor de

enantioselectiviteit.105

Een kleine hoeveelheid water werd toegevoegd aan het organisch solvent, aangezien dit de

enantioselectiviteit van lipasen kan verbeteren vanwege het stijgen van de conformationele flexibiliteit

geïnduceerd door de waterstofbrugvorming met het toegevoegde water.106,107

Literatuurstudie

26

Ook complexere relaties tussen de selectiviteit en de temperatuur zijn mogelijk. De enantioselectiviteit

kan bijvoorbeeld eerst stijgen en dan dalen in functie van de temperatuur. Dit werd waargenomen bij

een penicilline G-amidasegekatalyseerde hydrolyse van 3-amido-β-lactam 104. De enantioselectiviteit

daalde in functie van de temperatuur, tot er een minimum bereikt werd bij de inversietemperatuur

(Tinv). Hier was Emin = 24 bij 28 ˚C, om dan terug te stijgen tot 130 bij 55 ˚C. Een selectiviteitsfactor van

100 wordt vaak als de minimale waarde genomen voor de industriële toepassing van een enzymatisch

proces, dus hierbij maakte de kleine temperatuurswijziging het verschil tussen een inefficiënte en een

efficiënte methode. De 13C-NMR-chemische shift van de fenylacetoxy-carbonylgroep van verbinding

104 vertoonde een analoog gedrag in functie van de temperatuur. De auteurs stellen dat beide relaties

verklaard kunnen worden door de reorganisatie van solventclusters rond de opgeloste stof bij

verandering van de temperatuur. Deze clusters beïnvloeden de chemische omgeving en dus ook de

chemische shift. Ook beïnvloeden ze de energie van de transitietoestanden van het substraat-

enzymcomplex en dus de enantioselectiviteit.108

2.3.2 Invloed van solvent en enzymbereiding

Zoals reeds in een voorgaande paragraaf besproken, werd 1-fenylethanol 50 door ECβG geglycosyleerd

in een rendement van 39% en een ee van 89% voor het (R)-enantiomeer. Majumder et al.

onderzochten hoe de enantioselectiviteit van deze reactie verder verbeterd kon worden.109

Eerst werd het effect van de enzymbereiding nagegaan. Drie mogelijkheden werden getest. Ten eerste

werd pH tuning toegepast. Hierbij wordt het enzym opgelost in een buffer bij optimale pH en dan

gevriesdroogd. Een tweede enzympreparaat werd gelyofiliseerd in aanwezigheid van lyoprotectants

(colyofilisatie), hetgeen structurele veranderingen van eiwitten tijdens het vriesdrogen vermijdt.110

Ook de aanwezigheid van substraten minimaliseert structurele schade tijdens het vriesdrogen.111 Voor

het vriesdrogen van het ECβG werd er galactose gebruikt, aangezien dit zowel een lyoprotectant als

een substraat is. Voor gebruik van enzymen in low water media kan het aanwezige water verwijderd

worden door de enzymen te spoelen of neer te slaan in solvent, hetgeen actievere enzympreparaten

oplevert.112 Een voorbeeld van dergelijke formulering is enzyme precipitated and rinsed with propanol

(EPRP), dit was het derde geteste enzympreparaat.

Literatuurstudie

27

Vergeleken met de niet-geoptimaliseerde reactie werd er voor pH tuning reeds een hogere de behaald,

en colyofilisatie gaf een hogere conversie, de en ee. EPRP leidde tot nog betere resultaten. Deze

reacties vonden plaats in een mengsel van acetonitril (ACN), dimethylformamide (DMF) en water

(ACN/DMF/H2O (9/0,5/0,5)). De optimale enzymbereiding (EPRP) werd dan geselecteerd voor verdere

optimalisatie door het testen van enkele andere solventsystemen. De enantioselectiviteit kon nog

verder verbeterd worden door optimalisatie van het solvent.

Als laatste werd de reactie in DMSO nog verder geoptimaliseerd door toevoeging van moleculaire

zeven. Het verminderen van de waterhoeveelheid in organische solventen kan de enantioselectiviteit

verbeteren.52 Er wordt aangenomen dat dit veroorzaakt wordt door het afnemen van de

conformationele flexibiliteit, waardoor de enantioselectiviteit van het enzym toeneemt.113 Hoewel ook

een omgekeerde relatie mogelijk is, zoals reeds gezien bij de verestering van 2-aryloxypropionzuur 102

door het Candida rugosa lipase. Onder optimale omstandigheden werd er zo 45% omzetting met een

de van >99% bekomen. Zowel het solvent, de enzymbereiding als de hoeveelheid water beïnvloedt dus

de enantioselectiviteit van het β-galactosidase.

2.4 Conclusie

Enzymatische glycosylering heeft veel potentieel in vergelijking met de gangbare chemische

methoden. Enzymen zijn niet alleen in staat om de regioselectiviteit en de configuratie aan het

anomere koolstofatoom te controleren, maar ook om tussen twee enantiomeren van een chiraal

alcohol te discrimineren.

Bij het bestuderen van de literatuur in verband met de enantioselectiviteit van deze enzymen werd al

snel duidelijk dat dit complexe materie is die van vele factoren afhangt. Zowel de structuur van de

acceptor en donor als het gebruikte enzym, de temperatuur, reactietijd en solvent beïnvloeden de

bekomen selectiviteit. Het potentieel van deze enzymen om enantiomeer zuivere glycosiden en

alcoholen te bekomen is zeer groot, hetgeen het onderzoeken van de enantioselectiviteit zeer

interessant maakt. In deze Masterproef zal er dan ook gepoogd worden de enantioselectiviteit van het

aangewende glycosyltransferase en sucrosefosforylase te bestuderen.

Literatuurstudie

28

Tabel 2: De enantioselectiviteit van CAZymes.

Acceptor Omstandigheden Geprefereerd enantiomeer,

regioselectiviteitb, anomere configuratieb

de

(%)

Rendement

(%)

Ref.

Enantioselectiviteit van glycosyltransferasen

Butaan-2-ol 48 GTF-I of GTF-II (5 µg/mL),

UDP-glucose (4 mg/mL),

50 mM HEPES buffer, pH 7,0,

35 °C, 24 of 36 h

GTF-I, 24 h R 78 25c 61

GTF-II, 24 h S 90 24c

Octaan-2-ol 49 GTF-I, 24 h R 84 22c

GTF-II, 24 h S 93 20c

1-Fenylethanol 50 GTF-I, 36 h R 87 28c

GTF-II, 36 h S >99 26c

trans-Cyclohexaan-1,2-diol 51 GTF-I, 36 h R >99 39c

GTF-II, 36 h S >99 33c

1,2-trans-2-Isopropyl-5-

methylcyclohexanol 52

GTF-I, 24 h R 98 17c

GTF-II, 24 h S 100 21c

Abscisinezuur 53 Recombinant UGT71B6 (E. coli), 0,1 mM (+/-)-ABA, pH 7,4, 28 °C, 24 h S 84 20c 71

THPB 55 Gliocladium deliquescens, 1-2% glucose, PD medium, 28 °C, 120 h S 81 >48c 73

Conduritol B 59 GalT (2,5 u/mL)/α-Lactalbumine (1 mg/mL), 50 mM 59, 10 mM UDP-galactose,

100 mM Tris buffer, pH 7,5, 5 mM MnCl2, 0,2% NaN3, kt, 2 dagen

S 100 57 79

N-(2,3-Dihydroxypropyl)aceetamide 60 UDP-galactose-4-epimerase, GalT/α-Lactalbumine, 0,1 eq. UDP-glucose,

Mn(II), 48 h

R 100 25 80

Enantioselectiviteit van glycosylhydrolasen

2,3-Epoxypropanol 70 β-galactosidase (0,18 mg/mL), 0,065 eq. lactose, pH 7, kt, 16 h / 0 Niet vermeld 87

β-galactosidase (0,1 mg/mL), 0,014 eq. ONPG, pH 7, kt, 1 h R 50

Isopropylideenglycerol 69 β-galactosidase (0,18 mg/mL), 0,065 eq. lactose, pH 7, kt, 16 h / 0

β-galactosidase (0,1 mg/mL), 0,014 eq. ONPG, pH 7, kt, 1 h S 20

Butaan-2-ol 48 ECβG (44 u/mL), 0,08 mM 48-50, 71-74c, 0,02 eq. ONPG,

0,1 M fosfaatbuffer/aceton, pH 7,3, 30 °C, 1 h

R 64 73 90

3-Methylbutaan-2-ol 71 R 80 36

Octaan-2-ol 49 R 63 17

1-Fenylethanol 50 R 89 39

Propaan-1,2-diol 72 / (primair)

R (secundair)

Primair/secundair = 4/1

/

49

60

20

1-Methoxypropaan-2-ol 73 R 59 28

Methyl-3-hydroxybutanoaat 74a R 65 46

Ethyl-3-hydroxybutanoaat 74b R 55 37

Butyl-3-hydroxybutanoaat 74c R 11 8

Literatuurstudie

29

Propaan-1,2-diol 72 β-galactosidase (Sulfolobus solfataricus), Fenyl-β-D-galactoside,

H2O/octanol (1/2), 75 °C, 1,5-3 h

/ (primair)

S (secundair)


0

90

80a 91

β-galactosidase (E. coli), ONPG, H2O/aceton (3/2), 30 °C, 1 h / (Primair)

R (Secundair)


0

49

80a 90

β-galactosidase (E. coli), Lactose, H2O, 25 °C, 24 h R (primair)

R (secundair)


8

13

46a 88

Propaan-1,2-diol 72 β-galactosidase (Sulfolobus solfataricus), Fenyl-β-D-galactoside,

H2O/octanol (1/2), 75 °C, 1,5-3 h

Primair/secundair = 4/1d 90 85a 92

Butaan-1,2-diol 77 Primair/secundair = 4/1d 40 88a

Hexaan-1,2-diol 78 Primair/secundair = 4/1d 40 60a

Butaan-1,3-diol 79 Niet bepaald 0 87a

Pentaan-1,4-diol 80 Primair/secundair = 7/3d 40 90a

2-Methylbutaan-1-ol 81 n.v.t.d 0 90

2-Methylpentaan-2,4 diol 82 Enkel secundair (geen tertiair)d 40 35a

trans-Cyclohexaan-1,2-diol 51 n.v.t.d 0 25

Butaan-2-ol 48 ECβG (60 u/mL), 0,3 mM lactose, 0,1 mM fosfaatbuffer,

pH 7,3, 25 °C

R 10 32 88

Isopropylideenglycerol 69 / 0 47

Propaan-1,2-diol 72 R (primair)

R (secundair)


8

13

46a

Butaan-1,3-diol 79 R (primair)

R (secundair)


<1

33

61a

cis-Cyclopentaan-1,2-diol 83 β-galactosidase (Aspergillus oryzae), 83-84/PhGal (4/1), H2O/aceton (1/1), pH 5 Niet bepaald 70 13 93

cis-Cyclohexaan-1,2-diol 84 38 20

cis-Cyclopentaan-1,2-diol 83 β-galactosidase (E. coli), 83-84/PhGal (1/1), H2O, pH 7,3 89 30


cis-Cyclopentaan-1,2-diol 83 β-galactosidase (E. coli),83-84/lactose (1/1), H2O, pH 7,3

96 20


cis-Bicyclo[2.2.1]hept-5-een-2,3-

diol 85

β-galactosidase (E. coli), 85-87/PhGal (1/1), H2O, pH 7,3

75 24

cis -Bicyclo[2.2.1]heptaan-2,3-diol

86

63 28

cis-Cyclopentaan-1,3-diol 87 50 36

1-Fenylethanol 50 β-glucosidase (amandelen, 5 mg/mL), 0,8 mM 50-51, 0,2 mM glucose

ACN/H2O (9/1), 40 °C, 72 h

S 43 5 82

Literatuurstudie

30

a Rendement voor de primaire en secundaire glycosiden samen. b Indien relevant. c Conversie (%). d Absolute configuratie niet bepaald.

trans-Cyclohexaan-1,2-diol 51

Takadiastase, 51/maltose (1/0,34),

H2O, pH 4,5, 37 ˚C, 24 h

R, α 100 21 94

Naringinase, 51/maltose (1/0,34),

H2O, pH 4,5, 37 ˚C, 24 h

R, α 100 Niet

vermeld

Hesperidinase, 51/maltose (1/0,68),

H2O, pH 4, 27 ˚C, 5 d

R+S, α

Niet

bepaald

7

Takadiastase, 51/cellobiose (1/0,34), R, β 100 3

Hesperidinase, 51/cellobiose (1/0.34), R, β 100 Niet

vermeld

β-glucosidase, 51/salicine (1/0,41),

H2O, pH 5

R+S, β Niet

bepaald

7

Enantioselectiviteit van glycosylfosforylasen

Propaan-1,2-diol 72 Sucrosefosforylase (25 u/mL), 100 mM glucose-1-fosfaat,

10 mM MgCl2, pH 6,6, 30 °C

S (secundair)

Primair/secundair = 1,8

71 50 100

(R)-Propaan-1,2-diol 72 n.v.t


n.v.t 50

(S)-Propaan-1,2-diol 72 n.v.t


n.v.t 50

Butaan-1,2-diol 77 S (secundair)


74 48

3-Methoxypropaan-1,2-diol 95

R (secundair)


83 78

Beinvloeden van de enantioselectiviteit

1-Fenylethanol 50 β-galactosidase (Aspergillus oryzae),

ACN/DMF/H2O (9/0,5/0,5), 55 °C, 16 h

Gelyofiliseerd R 93 23 109

Colyofilisatie 95 28

EPRP 95 42

β-galactosidase (Aspergillus oryzae, EPRP),

55 °C, 4 h

ACN/DMF/H2O

(9/0,5/0,5)

97 15

ACN/DMSO (9/1) 97 28

DMSO 98 42

β-galactosidase (Aspergillus oryzae, EPRP),

DMSO, moleculaire zeven, 55 °C, 4 h

>99 45

Bespreking van de resultaten

31

3 Bespreking van de resultaten In deze Masterproef zal klassieke organische chemie gecombineerd worden met biokatalyse om

geglycosyleerde β-lactamen te synthetiseren. De enzymatische glycosylering van monocyclische 3-

hydroxy-β-lactamen 26 werd al eerder onderzocht en bevestigd in voorgaande Masterproeven.38,39 In

tegenstelling tot de α-glucosylering konden voor de β-glycosylering echter nog geen zuivere

verbindingen bekomen worden. Het hoofddoel van deze Masterproef zal dan ook bestaan uit het

verder uitwerken van deze reactie. Daarbij zal de mogelijke enantioselectiviteit van de gebruikte

enzymen bestudeerd worden. Nieuwe bicyclische β-lactamalcoholen 107 zullen bovendien

gesynthetiseerd worden om te pogen de scope van de gebruikte acceptoren in de enzymatische

glycosylering uit te breiden.

3.1 Synthese van monocyclische β-lactamalcoholen

In deze Masterproef werden gesubstitueerde 3-hydroxy-β-lactamen 26 gesynthetiseerd. Deze

verbindingen vervullen, naast potentieel interessante antibacteriële en antikankeractiviteiten,23,114

ook een rol als veelzijdige intermediairen in de organische chemie.115 De chemische synthese van deze

verbindingen werd reeds uitgewerkt in eerder onderzoek.38,116 Hierbij worden aldehyden 23 met

primaire aminen omgezet tot hun overeenkomstige iminen 24. Staudingersynthese, gevolgd door

basische ontscherming, levert de gewenste monocyclische 3-hydroxy-β-lactamen 26.


32

3.1.1 Synthese van (E)-N-(alkyl/arylmethylideen)aminen

(E)-N-(Alkyl/arylmethylideen)aminen 24 werden gesynthetiseerd door iminering van hun

overeenkomstige aldehyden 23 met één equivalent van de primaire aminen 108 in droge

dichloormethaan of tetrahydrofuraan (THF) als solvent in aanwezigheid van magnesiumsulfaat om het

gevormde water te verwijderen. Het aflopen van de reactie werd telkens aangetoond via 1H-NMR door

het verdwijnen van de karakteristieke aldehydesignalen bij respectievelijk 9,57, 9,76 en 10,00 ppm (δ,

1H-NMR, CDCl3).

Tabel 3: Synthese van (E)-N-(alkyl/arylmethylideen)aminen 24.

Verbinding R1 R2 Omstandigheden Rendement (%)

24a iPr Bn CH2Cl2, kt, 1 h 95

24b Pr iPr CH2Cl2, kt, 1 h 100a

24c Ph Bn THF, Δ, 16 h 65 a Door de hoge vluchtigheid van dit imine werd onmiddellijk de volgende reactie gestart zonder indampen van het solvent.

3.1.2 Synthese van 3-acetoxyazetidin-2-onen

De aldus bekomen iminen 24 werden vervolgens via een Staudinger-β-lactamsynthese met

acetoxyacetylchloride 109 omgezet tot de overeenkomstige 3-acetoxyazetidin-2-onen 25. Hoewel de

Staudingersynthese al meer dan 100 jaar bekend is, blijft het de meest algemene en meest gebruikte

reactie voor de synthese van β-lactamen en afgeleiden. De Staudingersynthese is een [2+2]-

cyclocondensatie tussen een imine en een keteen en wordt vaak gebruikt vanwege de eenvoudige

procedure en de meestal voorspelbare stereochemische uitkomst.12 Bij deze reactie kunnen twee

chirale centra in één enkele stap gegenereerd worden.117 Een andere veelvoorkomende procedure is

de Gilman-Speeter-reactie, een condensatie tussen een esterenolaat en een imine.118 Deze reactie

wordt bijvoorbeeld toegepast in de synthese van de zijketen van taxol.17


33

Er is lang veel discussie geweest over het mechanisme van de Staudingersynthese, voornamelijk over

het feit of ze stapsgewijs of geconcerteerd verloopt. Tegenwoordig wordt aangenomen dat ze

stapsgewijs verloopt.117 De reactie begint wanneer een zuurchloride 110 in contact komt met een base,

hetgeen resulteert in dehydrochlorering en de vorming van keteen 111. Het nucleofiele vrije

elektronenpaar op het N-atoom van imine 112 valt vervolgens dit keteen aan, resulterend in een

intermediair zwitterion 113. Deze nucleofiele additie vindt plaats langs de sterisch minst gehinderde

zijde van keteen 111. De tweede stap bestaat uit een conrotatorische elektrocyclische ringsluiting

resulterend in de vorming van cis-β-lactam 115.

Bij deze reactie kunnen twee nieuwe chirale centra gevormd worden, en de elektronische

eigenschappen van de substituenten op het keteen 111 en imine 112 bepalen onder meer de relatieve

configuratie van deze centra.119 Wanneer intermediair 113 een onmiddellijke ringsluiting ondergaat

worden cis-β-lactamen 115 gevormd. Indien er eerst isomerisatie rond de iminebinding plaatsvindt,

kunnen de thermodynamisch stabielere trans-β-lactamen 116 gevormd worden. De

diastereoselectiviteit wordt dus gecontroleerd door de competitie tussen directe ringsluiting

(snelheidsconstante k1) en de snelheid van isomerisatie van intermediair 113 (snelheidsconstante k2).

Elektronengevende keteensubstituenten (Bose-Evans ketenen) en elektronenzuigende

iminesubstituenten versnellen de directe ringsluiting (k1 stijgt), hetgeen leidt tot een hoger aandeel

cis-β-lactamen 115. Daarentegen leiden elektronenzuigende keteensubstituenten (Moore ketenen) en

elektronengevende iminesubstituenten tot een tragere ringsluiting (k1 daalt) en bijgevolg tot meer

vorming van trans-β-lactamen 116.119,120

Voor de Staudingersynthese werden iminen 24 opgelost in droge dichloormethaan of THF in de

aanwezigheid van drie equivalenten triëthylamine als base. Vervolgens werd het zuurchloride 109, zelf

ook opgelost in droog solvent, telkens met een toevloeischeitrechter voorzichtig aan het

reactiemengsel toegedruppeld bij 0 °C. Overnacht roeren bij kamertemperatuur leidde tot

cis-3-acetoxyazetidin-2-onen 25. Het compleet aflopen van deze reactie werd nagegaan door het

verdwijnen van de karakteristieke iminesignalen bij respectievelijk 7,66, 7,64 en 8,40 ppm (δ, 1H-NMR,

CDCl3). Voor de zuivering van deze verbindingen werd gebruik gemaakt van kolomchromatografie

(SiO2) voor verbindingen 25a en 25c. Voor verbinding 25b werd verder gewerkt met het ruwe

reactiemengsel omwille van een moeizame zuivering in voorgaand onderzoek.39,116


34

Tabel 4: Synthese van 3-acetoxyazetidin-2-onen 25.

