sveuČiliŠte u zagrebu - digre.pmf.unizg.hrdigre.pmf.unizg.hr/4604/1/marija mulanovic...

Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno – matematički fakultet

Biološki odsjek

Marija Mulanović

Učestalost rekombinacija između gena

glavnog sustava tkivne podudarnosti u čovjeka

Diplomski rad

Zagreb, 2015

Ovaj rad izrađen je u Kliničkoj jedinici za tipizaciju tkiva Kliničkog zavoda za

transfuzijsku medicinu i transplantacijsku biologiju, Kliničkog bolničkog centra

Zagreb, pod vodstvom prof.dr.sc. Zorane Grubić. Rad je predan na ocjenu Biološkom

odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja

naziva diplomirani inženjer biologije, smjer molekularna biologija.

ZAHVALE

Zahvaljujem svojoj mentorici prof.dr.sc. Zorani Grubić koja mi je svojim znanstvenim i

stručnim savjetima pomogla u izradi ovog diplomskog rada. Iskreno joj zahvaljujem

na susretljivosti, strpljenju i poklonjenom vremenu. Zahvaljujem i svim ostalim

djelatnicima Kliničke jedinice za tipizaciju tkiva na razumijevanju, te na ugodnoj i

poticajnoj radnoj atmosferi.

Posebno se zahvaljujem svom suprugu, roditeljima i prijateljicama na bezuvjetnoj

ljubavi i nesebičnoj podršci.

Ovaj rad posvećujem pok. mr.sc. Marici Kodrić-Šmit, nekadašnjoj Voditeljici Službe

za zdravstvenu ekologiju Zavoda za javno zdravstvo Sisačko-moslavačke županije.

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek

Diplomski rad

Učestalost rekombinacija između gena

glavnog sustava tkivne podudarnosti u čovjeka

Marija Mulanović

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Hrvatska

U radu je analizirana učestalost rekombinacija između lokusa HLA-A i -B, te HLA-B i -DRB1 unutar skupine od 2049 obitelji iz registra obitelji bolesnika mogućih primatelja krvotvornih matičnih stanica. Svi ispitanici testirani su za antigene/gene HLA-A, -B, -DR jednom od metoda: testom mikrolimfocitotoksičnosti ili metodom lančane reakcije polimerazom i početnicama specifičnim za pojedini alel ili skupinu alela (metode: PCR-SSP i PCR-SSO). Krosingover je utvrđen kod 3,61% obitelji, od toga u 3,47% obitelji krosingover je bio prisutan samo kod jednog djeteta, a u 0,15% obitelji utvrđeno je prisustvo krosingovera kod dvoje djece. Učestalost rekombinacija između lokusa HLA-A i -B iznosila je 0,61%, a između lokusa HLA-B i -DRB1 iznosila je 0,77%. Učestalost krosingovera u oogenezi bila je 1,8 puta veća od učestalosti krosingovera u spermatogenezi. Haplotipovi kod kojih je krosingover bio prisutan između lokusa HLA-A i -B najčešće su bili pozitivni za antigen/gen HLA-B27. Haplotipovi s krosingoverom između lokusa HLA-B i -DRB1 najčešće su na lokusu HLA-DRB1 imali antigen/gen HLA-DR13. Rezultati ovog istraživanja u skladu su s rezultatima istraživanja provedenim u drugim populacijama u svijetu. (49 stranica, 19 slika, 6 tablica, 48 literaturnih navoda, jezik izvornika: hrvatski) Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici Ključne riječi: geni HLA, rekombinacija, krosingover Voditelj: Dr.sc. Zorana Grubić, izv.prof., KBC Zagreb Suvoditelj: Dr.sc. Ana Galov, doc., PMF Sveučilišta u Zagrebu Ocjenitelji: Dr.sc. Mirjana Kalafatić, prof., PMF Sveučilišta u Zagrebu Dr.sc. Božena Mitić, prof., PMF Sveučilišta u Zagrebu Zamjena: Dr.sc. Zlatko Liber, izv.prof., PMF Sveučilišta u Zagrebu Rad prihvaćen: 02.12.2015.