Verbinding R1 R2 Omstandigheden Rendement (%) cis/transa

25a iPr Bn 1,3 eq. 109, CH2Cl2 47b 82/12

25b Pr iPr 1,1 eq. 109, CH2Cl2 84c 100/0

25c Ph Bn 1,5 eq. 109, THF 40 100/0 a Bepaald via 1H-NMR van het ruwe reactiemengsel. b Rendement voor het cis- en trans-isomeer samen. c Ruw rendement.

Zoals reeds eerder waargenomen werd er enkel voor verbinding 25a ook het trans-isomeer

bekomen.38,39 De cis- en trans-isomeren van dit β-lactam werden samen geïsoleerd en zij werden na

de volgende stap gescheiden via omkristallisatie. De diastereomere ratio’s (dr) werden bepaald na

integratie van de 1H-NMR-signalen na analyse van de vicinale koppelingsconstanten tussen de C3- en

C4-protonen. Voor de cis-β-lactamen bedroegen deze J = 4,6-5,0 Hz (1H-NMR, CDCl3) en voor het trans-

isomeer van β-lactam 25a bedroeg de koppelingsconstante 1,5 Hz, hetgeen overeenkomt met

waarden gerapporteerd in de literatuur voor cis- en trans-β-lactamen.119

3.1.3 Synthese van monocyclische β-lactamalcoholen

De laatste stap in deze syntheseroute bestond uit een ontscherming van de gevormde cis-3-acetoxy-

β-lactamen 25 via hydrolyse van de acetylgroep. Deze reactie vindt plaats in basisch midden, met als

solvent een mengsel van water en methanol. Het aflopen van deze reactie werd nagegaan via LC-MS-

analyse. Zuivere cis-3-hydroxy-β-lactamen 26 werden bekomen na omkristallisatie in

ethylacetaat/hexaan (1/4), waarbij ook trans-β-lactam 26a van zijn cis-diastereomeer gescheiden

werd. De gebruikte solventmengsels en rendementen van deze reactie worden weergeven in tabel 5.

Tabel 5: Synthese van 3-hydroxyazetidin-2-onen 26.

Verbinding R1 R2 Solvent Rendement (%)a

26a iPr Bn H2O/ MeOH (2/1) 47

26b Pr iPr H2O/ MeOH (1/1) 9b

26c Ph Bn H2O/ MeOH (1/1) 20

a Na omkristallisatie.

b Globaal rendement vanaf imine 24b.


35

3.2 Synthese van bicyclische β-lactamalcoholen

Nieuwe bicyclische β-lactamalcoholen 20 en 21 werden gesynthetiseerd om hun mogelijke reactiviteit

in de enzymatische glycosyleringsreacties te bestuderen. De chemische synthese van deze moleculen

bouwde verder op eerder onderzoek aan de vakgroep Groene Chemie en Technologie (Faculteit Bio-

ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent).40 De synthese startte vanuit optisch zuiver 1,2:5,6-di-O-

isopropylideen-D-mannitol 27, waaruit in vijf stappen (3R,4R)-3-benzyloxy-1-(2-chloorethyl)-4-formyl-

β-lactam 34 gevormd wordt. Deze veelzijdige chemische bouwsteen werd hierna omgezet tot

benzylbeschermde bicyclische β-lactamen 36 en 38. Vervolgens werd een methode uitgewerkt om

deze te ontschermen met vorming van de nieuwe bicyclische β-lactamalcoholen 21 en 20.

3.2.1 Synthese van (3R,4R)-3-benzyloxy-1-(2-chloorethyl)-4-formyl-β-lactam

De syntheseroute tot de bicyclische β-lactamalcoholen 20 en 21 start met de vorming van

(R)-glyceraldehydeacetonide 28 door oxidatieve splitsing van 1,2:5,6-di-O-isopropylideen-D-mannitol

27 met behulp van natriumperjodaat in aanwezigheid van natriumbicarbonaat. Na twee uur roeren bij

kamertemperatuur werd (R)-glyceraldehydeacetonide 28 zuiver en in een hoog rendement (83%)

bekomen. Aangezien 1,2:5,6-di-O-isopropylideen-D-mannitol 27 in optisch zuivere vorm aangewend

werd en bij deze reactie de absolute stereochemie van de chirale centra op C2 en C5 niet verloren

gaat, werd zo selectief het (R)-enantiomeer bekomen. Deze syntheseroute vormt een voorbeeld van

een synthese vanuit de chiral pool; zoals vermeld in het deel ‘literatuurstudie’ vormt dit één van de

drie manieren om optisch zuivere verbindingen te bekomen. Het startproduct beschikt hier reeds over

de gewenste stereochemie en indien er in volgende synthetische stappen geen racemisatie van de

chirale centra optreedt, blijft deze stereochemie ook behouden in het eindproduct.121

(R)-Glyceraldehydeacetonide 28 werd vervolgens geïmineerd met het hydrochloridezout van

2-chloorethylamine 29. Toevoegen van drie equivalenten triëthylamine was noodzakelijk om het

amine te activeren. Anderhalf equivalent magnesiumsulfaat werd aangewend om het gevormde water

te onttrekken. Na een uur was het karakteristieke aldehydesignaal (δ = 9,71 ppm, 1H-NMR, CDCl3)

verdwenen en de reactie afgelopen. Het reactiemengsel werd ingedampt en opgelost in droge ether

waarna de aldus gevormde kristallen, het hydrochloridezout van triëthylamine, werden verwijderd

door filtratie. Door de beperkte stabiliteit van dit imine 30 moest er voldoende zorg worden besteed


36

aan de temperatuur bij indampen en werd de Staudingersynthese direct uitgevoerd. Als bij de

oxidatieve splitsing van 1,2:5,6-di-O-isopropylideen-D-mannitol 27 en de imineringsreactie die hierop

volgde geen racemisatie van de chirale centra is opgetreden, kan imine 30 optreden als een chirale

inductor in de Staudingersynthese waarbij het de stereochemie controleert van de nieuw gevormde

chirale centra.

Daartoe werd imine 30 opgelost in droge dichloormethaan in aanwezigheid van drie equivalenten

triëthylamine als base. Hieraan werden 1,3 equivalenten benzyloxyacetylchloride 31, opgelost in droge

dichloormethaan, voorzichtig toegedruppeld bij 0 °C. Na 16 uur roeren bij kamertemperatuur werd

waargenomen dat imine 30 volledig omgezet was door het verdwijnen van het karakteristieke

iminesignaal (δ = 7,70 ppm, 1H-NMR, CDCl3). Zoals reeds waargenomen is de chirale inductie van imine

30 niet volledig en worden daardoor twee cis-diastereomeren 32a (major) en 32b (minor) gevormd in

een verhouding van 94/6 (dr werd bepaald via 1H-NMR (CDCl3) van het ruwe reactiemengsel).40

Diastereomeren 32a en 32b konden niet gescheiden worden door chromatografische zuivering. Het

vermelde rendement van 60% was dan ook voor beide diastereomeren samen. In een latere stap gaat

de stereochemie van het derde stereocenter verloren waarbij uit 32a en 32b twee cis-enantiomeren

gevormd worden.40 Deze synthese werd in eerder onderzoek reeds uitgewerkt met methoxy-, fenoxy-

en benzyloxyacetylchloride.40,122,123 In deze Masterproef werd geopteerd voor benzyloxyacetylchloride

31 omdat de hydroxylgroep zo met behulp van een eenvoudig te verwijderen benzylgroep beschermd

werd.

De volgende stap bestond uit een zure hydrolyse van de acetaalfunctie. Hiertoe werd het acetaal 32

opgelost in een mengsel van THF en water (1/1) in aanwezigheid van 1,2 equivalenten para-

tolueensulfonzuur. Deze reactie werd opgevolgd via LC-MS en de omzetting bleek volledig te zijn na

drie uur. Het reactiemengsel werd vervolgens geneutraliseerd met vast natriumbicarbonaat. Extractie

verwijderde het gedeprotoneerde, wateroplosbare para-tolueensulfonzuur en hierdoor werd


37

(1’S,3R,4S)-3-benzyloxy-1-(2-chloorethyl)-4-(1,2-dihydroxyethyl)azetidin-2-on 33 zuiver bekomen in

een hoog rendement (93%).

De finale stap ter vorming van het aldehyde 34 bestond opnieuw uit oxidatieve splitsing van een diol.

Hiertoe werd diol 33 opgelost in een mengsel van dichloormethaan en verzadigd natriumbicarbonaat

(25/1) en gekoeld met behulp van een ijsbad. Vervolgens werden 2,4 equivalenten natriumperjodaat

portiegewijs over een periode van tien minuten toegevoegd. De reactie werd opgevolgd via LC-MS en

vereiste 36 uur voor een volledige omzetting, in tegenstelling tot de gerapporteerde twee uur.122

Eenvoudig affiltreren en wassen van het reactiemengsel echter leidde tot zuiver (3R,4R)-3-benzyloxy-

1-(2-chloorethyl)-4-formyl-β-lactam 34 in een hoog rendement (94%).

3.2.2 Synthese van (6S,7R)-7-benzyloxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-onen

Voor de synthese van (6S,7R)-7-benzyloxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-onen 36a-b werd aldehyde

34 eerst geïmineerd met isopropylamine of benzylamine en vervolgens ringgesloten. Het nog niet

eerder beschreven benzylaminederivaat 36b werd gesynthetiseerd omdat dit bij een

hydrogenolysereactie simultane O- en N-debenzylering zou kunnen ondergaan.124 Daardoor zou dit

derivaat een minder sterisch gehinderde verbinding vormen, hetgeen belangrijk kan zijn voor de

reactiviteit in de enzymatische glycosylering.

De iminering vond plaats in droge dichloormethaan met 1,5 equivalenten magnesiumsulfaat als

droogmiddel. Het aflopen van deze reacties werd opnieuw via 1H-NMR-analyse bevestigd. Deze iminen

35a-b werden bekomen in hoge rendementen en zuiverheden, waardoor meteen de volgende reacties

opgestart konden worden.

In de volgende stap ondergingen iminen 35a-b reductie gevolgd door ringsluiting. Hiertoe werden de

iminen 35a-b opgelost in methanol of ethanol en met behulp van een ijsbad gekoeld.

Natriumboorhydride werd portiegewijs gedurende vijf minuten aan het reactiemengsel toegevoegd

gevolgd door verhitting tot refluxtemperatuur voor twee of 16 uur. Zuivering gebeurde door middel

van filtratie over silicagel, hetgeen resulteerde in de benzylbeschermde bicyclische β-lactamen 36a-b

in middelmatig tot hoog rendement (55-84%).


38

3.2.3 Synthese van (6S,7R)-7-benzyloxy-4-oxa-1-azabicyclo[4.2.0]octaan-8-on

Voor de synthese van (6S,7R)-7-benzyloxy-4-oxa-1-azabicyclo[4.2.0]octaan-8-on 38 werd aldehyde 34

opgelost in methanol en gekoeld door middel van een ijsbad. Hieraan werden portiegewijs twee

equivalenten natriumboorhydride toegevoegd. Na één uur roeren onder refluxomstandigheden was

deze reactie afgelopen, hetgeen werd nagegaan door het verdwijnen van het karakteristieke

aldehydesignaal (δ = 9,58 ppm, 1H-NMR, CDCl3). Het zo gevormde alcohol 37 werd vervolgens

gedeprotoneerd met natriumhydride, een sterke base. Ringsluiting vond overnacht plaats in DMSO bij

hoge temperatuur.

3.2.4 Debenzylering ter vorming van bicyclische β-lactamalcoholen

De laatste stap bestond uit de ontscherming van de benzylgroep op zuurstof in verbindingen 36a-b en

38 hetgeen leidde tot de vorming van de gewenste bicyclische β-lactamalcoholen 20-21b.

De (6S,7R)-7-hydroxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-onen 21a-b vormen nieuwe bicyclische

piperazineafgeleiden. Piperazinen vertonen vele interessante biologische activiteiten zoals antifungale

en antibacteriële activiteit of treden op als serotinereceptorantagonisten of -agonisten.26–30

(6S,7R)-7-Hydroxy-4-oxa-1-azabicyclo[4.2.0]octaan-8-on 20 kan beschouwd worden als een

interessant intermediair in de synthese van nieuwe gesubstitueerde morfolinederivaten met

toepassingen als hongeronderdrukkers, antidepressiva, antikankerverbindingen, antioxidantia en

antibiotica.25

De af te splitsen benzylgroep is afkomstig van benzyloxyacetylchloride 31 dat aangewend werd in de

Staudingersynthese. Deze beschermgroep werd gekozen omdat deze eenvoudig en onder milde

omstandigheden kan worden verwijderd via een hydrogenolysereactie.124 In de literatuur zijn er enkele

voorbeelden van hydrogenolysereacties van 3-benzyloxy-β-lactamen bekend.125–127 Deze voorbeelden

vormden de leidraad voor de uiteindelijk gekozen reactieomstandigheden. De hieronder afgebeelde

3-benzyloxy-β-lactamen 117 konden bijvoorbeeld in zeer hoge rendementen (85-97%) omgezet

worden tot hun overeenkomstige alcoholen 118 door middel van een hydrogenolysereactie in

methanol met 5 bar waterstofgas en 10% (m/m) palladium op koolstof (Pd/C) als katalysator.


39

Een testreactie in deze omstandigheden met β-lactam 36a leidde tot een extreem trage reactie. Er

werd dan ook gekozen voor hogere katalysatorhoeveelheden (40-80%, m/m). Er werd ook gepoogd

verbinding 38 te ontschermen onder atmosferische druk met behulp van een ballon met waterstofgas,

hetgeen echter niet mogelijk bleek. Hydrogenolyse met 40% Pd/C voor verbindingen 36a-b gaf

aanleiding tot volledige ontscherming na één week, waarbij voor 36b, zoals geanticipeerd, zowel de O-

als N-benzylgroep afgesplitst werd. Voor verbinding 38 werd 80% katalysator gebruikt en was een erg

lange reactietijd nodig om een volledige omzetting te bekomen. Ondanks het nadeel van de lange

reactietijden, konden de producten echter zeer eenvoudig in zuivere vorm bekomen worden. Daartoe

werden de ruwe reactiemengsels gefiltreerd over celiet, het solvent ingedampt en de residu’s opgelost

in water. Aangezien de producten 20-21b zeer wateroplosbaar waren, konden zij eenvoudig en

efficiënt gezuiverd worden via een extractie van de apolairdere onzuiverheden met ethylacetaat.

(6S,7R)-7-Hydroxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-onen 21a-b werden zo bekomen in een hoog

rendement (64-91%). Voor verbinding 20 werd een opbrengst van 98% bekomen maar was er nog een

onzuiverheid (~25%) aanwezig. Een analytisch zuiver staal kon via preparatieve TLC bekomen worden

in een rendement van 21%.

3.3 β-glucosylering van monocyclische β-lactamalcoholen

Glycosylering heeft een enorme invloed op de fysicochemische eigenschappen van een verbinding. In

de natuur is glycosylering één van de meest voorkomende en belangrijkste modificatie van

biomoleculen. Het speelt een centrale rol in cellulaire communicatie en de organisatie van het leven

in het algemeen.128 Er bestaan dan ook veel ziektes, zeker aangeboren of erfelijke ziektes zoals het

syndroom van Wiskott-Aldrich, die geassocieerd zijn met de foute glycosylering van bepaalde

eiwitten.129,130,131 De herkenning van specifieke glucanen op het oppervlak van een cel vormt vaak de

basis van virale en bacteriële infecties132 en de metastase van kanker.133 Een breed bereik aan

verbindingen kan geglycosyleerd worden, gaande van macromoleculen zoals proteïnen, vetten en

glycanen op de celwand tot kleine moleculen zoals secundaire metabolieten en oligosachariden.134

De wateroplosbaarheid, stabiliteit en biologische activiteit van kleine moleculen kan drastisch

beïnvloed worden door glycosylering. Glycosylering verhoogt bijvoorbeeld de stabiliteit van vitamine

C en anthocyanidinen.32,135 Daarnaast verlaagt het de biologische- en antikankeractiviteit van deze

anthocyanidinen, de antioxidantactiviteit kan zowel stijgen, gelijk blijven als dalen.136 De glycosylering

van steviol resulteert in zoetsmakende steviolglycosiden.137 Glycosylering speelt ook een rol bij de


40

detoxificatie van xenobiotica door hun glucuronylering. Lipofiele endo- en exobiotica worden zo

omgezet tot wateroplosbaardere glucuroniden en geëxcreteerd.138,139

Ook de configuratie van het anomere centrum (α of β) kan de biologische activiteit beïnvloeden.

Methyl-β-galactofuranoside en n-octyl-β-galactofuranoside bezitten bijvoorbeeld een

immuunstimulerend effect. De overeenkomstige α-galactofuranosiden beschikken echter niet over

deze eigenschap.140 Vandaar het belang om zowel de α- als β-glucosiden van de 3-hydroxy-β-lactamen

selectief te kunnen synthetiseren.

In de organische chemie werd reeds veel onderzoek gevoerd naar manieren om glycosyleringsreacties

uit te voeren. Deze chemie is echter zeer complex. Glucose heeft bijvoorbeeld één hemiacetale

hydroxylgroep, drie secundaire hydroxylgroepen en één primaire hydroxylgroep. Selectief één van

deze hydroxylgroepen koppelen met een acceptor houdt dus een enorme uitdaging in. Deze

uitdagende regioselectiviteit leidt tot het noodzakelijk zijn van vele beschermings- en

ontschermingsstappen en activeringen van de glycosyldonor. De daarmee gepaard gaande complexe

synthetische manipulaties leiden tot lage rendementen, het gebruik van grote hoeveelheden

organische solventen en vaak ook de vorming van toxische gehalogeneerde (bij)producten. Productie

van glycosiden via chemische methoden in een economisch en ecologisch haalbare manier blijft dus

nog steeds een grote uitdaging.128

Door gebruik te maken van biokatalyse kunnen vele van de nadelen van chemische glycosyleringen

vermeden worden. Biokatalyse wordt steeds meer een bruikbaar alternatief voor sommige chemische

reacties, ook op industriële schaal.141 Enzymen zijn in staat regio-, stereo- en enantioselectief

glycosyleringen uit te voeren zonder andere functionele groepen te moeten beschermen, hetgeen

chemisch vaak zeer moeilijk of zelfs onmogelijk is. Het vermijden van beschermings- en

ontschermingsstappen zorgt ervoor dat er minder synthetische stappen vereist zijn. Enzymatische

glycosyleringen behoren ook tot de groene chemie aangezien het gebruik van toxische chemicaliën

vermeden wordt en er veiligere solventen (water) en reactieomstandigheden worden toegepast. Als

glycosyldonor kunnen ook hernieuwbare grondstoffen zoals sucrose aangewend worden.142

Om de problemen geassocieerd met de chemische glycosylering te vermijden en gebruik te maken van

de voordelen die biokatalyse biedt, werd er in deze Masterproef en in voorgaand onderzoek gezocht

naar enzymatische methodes om deze uitdagende substraten te glucosyleren.38,39 Er zijn verschillende

types CAZymes die deze reactie zouden kunnen uitvoeren. Om de α- en β-glycosiden 26αG en 26βG te

synthetiseren werden twee enzymen geselecteerd die gekend staan om hun brede

acceptorsubstraatspecificiteit. Voor het maken van α-glycosiden 26αG werd gebruik gemaakt van

mutant R134A van het sucrose 6'-fosfaat fosforylase van Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum

(TtSPP_R134A), terwijl voor de β-glycosiden 26βG werd gekozen voor het UDP-glucosyltransferase van

Stevia rebaudiana (UGT-76G1Sr).


41

Voor de α-glycosiden 26αG kon reeds in voorgaand onderzoek voldoende product gesynthetiseerd

worden voor een volledige karakterisatie.38,39 Voor de β-glycosiden 26βG was dit echter nog niet het

geval. Voornamelijk het moeilijk te verwijderen co-solvent DMSO, andere residuele onzuiverheden en

de lage hoeveelheid product die geen verdere zuivering toelieten, vormden hier een probleem. Ook

de enzymfermentatie van UGT-76G1Sr vormde een knelpunt. Het hoofddoel van deze Masterproef zal

dan ook bestaan uit de synthese en karakterisatie van de β-geglucosyleerde monocyclische β-lactamen

26βG. Hiertoe zullen er, na expressie van de nodige enzymen, reacties op kleine schaal (100-150 µL)

uitgevoerd worden om de reactieomstandigheden te optimaliseren. Na optimalisatie worden er op

grotere schaal (~100 mL) preparatieve reacties opgestart om uiteindelijk voldoende product te

bekomen voor een volledige karakterisatie (1H-NMR, 13C-NMR, MS, IR).

3.3.1 Screening en productie enzym

UGT-761Sr gebruikt UDP-glucose als geactiveerde donor en behoort tot de grootste groep Leloir GT’s:

de plant UDP-dependent glycosyltransferases (UGT’s). Dit enzym is afkomstig van honingkruid of de

steviaplant (Stevia rebaudiana); in planta katalyseert het de β-glycosylering van stevioside 119 of

steviolbioside 120 tot respectievelijk rebaudioside A 121 of rebaudioside B 122, die allebei toepassing

vinden als natuurlijke zoetstoffen.143

Er bestaat aanzienlijke interesse in dit enzym vanwege zijn opmerkelijk grote substraatspecificteit. In

tegenstelling tot microbiële GT’s, zoals het oleandomycine glycosyltransferase (OleD) uit

Streptomyces,144,145 hebben GT’s uit planten vaak een zeer grote substraatspecificiteit in vivo.134 Voor

in vitro glycosyleringen echter werden er tegenstellende waarnemingen gerapporteerd. Sommige


42

plant GT’s zijn promiscue en worden voornamelijk gelimiteerd door hun regioselectiviteit, waarbij het

substraat enkel over een sterisch ongehinderde hydroxylgroep dient te beschikken.146 Daarentegen

zijn er ook zeer specifieke GT’s bekend. Anthocyanine 3’-O-glucosyltransferase (3’GT) uit Gentiana

triflora bijvoorbeeld, katalyseert zeer specifiek de glucosylering van de 3’-hydroxylgroep van

delfinidine-type anthocyaninen met glucose op de 3- en 5-plaatsen.147 Het UGT-76G1Sr van Stevia

rebaudiana vertoonde in vitro echter een opmerkelijk brede substraatspecificiteit, gaande van

alifatische alcoholen tot fenolen, flavonoïden en glucosiden. In tabel 6 zijn de acceptoren die tot nu

toe succesvol werden geglucosyleerd met dit enzym weergegeven.148 Curcumine 125 kon bijvoorbeeld

bijna volledig (96% omzetting) worden omgezet tot de mono- en diglucosiden 126 en 127 wanneer

trehalose als eiwitstabilisator gebruikt werd.148

Tabel 6: Acceptoren die reeds succesvol geglucosyleerd werden met UGT-76G1Sr.

Alcoholen Gesubstitueerde monofenolen Polyfenolen Glycosiden

Ethanol Catechol Catechine Polydatine

Hexaan-1-ol Resorcinol Epicatechine Salicine

Heptaan-1-ol Hydrochinon Hesperetine p-Nitrofenyl-α-

Octaan-1-ol Eugenol Luteoline glucose/galactose

Decaan-1-ol Orcinol Quercetine p-Nitrofenyl β-fucose

Cyclohexanol Methyl/Ethyl/Propyl/Octyl/Laurylgallaat Resveratrol Stevioside

trans-Cyclohexaan-1,2-diol Vanilline Curcumine Arbutine

Cinnamylalcohol Vanillylalcohol 4-Fenoxyfenol Esculine

β-Citronellol o/p-Nitrofenol

Geraniol Anisylalcohol

Fenol

UGT-76G1Sr behoort tot de inverting GT’s, hetgeen inhoudt dat er een inversie van de anomere

configuratie plaatsvind bij glycosylering.149 Aangezien UDP-glucose 47 over de α-configuratie beschikt,

zal het product 123βG een β-glucoside zijn. Deze reactie vindt plaats via een SN2-achtig mechanisme.

De hydroxylgroep van de acceptor 123 wordt gedeprotoneerd door een carboxylaatresidu van het

enzym. Dit gedeprotoneerde alcohol is nucleofieler en dus reactiever. Aanval van dit alcohol op het

anomere centrum van de donor 47 geeft aanleiding tot een oxocarbeniumion-achtige

transitietoestand 124. Het verlaten van de leaving group leidt dan tot een β-geglucosyleerd product

123βG. Deze uitstoot van de leaving group, een gesubstitueerd fosfaat zoals UDP, wordt

vergemakkelijkt door een divalent metaalion dat de negatieve lading stabiliseert.150


43

Een grote praktische hindernis voor de toepassing van GT’s zijn hun dure nucleotide-geactiveerde

glycosyldonoren. De donor voor UGT-76G1Sr, UDP-glucose, is te duur om in grootschalige

toepassingen in stoichiometrische hoeveelheden toegediend te worden.151 Er kan echter een

cofactor-regeneratiesysteem geïmplementeerd worden. Sucrose synthase (SuSy) is in staat

UDP-glucose te generen uit UDP en sucrose. Bij de glucosyleringsreactie verbruikt UGT-76G1Sr

UDP-glucose en stelt het UDP vrij, hetgeen door SuSy gebruikt kan worden om continu UDP-glucose te

regenereren. Naast het besparen van geld heeft dit systeem nog andere voordelen: UDP zou

UGT-76G1Sr kunnen inhiberen,148,152 en daarnaast is het bekend dat sucrose eiwitten stabiliseert.153

De enzymfermentatie van UGT-76G1Sr vormde een knelpunt in voorgaand onderzoek. Fermentatie op

grote schaal in een fermentor (8 L) leidde tot enzym in een wateronoplosbare vaste fractie. Reacties

met dit extract leken na TLC-analyse tot product te leiden, echter waren deze glucosidespots

waarschijnlijk onzuiverheden in het enzymextract en werden er geen geglycosyleerde β-lactamen

geproduceerd. Ook bij fermentaties op kleinere schaal kwamen problemen voor met de expressie van

het enzym.39 In deze Masterproef werd er dan ook besloten om het enzym enkel op erlenmeyerschaal

tot expressie te brengen. UGT-76G1Sr werd tot expressie gebracht in E. coli en gezuiverd via

nikkel-nitrilotriazijnzuur (Ni-NTA) affiniteitchromatografie. De activiteit van het UGT-76G1Sr werd na

elke expressie en zuivering bevestigd door middel van een positieve controlereactie, namelijk de

glucosylering van curcumine 125 die door dit enzym zeer efficiënt wordt uitgevoerd.148 Na incubatie

overnacht konden na TLC-analyse duidelijk zichtbare glucosidespots waargenomen worden, hetgeen

bewijst dat het enzym actief is. SuSy werd als celextract aangewend en niet opgezuiverd via Ni-NTA

affiniteitschromatografie omdat het goed tot expressie komt en slechts in kleine hoeveelheden dient

te worden aangewend.


44

3.3.2 Optimalisering van de reactieomstandigheden

De reactieomstandigheden uit eerder onderzoek38,39 werden geoptimaliseerd om de resterende

hindernissen die de karakterisatie van de doelverbindingen belemmerden weg te nemen. Aangezien

een van de grootste problemen bij de eerdere synthese van deze β-glycosiden bestond uit het

verwijderen van het co-solvent DMSO, werd er eerst gezocht naar een geschikter co-solvent voor deze

reacties. Het co-solvent wordt toegevoegd om de oplosbaarheid van de hydrofobe acceptoren te

verhogen in het waterige reactiemedium.

Hiertoe werd eerst de oplosbaarheid van verbinding 26a nagegaan in een reeks potentiële co-

solventen en daarna werd nagegaan of het enzym ook actief bleef in aanwezigheid van dit co-solvent.

Hiervoor werden reacties op kleine schaal opgezet en werd de vorming van glucosiden kwalitatief

nagegaan door middel van TLC (tabel 7, zwarte cirkel). Zowel met aceton, methanol, dibutylether als

met methyl-tert-butylether (MTBE) werd de vorming van glucosiden waargenomen. Aceton werd

geselecteerd als het meest geschikte co-solvent vanwege zijn lage toxiciteit, hoge vluchtigheid, goede

solventeigenschappen voor verbinding 26a en de afwezigheid van een mogelijks competitieve

hydroxylgroep.

Tabel 7: Semi-kwantitatieve TLC analyse van glucoside 26aβG na 16 uur (UGT-76G1Sr (1,25 mg/mL), SuSy (0,9 mg/mL),

15 mM 26a, 200 mM sucrose, 2 mM UDP, 10 v/v% organisch solvent, 50 mM MOPS buffer, pH 7, 32 °C).

Solvent Oplosbaarheida Activiteit

2-Fenylethanol + -

Acetonitril + -

MeOH + +

Aceton + +

DMSO + -

Dibutylether - +

MTBE +/- +

a Oplosbaarheid van 150 mM 26a bij 32 °C, +: quasi meteen volledig opgelost, -: niet volledig oplosbaar, +/-: volledig oplosbaar na 5 min.

Een tweede wijziging ten opzichte van eerder onderzoek bestond uit het verlagen van de

reactietemperatuur van 40 °C naar 32 °C. Hoewel UGT-76G1Sr een temperatuuroptimum heeft van

40 °C148 werd er gekozen om de reacties bij een lagere temperatuur te laten plaatsvinden om eventuele

stabiliteitsproblemen te vermijden en zo een langere reactietijd mogelijk te maken.

3.3.3 Synthese van cis-3-O-β-D-glucopyranosyl-3-hydroxyazetidin-2-onen

Na optimalisering van de reactieomstandigheden konden reacties op grote schaal (100 mL) worden

uitgevoerd om voldoende producten 26a-cβG zuiver te bekomen en zo volledige karakterisaties van

deze verbindingen toe te laten. Er werd begonnen met de β-glucosylering van verbinding 26a om de

validiteit van de gebruikte methode te testen. Hierna werden ook de twee andere derivaten


45

gesynthetiseerd. De reactie werd opgevolgd via LC-MS en TLC, en omzettingsgraden werden bepaald

via LC-MS en LC-UV door middel van standaardreeksen uitgewerkt in eerder onderzoek.39

Reactieomstandigheden, omzettingen en behaalde rendementen na zuivering worden weergegeven

in tabel 8.

Tabel 8: Synthese van cis-3-O-β-D-glucopyranosyl-3-hydroxyazetidin-2-onen 26a-cβG.

Verbinding R1 R2 Omstandigheden Omzetting (%) Rendement (%)a

26a iPr Bn UGT-76G1Sr (0,125 mg/mL), SuSy (0,36 mg/mL),

6 weken

9 0,2

26b Pr iPr UGT-76G1Sr (0,186 mg/mL), SuSy (0,31 mg/mL),

2 weken

14 1,4

26c Ph Bn UGT-76G1Sr (0,111 mg/mL), SuSy (0,31 mg/mL),

2 weken

4 1

a Rendement na kolomchromatografie (SiO2 en C18).

Voor de zuivering van het eerst-gesynthetiseerde derivaat 26aβG werd begonnen met een extractie

met isopropanol en zout (NaCl) om de suikers te verwijderen. Indampen van de isopropanol en het

heroplossen van het residu in methanol gevolgd door filtratie verwijderde de zouten. De volgende

zuiveringstap bestond uit automatische normal phase kolomchromatografie (SiO2) met als eluens

EtOAc/MeOH/H2O (30/5/4). Hierna was het product 26aβG echter nog niet voldoende zuiver

aangezien het acceptorsubstraat 26a nog niet volledig gescheiden was van het glucoside 26aβG. Er

werd een bijkomende chromatografische stap (SiO2) uitgevoerd waarbij de acceptor eerst volledig

geëlueerd werd met ethylacetaat, waarna er langzaam overgeschakeld werd naar een sterker eluens

(EtOAc/ MeOH/H2O (30/5/4)) om zo het glucoside te bekomen. β-Glucoside 26aβG werd hierdoor met

een acceptabele zuiverheid (>85%, LC-MS) geïsoleerd, een resterende onzuiverheid was echter nog

steeds aanwezig. De zuiverheid van het glycoside werd wel al voldoende geacht voor karakterisatie.

Na dit bemoedigende resultaat werden ook de β-glucosyleringen van de andere twee monocyclische

β-lactamen 26b en 26c onder dezelfde reactieomstandigheden opgestart.

Er dient opgemerkt te worden dat verbinding 26c niet volledig oplosbaar is onder deze

omstandigheden en de concentratie van de acceptor 26c dus niet voldeed aan de gewenste 15 mM.

Er werd gepoogd een oplossing te vinden voor dit probleem door een aantal andere co-solventen

(EtOAc, dibutylether, MTBE, DMSO) te screenen voor dit substraat of een groter percentage co-solvent

(15% en 20% aceton) aan te wenden. Reacties in deze omstandigheden op kleine schaal gaven echter

vergelijkbare omzettingen, waardoor er besloten werd dezelfde reactieomstandigheden te blijven


46

hanteren. Bij de zuivering werd onopgeloste acceptor 26c eerst afgefiltreerd om de verdere zuivering

te vereenvoudigen.

Voor de glycosiden 26bβG en 26cβG werd de tweede chromatografische methode met gradiëntelutie

gebruikt. Ook hierbij werden glycosiden bekomen met een zuiverheid van >85% (LC-MS). Er werd

gepoogd de steeds aanwezige onzuiverheid te identificeren aan de hand van 1H-NMR en LC-MS. Deze

was echter niet 3-(N-morfolino)-propaansulfonzuur (MOPS), UDP, UDP-glucose, sucrose of fructose,

en was dus waarschijnlijk een onzuiverheid afkomstig van het enzymextract. Een laatste zuivering via

automatische reversed phase kolomchromatografie (C18) werd toegepast om deze onzuiverheid te

verwijderen, waarna de drie glucosiden 26a-cβG volledig zuiver werden bekomen. De noodzaak tot

meerdere chromatografische zuiveringen had een nadelig effect op de rendementen (~1%), maar

leidde tot een zuiverheid die hoog genoeg was om een volledige karakterisatie mogelijk te maken.

3.3.4 Karakterisatie van cis-3-O-β-D-glucopyranosyl-3-hydroxyazetidin-2-onen

Bij analyse van de NMR-spectra werd snel duidelijk dat, in tegenstelling tot de α-glycosylering waarbij

er maar één product waargenomen werd, de β-glycosylering steeds tot twee glucosiden leidde.

UGT-76G1Sr was dus niet volledig enantioselectief. Het scheiden van de gevormde diastereomeren

werd niet haalbaar of nodig geacht, mede door de zeer gelijkaardige fysicochemische eigenschappen

van de glucosiden 26a-cβG en de kleine resterende hoeveelheden product.

Het doel van de reacties op preparatieve schaal was de karakterisatie van de β-glucosiden 26a-cβG.

Door middel van 1D- en 2D-NMR experimenten (COSY, HSQC en HMBC) werden de NMR-signalen

volledig toegewezen. De typische signalen van de β-anomere protonen bestonden uit doubletten bij

4,10-4,70 ppm (δ, 1H-NMR, D2O), en een duidelijke koppeling van deze protonen met H2 was steeds te

zien met vicinale koppelingsconstanten die 7,8-8,4 Hz bedroegen. Door deze typische koppelingen

konden deze signalen onderscheiden worden van de nabije β-lactamsignalen. Deze en andere

karakteristieke waarden worden weergegeven in tabel 9, en voor verbinding 26cβG wordt ter

illustratie ook het 1H-NMR-spectrum (D2O) in figuur 1 weergegeven.

Tabel 9: Karakteristieke NMR-signalen (D2O) van de β-glycosiden 26a-cβG.

Verbinding R1 R2 Diastereomere ratio δ CHβ (ppm) JHβ-H2 (Hz) δ CHβ (ppm)

26aβG iPr Bn 44/56 4,52

4,70

7,9

7,8

102,3

102,6

26bβG Pr iPr 36/64 4,50

4,66

8,1

8,1

102,2

102,4

26cβG Ph Bn 41/59 4,52

4,10

8,4

8,4

101,1

102,6


47

Figuur 1: Karakteristieke 1H-NMR-signalen (D2O) van 26cβG, signalen afkomstig van het glucosedeel zijn aangeduid in het

rood.

3.3.5 Enantioselectiviteit van de enzymatische glycosylering

Zoals reeds aangehaald in het deel ‘Literatuurstudie’, worden bij koppeling van racemische cis-3-

hydroxy-β-lactamen (R,R)-26 en (S,S)-26 met optisch zuiver glucose diastereomeren (R,R)-26G en (S,S)-

26G gevormd. Enzymen zijn chirale katalysatoren en het is dus mogelijk dat zij kunnen discrimineren

tussen één van de twee enantiomeren van de cis-3-hydroxy-β-lactamen 26. Reactieomstandigheden

zoals temperatuur, (co-)solvent, enzymformulering, additieven… kunnen deze selectiviteit bovendien

beïnvloeden.

Voor de α-glycosylering werd er in voorgaand onderzoek steeds maar één product waargenomen,38,39

hetgeen duidt op volledige selectiviteit van het enzym voor één van de twee enantiomeren van de

cis-3-hydroxy-β-lactamen 26. Bij synthese van de β-glycosiden 26a-cβG werd echter steeds de vorming

van twee isomere producten waargenomen. Analyse van de NMR-spectra van synthesen van de β-

glucosiden, die in voorgaand onderzoek bij andere omstandigheden hadden plaatsgevonden, leerde


48

dat de verhoudingen van de diastereomeren kon variëren. Zo werd er voor 26aβG bij 32 °C met als co-

solvent aceton een dr van 44/56 bekomen. Bij 40°C met als co-solvent DMSO werd een dr van 71/29

bekomen, wat wijst op een andere selectiviteit. Om de invloed van de reactieomstandigheden op de

enantioselectiviteit van de β-glucosylering na te gaan, werd er gepoogd de enantiomere overmaat van

het niet-gereageerde substraat (ees) na reactie in verschillende omstandigheden te bepalen. Vóór

reactie komen de cis-3-hydroxy-β-lactamen 26 namelijk voor als racemisch mengsel. Wanneer het

enzym een selectiviteit heeft voor een bepaald enantiomeer zal er meer van dit enantiomeer omgezet

worden. Na reactie is de acceptor dan aangerijkt aan één van de twee enantiomeren. Kwantificatie

van deze aanrijking verschaft aldus informatie over de enantioselectiviteit van het enzym.

Om de ees te kunnen bepalen werd er gebruik gemaakt van HPLC met een chirale kolom. Na

methodeontwikkeling voor deze scheiding werden β-glycosyleringsreacties op kleine schaal

(150-500 µL) uitgevoerd, met als variabelen het gebruikte co-solvent en de temperatuur. Na reactie

werd het ruwe reactiemengsel geëxtraheerd met ethylacetaat, de organische fase behouden en

ingedampt. Het residu werd vervolgens opgelost in n-hexaan/EtOH en geanalyseerd met chirale HPLC.

De omzetting werd steeds bepaald via LC-MS of LC-UV, aangezien dit ook de ee en de beïnvloedt.154

De resultaten van dit onderzoek zijn weergegeven in tabel 10.

Tabel 10: Enantioselectiviteit van de β-glycosylering.

Verbinding R1 R2 Omstandigheden ees (%) (omzetting (%))a,b dep (%) (omzetting (%))a,c

26a iPr Bn blanco

Aceton, 32 °C

-2,7

-2,8 (6)

-11 (9)

Aceton, 40 °C -3,8 (1)

DMSO, 32 °C 0,6 (6)

DMSO, 40 °C -6,8 (40) 44 (9)

26b Pr iPr blanco

Aceton, 32 °C

-7,11

-d(10)

-30 (14)

Aceton, 40 °C - d(/)

DMSO, 32 °C - d(15)

DMSO, 40 °C - d(9) -26 (5)

26c Ph Bn blanco

Aceton, 32 °C

-4,0

2,5 (10)

18 (4)

Aceton, 40 °C -6,1 (12)

DMSO, 32 °C -4,1 (12)

DMSO, 40 °C 6,1 (22) -47 (4,5) a Negatieve waarde betekent een selectiviteit voor het andere enantiomeer. b Bepaald via chirale HPLC met een ChiralPak® IA kolom, n-hexaan/isopropanol (96/4), 1 mL/min, 35 °C, 220 nm. c Bepaald via 1H-NMR (D2O).

d Accurate bepaling ees was niet mogelijk door co-elutie van een onzuiverheid uit het reactiemengsel.