BASIC DOCUMENTATION CARD

University of Zagreb Faculty of Science Division of Biology

Graduation Thesis

Recombination frequency between genes

of the human major histocompatibility complex

Marija Mulanović

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Hrvatska

In this study we analyzed the recombination frequency between loci HLA-A and -B, and between loci HLA-B and -DRB1 in the group of 2049 families from the registry of hematopoietic stem cells recipients. All subjects were tested by one of the methods: microlymphocytotoxicity test or by polymerase chain reaction and primers specific for a particular allele or group of alleles (methods: PCR-SSP and PCR-SSO). The presence of crossingovers has been determined in 3.61% of families, out of which in 3.47% of families the crossingover has been determined in one child, and in 0.15% families the presence of crossingovers revealed in two children. The recombination frequency between loci HLA-A and -B was 0.61%, while between loci HLA-B and -DRB1 was 0.77%. Analysis of crossingover origin in the family revealed that the recombination frequency in oogenesis was 1.8 times higher than the recombination frequency in spermatogenesis. Among haplotypes with crossingovers between loci HLA-A and -B the crossingover was most common in those carrying the antigen/gene HLA-B27. In families with crossingovers between loci HLA-B and -DRB1 the recombination usually occurred in haplotypes positive for antigen/gene HLA-DR13. Results of this study are in concordance with the results from similar investigations. (49 pages, 19 figures, 6 tables, 48 references, original in: Croatian) Thesis deposited in the Central Biological Library Key words: HLA genes, recombination, crossingover Supervisor: Dr. Zorana Grubić, Assoc.Prof., University Hospital Centre Zagreb Co-supervisor: Dr. Ana Galov, Asst.Prof., Faculty of Science, University of Zagreb Reviewers: Dr. Mirjana Kalafatić, Prof., Faculty of Science, University of Zagreb Dr. Božena Mitić, Prof., Faculty of Science, University of Zagreb Replacement: Dr. Zlatko Liber, Assoc.Prof., Faculty of Science,University of Zagreb Thesis accepted: 02.12.2015.

POPIS KRATICA

AgB – glavni sustav tkivne podudarnosti kod štakora

ChL-A – glavni sustav tkivne podudarnosti kod čimpanze

DL-A – glavni sustav tkivne podudarnosti kod psa

H-2 – glavni sustav tkivne podudarnosti kod miša

RhL-A – glavni sustav tkivne podudarnosti kod majmuna

SL-A – glavni sustav tkivne podudarnosti kod svinje

C2 – komponenta komplementa

C4A – komponenta komplementa

C4B – komponenta komplementa

CD4 – glikoprotein na površini stanica imunosnog sustava (pomagačkih limfocita T,

monocita, makrofaga i dendritičkih stanica)

CD8 – glikoprotein na površini stanica imunosnog sustava (citotoksičnih limfocita T)

C.O. – prema engl. crossing over, krosingover

DNA – deoksiribonukleinska kiselina

IHWS – Međunarodni radni sastanak o tkivnoj podudarnosti

HLA – humani leukocitni antigeni

MHC – glavni sustav tkivne podudarnosti

mRNA – glasnička ribonukleinska kiselina

NK – prirodne ubilačke stanice

TNF-α – faktor nekroze tumora alfa

TNF-β – faktor nekroze tumora beta

WHO – Svjetska zdravstvena organizacija

SADRŽAJ 1. UVOD ................................ ................................ ......................... 1

1.1. Općenito o glavnom sustavu tkivne podudarnosti (HLA) ............. 1

1.1.1. Otkriće sustava HLA, uloga, organizacija i nasljeđivanje ...... 1

1.1.2. Geni HLA ................................ ................................ ......... 4

1.1.3. Molekule HLA ................................ ................................ ... 6

1.1.4. Nazivlje sustava HLA ................................ ...................... 10

1.2. Osobine sustava HLA ................................ ............................ 12

1.2.1. Polimorf izam ................................ ................................ .. 12

1.2.2. Rekombinacija ................................ ................................ 14

1.2.3. Neravnoteža udruživanja ................................ ................. 17

1.2.4. Segregacija ................................ ................................ .... 18

1.3. Primjena istraživanja sustava HLA ................................ ......... 20

1.3.1. Transplantacija tkiva i organa ................................ .......... 20

1.3.2. Geni HLA i bolesti ................................ ........................... 21

1.3.3. Populacijska istraživanja ................................ ................ 22

2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA ................................ ............................. 24