Deze methode om de enantioselectiviteit te bestuderen werd gehinderd door enkele grote obstakels

waardoor de resultaten niet eenduidig zijn. Ten eerste vertoonden de ee’s van de blanco stalen reeds

vrij grote afwijkingen (verwachte ee’s = 0). Ten tweede waren de bekomen omzettingen laag, hetgeen

een grote invloed heeft op de ees. Een reactie met volledige enantioselectiviteit en een omzetting van

5% geeft bijvoorbeeld nog steeds maar aanleiding tot een ees van 5,3%. Deze verschillen zijn, mede

door de hoge ruis bij de metingen, niet betrouwbaar te detecteren. Ten derde vonden de reacties


49

steeds plaats op kleine schaal, waarbij er snel afwijkingen kunnen optreden. Om de betrouwbaarheid

te verhogen zou een triplicaat uitgevoerd kunnen worden. Bijvoorbeeld kan elke reactie driemaal

worden uitgevoerd, van elke reactie driemaal een staal worden genomen en elk van deze stalen

driemaal geanalyseerd worden via HPLC. Binnen het tijdsbestek van deze Masterproef was dit echter

niet meer mogelijk. Een laatste probleem stelde zich specifiek bij het bepalen van de ees van verbinding

26b. Hierbij elueerde er steeds ook een onzuiverheid uit het reactiemengsel samen met de

enantiomeren, hetgeen nauwkeurige bepaling van de ees onmogelijk maakte.

De diastereomere overmaten van het product (dep) vormen een andere manier om informatie te

verkrijgen over de enantioselectiviteit van het enzym. De dep’s konden via 1H-NMR (D2O) bepaald

worden door de integratie van de anomere of β-lactamprotonen en zijn weergegeven in tabel 10. Bij

het bepalen van de dep moet uiteraard wel de kanttekening worden geplaatst dat deze waarden na

zuivering werden bekomen. Aangezien diastereomeren verschillende fysicochemische eigenschappen

hebben, is het mogelijk dat bij de zuivering de recovery van één van de twee diastereomeren groter is,

hetgeen de dep zou doen afwijken van de werkelijke selectiviteit van het enzym. Dit wordt ook duidelijk

weerspiegeld in de minder samenhangende resultaten, dewelke bovendien sterk verschillend zijn van

de ees resultaten. Betrouwbaardere resultaten zouden behaald kunnen worden indien de dep bepaald

zou worden op basis van NMR-spectra van de ruwe reactiemengsels. Dit is echter praktisch niet

haalbaar door de vrij lage concentratie product in vergelijking met de concentratie aan acceptor,

sucrose, fructose, UDP en UDP-glucose.

Ook de enantioselectiviteit van de α-glycosylering werd bestudeerd (tabel 11). Hiertoe werden NMR-

spectra van de eerder gesynthetiseerde glucosiden geanalyseerd op de aanwezigheid van een mogelijk

tweede product. Ook werden reacties op kleine schaal uitgevoerd om de ees na reactie te bepalen.

Enkel voor 26aαG bleek er een klein aandeel van een ander glucoside aanwezig. Hieruit blijkt dat de

enantioselectiviteit hoog tot volledig is (de = 91-100%).

Tabel 11: Enantioselectiviteit van de α-glycosylering.

Verbinding R1 R2 ees (%) (omzetting (%))a,b dep (%) (omzetting (%))c

26a iPr Bn 0,9 (11) 91 (23)

26b Pr iPr -d (17) 100 (50)

26c Ph Bn 11,6 (10) 100 (10) a Negatieve waarde betekent een selectiviteit voor het andere enantiomeer. b Bepaald via chirale HPLC met een ChiralPak® IA kolom, n-hexaan/isopropanol (96/4), 1 mL/min, 35 °C, 220 nm. c Bepaald via 1H-NMR (D2O).

d Accurate bepaling ees was niet mogelijk door co-elutie van een onzuiverheid uit het reactiemengsel.

Vanwege de vermelde obstakels kon er moeilijk een duidelijke conclusie met betrekking tot de

enantioselectiviteit van UGT-76G1Sr getrokken worden. In de literatuur zijn er enkele gevallen bekend

van GT’s die met hoge enantioselectiviteit glycosyleringen katalyseren.61,71,79,80,155 De invloed van

reactieomstandigheden op de enantioselectiviteit van GT’s werd echter nog niet in detail bestudeerd.

In verder onderzoek zou deze selectiviteit grondiger bestudeerd kunnen worden, om zo eventueel


50

omstandigheden te vinden waarbij een hogere enantioselectiviteit wordt bekomen. Voor de α-

glucosylering met TtSPP_R134A kan echter wel geconcludeerd worden dat deze met een erg hoge

enantioselectiviteit plaatsvindt en aldus een route vormt naar optisch zuivere α-glucosiden en

alcoholen.

3.4 Enzymatische glycosylering van bicyclische β-lactamalcoholen

Bicyclische β-lactamen 107 werden in dit volgende luik getest als nieuwe substraten in enzymatische

glycosyleringsreacties. Voor deze bicyclische substraten 107 werden reacties gestart onder dezelfde

omstandigheden als voor de monocyclische β-lactamen 26. De bicyclische acceptoren 107 zijn echter

starre en meer gehinderde substraten dan de monocyclische β-lactamalcoholen 26, hetgeen tot uiting

komt in hun reactiviteit. Er werd ook gepoogd een ander enzym dat gekend staat om zijn erg brede

substraatspecificiteit, OleD, tot expressie te brengen en zijn activiteit voor deze bicyclische structuren

te evalueren.

3.4.1 α-Glycosylering van bicyclische β-lactamalcoholen

In voorgaand onderzoek bleek dat het sucrose 6'-fosfaat fosforylase, TtSPP_R134A, in staat was

3-hydroxy-β-lactamen 26 te glycosyleren. De reactieomstandigheden werden reeds geoptimaliseerd

en reacties op preparatieve schaal met sucrose als glucosyldonor en aceton als co-solvent gaven

aanleiding tot de gewenste α-glucosiden 26αG in een rendement van 2-17%.38,39 Er werd getest of dit

enzymsysteem ook de bicyclische β-lactamalcoholen 107 zou kunnen glucosyleren.

Het enzym aangewend voor de α-glycosylering, TtSPP_R134A, is een mutant van een thermostabiel

sucrose 6’-fosfaat fosforylase (SPP) afkomstig uit Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum

(Tt). Het geprefereerde substraat is sucrose 6’-fosfaat (Km = 13 mM). Sucrose, een veel goedkopere

donor, kan echter ook als glycosyldonor aangewend worden (Km = 77 mM).156 GP’s katalyseren drie


51

types reacties: glycosyltransfer van en naar fosfaat (respectievelijk synthese en fosforolyse), hydrolyse

en transglycosylering.157

De transglycosylering met SPP maakt gebruik van een double displacement (‘ping-pong’) mechanisme.

Zure katalyse protoneert de leaving group, fructose, en een nucleofiel carboxylaatresidu valt aan op

het anomere koolstofatoom van sucrose 128 met vorming van een covalent enzym-

substraatintermediair 129. Vervolgens wordt de hydroxylgroep van een acceptor 123 gedeprotoneerd,

welke dan aanvalt op het anomere koolstofatoom met verbreking van de covalente enzym-

glucosebinding. Deze twee nucleofiele substituties, elk gepaard met inversie van de stereochemie,

zorgen ervoor dat de α-configuratie van de donor 128 in het product 123αG behouden blijft.157–159

Na enzymexpressie werden celpellets gezuiverd door middel van cellyse met lysozym en sonicatie

gevolgd door een hittezuivering. Vervolgens werden reacties op kleine schaal opgestart met de

bicyclische β-lactamen 20-21b. Aangezien deze verbindingen wateroplosbaar zijn, werd er geen co-

solvent meer toegevoegd, hetgeen de enzymstabiliteit positief kan beïnvloeden. Het eerst

gesynthetiseerde isopropylderivaat 21a werd getest en mogelijke vorming van geglycosylereerde

producten werd nagegaan via LC-MS en TLC. Er werd geen product waargenomen, ook niet na lange

reactietijden (drie weken). Aangezien deze teleurstellende resultaten mogelijks veroorzaakt werden

door sterische hinder van de isopropylgroep, werd er besloten kleinere bicyclische derivaten 21b en

20 te synthetiseren en te testen. In eerder onderzoek bleek al dat TtSPP_R134A kleinere acceptoren

prefereert.39 Ook met deze minder gehinderde verbindingen 21b en 20 werd er echter geen

productvorming waargenomen.


52

3.4.2 β-glycosylering van bicyclische β-lactamalcoholen

3.4.2.1 β-glycosylering met UGT-76G1Sr

Voor de β-glycosylering met UGT-76G1Sr werden de reactieomstandigheden die effectief bleken voor

de glycosylering van de monocyclische β-lactamalcoholen 26 toegepast op de bicyclische acceptoren

20-21b. Er werd echter geen productvorming waargenomen via TLC en LC-MS, ook niet na opdrijven

van de acceptorconcentratie 21a.

3.4.2.2 β glucosylering met OleD

Aangezien de eerder aangewende enzymatische methoden voor glycosylering van monocyclische β-

lactamalcoholen 26 niet succesvol bleken voor de bicyclische derivaten 20-21b, werd er gezocht naar

een ander enzym om deze transformatie uit te voeren. Recente studies op OleD, het oleandomycine

glucosyltransferase uit Streptomyces antibioticus, gaven aan dat dit enzym over een zeer brede

substraatspecificiteit beschikt.145,160 OleD katalyseert in vivo de β-glucosylering van oleandomycine 130

gebruik makend van UDP-glucose als donor om glucoside 131 te produceren.161 Oleandomycine 130 is

een macrolide antibioticum met bacteriostatische activiteit. Het bindt op de 50S subeenheid van de

ribosomen waar het de translatie en de vorming van de 50S subeenheid inhibeert.162 In vivo inactiveert

de oleandomycineproducerende bacterie intracellulaire oleandomycine 130 door glycosylering.163 De

producent excreteert daarnaast ook een enzym dat het inactieve geglucosyleerde oleandomycine 131

terug omzet tot het actieve antibioticum.164 De reeds brede substraatspecificiteit van OleD werd

verder uitgebreid door middel van enzyme engineering, waarbij een drievoudige mutant

(A242V/S132F/P67T, afkorting: ASP) gegenereerd werd met een sterk vergrote substraatspecificteit.144


53

De substraatspecificiteit van deze mutant bleek enorm breed te zijn en omvatte antrachinonen,

polyenen, steroïden, macroliden, β-lactamen, eendiynen, alifatische alcoholen, alifatische thiolen, N-

gesubstitueerde anilinen, oximen, hydrazinen, hydraziden, N-hydroxyamiden, carbonzuren… OleD is

het eerste gerapporteerde GT dat de vorming van zowel O-, S- als N-glycosidische bindingen kan

katalyseren. Naast zijn opvallende substraatspecificteit was OleD wel opmerkelijk regio- en

stereoselectief, ook in de aanwezigheid van meerdere nucleofielen. Dit enzym leek dan ook zeer

veelbelovend om de sterisch gehinderde bicyclische β-lactamalcoholen te glycosyleren.145 Voor de

expressie en zuivering van OleD werden proceduren uit recent gepubliceerd onderzoek gebruikt.144,145

Vervolgens werden reacties op kleine schaal uitgevoerd volgens omstandigheden beschreven in de

literatuur145 en daarnaast ook met het recyclagesysteem voor UDP-glucose via sucrose synthase

aangewend voor de eerdere β-glycosyleringen. Ook bij dit nieuwe, nochtans veelbelovende enzym,

werden helaas geen geglucosylereerde producten 107βG waargenomen.

Dit teleurstellende resultaat deed sterk twijfelen aan de activiteit van het gefermenteerde enzym. Om

de activiteit van OleD na te gaan werd de glucosylering getest van fenol 132, een goede acceptor.145

De glucosylering van fenol 132 leidde echter ook niet tot een detecteerbaar product. Hierdoor werd

besloten dat er een probleem was opgetreden met de enzymexpressie, hetgeen werd bevestigd via

natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE). Binnen het tijdsbestek van deze

Masterproef kon deze expressie echter niet opnieuw worden uitgevoerd.


54

3.5 Chemische glycosylering van β-lactamalcoholen

Aangezien de geteste enzymatische glycosyleringsmethoden niet bleken te werken voor de

verschillende bicyclische β-lactamen 20-21b, werd er ook gezocht naar een mogelijkheid om deze

transformatie op een zuiver chemische wijze uit te voeren. Daarbij zou een 3-hydroxy-β-lactam 133

gekoppeld worden aan een geschikte glucosyldonor, hetgeen na een eventuele ontscherming

resulteert in een α- of β-geglucosyleerd 3-hydroxy-β-lactam 133G.

Heel algemeen kan een chemische glycosylering als volgt worden voorgesteld. Van een geschikte

glycosyldonor 134 wordt de anomere hydroxylgroep tot een leaving group (LG) getransformeerd en

zijn alle andere hydroxylgroepen beschermd (PG). Toevoegen van een activator activeert de leaving

group, leidend tot de vorming van het oxocarbeniumion 135. De hydroxylgroep van de acceptor 123

kan dan langs boven of langs onder de ring aanvallen. Zonder neighbouring group participation (NGP)

zal hieruit een mengsel van α- en β-anomeren ontstaan. NGP met bijvoorbeeld een acylgroep op C2,

schermt één kant van de ring af voor reactie, hetgeen ervoor zorgt dat de stereochemie gecontroleerd

wordt.36

Een literatuuronderzoek in een voorgaande Masterproef omvatte de chemische synthese van

geglycosyleerde β-lactamen.38 Eén van de weinige syntheseroutes in de literatuur waarbij de

3-hydroxylgroep van een β-lactam effectief gekoppeld werd met het anomere koolstofatoom van een

glycosyldonor betrof de glycosylering met glycal 137 in aanwezigheid van katalytische hoeveelheden

dijood (I2). Als voorbeeld staat de reactie van cis-3-hydroxy-1-(4-methoxybenzyl)-4-fenylazetidin-2-on

136 met glycal 137 hieronder weergegeven. Deze glycosylering leidde stereospecifiek tot de vorming

van een α-2,3-onverzadigd glycoside 139 via de Ferrier-omlegging.115 Stereoselectieve dihydroxylering

van dit onverzadigd glycoside met osmium(VIII)oxide (OsO4) gevolgd door ontscherming van de

acetylgroepen zou tot de gewenste α-geglucosyleerde β-lactamen kunnen leiden.165–168 Door het nodig


55

zijn van deze extra chemische dihydroxyleringsstap werd er echter gezocht naar een andere

syntheseweg.

Als alternatief werd geopteerd voor één van de eerste chemische glycosyleringen, de Koenigs-

Knorrglycosylering. Deze werd reeds gepubliceerd in 1901 en houdt een reactie in tussen een

glycosylhalogenide en een alcohol.169 Deze methode is grondig bestudeerd en verbeterd met de tijd,

en tegenwoordig bestaan er ook waardevolle alternatieven.170,171 Het betreft echter nog steeds de

geprefereerde methode wanneer gesofisticeerdere proceduren falen.169 Hierbij reageren per-O-

geacyleerde glycosylhalogeniden met een alcohol in aanwezigheid van een zwaar-metaalzout of een

organische base als zuuracceptor. Deze laatste versnelt ook de reactie en voorkomt nevenreacties

zoals deacylering.172 De eenvoudigste variant gebruikt 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-

glucopyranosylbromide 140 als glucosyldonor en zilverzouten als activator.173 Het toevoegen van een

zilverzout genereert het oxocarbeniumion 141. Interactie met de naburige acetylgroep op C2 (NGP)

vormt dan het acyloxoniumion 142. Hiermee kan dan de hydroxylgroep van de acceptor (ROH)

reageren, leidend tot vorming van het β-glucoside . De aanval van de hydroxylgroep van de acceptor

(ROH) kan echter ook op het acylkoolstofatoom plaatsvinden, leidend tot de vorming van ortho-ester

145 als frequent voorkomend nevenproduct.172


56

Vanwege de kortere en eenvoudigere syntheseroute tot de monocyclische β-lactamen werden de

chemische glycosyleringsmethoden eerst hiermee getest. De glycosyldonor, 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-

D-glucopyranosylbromide 140, kan als dusdanig aangekocht worden, maar kan ook zeer eenvoudig

bereid worden vanuit goedkope startmaterialen in een one-pot-synthese.174 Daartoe werd glucose 61

eerst geacyleerd tot het penta-acetaat 146 met behulp van azijnzuuranhydride en een zure

katalysator. Hierna werden acetylbromide en methanol toegevoegd, hetgeen leidde tot de in situ

vorming van waterstofbromide en zo de vorming van 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-

glucopyranosylbromide 140 in kwantitatieve rendementen en met hoge zuiverheid na indampen van

het solvent. De selectiviteit voor het α-anomeer wordt verklaard door het anomere effect, namelijk

het stabieler zijn van de axiale oriëntatie van elektronegatieve substituenten naast een heteroatoom

in een cyclohexaanring. Voor geacyleerde aldopyranosylhaliden zoals verbinding 140 is deze voorkeur

zo groot dat ze zorgt voor een volledige selectiviteit voor het α-anomeer.175,176 α-Halogeenethers zoals

verbinding 140 ondergaan in het algemeen een snelle solvolyse, hetgeen leidt tot het domineren van

het thermodynamische stabielere α-anomeer.177

In de volgende stap werd deze glycosyldonor aangewend om 3-hydroxy-β-lactam 26c te glycosyleren.

Een aantal conventionele reactieomstandigheden werden getest,172,178,179 met op het eerste zicht

veelbelovende resultaten, ondanks de noodzaak aan meerdere equivalenten glycosyldonor 140.

Pogingen A en B werden samen gezuiverd via automatische reversed phase kolomchromatografie (C18)

in een rendement van 14%. Na NMR-analyse bleek echter dat het product bijna exclusief ( >90% o.b.v.

1H-NMR (CDCl3)) bestond uit ortho-ester 147, in plaats van het gewenste glycoside 148.


57

Tabel 12: Omstandigheden voor de Koenigs-Knorrglycosylering met 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosylbromide 140.

Poging Omstandigheden Resultaata

A 6 eq. 140, 6 eq. Ag2CO3

CH2Cl2, moleculaire zeven (4Å), kt, 72 h

50% omzetting

B 6 eq. 140, 6 eq. Ag2O

CH2Cl2, moleculaire zeven (4Å), kt, 72 h

35% omzetting

C 4 eq. 140, 4 eq. Ag2CO3

tolueen, Δ, Dean-Stark, 16 h

50% omzetting, afbraak overnacht

a Bepaald via LC-MS.

De vorming van ortho-esters 147 werd bevestigd via NMR-analyse omdat de signalen van één van de

vier acetylgroepen verschoven waren van ~170 naar 121,0 en 121,4 ppm (δ, 13C-NMR, CDCl3), typische

waarden voor ortho-esters.65,179,69 Bij glycosylering van cholesterol 149 door Presser et al. met dezelfde

glucosyldonor 140, tetramethylureum (TMU) als zuurvanger en zilvertriflaat (AgOTf) als activator werd

ook bijna uitsluitend ortho-ester 150 bekomen.173

De literatuur geeft aan dat sterisch meer gehinderde beschermgroepen voor de hydroxylgroepen

zouden leiden tot een grotere anomere en regioselectiviteit in de Koenigs-Knorrglycosylering.173,181–183

Vandaar dat er besloten werd de hydroxylgroepen onder de vorm van pivaloylgroepen (t-BuCO) te

beschermen. Voor de synthese van 2,3,4,6-tetra-O-pivaloyl-α-D-glucopyranosylbromide 152 werd een

procedure uit de literatuur gevolgd.173 D-Glucose 61 werd in aanwezigheid van acht equivalenten

pivaloylchloride (PivCl), acht equivalenten triëthylamine als zuurvanger en een katalytische

hoeveelheid 4-dimethylaminopyridine (DMAP) als nucleofiele katalysator omgezet tot 1,2,3,4,6-penta-

O-pivaloyl-D-glucopyranose 151.184 Na zuivering door omkristallisatie in ethanol werd de anomere

pivaloylgroep vervangen door een broomatoom met trimethylsilylbromide (TMSBr) als bromidedonor

en een katalytische hoeveelheid Lewiszuur, bismuth(III)bromide (BiBr3). Ook hier wordt de selectiviteit

voor het α-anomeer verklaard door het anomere effect.