3. MATERIJALI I METODE ................................ .............................. 25

3.1. Ispitanici ................................ ................................ .............. 25

3.2. Metode ................................ ................................ ................ 25

3.2.1. Određivanje antigena HLA ................................ ............... 25

3.2.2. Određivanje gena HLA ................................ .................... 26

3.3. Statistička obrada podataka ................................ .................. 27

4. REZULTATI ................................ ................................ ............... 28

4.1. Zbirni prikaz ispit ivane skupine obitel j i ................................ ... 28

4.2. Analiza obitelj i s krosingoverom nastalim u oogenezi .............. 29

4.3. Analiza obitelj i s krosingoverom nastalim u spermatogenezi .... 30

4.4. Analiza obitelj i s rekombinantnim haplotipom HLA nepoznatog

pori jekla ................................ ................................ ..................... 32

4.5. Analiza obitelj i s dva krosingovera ................................ ......... 33

4.6. Analiza haplot ipova HLA u obitel j ima s krosingoverom između

lokusa HLA-A i -B................................ ................................ ........ 36

4.7. Analiza haplot ipova HLA u obitel j ima s krosingoverom između

lokusa HLA-B i -DRB1 ................................ ................................ . 38

5. RASPRAVA ................................ ................................ ............... 40

6. ZAKLJUČAK ................................ ................................ .............. 43

7. LITERATURA ................................ ................................ ............. 44

8. ŽIVOTOPIS ................................ ................................ ............... 49

1

1. UVOD

1.1. Općenito o glavnom sustavu tkivne podudarnosti (HLA)

Kod većine dosad istraživanih kralješnjaka pronađena je usko vezana skupina

gena i obitelji gena čiji produkti, odnosno molekule, imaju ključnu ulogu u

međusobnom prepoznavanju stanica i raspoznavanju vlastitog od tuđeg (Klein,

1986). Taj kompleks gena nazvan je glavni sustav gena tkivne podudarnosti,

odnosno MHC (engl. Major Histocompatibility Complex). Produkti gena ovog sustava

– antigeni tkivne podudarnosti – dolaze u različitim količinama na različitim stanicama

pojedinog organizma. Kod čovjeka je taj sustav gena najprije otkriven na leukocitima i

naziva se sustav HLA (engl. Human Leukocyte Antigens).

1.1.1. Otkriće sustava HLA, uloga, organizacija i nasljeđivanje

Sam koncept odbacivanja stranog tkiva kao rezultat imunosnog odgovora na

antigene tkivne podudarnosti, potječe od radova Petera Gorera 1930-ih godina

(Thorsby, 2009). Gorer je izvodio istraživanja na visokosrodnim sojevima

laboratorijskih miševa u cilju određivanja antigena krvnih grupa. Otkrio je četiri grupe

gena koje su nosile nasljednu uputu za antigene na krvnim stanicama. Gorer je

kasnije nastavio istraživanja 40-ih i 50-ih godina prošlog stoljeća zajedno s

Georgeom Snellom i utvrdio da upravo antigeni kodirani genima jedne od tih grupa

sudjeluju u odbacivanju transplantiranih tumora i ostalih tkiva. Snell je ovu grupu

gena nazvao H geni (engl. Histocompatibility Genes), odnosno geni tkivne

podudarnosti.

Eksperimentalne metode križanja u srodstvu i presađivanja transplantata kože koje

su se izvodile na miševima dovele su do otkrića glavnog sustava tkivne podudarnosti

kod miša, ali dokaze o postojanju takvog sustava kod čovjeka pružile su tek

alogenične transfuzije krvi i transplantacije organa. Dausset i suradnici su 1954.

godine uočili da pacijenti koji su odbacili bubreg ili su imali posttransfuzijsku reakciju

često razvijaju cirkulirajuća citotoksična protutijela. Navedena protutijela su reagirala

2

na molekule antigena s površine bijelih krvnih stanica davatelja krvi, odnosno organa,

te je serum primatelja uz prisustvo komplementa lizirao limfocite davatelja (Thorsby,

2009).

Na važnost sustava HLA u fiziologiji imunosnog odgovora ukazali su Benacerraf i

suradnici 1960-ih koji su pokazali da različiti visokosrodni sojevi zamoraca i miševa

nakon imunizacije polipeptidnim antigenima razvijaju ili ne razvijaju protutijela kao

odgovor na imunizaciju. Taj imunosni odgovor je autosomalno nasljedno svojstvo

koje se pripisuje regiji MHC, dok su geni koji ga kontroliraju nazvani Ir genima (engl.