58

Deze glucosyldonor 152 werd dan vervolgens aangewend in de Koenigs-Knorrglycosylering. De

precieze omstandigheden zijn weergegeven in tabel 13, en werden gekozen na analyse van de

literatuur.173,181,182 Er werden telkens slechts sporen van het gewenste product waargenomen via LC-

MS. Een poging tot zuivering vond plaats via reversed phase kolomchromatografie (C18). Het gewenste

product kon echter nooit geïsoleerd worden.

Tabel 13: Koenigs-Knorrglycosylering met 2,3,4,6-tetra-O-pivaloyl-α-D-glucopyranosylbromide 152.

Poging Omstandigheden Resultatena

A 2 eq. 152, 2 eq. AgOTf, 2 eq. 2,6-lutidine,

CH2Cl2, kt, 72 h

Zeer lage omzettingen (< 10%), vormen van een complex

reactiemengsel

B 1,5 eq. 152, 2 eq. Ag2CO3

Et2O, moleculaire zeven (4Å), kt, 72 h


reactiemengsel

C 1,5 eq. 152, 2 eq. Ag2O

Et2O, moleculaire zeven (4Å), kt, 72 h


reactiemengsel

D 1,5 eq. 152, 1,5 eq. AgOTf, 2 eq. TMU

CH2Cl2, -40 °C tot kt, 72 h


reactiemengsel a Bepaald via LC-MS.

De zeer teleurstellende resultaten van de geteste glycosyleringsmethoden bevestigen het complexe

karakter van deze chemie en de voordelen die enzymatische methoden kunnen bieden. De reactie met

een glycal onder katalyse van dijood gevolgd door stereoselectieve dihydroxylering zou nog een

interessante chemische route kunnen vormen naar de geglucosylereerde 3-hydroxy-β-lactamen 133G.

Er bestaan nog vele andere chemische glycosyleringsmethoden en glycosyldonors zoals thioglycosiden,

trichlooracetimidaten, 4-pentenylglycosiden…36,169,185 Verdere uitdieping van de chemische

glycosylering viel echter buiten het doel van deze Masterproef.


59

3.6 Conclusie en perspectief

Drie verschillende monocyclische 3-hydroxy-β-lactamen werden succesvol chemisch gesynthetiseerd

en vervolgens enzymatisch geglucosyleerd tot hun overeenkomstige β-glucosiden. Deze konden

volledig gekarakteriseerd worden met behulp van NMR, IR en MS. Organische chemie werd dus

succesvol gecombineerd met biokatalyse voor de synthese van deze uitdagende nieuwe verbindingen.

Het aangewende enzym heeft echter moeite om de 3-hydroxy-β-lactamen te glycosyleren, wat tot

uiting komt in de lage omzettingen (4-14%) en rendementen (0,2-1,4%) die behaald werden.

Mogelijke verbeteringen om hogere omzettingen en rendementen te bekomen zullen hier worden

aangereikt. Een eerste, voor de hand liggende mogelijkheid is het toevoegen van meer enzym. De

fermentatie en vooral de zuivering van het enzym zou hierdoor echter al snel een knelpunt worden.

Een tweede mogelijkheid bestaat uit enzyme engineering, hetgeen zowel de stabiliteit van de enzymen

als hun affiniteit voor de gebruikte acceptoren zou kunnen doen toenemen. Ook andere manieren om

enzymen te stabiliseren zoals chemische modificatie, immobilisatie en additieven (medium

engineering) zouden toegepast kunnen worden.186 Ten derde kunnen er geschiktere enzymen, met

een hogere affiniteit of stabiliteit, gezocht worden om deze transformatie uit te voeren. Een laatste

manier om hogere rendementen te bekomen is het verbeteren van de zuiveringsprocedure. De

noodzaak tot twee chromatografische zuiveringen gaat met een lage recovery gepaard. Preparatieve

HPLC met zijn hogere resolutie zou deze zuivering eventueel in één stap kunnen bewerkstelligen.

In toekomstig onderzoek zou de enantioselectiviteit van de aangewende enzymen verder bestudeerd

kunnen worden. Sucrose 6’-fosfaat fosforylase beschikte over een (bijna) volledige enantioselectiviteit

voor één van de twee enantiomeren van de racemische 3-hydroxy-β-lactamen. In verder onderzoek

zou onderzocht kunnen worden of het ook andere chirale alcoholen enantioselectief kan glycosyleren,

om zo een route naar optisch zuivere α-glycosiden en alcoholen te vormen. Voor de β-glycosylering

kon reeds geconcludeerd worden dat deze met een lage tot middelmatig enantioselectiviteit

plaatsvond, die bovendien beïnvloed werd door de reactieomstandigheden (solvent, temperatuur).

Deze enantioselectiviteit en zijn beïnvloedende factoren zou in de toekomst verder onderzocht kunnen

worden.

Voor de nieuwe bicyclische β-lactamalcoholen konden nog geen glucosiden gesynthetiseerd worden.

Verder onderzoek naar andere enzymen om deze substraten te glycosyleren is dan ook aangewezen.

Zeker OleD zou veel potentie hebben, door problemen met de eiwitexpressie kon er echter nog geen

conclusie hierover getrokken worden. De moeilijkheden ondervonden bij de enzymatische

glycosylering van bicyclische β-lactamalcoholen duiden wel aan dat er een behoefte is aan nieuwe

enzymen met een grotere substraatspecificiteit om glycosyleringsreacties uit te voeren

Samenvatting en besluit

60

4 Samenvatting en besluit β-Lactamen vormen een klasse heterocyclische verbindingen met een enorm belang in de organische

en medicinale chemie. Sinds de ontdekking van penicilline in 1928 maken β-lactamantibiotica een

essentieel onderdeel uit van de hedendaagse geneeskunde. De noodzaak tot nieuwe antibiotica door

groeiende resistentievorming houdt de synthese van nieuwe β-lactamen relevant. Hun belang wordt

nog vergroot door de vele andere potentiële biologische activiteiten die β-lactamen kunnen bezitten

(antitumor, antiviraal, antidiabetisch…) en hun rol in de organische chemie via de β-lactam synthon

method.

Glycosylering, één van de meest voorkomende en belangrijkste modificaties van biomoleculen, kan de

eigenschappen van het aglycon drastisch veranderen (wateroplosbaarheid, stabiliteit,

biobeschikbaarheid, biologische activiteit…). Geglucosyleerde β-lactamalcoholen kunnen zo

interessante farmacologische eigenschappen vertonen en daarnaast kunnen ze ook als

geglucosyleerde precursoren optreden in de organische synthese. Glycosyleringsreacties zijn erg

moeilijk uit te voeren via klassieke organische chemie en vormen dus een uitstekend terrein voor

biokatalyse. Hierbij kunnen enzymen, met een hoge selectiviteit en activiteit, synthetische routes

verkorten en vereenvoudigen door het wegnemen van beschermings-, ontschermings- en

activeringsstappen.

4.1 Samenvatting

In een eerste luik van deze Masterproef werden monocyclische β-lactamalcoholen gesynthetiseerd via

de Staudingersynthese. In een tweede luik werd dan gepoogd deze substraten te glucosyleren door

middel van biokatalyse. Ook de enantioselectiviteit van de enzymatische glycosylering werd

bestudeerd. Daarnaast werden nieuwe bicyclische β-lactamalcoholen gesynthetiseerd en geëvalueerd

in de enzymatische glycosyleringsreacties. Tenslotte werd ook een chemische route naar

geglucosylereerde β-lactamen geëvalueerd.

De synthese van de monocyclische β-lactamalcoholen vi startte met de vorming van iminen iii door

behandeling van aldehyden i met primaire aminen ii. 3-Acetoxy-azetidin-2-onen v werden vervolgens

gevormd door middel van een Staudingersynthese met acetoxyacetylchloride iv. De finale stap

bestond uit de ontscherming van de acetylgroep in laatstgenoemde verbindingen, hetgeen aanleiding

gaf tot de gewenste monocyclische β-lactamalcoholen vi.

In een volgend luik werden deze monocyclische 3-hydroxy-β-lactamen vi enzymatisch geglucosyleerd

tot de overeenkomstige β-glucosiden β-vii. In eerder onderzoek werden al succesvol de

overeenkomstige α-glucosiden α-vii van deze verbindingen gesynthetiseerd, de β-glucosiden werden

echter nog niet eerder zuiver bekomen. In deze Masterproef werden de drie β-glucosiden β-vii in hoge


61

zuiverheid gesynthetiseerd en volledig gekarakteriseerd door middel van een enzymatische

glucosyleringsreactie. Hiertoe werden de benodigde enzymen (UGT-76G1Sr en SuSy) gefermenteerd

en gezuiverd. Vervolgens werd een nieuw co-solvent gezocht ter vervanging van het moeilijk te

verwijderen DMSO. Bovendien werd een kostenbesparend recyclagesysteem voor UDP-glucose

geïmplementeerd, gebruikmakend van sucrosesynthase. β-Glucosyleringen op preparatieve schaal

gaven na zuivering via normal en reversed phase kolomchromatografie aanleiding tot de

doelverbindingen. Klassieke organische synthese werd dus succesvol met biokatalyse gekoppeld om

deze nieuwe verbindingen te synthetiseren.

De enantioselectiviteit van de gebruikte enzymen werd vervolgens bestudeerd. Het sucrose 6’ fosfaat

fosforylase (TtSPP_R134A), aangewend in de α-glucosylering, beschikt over een (bijna) volledige

enantioselectiviteit voor één van de twee enantiomeren van de racemische 3-hydroxy-β-lactamen vi.

Hierdoor vormt deze enzymatische glycosylering dus een route naar diastereomeer zuivere α-

glucosiden α-vii en een mogelijkheid tot kinetische resolutie van 3-hydroxy-β-lactamen vi. Voor de β-

glycosylering met het glucosyltransferase uit Stevia rebaudiana (UGT-76G1Sr) kon er geconcludeerd

worden dat deze met een lage tot middelmatige enantioselectiviteit plaatsvond, dewelke echter wel

afhing van de reactieomstandigheden (solvent, temperatuur). Een duidelijke conclusie omtrent de

invloed van de reactieomstandigheden kon echter nog niet getrokken worden, voornamelijk te wijten

aan de lage omzettingen van de startmaterialen.

Om de substraatspecificiteit van de gebruikte enzymen te verbreden, werden eveneens nieuwe

bicyclische β-lactamalcoholen xx en xxi gesynthetiseerd. Deze syntheseroute loopt gelijk met eerder

onderzoek122 en startte met de vorming van optisch zuiver (R)-glyceraldehydeacetonide ix via

oxidatieve splitsing van 1,2:5,6-di-O-isopropylideen-D-mannitol viii. Iminering van dit aldehyde ix met

2-chloorethylamine x gevolgd door Staudingersynthese met benzyloxyacetylchloride xii gaf aanleiding


62

tot β-lactam xiii. Hydrolyse van het acetaal xiii, gevolgd door oxidatieve splitsing van het zo gevormde

diol xiv, gaf aanleiding tot (3R,4R)-3-benzyloxy-1-(2-chloorethyl)-4-formyl-β-lactam xv. Iminering van

aldehyde xv gevolgd door reductie en ringsluiting leidde tot (6S,7R)-7-benzyloxy-1,4-

diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-onen xvii. Anderzijds gaf reductie van aldehyde xv, gevolgd door

deprotonering en ringsluiting, aanleiding tot (6S,7R)-7-benzyloxy-4-oxa-1-azabicyclo[4.2.0]octaan-8-

on xix. Voor benzylbeschermde β-lactamen xvii en xix werd vervolgens een ontscherming uitgebouwd

door middel van een hydrogenolysereactie met waterstofgas. Bicyclische β-lactamalcoholen xxi en xx

konden zo eenvoudig en in zuivere vorm bekomen worden. Dubbele ontscherming trad hierbij op bij

N- en O-benzylbeschermde β-lactamen xvii.


63

Vervolgens werd het potentieel van deze bicyclische β-lactamalcoholen xxi en xx in de enzymatische

glucosyleringsreacties geëvalueerd. De enzymsystemen die de glycosylering van monocyclische β-

lactamen vi succesvol katalyseerden, bleken echter geen aanleiding te geven tot waarneembare

producten xxii voor deze nieuwe substraten. Er werd dan ook gepoogd een ander enzym, OleD, aan te

wenden voor deze glucosyleringsreactie. Door problemen met de expressie van dit enzym kon hierover

echter geen conclusie getrokken worden.

Door bovenstaande problemen met de glycosylering van bicyclische β-lactamalcoholen xxi en xx werd

ook een chemische weg ter vorming van de doelverbindingen geëvalueerd. Hiertoe werden twee

verschillende glucosyldonoren xxiii en xxiv gesynthetiseerd vanuit glucose en vervolgens aangewend

voor de Koenigs-Knorrglucosylering van β-lactam xxv. Deze methode bleek echter ook verschillende

hindernissen met zich mee te brengen. Voor glycosyleringen met xxii werden voornamelijk ortho-

esters als hoofdproduct bekomen en voor glycosyleringen met de meer gehinderde glycosyldonor xxiv

werden slechts sporen van het gewenste product aangetroffen. De gewenste geglucosyleerde

β-lactamen xxvi konden via deze methoden dus niet bekomen worden. Andere chemische

glycosyleringsmethoden en glycosyldonoren zoals thioglycosiden of trichlooracetimidaten zouden

eventueel wel effectief kunnen zijn. De moeilijkheden ondervonden met de chemische glycosylering

duiden echter wel de voordelen aan die biokatalyse kan bieden.

4.2 Besluit

β-Lactamen vormen waardevolle verbindingen in de organische en medicinale chemie. Hun belang kan

bovendien enkel toenemen gezien de groeiende antibiotica-resistentievorming. Glycosylering is één

van de belangrijkste modificaties van biomoleculen en kan de farmacologische eigenschappen van

verbindingen gunstig beïnvloeden. De lage wateroplosbaarheid van bepaalde β-lactamen maakt de

glycosylering ervan daarom uiterst interessant om bruikbare medicinale verbindingen te bekomen.

Ondanks het grote belang van deze chemie is er nog maar weinig onderzoek gevoerd naar het

glucosyleren van β-lactamen. In deze Masterproef en in voorgaand onderzoek werden de α- en β-

glucosiden van monocyclische β-lactamalcoholen gesynthetiseerd met behulp van twee enzymen,

TtSPP_R134A en UGT-76G1Sr. De α- glycosylering bleek met een hoge enantioselectiviteit te verlopen,

terwijl de β-glycosylering met een lage selectiviteit plaatsvond die afhankelijk was van de


64

reactieomstandigheden. De substraatspecificiteit van deze enzymen bleek echter niet breed genoeg

om ook bicyclische β-lactamalcoholen te glucosyleren, en daarnaast bleven de bekomen omzettingen

en rendementen erg laag. Enzyme engineering, het screenen van nieuwe enzymen en het verbeteren

van de zuivering zouden een oplossing voor deze problemen kunnen bieden.

In deze Masterproef werden organische synthese en biokatalyse succesvol gecombineerd. Daardoor

werd er een stap gezet naar de verdere integratie van biokatalyse in de organische chemie, hetgeen

onderdeel uitmaakt van groene chemie en daarom een groot belang heeft in het kader van duurzame

ontwikkeling.

Experimenteel deel

65

5 Experimenteel deel

5.1 Analysemethoden

5.1.1 Dunnelaagchromatografie (TLC)

Voor de analyse van ruwe reactiemengsels, de bepaling van Rf-waarden en de controle van fracties na

kolomchromatografie werd dunnelaagchromatografie met een experimenteel bepaald eluens

gehanteerd. Daartoe werden silicaplaatjes (Merck Silicagel 60 F254, precoated, dikte 0,25 mm) gebruikt.

Detectie van de verbindingen gebeurde door middel van UV-belichting of met behulp van een

kaliumpermanganaatoplossing. Voor de analyse van glycosiden werden aluminiumoxideplaten (Merck

TLC Aluminium Oxide 60 F254) gebruikt. Detectie gebeurde door UV-belichting of een waterige

zwavelzuuroplossing (10 v/v%).

5.1.2 Preparatieve dunnelaagchromatografie (prep. TLC)

Voor zuivering op zeer kleine schaal (tot 10 mg) werden analytische silicaplaten gebruikt (Merck

Silicagel 60 F254, precoated, dikte 0,25 mm). Op grotere schaal werd zuivering uitgevoerd via prep. TLC

met behulp van Analtech Silicaplaten GF, precoated met UV 254, 20 x 20 cm en met een dikte van 2,0

mm. Detectie gebeurde door UV-belichting of met behulp van een kaliumpermanganaatoplossing.

5.1.3 Kolomchromatografie

Voor de preparatieve zuivering van ruwe reactiemengsels door middel van kolomchromatografie werd

silicagel aangewend als stationaire fase (35-70 μm diameter en ca. 6 nm poriediameter). Afhankelijk

van de hoeveelheid te zuiveren product werd de diameter van de gebruikte glazen kolommen gekozen.

Bij de elutie bedroeg de uitloopsnelheid van het solventfront ongeveer 5 cm per minuut. Het geschikte

eluens werd bepaald aan de hand van dunnelaagchromatografie.

5.1.4 Automatische kolomchromatografie

Automatische kolomchromatografie werd uitgevoerd door middel van een Grace Reveleris™ Flash

Chromatography systeem (SiO2) of een Buchi Reveleris® X2 Flash Chromatography system (C18).

Hiertoe werden herbruikbare kolommen (SiO2, korreldiameter van 0,040-0,063 mm, of C18,

korreldiameter van 0,020-0,040 mm) aangewend. De uitloopsnelheid van het solvent was afhankelijk

van het type kolom. Detectie van de verbindingen gebeurde aan de hand van ELSD-detector

(Evaporative Light Scattering Detector) en twee (Grace Reveleris™) of drie (Reveleris® X2) UV-

detectoren waarvan de golflengten werden ingesteld naargelang het te zuiveren mengsel.

5.1.5 Vloeistofchromatografie massaspectrometrie (LC-MS)

Vloeistofchromatografie massaspectrometrie (LC-MS) werd uitgevoerd aan de hand van een Agilent

1200 series LC/MSD SL-toestel, uitgerust met een Supelco Ascentis Express C18 kolom (I.D. × L 4,6 mm

Experimenteel deel

66

× 3 cm, 2,7 μm fused core partikels met 90 Å poriëngrootte), een UV-detector, een Agilent 1100 Series

MS massaspectrometer met elektronspray-ionisatiegeometrie (ESI, 4000 V, 70 eV) en een

quadrupooldetector. Het gebruikte solventmengsel bestond uit acetonitril en water, waarvan de

verhoudingen en de aangelegde gradiënten bepaald werden door de gebruikte methode. Voor het

bepalen van de omzettingen van de β-glucosyleringsreactie werd gebruikt gemaakt van LC-MS en LC-

UV in combinatie met standaardreeksen van de α-glucosiden aangemaakt in voorgaand onderzoek.39

5.1.6 NMR-spectroscopie

Een Bruker Avance Nanobay III NMR-spectrometer met een 5 mm BBFO Z-gradiënt high resolution

probe werden aangewend voor het opnemen van 1H-NMR- en 13C-NMR-spectra (respectievelijk 400

MHz en 100,6 MHz). Analyse gebeurde na het oplossen van de verbindingen in een geschikt

gedeutereerd solvent. CDCl3 met tetramethylsilaan (TMS) als interne standaard werd hiervoor

aangewend. Bij een lage oplosbaarheid werd gebruikt gemaakt van D2O. De chemische verschuiving

werd gerapporteerd als een δ-waarde in ppm en de toewijzing van signalen gebeurde in combinatie

met COSY- en HSQC-spectra.

5.1.7 Massaspectrometrie

Massaspectrometrische analyse (lage resolutie) werd uitgevoerd gebruikmakende van een Agilent

1100 MSD SL series massaspectrometer met elektronspray ionisatie geometrie (ES, 4000 V) en een

quadrupooldetector. Voor het opnemen van hoge resolutie elektronspray (ES) spectra werd gebruik

gemaakt van een Agilent Technologies 6210 Series “Time-of-Flight” massaspectrometer.