Immune Response). Tek 1970-ih je objašnjena centralna uloga gena MHC nakon što

se pokazalo da antigen-specifični limfociti T ne prepoznaju antigene slobodne u

otopini, već prepoznaju samo dijelove, točnije peptidne fragmente koji su

nekovalentno vezani za molekule MHC. Snell, Dausset i Benacerraf dobili su

Nobelovu nagradu 1980. godine za svoj doprinos otkriću i razumijevanju glavnog

sustava tkivne podudarnosti kod miša i kod čovjeka (Thorsby, 2009).

Iako je do otkrića sustava HLA došlo tek kad su produkti gena ovog sustava

identificirani kao odgovorni za odbacivanje nepodudarnog presatka, ključna uloga

gena HLA počiva u pokretanju i regulaciji imunosnog odgovora u svrhu obrane od

mikroorganizama. Molekule HLA su membranski proteini čije izvanstanične domene

izlažu peptidne fragmente nastale preradom stranih proteinskih antigena. Postoje

dvije osnovne grupe molekula HLA koje prepoznaju dvije različite vrste limfocita T.

Citotoksični limfociti T prepoznaju strani antigen istodobno s molekulama HLA

razreda I, dok molekule HLA razreda II udružene sa stranim peptidima na tzv.

predočnim stanicama (makrofagi, limfociti B) prepoznaju pomagački limfociti T. Na taj

način sustav HLA sudjeluje u obrani organizma kao sastavni dio stečene ili specifične

imunosti, kako u humoralnoj, tako i u staničnoj imunosti. Geni HLA posreduju u

staničnim interakcijama, sudjeluju u regulaciji imunoreaktivnosti, određuju osjetljivost

na viruse, imunosnu preosjetljivost i autoimunosne bolesti (Andreis i sur., 2004).

Postoji velika homologija unutar sustava tkivne podudarnosti između različitih

vrsta, no svaka vrsta pokazuje pojedine specifičnosti. Glavni sustav tkivne

podudarnosti kod različitih vrsta nosi različite nazive: AgB kod štakora, B kod pilića,

ChL-A kod čimpanze, DL-A kod psa, H-2 kod miša, RhL-A kod rhesus majmuna, a

SL-A kod svinje. Kod čovjeka se geni HLA nalaze na kromosomu 6 (Janeway i sur.,

2005). Na slici 1 prikazana je regija HLA i raspored gena u njoj.

3

Slika 1. Organizacija gena glavnog sustava tkivne podudarnosti u čovjeka

(izvor: Janeway, Travers, Walport, Shlomchik, 2005)

Geni sustava HLA pokazuju veliku raznolikost, što znači da u populaciji postoji

mnogo alternativnih oblika – alela nekog gena. Geni koji su dio sustava HLA fizički su

smješteni vrlo blizu jedan drugome zbog čega većina osoba nasljeđuje alele ove

usko vezane skupine gena u setovima, po jedan set od svakog roditelja. Takav set

gena HLA naziva se haplotip HLA, a svaka jedinka nasljeđuje jedan majčin i jedan

očev haplotip HLA. U jednoj stanici vidljiva je genska ekspresija oba naslijeđena

haplotipa HLA, jer su geni HLA kodominantni (Goldsby i sur., 2003). Nasljeđivanje

haplotipova HLA od heterozigotnih roditelja je prikazano na slici 2. U slučaju da otac i

majka imaju različite haplotipove HLA, mogućnost da potomci naslijede isti majčin i

očev haplotip HLA i budu međusobno identični je 25%. Na slici 2 vidi se i primjer

rekombinantnog majčinog haplotipa koji je nastao kao posljedica krosingovera u

mejozi prilikom nastanka majčinih spolnih stanica.

4

Slika 2. Nasljeđivanje haplotipova HLA u obitelji

(A i B – očevi haplotipovi HLA, C i D – majčini haplotipovi HLA,

R – rekombinantni majčin haplotip HLA)

1.1.2. Geni HLA

Regija HLA smještena je na kraćem kraku kromosoma 6 (6p21.3). Sastoji se

od preko 220 gena i obuhvaća više od 4x106 parova baza DNA (Horton i sur., 2004).