5.1.8 Infraroodspectroscopie

Infraroodspectra van zuivere verbindingen werden opgenomen met een Shimadzu IRAffinity-1S FT-IR

spectrometer. Hiertoe werd de verbinding opgelost in solvent (MeOH) en aangebracht op het optisch

element, waarna het solvent geëvaporeerd werd en met behulp van de gekoppelde LabSolutions IR

software een infraroodspectrum werd verkregen.

5.1.9 Chirale vloeistofchromatografie

Een Daicel ChiralPak® IA kolom (amylose tris(3,5-dimethylfenylcarbamaat) geïmmobiliseerd op 5 µm

silicagel, I.D. x L 4,6 mm x 250 mm) werd aangewend voor het uitvoeren van chirale HPLC-analysen.

Het aangewende solventmengsel bestond uit n-hexaan/isopropanol (96/4). De kolomtemperatuur en

het debiet bedroegen respectievelijk 35 °C en 1 mL/min.

5.1.10 Optische rotatie

Optische rotaties werden met een Jasco P-2000 polarimeter gemeten. Methanol werd als solvent en

blanco aangewend.

Experimenteel deel

67

5.1.11 Meten van de celdichtheid

Om de groei van E. coli op te volgen tijdens de enzymexpressie werd de optische densiteit van het

medium gemeten met een V-360 bio spectrofotometer (Jasco) bij 600 nm (OD600).

5.1.12 SDS-PAGE

Natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) werd gebruikt om eiwitten te

scheiden op basis van hun moleculair gewicht met als doel de aanwezigheid van een bepaald enzym

te bevestigen. Hiertoe werd elk staal (10 µL) gemengd met Laemmli buffer (20 µL), dewelke bereid

werd door het mengen van 335 µL water, 125 µL 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 250 µL glycerol, 200 µL 10%

(w/v) SDS en 20 µL 0,5% broomfenolblauw. Hierna werden de stalen 5 minuten verhit bij 100 °C. De

gel zelf bestond uit een separating en stacking gel (tabel 14). Polymerisatie werd geïnitieerd door het

toevoegen van ammoniumpersulfaat (APS) om de radicalen te vormen en tetramethylethyleendiamine

(TEMED) als stabilisator voor deze radicalen. De na polymerisatie bekomen gel werd in een tank

geplaatst met een negatieve elektrodekamer en buffer (3 g/L Tris base, 14,4 g/L glycine, 1 g/L SDS).

Vervolgens werden de stalen geladen in de gel. Daarnaast werd ook een ladder (Thermo Scientific

PageRuler Prestained, 2 µL) met meerdere eiwitten van vastgelegde groottes geladen als referentie.

Een elektrisch veld (130 V) werd over de gel aangelegd, hetgeen de negatief geladen SDS-behandelde

eiwitten deed migreren van de kathode naar de anode. Nadien werd de gel behandeld met

fixeeroplossing (40% EtOH, 10% AcOH) gedurende tien minuten gevolgd door behandeling met een

kleuroplossing (QC Colloidal Coomassie Stain) overnacht. Uiteindelijk werd de gel ontkleurd door een

aantal keren te wassen met gedeïoniseerd water tot er een heldere achtergrond werd bekomen.

Tabel 14: Samenstelling van de separation en stacking gel aangewend voor SDS-PAGE analyse.

Separation gel Stacking gel

Acryl/Bis 30% 2,4 mL 0,8 mL

Tris-HCl buffer 1,5 mL (1,5 M, pH 8,8) 1,25 mL (0,5 M, pH 6,8)

Water 2,1 mL 2,95 mL

SDS 60 µL 50 µL

TEMED 100%a 6 µL 5 µL

APS 40%a 30 µL 25 µL a Toegevoegd wanneer de polymerisatie gestart wordt.

5.2 Droge solventen

Dichloormethaan, tetrahydrofuraan, tolueen en ether werden gedroogd door middel van het MBraun

SPS-800 solvent purification system. De solventen zijn beschikbaar in Pure-Pac containers met een

capaciteit van 17 L en worden onder druk gezet met inert gas (stikstof) waarna ze door twee

filter/droogkolommen gaan. Deze roestvrij stalen kolommen (1.4301 / US 304) beschikken over een

intern volume van 4,8 L waarbij de filterdeeltjes (moleculaire zeven) afhankelijk zijn van het gebruikte

solvent. THF werd eerst door een extra filterelement gestuurd alvorens in contact te komen met de

kolommen. De gedroogde solventen werden vervolgens verzameld in afzonderlijke kolven onder

inerte atmosfeer met behulp van een membraanpomp (type MPC 301 Zp).

Experimenteel deel

68

5.3 Veiligheid

5.3.1 Algemene veiligheidsaspecten

Alle experimenten in deze Masterproef werden in het kader van veiligheid en gezondheid uitgevoerd

volgens de ‘Interne richtlijnen’ opgesteld door de onderzoeksgroep SynBioC (Vakgroep Groene Chemie

en Technologie, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Universiteit Gent). Vooraleer een experiment

aan te vangen werden steeds de Material Safety Data Sheet (MSDS) fiches van de benodigde reagentia

geraadpleegd. Daarnaast werd er extra aandacht besteed bij het aanwenden van risicohoudende

apparatuur of reagentia teneinde de persoonlijke bescherming en die van omstaanders te garanderen.

5.3.2 Specifieke veiligheidsrisico’s

Bij het experimentele werk van deze Masterproef werd getracht het gebruik van gevaarlijke

chemicaliën te beperken of veiligere alternatieven aan te wenden. In enkele gevallen was dit echter

niet mogelijk om het gewenste resultaat te bekomen. De belangrijkste risicovolle producten die

gehanteerd werden, worden hieronder beschreven met betrekking tot hun eventuele fysische,

gezondheids- en/of milieugevaren.

Silica is een dragermateriaal in chromatografische toepassingen. Ademhalingsbescherming is

aanbevolen vanwege de fijne deeltjesgrootte van dit materiaal.

Natriumhydride (95%) wordt gebruikt als sterke base. Het is een ontvlambaar vast poeder dat in

contact met water ontvlambare gassen vrijstelt. Het kan ernstige brandwonden en oogletsel

veroorzaken en dient steeds onder inerte atmosfeer en in droge omstandigheden behandelt te

worden.

Trimethylsilylbromide (TMSBr) is een ontvlambare, vluchtige vloeistof dewelke ernstige brandwonden

en oogletsels kan veroorzaken en bij contact met water HBr vrijstelt. Het aanwenden van TMSBr dient

steeds onder inerte atmosfeer en onder droge omstandigheden te gebeuren.

Benzyloxyacetylchloride en acetoxyacetylchloride kunnen sterke brandwonden veroorzaken en

reageren zeer sterk met water. Droge omstandigheden zijn dan ook noodzakelijk voor de manipulatie

van deze zuurchloriden. Deze verbindingen stellen in basisch milieu of in aanwezigheid van water HCl

vrij.

Waterstofgas kan vlam vatten bij verwarming en vormt explosieve mengsels met de lucht. Het dient

daartoe op goed geventileerde plaatsen bewaard te worden.

Dichloormethaan (CH2Cl2) is een veelgebruikt solvent. Het is een zeer volatiele vloeistof die de huid en

ogen irriteert en wordt er daarnaast van verdacht kanker te veroorzaken. Bij verhitting tot

Experimenteel deel

69

decompositie worden zeer toxische fosgeen- en HCl-dampen uitgestoten. Deze vloeistof dient steeds

in een trekkast gebruikt te worden.

Palladium op koolstof (Pd/C) is een ontvlambaar zwart poeder en dient onder inerte atmosfeer

aangewend te worden.

5.4 Beschrijving van de experimenten

5.4.1 Synthese van (6S,7R)-4-benzyl-7-benzyloxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-on 36b

In een eerste stap werd in een gevlamdroogde kolf van 50 mL 268 mg (1 mmol) (3R,4R)-3-benzyloxy-

1-(2-chloorethyl)-4-formyl-β-lactam 34, gesynthetiseerd volgens een literatuurprocedure,122 opgelost

in 25 mL droge dichloormethaan. Hieraan werd 181 mg MgSO4 (1,5 mmol; 1,5 eq.) en 107 mg

benzylamine (1 mmol, 1 eq.) toegevoegd. Reactie bij kamertemperatuur en onder stikstofatmosfeer

gedurende één uur gaf, na affiltreren van het droogmiddel en evaporatie van het solvent aan de

rotavapor, aanleiding tot 335 mg (3R,4S)-4-[(E)-(benzylimino)methyl]-3-benzyloxy-1-(2-

chloorethyl)azetidin-2-on 35b (94%).

In de volgende stap werd 357 mg (1 mmol) van het imine 35b opgelost in 20 mL methanol in een kolf

van 50 mL. De inhoud van de kolf werd door middel van een ijsbad afgekoeld tot 0 °C, waarna er

langzaam 76 mg (2 mmol; 2 eq.) NaBH4 werd toegevoegd. Dit reactiemengsel werd gedurende 16 uur

onder refluxomstandigheden geroerd, waarna er 20 mL water werd toegevoegd en het resulterend

mengsel geëxtraheerd werd met 20 mL dichloormethaan. De waterlaag werd vervolgens nog

tweemaal met 20 mL dichloormethaan geëxtraheerd. De gecombineerde organische fracties werden

gedroogd met behulp van MgSO4. Na affiltreren van het droogmiddel, indampen van het solvent aan

de rotavapor en zuivering via filtratie over silicagel (SiO2) met als eluens ethylacetaat werd er 177 mg

(6S,7R)-4-benzyl-7-benzyloxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-on 36b (55%) bekomen.

(6S,7R)-4-Benzyl-7-benzyloxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-on 36b

1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 2,08 (1H, d x d x d, J = 11,6, 11,3, 4,0 Hz,

NCH2(HCH)NBn); 2,19 (1H, d x d, J = 11,3, 10,4 Hz, NCH(HCH)NBn); 2,64

(1H, d x d, J = 11,3, 4,5 Hz, NCH(HCH)NBn); 2,71 (1H, d x d, J = 11,3, 4,4

Hz, NCH2(HCH)NBn); 2,93 (1H, d x d x d x d, J = 13,1, 11,6, 4,4, 1,2 Hz,

N(HCH)CH2NBn); 3,49 (1H, d, JAB = 13,3 Hz, N(HCH)Bn); 3,55 (1H, d, JAB = 13,3 Hz, N(HCH)Bn); 3,52-3,57

(1H, m, NCHCH2NBn)); 3,74 (1H, d x d, J = 13,1, 4,0 Hz, N(HCH)CH2NBn); 4,53 (1H, d, JAB = 11,7 Hz,

O(HCH)); 4,68 (1H, d x d, J = 4,2, 1,2 Hz, CHO); 4,79 (1H, d, JAB = 11,7 Hz, O(HCH)); 7,24-7,34 (10H, m,

CHarom). 13C NMR (100 MHz, ref = CDCl3): δ 39,2 (NCH2CH2NBn); 52,0 (NCHCH2NBn); 52,1 (NCH2CH2NBn);

52,4 (NCHCH2NBn); 63,2 (NCH2Ph); 73,6 (OCH2Ph); 82,8 (CHO); 127,4, 128,3, 128,4, 128,5, 128,6 en

129,1 (10 x HCarom); 137,0 (Carom,quat); 137,9 (Carom,quat); 167,8 (C=0). IR (ATR, cm-1): νC=O = 1755; νmax =

2926, 2336, 1667, 1452, 1398, 1346, 1148, 741, 698. MS (70 eV): m/z (%) 323 (M+ + 1, 100). Bruine

olie. Rf = 0,42 (EtOAc). Rendement na filtratie over SiO2: 55%. [𝛼]D23 = +47,5 (c = 0,10; MeOH).

Experimenteel deel

70

5.4.2 Synthese van bicyclische β-lactamalcoholen 20-21b

Als een representatief voorbeeld voor de synthese van bicyclische β-lactamalcoholen 20-21b wordt de

synthese van (6S,7R)-7-hydroxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-on 21b besproken.

In een proefbuis werd 322 mg (1 mmol) (6S,7R)-4-benzyl-7-benzyloxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-

on 36b in 4 mL methanol opgelost. Onder stikstofatmosfeer werd 129 mg palladium op geactiveerde

kool toegevoegd (40 m/m%, 10% Pd). Het resulterend mengsel werd dan in een Parr hydrogenator

(Parker Balston) geplaatst, dewelke drie maal ontgast werd en gevuld werd met waterstofgas. Het

reactiemengsel werd één week lang geroerd wordt bij kamertemperatuur onder 5 bar waterstofgas.

Het heterogene mengsel werd vervolgens gefiltreerd over celiet® en het solvent ingedampt aan de

rotavapor. Het aldus bekomen residu werd opgelost in water en twee maal geëxtraheerd met

ethylacetaat. De waterlaag werd behouden en ingedampt aan de rotavapor, hetgeen 129 mg (91%)

(6S,7R)-7-hydroxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-on 21b leverde. Voor verbinding 21a werd dezelfde

procedure gevolgd en voor verbinding 20 was er een langere reactietijd van drie weken nodig en werd

een hogere katalysatorhoeveelheid aangewend (80 m/m%). Voor deze verbinding 20 werd bijkomstig

prep. TLC (EtOAc/MeOH 87/13) uitgevoerd om een analytisch zuiver staal te bekomen.

(6S,7R)-7-Hydroxy-4-isopropyl-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-on 21a

1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1,04 en 1,05 (2 x 3H, 2 x d, J = 6,6 Hz, (CH3)2CH); 2,27 (1H,

t x d, J = 11,3, 3,9 Hz, NCH2(HCH)NiPr); 2,42 (1H, d x d, J = 11,5, 10,2 Hz,

NCH(HCH)NiPr); 2,70 (1H, ~d x d, J = 11,3, 4,5 Hz, NCH2(HCH)NiPr); 2,86 (1H, septet, J

= 6,6 Hz, (CH3)2CH); 2,91-2,99 (2H, m, NCH(HCH)NiPr en N(HCH)CH2NiPr); 3,63 (1H, d x d x d, J = 10,2,

4,7, 4,6 Hz, NCHCH2NiPr); 3,74 (1H, ~d x d, J = 13,0, 3,9 Hz, N(HCH)CH2NiPr); 4,93 (1H, d x d, J = 4,6, 1,4

Hz, CHO). 13C NMR (100 MHz, ref = CDCl3): δ 17,9 en 18,2 ((CH3)2CH); 39,7 (NCH2CH2NiPr); 47,9

(NCH2CH2NiPr); 48,1 (NCHCH2NiPr); 52,6 (NCHCH2NiPr); 55,4 ((CH3)2CH); 76,7 (CHO); 170,1 (C=O). IR

(ATR, cm-1): νOH = 3308; νC=O = 1724; νmax = 2967, 1445, 1308, 1219, 1169, 1128, 1034, 980. MS (70 eV):

m/z (%) 185 (M+ + 1, 100). Kleurloze olie. Rf = 0,25 (CH3CN/H2O 85/15). Rendement: 64%. [𝛼]D24 = +66,3

(c = 0,70; MeOH).

(6S,7R)-7-Hydroxy-1,4-diazabicyclo[4.2.0]octaan-8-on 21b

1H NMR (400 MHz, D2O): δ 2,59 (1H, ~t x d, J = 13,4, 4,8 Hz, NCH2(HCH)NH); 2,68 (1H, d

x d, J = 12,7, 10,9 Hz, NCH(HCH)NH); 2,93-3,00 (2H, m, NCH2(HCH)NH en N(HCH)CH2NH);

3,16 (1H, d, J = 12,7, 4,7 Hz, NCH(HCH)NH); 3,67-3,72 (2H, m, NCHCH2NH en

N(HCH)CH2NH); 4,98 (1H, d x d, J = 4,2, 0,9 Hz, CHO). 13C NMR (100 MHz, D2O): δ 38,7 (NCH2CH2NH);

43,4 (NCH2CH2NH); 43,8 (NCHCH2NH); 52,2 (NCHCH2NH); 75,5 (CHO); 170,3 (C=O). IR (ATR, cm-1): νOH =

3258; νC=O = 1736; νmax = 2943, 1574, 1408, 1152, 1110, 978, 511, 415. MS (70 eV): m/z (%) 143 (M+ +

1, 100). Bruine olie. Rf = 0,05 (EtOAc/MeOH/H2O 30/5/4). Rendement: 91%. [𝛼]D23 = +27,2 (c = 0,10;

MeOH).

Experimenteel deel

71

(6S,7R)-7-Hydroxy-4-oxa-1-azabicyclo[4.2.0]octaan-8-on 20

1H NMR (400 MHz, D2O): δ 3,14 (1H, d x d x d, J = 13,2, 12,2, 4,6 Hz, N(HCH)CH2O); 3,47

(1H, d x d x d, J = 11,6, 12,2, 3,0 Hz, NCH2(HCH)O); 3,62 (1H, d x d, J = 11,4, 10,9 Hz,

NCH(HCH)O); 3,70 (1H, d x d, J = 13,2, 3,0 Hz, N(HCH)CH2O); 3,83 (1H, d x d x d, J = 10,9,

4,5, 4,1 Hz, NCHCH2O); 3,93 (1H, d x d, J = 11,6, 4,6 Hz, NCH2(HCH)O); 4,20 (1H, d x d, J = 11,4, 4,5 Hz,

NCH(HCH)O); 5,04 (1H, d, J = 4,1 Hz, CHO). 13C NMR (100 MHz, D2O): δ 38,8 (NCH2CH2O); 51,1

(NCHCH2O); 65,6 (NCH2CH2O); 67,2 (NCHCH2O); 75,6 (CHO); 170,8 (C=O). IR (ATR, cm-1): νOH = 3364;

νC=O = 1730; νmax = 2972, 2868, 1410, 1094, 1045, 671, 658, 419. MS (70 eV): m/z (%) 144 (M+ + 1, 100).

Witte kristallen. Rf = 0,57 (EtOAc/MeOH 87/13). Rendement na preparatieve TLC: 21%. [𝛼]D23 = +37,0

(c = 0,10; MeOH).

5.4.3 Productie en zuivering van fosforylasen en glycosyltransferasen

5.4.3.1 Expressie in E. coli

TtSPP_R134A, UGT-76G1Sr en SuSy werden al tot expressie gebracht voor deze Masterproef. Ligatie

van het gen dat codeert voor TtSPP_R134A in het expressieplasmide pCXshP34 liet de expressie toe

van een mutant sucrose 6’-fosfaat fosforylase uit Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum. Dit

plasmide werd dan getransformeerd in E. coli CGSC8974 fosfatase-negatieve cellen.156 Analoog werden

de genen die coderen voor UGT-76G1Sr en het SuSy van Acidithiobacillus caldus (SuSyAc) geligeerd in

respectievelijk de induceerbare expressievector pET21a en de constitutieve vector pCXshP34. Deze

plasmiden werden vervolgens getransformeerd in E. coli BL21(DE3).148,187

Voor de expressie OleD werd een plasmide die het gen bevat voor mutant P67T/S132F/A242V van het

oleandomycine glycosyltransferase uit Streptomyces antibioticus (OleD) in de pET21a vector

aangekocht bij Twist bioscience en vervolgens getransformeerd in E. coli BL21(DE3). Hiertoe werd ~10

ng plasmide toegevoegd aan de electrocompetente celsuspensie, dewelke vervolgens voorzichtig werd

gemengd en getransfereerd naar een steriele pulser cuvet (Westburg, 2mm). Elektroporatie vond

plaats bij 2 kV (200 Ω). Onmiddellijk hierna werd 1 mL lysogeny broth (LB) medium (10 g/L tryptoon, 5

g/L gistextract, 5 g/L NaCl) toegevoegd en werden de cellen naar een nieuwe proefbuis getransfereerd

en geïncubeerd bij 37 °C gedurende één uur. De cellen werden vervolgens uitgeplaat in verschillende

verdunningen op LB platen waaraan 100 μg/mL ampicilline werd toegevoegd en overnacht

geïncubeerd bij 37 °C.

5.4.3.2 Productie in Erlenmeyers

Voor de productie van UGT-76G1Sr en OleD werden de stammen tot groei gebracht (37°C, 200 rpm) in

gesteriliseerde proefbuizen met 5 mL LB medium (10 g/L tryptoon, 5 g/L gistextract, 5 g/L NaCl) en

ampicilline (100 µg/mL).

Voor UGT-76G1Sr werd na incubatie overnacht 1% inoculum, 100 µg/mL ampicilline en 25 mL van een

zoutoplossing (0,17 M KH2PO4 and 0,72 M K2HPO4) toegevoegd aan 225 mL gesteriliseerd terrific broth

Experimenteel deel

72

(TB) medium (12 g/L tryptoon, 24 g/L gist extract en 5 g/L glycerol). Voor OleD werd na incubatie

overnacht 100 µg/mL ampicilline toegevoegd aan 250 mL gesteriliseerd LB medium dewelke

vervolgens geïnoculeerd werd (1%).

Na inoculatie van de erlenmeyers werd de OD600 opgevolgd. Wanneer deze een waarde van 0,6

(UGT-76G1Sr) of 0,7 (OleD) bereikte werd de inducer, isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG),

toegevoegd tot een finale concentratie van 1 mM (UGT-76G1Sr) of 0,4 mM (OleD). Na expressie

overnacht (16 °C (UGT-76G1Sr) of 28 °C (OleD), 200 rpm) werden de cellen geoogst door middel van

centrifugatie (Hettich ROTIXA 50 RS). De aldus bekomen celpellets werden ingevroren bij -20 °C.

5.4.3.3 Zuivering van de enzymen

TtSPP_R134A, SuSyAc, UGT-76G1Sr en OleD werden allen intracellulair geproduceerd door E. coli. Om

een gezuiverde enzymoplossing te bekomen, waren cellyse en zuiveringstappen nodig. In de eerste

stap, cellyse, werden de intracellulaire enzymen vrijgesteld. Voor TtSPP_R134A en SuSyAc werd er 5 g

van de bevroren celpellets opgelost in 25 mL lysebuffer (50 mM MOPS buffer, 100 μM PMSF, 1 mg/mL

lysozym, pH 7), deze werd dan 30 minuten geïncubeerd op ijs en vervolgens blootgesteld aan twee

maal 3 minuten sonicatie (Branson 250 sonifier, output control 3, 50% duty cycle). Vervolgens werd

het ruw celextract bekomen door middel van afcentrifugeren van de celresten.

Voor de lyse van de celpellets die UGT-76G1Sr en OleD bevatten werd een bevroren pellet afkomstig

van een 250 mL cultuur opgelost in 8 mL lysebuffer (500 mM NaCl, 50 mM NaPB (pH 7,4), 10 mM

imidazool, 100 μM PMSF, 1 mg/mL lysozym), en verder opgezuiverd doormiddel van Ni-NTA

affiniteitschromatografie gebruik makend van gravity-flow kolommen (MC Lab). Na elutie werd een

bufferuitwisselingsstap uitgevoerd tot 50 mM MOPS buffer (pH 7) voor UGT-76G1Sr of 50 mM TRIS

(pH 8) voor OleD in 30 kDa Amicon Ultra centrifugal filters (Merck).

Het SuSyAc bevattend ruw celextract werd niet verder gezuiverd en voor TtSPP_R134A werd er een

hittezuivering toegepast. Hiertoe werden 50 mL falcons met het ruwe celextract in een warmwaterbad

geplaatst bij 60 °C. Na één uur incubatie werden de falcons 15 minuten lang geïncubeerd. Vervolgens

werd het celextract gecentrifugeerd (14000 rpm, 15 min Hettich® Universal 320R centrifuge) en het

supernatans behouden.

5.4.3.4 Karakterisatie van de enzymen

De enzymconcentraties van de gezuiverde UGT-76G1Sr, TtSPP_R134A en OleD enzymoplossingen

werden bepaald door middel van UV-VIS spectrofotometer (Nanodrop 2000, Thermo Scientific) via de

absorptiemeting bij 260 nm. Eerst werd een blanco oplossing gemeten, namelijk de gebruikte

bufferoplossing voor de enzymoplossing. Ter bepaling van de concentratie werden twee

enzymkarakteristieken gebruikt: de extinctiecoëfficiënt en het moleculaire gewicht van het eiwit.

Experimenteel deel

73

5.4.4 Synthese van β-geglucosyleerde monocyclische β-lactamalcoholen 26a-cβG

UGT-76G1Sr werd aangewend voor de productie van β-glucosiden. De synthesen van 26aβG, 26bβG

en 26cβG vonden plaats onder gelijkaardige omstandigheden gedurende twee (26b-cβG ) of zes weken

(26aβG): 200 mM sucrose, 2 mM UDP, 15 mM 26a-c, 10 v/v% aceton, 0,111-0,186 mg/mL UGT-761Sr,

0,31-0,36 mg/mL SuSyAc, 50 mM MOPS buffer, pH 7. Het reactievolume (~100 mL) werd hiertoe

verdeeld over drie falcons van 100 mL en op een shaker geplaatst (32°C, 200 rpm).

Dunnelaagchromatografie werd aangewend om de mogelijke productie van glycosiden te bevestigen

en hun Rf waarden te bepalen. De omzettingsgraden werden opgevolgd met behulp van LC-MS en LC-

UV.

Voor de zuivering van de β-glucosiden 26a-cβG werd het reactiemengsel (~100 mL) geëxtraheerd met

100 mL isopropanol en zout (300 mg/mL). De waterlaag werd vervolgens nog twee maal met 10 mL

isopropanol geëxtraheerd. De gecombineerde organische fracties werden ingedampt aan de

rotavapor. Om het zout te verwijderen werd het product opgelost in 20 mL MeOH, gefiltreerd en

geëvaporeerd. Hierna werd kolomchromatografie (SiO2) toegepast met gradiëntelutie. EtOAc werd

gebruikt tot de acceptor volledig geëlueerd was waarna er langzaam werd overgeschakeld op

EtOAc/MeOH/H2O (30/5/4). De fracties werden geanalyseerd met behulp van TLC (EtOAc/MeOH/H2O

(30/5/4)). De glucosidebevattende fracties werden gecombineerd en ingedampt. Om een laatste

onzuiverheid te verwijderen werd er ook nog reversed phase automatische kolomchromatografie (C18)

toegepast met als eluens een gradiënt van H2O en acetonitril.

Cis-1-benzyl-3-O-β-D-glucopyranosyl-3-hydroxy-4-isopropylazetidin-2-on 26aβG

Spectrale gegevens afgeleid uit het mengsel der diastereomeren (dr = 44/56).

1H NMR (400 MHz, D2O): δ 0,92-0,99 (2 x 6H, m, 2 x (CH3)2CH); 2,10 (2 x

1H, octet, J = 6,5 Hz, 2 x (CH3)2CH); 3,33-3,41 (2 x 1H, m, 2 x CHCHβ);

3,42-3,55 (2 x 3H, m, 2 x CHCHCHCHCHβ); 3,65-3,72 (2 x 1H, m, CHiPr);

3,73-3,78 (2 x 1H, m, 2 x O(HCH)); 3,89-3,95 (2 x 1H, m, 2 x O(HCH));

4,34 (1H, d, JAB = 15,8 Hz, N(HCH)); 4,36 (1H, d, JAB = 15,4 Hz, N(HCH)); 4,52 (1H, d, J = 7,9 Hz, CHβ); 4,70

(1H, d, J = 7,8 Hz, CHβ); 4,73 (1H, d, JAB = 15,4 Hz, N(HCH)); 4,75 (1H, d, JAB = 15,8 Hz, N(HCH)); 5,08 (1H,

d, J = 4,8 Hz, CHCHiPr); 5,14 (1H, d, J = 4,9 Hz, CHCHiPr); 7,33-7,47 (2 x 5H, m, CHarom). 13C NMR (100

MHz, D2O): δ 18,0, 18,3 18,8 en 19,1 (2 x (CH3)2CH)); 27,5 ((CH3)2CH); 27,6 ((CH3)2CH); 45,8 (NCH2); 45,9

(NCH2); 60,7 (OCH2); 60,8 (OCH2); 64,7 (CHiPr); 64,9 (CHiPr); 69,6, 69,7, 75,69, 75,71, 76,0 en 76,2 (2 x

CHCHCHCHCHβ); 73,0 (CHCHβ); 73,2 (CHCHβ); 79,7 (CHCHiPr); 80,7 (CHCHiPr); 102,3 (CHβ); 102,6 (CHβ);

128,0, 128,1, 128,2 en 129,0 (2 x (5 x HCarom)); 135,09 (Carom,quat); 135,15 (Carom,quat); 170,68 (C=O); 170,72

(C=O). IR (ATR, cm-1): νOH = 3356; νC=O = 1724; νmax = 2927, 1680, 1415, 1227, 1078, 1043, 993, 419. MS

(70 eV): m/z (%) 382 (M+ + 1, 100). HRMS (ESI): berekend voor C19H28NO7+: 382,18603 [M + H]+,

gevonden: 382,1863. Kleurloze olie. Rf = 0,4 (EtOAc/MeOH/H2O 30/5/4). Rendement na

kolomchromatografie (SiO2 en C18): 0,2%.

Experimenteel deel

74

Cis-3-O-β-D-glucopyranosyl-3-hydroxy-1-isopropyl-4-propylazetidin-2-on 26bβG


1H NMR (400 MHz, D2O): δ 0,95 (2 x 3H, t, J = 7,3 Hz, 2 x CH2CH3); 1,24-1,31

(2 x 6H, m, 2 x (CH3)2CH); 1,33-1,50 (2 x 2H, m, 2 x CH2CH3); 1,68-1,82 (2 x

2H, m, 2 x CH2CH2CH3); 3,35 (2 x 1H, d x d, J = 8,4, 8,1 Hz, 2 x CHCHβ); 3,38-

3,55 (2 x 3H, m, 2 x CHCHCHCHCHβ); 3,72-3,84 (2 x (2 x 1H), m, 2 x CHiPr en

2 x O(HCH)); 3,93 (2 x 1H, d, J = 12,2 Hz, O(HCH)); 4,00-4,05 (2 x 1H, m, 2 x

CHCHPr); 4,50 (1H, d, J = 8,1 Hz, CHβ); 4,66 (1H, d, J = 8,1 Hz, CHβ); 5,01 (1H, d, J = 4,8 Hz, CHCHPr); 5,03

(1H, d, J = 4,8 Hz, CHCHPr). 13C NMR (100 MHz, D2O): δ 13,4 (CH2CH3); 13,5 (CH2CH3); 18,5 (CH2CH3);

18,7 (CH2CH3); 18,9 en 20,7 ((CH3)2CH); 19,0 en 20,6 ((CH3)2CH); 30,6 (CH2CH2CH3); 30,9 (CH2CH2CH3);

45,0 ((CH3)2CH); 45,1 ((CH3)2CH); 58,5 (CHPr); 58,7 (CHPr); 60,7 (2 x OCH2); 69,58, 69,66, 75,66, 75,69,

75,9 en 76,2 (2 x CHCHCHCHCHβ); 73,0 (CHCHβ); 73,2 (CHCHβ); 79,4 (CHCHPr); 79,6 (CHCHPr); 102,2

(CHβ); 102,4 (CHβ); 168,8 (C=0); 169,0 (C=0). IR (ATR, cm-1): νOH = 3356; νC=O = 1722; νmax = 2932, 1680,

1416, 1225, 1175, 1078, 1043, 419. MS (70 eV): m/z (%) 334 (M+ + 1, 100). Kleurloze olie. Rf = 0,38

(EtOAc/MeOH/H2O 30/5/4). Rendement na kolomchromatografie (SiO2 en C18): 1%.

Cis-1-benzyl-4-fenyl-3-O-β-D-glucopyranosyl-3-hydroxyazetidin-2-on 26cβG


1H NMR (400 MHz, D2O): δ 3,01 (1H, d x d, J = 8,8, 8,4 Hz, CHCHβ); 3,07

(1H, d x d, J = 8,5, 8,4 Hz, CHCHβ); 3,13-3,41 (2 x 3H, m, 2 x

CHCHCHCHCHβ); 3,53 (1H, d x d, J = 11,8, 5,5 Hz, O(HCH)); 3,70 (1H, d

x d, J = 11,8, 5,7 Hz, O(HCH)); 3,73 (1H, d, J = 12,0 Hz, O(HCH)); 3,89

(1H, d, J = 12,0 Hz, O(HCH)); 4,10 (1H, d, J = 8,4 Hz, CHβ); 4,13 (1H, d, JAB = 14,8 Hz, N(HCH)); 4,17

(1H, d, JAB = 15,1 Hz, N(HCH)); 4,52 (1H, d, J = 8,4 Hz, CHβ); 4,72 (1H, d, JAB = 14,8 Hz, N(HCH)); 4,73

(1H, d, JAB = 15,1 Hz, N(HCH)); 4,91 (1H, d, J = 4,6 Hz, CHPh); 4,93 (1H, d, J = 4,3 Hz, CHPh); 5,31

(1H, d, J = 4,6 Hz, CHCHPh); 5,37 (1H, d, J = 4,3 Hz, CHCHPh); 7,20-7,21, 7,32-7,35 en 7,41-7,43 (2

x 10H, 3 x m, 2 x (10 x HCarom)). 13C NMR (100 MHz, D2O): δ 44,6 (NCH2); 44,7 (NCH2); 60,66 (OCH2);

60,72 (OCH2); 61,9 (CHPh); 62,6 (CHPh); 69,2, 69,5, 75,1, 75,5 en 75,9 (2 x CHCHCHCHCHβ); 72,5

(CHCHβ); 72,8 (CHCHβ); 80,6 (CHCHPh); 82,3 (CHCHPh); 101,1 (CHβ); 102,6 (CHβ); 128,2, 128,4,

128,66, 128,68, 128,73, 128,75, 128,79, 128,9 en 128,98 (2 x (10 x HCarom)); 132,7 (Carom,quat); 133,3

(Carom,quat); 134,2 (2 x Carom,quat); 169,1 (C=O); 169,3 (C=O). IR (ATR, cm-1): νOH = 3341; νC=O = 1738; νmax =

2924, 1672, 1452, 1416, 1233, 1076, 1045, 700. MS (70 eV): m/z (%) 416 (M+ + 1, 100). Kleurloze olie.

Rf = 0,36 (EtOAc/MeOH/H2O 30/5/4). Rendement na kolomchromatografie (SiO2 en C18): 1%.

Bronnenlijst

75

6 Bronnenlijst

1. Macheboeuf, P.; Contreras-Martel, C.; Job, V.; Dideberg, O.; Dessen, A. FEMS Microbiol. Rev. 2006, 30,

673.

2. Staudinger, H. Justus Liebigs Ann. Chem. 1907, 356, 51.

3. Kong, K.-F.; Schneper, L.; Mathee, K. APMIS 2010, 118, 1.

4. Abraham, E. P.; Newton, G. G. F. Biochem. J. 1961, 79, 377.

5. Papp-Wallace, K. M.; Endimiani, A.; Taracila, M. A.; Bonomo, R. A. Antimicrob. Agents Chemother. 2011,

55, 4943.

6. Cole, M. Phil. Trans. R. Soc. L. 1980, 289, 207.

7. M. Munita, J.; A. Arias, C. Am. Soc. Microbiol. Press 2016, 4, 1.

8. Mehta, P. D.; Sengar, N. P. S.; Pathak, A. K. Eur. J. Med. Chem. 2010, 45, 5541.

9. Arya, N.; Jagdale, A. Y.; Patil, T. A.; Yeramwar, S. S.; Holikatti, S. S.; Dwivedi, J.; Shishoo, C. J.; Jain, K. S.

Eur. J. Med. Chem. 2014, 74, 619.

10. Page, M. I. Acc. Chem. Res. 1984, 17, 144.

11. Ojima, I. Acc. Chem. Res. 1995, 28, 383.

12. Deshmukh, A. R. A. S.; Bhawal, B. M.; Krishnaswamy, D.; Govande, V. V; Shinkre, B. A.; Jayanthi, A. Curr.

Med. Chem. 2004, 11, 1889.

13. Blume, E. J. Natl. Cancer Inst. 1989, 81, 1122.

14. Holmes, F. A.; Walters, R. S.; Theriault, R. L.; Forman, A. D.; Newton, L. K.; Raber, M. N.; Buzdar, A. U.;

Frye, D. K.; Hortobagyi, G. N. J. Natl. Cancer Inst. 1991, 83, 1797.

15. Rowinsky, E. K.; Cazenave, L. A.; Donehower, R. C. J. Natl. Cancer Inst. 1990, 82, 1247.

16. Kingston, D. G. I. Pharmac. Ther. 1991, 52, 1.

17. Ojima, I.; Habus, I.; Zhao, M.; Georg, G. I.; Jayasinghe, L. R. J. Org. Chem. 1991, 56, 1681.

18. Ojima, I.; Habus, I.; Zhao, M.; Zucco, M.; Park, Y. H.; Sun, C. M.; Brigaud, T. Tetrahedron 1992, 48, 6985.

19. Klenke, B.; Wiegand, I.; Schiffer, G.; Broetz-Oesterhelt, H.; N. Maiti, S.; Khan, J.; Reddy, A.; Yang, Z.; Hena,

M.; Jia, G.; Ligong, O.; Liang, H.; Yip, J.; Gao, C.; Tajammul, S.; Mohammad, R.; Biswajeet, G.;U.S. Pat. Appl.

Publ. 2017, US9556165B2

20. Center for Disease Dynamics, Economics & Policy. State of the World's Antibiotics, 2015. CCDEP

Washington, D.C. 2015, 1-84.

21. Westley-Horton, E.; Koestner, J. A. Am. J. Med. Sci. 1991, 302, 46.

22. Thomas, M. D.; Langston-Unkefer, P. J.; Uchytil, T. F.; Durbin, R. D. Plant Physiol. 1983, 71, 912.

23. Hart, K. M.; Reck, M.; Bowman, G. R.; Wencewicz, T. A. Med. Chem. Commun. 2016, 7, 118.

24. Sun, L.; Vasilevich, N. I.; Fuselier, J. A.; Hocart, S. J.; Coy, D. H. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 2041.

25. Wijtmans, R.; Vink, M. K.; Schoemaker, H. E.; van Delft, F. L.; Blaauw, R. H.; Rutjes, F. P. Synthesis 2004,

5, 641.

26. Hwu, J. R.; Tsay, S.-C.; Hakimelahi, S. J. Med. Chem. 1998, 41, 4681.

27. Berkheij, M.; Van Der Sluis, L.; Sewing, C.; Den Boer, D. J.; Terpstra, J. W.; Hiemstra, H.; Iwema Bakker,

W. I.; Van Den Hoogenband, A.; Van Maarseveen, J. H. Tetrahedron Lett. 2005, 46, 2369.

28. Wang, B. L.; Shi, Y. X.; Ma, Y.; Liu, X. H.; Li, Y. H.; Song, H. Bin; Li, B. J.; Li, Z. M. J. Agric. Food Chem. 2010,

58, 5515.

29. Gan, L. L.; Fang, B.; Zhou, C. H. Bull. Korean Chem. Soc. 2010, 31, 3684.

30. Fuller, R. W.; Snoddy, H. D.; Mason, N. R.; Molloy, B. B. Eur. J. Pharmacol. 1978, 52, 11.

31. Kaminaga, Y.; Nagatsu, A.; Akiyama, T.; Sugimoto, N.; Yamazaki, T.; Maitani, T.; Mizukami, H. FEBS Lett.

2003, 555, 311.

32. Bae, H. K.; Lee, S. B.; Park, C. S.; Shim, J. H.; Lee, H. Y.; Kim, M. J.; Baek, J. S.; Roh, H. J.; Choi, J. H.; Choe,

Bronnenlijst

76

E. O.; Ahn, D. U.; Park, K. H. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3309.

33. Olson, A. C.; Gray, G. M.; Guadagni, D. G. J. Food Sci. 1979, 44, 1358.

34. Chu, H.; Jin, G.; Friedman, E.; Zhen, X. Cell. Mol. Neurobiol. 2008, 28, 491.

35. Mulder, G. J. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1992, 32, 25.

36. Das, R.; Mukhopadhyay, B. ChemistryOpen 2016, 5, 401.

37. Desmet, T.; Soetaert, W.; Bojarová, P.; Kařen, V.; Dijkhuizen, L.; Eastwick-Field, V.; Schiller, A. Chem.

Eur. J. 2012, 18, 10786.

38. Vandoorne, K.; Masterproef, Universiteit Gent, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, 2016.

39. Dhaene, S.; Masterproef, Universiteit Gent, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, 2017.

40. Van Brabandt, W.; Doctoraatsthesis, Universiteit Gent, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, 2006.

41. Laplante, S. R.; Edwards, P. J.; Fader, L. D.; Jakalian, A.; Hucke, O. ChemMedChem 2011, 6, 505.

42. Rickhaus, M.; Mayor, M.; Juríček, M. Chem. Soc. Rev. 2017, 46, 1643.

43. Tsukazaki, M.; Tinkl, M.; Roglans, A.; Chapell, B. J.; Taylor, N. J.; Snieckus, V. J. Am. Chem. Soc. 1996,

118, 685.

44. Chong, D.; Mooney, J. Chirality and Stereoisomers - Chemistry LibreTexts. Geraadpleegd op 15

November 2017 via

https://chem.libretexts.org/Core/Organic_Chemistry/Chirality/Chirality_and_Stereoisomers

45. Carvalho, P. O.; Cass, Q. B.; Calafatti, S. A.; Contesini, F. J.; Bizaco, R. Brazilian J. Chem. Eng. 2006, 23,

291.

46. Maier, N. M.; Franco, P.; Lindner, W. J. Chromatogr. A 2001, 906, 3.

47. Carey, J. S.; Laffan, D.; Thomson, C.; Williams, M. T. Org. Biomol. Chem. 2006, 4, 2337.

48. Kagan, H.; Fiaud, J. Top. Stereochem. 1988, 18, 249.

49. Mangelinckx, S.; De Kimpe, N. Syllabus, Chemie der natuurproducten. Universiteit Gent, 2013.

50. Finn, M. G. Chirality 2002, 14, 534.

51. Desmet, T.; Soetaert, W. Syllabus, Biokatalyse en enzymtechnologie. Universiteit Gent, 2011

52. Chen, C.; Fujimoto, Y.; Girdaukas, G.; Sih, C. J. J. Am. Chem. Soc. 1982, No. 104, 7294.

53. Emad, L. I. J. Pharm. Sci. 2006, 96, 1659.

54. Leung, D.; Kang, S. O.; Anslyn, E. V. Chem. Soc. Rev. 2012, 41, 448.

55. Okamoto, Y.; Ikai, T. Chem. Soc. Rev. 2008, 37, 2593.

56. Aboul-Enein, H. Y.; El-Awady, M. I.; Heard, C. M.; Nicholls, P. J. Biomed. Chromatogr. 1999, 13, 531.

57. Jenkins, A. L.; Hedgepeth, W. A. Chirality 2005, 17, 24.

58. Wenzel, T. J.; Wilcox, J. D. Chirality 2003, 15, 256.

59. Desmet, T.; Soetaert, W. Biocatal. Biotransformation 2011, 29, 1.

60. Křen, V.; Thiem, J. Chem. Soc. Rev. 1997, 26, 463.

61. Shimoda, K.; Kubota, N.; Hamada, H. Tetrahedron: Asymmetry 2004, 15, 2319.

62. Hirata, T.; Shimoda, K.; Fujino, T.; Yamane, S.; Ohta, S. Bull. Chem. Soc. Jpn. 2001, 74, 539.

63. Habulin, M.; Knez, Ž. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2009, 58, 24.

64. Finkelstein, R. R.; Gampala, S. S. L.; Rock, C. D. Plant Cell 2002, 14 Suppl, s15.

65. Roberts, D. L.; Heckman, R. A.; Hege, B. P.; Bellin, S. A. J. Org. Chem. 1967, 33, 3566.

66. Constantino, M. G.; Losco, P.; Castellano, E. E. J. Org. Chem. 1989, 54, 681.

67. Constantino, M. J. Org. Chem. 1986, 51, 253.

68. Smith, T. R.; Clark, A. J.; Clarkson, G. J.; Taylor, P. C.; Marsh, A. Org. Biomol. Chem. 2006, 4, 4186.

69. Cutler, A. J.; Krochko, J. E. Trends Plant Sci. 1999, 4, 472.

70. Hartung, W.; Sauter, A.; Hose, E. J. Exp. Bot. 2002, 53, 27.

71. Lim, E. K.; Doucet, C. J.; Hou, B.; Jackson, R. G.; Abrams, S. R.; Bowles, D. J. Tetrahedron: Asymmetry

2005, 16, 143.

Bronnenlijst

77

72. Kepka, M.; Benson, C. L.; Gonugunta, V. K.; Nelson, K. M.; Christmann, a.; Grill, E.; Abrams, S. R. Plant

Physiol. 2011, 157, 2108.

73. Ge, H. X.; Zhang, J.; Kai, C.; Liu, J. H.; Yu, B. Y. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012, 93, 2357.

74. Hudlicky, T.; Luna, H.; Olivo, H. F.; Andersen, C.; Nugent, T.; Price, J. D. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1

1991, No. 12, 2907.

75. Legler, G. Methods Enzym. 1977, 46, 368.

76. Akiyama, T.; Shima, H.; Ozaki, S. Tetrahedron Lett. 1991, 32, 5593.

77. Akiyama, T.; Shima, H.; Ohnari, M.; Okazaki, T.; Ozaki, S. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1993, 66, 3760.

78. Drian, C. Le; Vionnet, J.-P.; Vogel, P. Helv. Chim. Acta 1990, 73, 161.

79. Yu, L.; Cabrera, R.; Ramirez, J.; Malinovskii, V. A.; Brew, K.; Wang, P. G. Tetrahedron Lett. 1995, 36,

2897.

80. Nishida, Y.; Tamakoshi, H.; Kobayashi, K.; Thiem, J. Org. Lett. 2001, 3, 1.

81. Wiemann, T.; Nishida, Y.; Sinnwell, V.; Thiem, J. J. Org. Chem. 1994, 59, 6744.

82. Vic, G.; Biton, J.; Le Beller, D.; Michel, J. ‐M; Thomas, D. Biotechnol. Bioeng. 1995, 46, 109.

83. Van Rantwijk, F.; Woudenberg-Van Oosterom, M.; Sheldon, R. A. J. Mol. Catal. B: Enzym. 1999, 6, 511.

84. Křen, V.; Thiem, J. Chem. Soc. Rev. 1997, 26, 463.

85. de Zoete, M. C.; van Rantwijk, F.; Sheldon, R. A. Catal. Today 1994, 22, 563.

86. Boos, W. Methods Enzymol. 1982, 89, 59.

87. Bjorkling, F.; Godtfredsen, S. E. Tetrahedron 1986, 44, 2957.

88. Crout, D. H. G.; Macmanus, D. A.; Critchley, P. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1990, 0, 1865.

89. Crout, D. H. G.; Macmanusa, D. A.; Critchley, P. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1991, 3, 376.

90. Matsumura, S.; Yamazaki, H.; Toshima, K. Biotechnol. Lett. 1997, 19, 583.

91. Trincone, A.; Nicolaus, B.; Lama, L.; Morzillo, P.; Rosa, M. De; Gambacorta, A. Biotechnol. Lett. 1991, 13,

235.

92. Trincone, A.; Nicolaus, B.; Lama, L.; Gambacorta, A. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1991, 0, 2841.

93. Hans-Joachim Gais, A. Z. and P. M. Tetrahedron Lett. 2000, 29, 5743.

94. Itano, K.; Kazuo, Y.; Kihara, C.; Tanaka, O. Carbohydr. Res. 1980, 87, 27.

95. Werschkun, B.; Konig, W. A.; Genb, V.; Ikva, J. T. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1995, 0, 2459.

96. Zarevúcka, M.; Vacek, M.; Kuldová, J.; Šaman, D.; Wimmer, Z.; Weignerova, L.; Kren, V. Chirality 1999,

11, 451.

97. Sláma, K.; Romaňuk, M. Insect Biochem. 1976, 6, 579.

98. Wimmer, Z.; Kuldová, J.; Hrdý, I.; Bennettová, B. Insect Biochem. Mol. Biol. 2006, 36, 442.

99. Luley-Goedl, C.; Sawangwan, T.; Mueller, M.; Schwarz, A.; Nidetzky, B. Food Technol. Biotechnol. 2010,

48, 276.

100. Renirie, R.; Pukin, A.; Van Lagen, B.; Franssen, M. C. R. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2010, 67, 219.

101. Reetz, M. T. Curr. Opin. Chem. Biol. 2002, 6, 145.

102. Rozzell, J. D. Bioorganic Med. Chem. 1999, 7, 2253.

103. Schmid, R. D.; Verger, R. Angew. Chemie Int. Ed. 1998, 37, 1608.

104. López-Serrano, P.; Wegman, M. A.; Van Rantwijk, F.; Sheldon, R. A. Tetrahedron: Asymmetry 2001, 12,

235.

105. Watanabe, K.; Koshiba, T.; Yasufuku, Y.; Miyazawa, T.; Ueji, S. Bioorg. Chem. 2001, 29, 65.

106. Kitaguchi, H.; Itoh, I.; Ono, M. Chem. Lett. 1990, 19, 1203.

107. Zaks, A.; Klibanov, A. M. J. Biol. Chem. 1988, 263, 3194.

108. Cainelli, G.; De Matteis, V.; Galletti, P.; Giacomini, D.; Orioli, P. Chem. Commun. 2000, 0, 2351.

109. Majumder, A. B.; Singh, B.; Gupta, M. N. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 124.

110. Anchordoquy, T. J.; Carpenter, J. F. Arch. Biochem. Biophys. 1996, 332, 231.

111. Mishra, P.; Griebenow, K.; Klibanovt, A. M. Biotechnol. Bioeng. 1996, 52, 609.

Bronnenlijst

78

112. Roy, I.; Gupta, M. N. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 2191.

113. Bornscheuer, U.; Herar, A.; Kreye, L.; Wendel, V.; Capewell, A.; Meyer, H. H.; Scheper, T.; Kolisis, F. N.

Tetrahedron: Asymmetry 1993, 4, 1007.

114. Malebari, A. M.; Greene, L. M.; Nathwani, S. M.; Fayne, D.; O’Boyle, N. M.; Wang, S.; Twamley, B.;

Zisterer, D. M.; Meegan, M. J. Eur. J. Med. Chem. 2017, 130, 261.

115. Banik, B. K.; Manhas, M. S. Tetrahedron 2012, 68, 10769.

116. Crul, L.; Masterproef, Universiteit Gent, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, 2016.

117. Cossío, F. P.; Arrieta, A.; Sierra, M. A. Acc. Chem. Res. 2008, 41, 925.

118. Benaglia, M.; Cinquini, M.; Cozzi, F. Eur. J. Org. Chem. 2000, 2000, 563.

119. Jiao, L.; Liang, Y.; Xu, J. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 6060.

120. Xu, J. Arkivoc 2009, 2009, 21.

121. Blaser, H. U. Chem. Rev. 1992, 92, 935.

122. Van Brabandt, W.; Vanwalleghem, M.; D’hooghe, M.; De Kimpe, N. J. Org. Chem. 2006, 71, 7083.

123. Vanwalleghem, M.; Masterproef, Universiteit Gent, Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, 2006.

124. Hartung, W. H.; Simonoff, R. Hydrogenolysis of Benzyl Groups Attached to Oxygen, Nitrogen, or Sulfur.

In Organic Reactions; 1953; pp 263–326.

125. Mollet, K.; Goossens, H.; Piens, N.; Catak, S.; Waroquier, M.; Törnroos, K. W.; Van Speybroeck, V.;

D’hooghe, M.; De Kimpe, N. Chem. Eur. J. 2013, 19, 3383.

126. D’hooghe, M.; Van Brabandt, W.; Dekeukeleire, S.; Dejaegher, Y.; De Kimpe, N. Chem. Eur. J. 2008, 14,

6336.

127. Leemans, E.; D’hooghe, M.; Dejaegher, Y.; Törnroos, K. W.; De Kimpe, N. Eur. J. Org. Chem. 2010, 2010,

352.

128. De Bruyn, F.; Maertens, J.; Beauprez, J.; Soetaert, W.; De Mey, M. Biotechnol. Adv. 2015, 33, 288.

129. Lehle, L.; Strahl, S.; Tanner, W. Angew. Chemie Int. Ed. 2006, 45, 6802.

130. Durand, G.; Seta, N. Clin. Chem. 2000, 46, 795.

131. Dennis, J. W.; Granovsky, M.; Warren, C. E. BioEssays 1999, 21, 412.

132. Schnaitman, C. a; Klena, J. D. Microbiol. Rev. 1993, 57, 655.

133. Büll, C.; Stoel, M. A.; den Brok, M. H.; Adema, G. J. Cancer Res. 2014, 74, 3199.

134. Bowles, D.; Isayenkova, J.; Lim, E.-K.; Poppenberger, B. Curr. Opin. Plant Biol. 2005, 8, 254.

135. Yamamoto, I.; Muto, N.; Nagata, E.; Nakamura, T.; Suzuki, Y. Biochim. Biophys. Acta 1990, 1035, 44.

136. Zhao, C. L.; Chen, Z. J.; Bai, X. S.; Ding, C.; Long, T. J.; Wei, F. G.; Miao, K. R. Mol. Divers. 2014, 18, 687.

137. Geuns, J. M. C. Phytochemistry 2003, 64, 913.

138. King, C. D.; Rios, G. R.; Green, M. D.; Tephly, T. R. Curr. Drug Metab. 2000, 1, 143.

139. Ritter, J. K. Chem.-Biol. Interact. 2000, 129, 171.

140. Sassaki, G. L.; Rattmann, Y. D.; Santana-Filho, A. P.; Riter, D. S.; Iagher, F.; Trindade, E. S.; Da Silva, M.

D.; Santos, A. R. S.; De Souza, L. M.; Iacomini, M.; Gorin, P. A. J. Chem.-Biol. Interact. 2013, 205, 29.

141. Schmid, A.; Dordick, J. S.; Hauer, B.; Kiener, A.; Wubbolts, M.; Witholt, B. Nature 2001, 409, 258.

142. Lim, E. K. Chem. Eur. J 2005, 11, 5486.

143. Ceunen, S.; Geuns, J. M. C. J. Nat. Prod. 2013, 76, 1201.

144. Williams, G. J.; Zhang, C.; Thorson, J. S. Nat. Chem. Biol. 2007, 3, 657.

145. Gantt, R. W.; Goff, R. D.; Williams, G. J.; Thorson, J. S. Angew. Chemie Int. Ed. 2008, 47, 8889.

146. Hansen, K. S.; Kristensen, C.; Tattersall, D. B.; Jones, P. R.; Olsen, C. E.; Bak, S.; Møller, B. L.

Phytochemistry 2003, 64, 143.

147. Fukuchi-mizutani, M.; Okuhara, H.; Fukui, Y.; Nakao, M.; Katsumoto, Y.; Yonekura-sakakibara, K.;

Kusumi, T.; Hase, T.; Tanaka, Y. Plant Physiol. 2003, 132, 1652.

148. Dewitte, G.; Walmagh, M.; Diricks, M.; Lepak, A.; Gutmann, A.; Nidetzky, B.; Desmet, T. J. Biotechnol.

2016, 233, 49.

Bronnenlijst

79

149. Kim, H. S.; Kim, B. G.; Sung, S.; Kim, M.; Mok, H.; Chong, Y.; Ahn, J. H. Planta 2013, 238, 683.

150. Lairson, L. L.; Henrissat, B.; Davies, G. J.; Withers, S. G. Annu. Rev. Biochem. 2008, 77, 521.

151. Zhao, H.; Van Der Donk, W. A. Curr. Opin. Biotechnol. 2003, 14, 583.

152. Masada, S.; Kawase, Y.; Nagatoshi, M.; Oguchi, Y.; Terasaka, K.; Mizukami, H. FEBS Lett. 2007, 581,

2562.

153. Lee, J.; Timasheff, S. J. Biol. Chem. 1981, 256, 7193.

154. Straathof, A. J. J.; Jongejan, J. A. Enzyme Microb. Technol. 1997, 21, 559.

155. Ge, H.-X.; Zhang, J.; Dong, Y.; Cui, K.; Yu, B.-Y. Chem. Commun. 2012, 48, 6127.

156. Dirks-Hofmeister, M. E.; Verhaeghe, T.; De Winter, K.; Desmet, T. Angew. Chemie Int. Ed. 2015, 54,

9289.

157. Goedl, C.; Sawangwan, T.; Wildberger, P.; Nidetzky, B. Biocatal. Biotransformation 2010, 28, 10.

158. Desmet, T.; Soetaert, W. Process Biochem. 2012, 47, 11.

159. Goedl, C.; Sawangwan, T.; Mueller, M.; Schwarz, A.; Nidetzky, B. Angew. Chemie Int. Ed. 2008, 47,

10086.

160. Williams, G. J.; Zhang, C.; Thorson, J. S.; Gavin J. Williams, Changsheng Zhang, and J. S. T. Nat. Chem.

Biol. 2007, 3, 657.

161. Quirós, L. M.; Aguirrezabalaga, I.; Olano, C.; Méndez, C.; Salas, J. A. Mol. Microbiol. 1998, 28, 1177.

162. Champney, W. S.; Burdine, R. Curr. Micriobiol. 1998, 37, 412.

163. Vilches, C.; Hernandez, C.; Mendez, C.; Salas, J. A. J. Bacteriol. 1992, 174, 161.

164. Quirós, L. M.; Hernández, C.; Salas, J. A. Eur. J. Biochem. 1994, 222, 129.

165. Babu, R. S.; O’Doherty, G. A. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 12406.

166. Bataille, C.; Bégin, G.; Guillam, A.; Lemiègre, L.; Lys, C.; Maddaluno, J.; Toupet, L. J. Org. Chem. 2002, 67,

8054.

167. Castagnolo, D.; Botta, L.; Botta, M. Carbohydr. Res. 2009, 344, 1285.

168. Guaragna, A.; Dalonzo, D.; Paolella, C.; Napolitano, C.; Palumbo, G. J. Org. Chem. 2010, 75, 3558.

169. Capozzi, G.; Menichetti, S.; Nativi, C. Selective Glycosidation Reactions and Their Use in Medicinal

Chemistry. In New Trends in Synthetic Medicinal Chemistry; 2008; pp 221–259.

170. Paulsen, H. Angew. Chemie Int. Ed. 1982, 21, 155.

171. Toshima, K.; Tatsuta, K. Chem. Rev. 1993, 93, 1503.

172. Igarashi, K. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1977, 34, 243.

173. Presser, A.; Kunert, O.; Pötschger, I. Monatsh. Chem. 2006, 137, 365.

174. Hunsen, M.; Long, D. A.; D’Ardenne, C. R.; Smith, A. L. Carbohydr. Res. 2005, 340, 2670.

175. Cuevas, G.; Investigacih, C. De. Tetrahedron 1992, 48, 5019.

176. Haynes, L. J.; Newth, F. H. Adv. Carbohydr. Chem. 1955, 10, 207.

177. Lemieux, R. U.; Hendriks, K. B.; Stick, R. V. J. Am. Chem. Soc. 1975, 97, 4056.

178. Uvarova, N. I.; Atopkina, L. N.; Elyakov, G. B. Carbohydr. Res. 1980, 83, 33.

179. Seebacher, W.; Haslinger, E.; Weis, R. Monatsh. Chem. 2001, 132, 839.

180. Perlin, A. S. Can. J. Chem. 1963, 41, 399.

181. Kunz, H.; Harreus, A. Liebigs Ann. der Chemie 1982, 1982, 41.

182. Harreus, A.; Kunz, H. Liebigs Ann. der Chemie 1986, 1986, 717.

183. Wilkinson, K. L.; Elsey, G. M.; Prager, R. H.; Tanaka, T.; Sefton, M. A. Tetrahedron 2004, 60, 6091.

184. Xu, S.; Held, I.; Kempf, B.; Mayr, H.; Steglich, W.; Zipse, H. Chem. Eur. J. 2005, 11, 4751.

185. Schmidt, R. R.; Kinzy, W. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1994, 50, 21.

186. Iyer, P. V.; Ananthanarayan, L. Process Biochem. 2008, 43, 1019.

187. Diricks, M.; Gutmann, A.; Debacker, S.; Dewitte, G.; Nidetzky, B.; Desmet, T. Protein Eng. Des. Sel. 2017,

30, 141.

synthese en enzymatische glycosylering van mono- en

Documents