Podijeljena je u tri subregije unutar kojih se nalaze i geni koji nisu geni HLA. Geni

HLA dijele se u dvije skupine gena:

1. geni HLA razreda I kodiraju glikoproteine prisutne na površini gotovo svih

stanica s jezgrom; glavna uloga im je predočivanje peptidnih antigena

citotoksičnim limfocitima T

2. geni HLA razreda II kodiraju glikoproteine koji se nalaze na antigen-predočnim

stanicama poput makrofaga, dendritičkih stanica i limfocita B gdje predočuju

prerađene antigenske peptide pomagačkim limfocitima T

5

Slika 3. Detaljna mapa regije HLA

(izvor: Janeway, Travers, Walport, Shlomchik, 2005)

Regija gena HLA razreda I proteže se na oko 2x106 parova baza i sadrži

otprilike 20-ak gena. Kako je istaknuto na slici 3, unutar nje se nalaze tri osnovna

gena (HLA-A, -B i -C) koji kodiraju tzv. klasične molekule HLA razreda I. Ti geni

kodiraju α lanac molekule HLA razreda I. Unutar regije HLA razreda I nalaze se i geni

koji kodiraju neklasične molekule HLA razreda I (HLA-E , -F , -G , -J i -X). Tu se

nalazi i obitelj gena MIC koja uključuje gene MIC-A, -B, -C, -D i -E koji su dobili ime

MIC (engl. MHC class I related chain) zbog toga što njihove molekule nalikuju

molekulama HLA razreda I. Geni HLA razreda I koji kodiraju neklasične molekule su

mnogo manje polimorfni od gena HLA-A, -B i -C. Neki od neklasičnih gena HLA

razreda I su pseudogeni pa prema tome ne nose nasljednu uputu za proteinski

produkt. Točna funkcija većine neklasičnih molekula HLA razreda I još nije do kraja

razjašnjena (Goldsby i sur., 2003).

Geni HLA-DR, HLA-DP i HLA-DQ nose nasljednu uputu za molekule HLA

razreda II – tzv. klasične molekule HLA razreda II. U toj regiji nalaze se još i tzv.

neklasični geni HLA razreda II (HLA-DM i HLA-DO).

Obitelj gena HLA-DR sastoji se od jednog gena koji kodira za α lanac (HLA-

DRA) i čak do 9 gena za β lanac (HLA-DRB1 do HLA-DRB9) uključujući i

pseudogene. U humanoj regiji HLA-DR postoje 4 funkcionalna gena za β lanac, ali su

6

u haplotipu prisutna maksimalno dva gena za β lanac i na taj način na nekim

stanicama mogu biti prisutne dvije različite vrste molekula HLA-DR.

Geni obitelji HLA-DP i HLA-DQ imaju svaki po jedan gen za α i β lanac, te

dodatni par pseudogena. U stanici se α lanci molekula HLA-DR, HLA-DQ i HLA-DP

povezuju prvenstveno s β lancima iste genske obitelji. To znači da će se produkti

gena HLA-DPA1 i HLA-DPB1 povezati i tvoriti molekulu HLA-DP. Slično tome će geni

HLA-DQA1 i HLA-DQB1 nositi uputu za molekule HLA-DQ.

Skupini neklasičnih gena HLA razreda II pripadaju geni HLA-DM i HLA-DO.

Produkti ovih gena su molekule HLA-DM i HLA-DO. Molekule HLA-DM olakšavaju

vezivanje stranih peptida na molekule HLA razreda II, dok molekule HLA-DO koje se

eksprimiraju samo u timusu i na zrelim limfocitima B služe kao regulatori procesiranja

stranih antigena.

Centralna regija se sastoji od vrlo raznolike skupine gena. Produkti gena

centralne regije su ili na neki način povezani s funkcijama molekula HLA ili su geni

centralne regije pod nadzorom sličnih kontrolnih mehanizama kao i geni HLA (Yung i

sur., 2000). Geni ove regije kodiraju neke komponente komplementa (C2, C4A, C4B i

faktor B), proteine toplinskoga šoka i citokine TNF-α i TNF-β.

1.1.3. Molekule HLA

Molekule (antigeni) HLA su membranski glikoproteini, sastavni dijelovi

staničnih membrana. Slično kao i geni HLA, molekule HLA se prema svojim

funkcijama dijele na molekule HLA razreda I i molekule HLA razreda II. Oba tipa

molekula HLA funkcioniraju kao visoko specijalizirane molekule koje formiraju

stabilne komplekse s peptidnim fragmentima stranih antigena i predočuju ih na

površini stanice kako bi ih prepoznali limfociti T. Molekule HLA razreda I pronalazimo

na gotovo svim stanicama s jezgrom. Molekule HLA razreda II nalaze se samo na

određenim stanicama imunosnog sustava i to na limfocitima B, makrofagima,

dendritičkim i endotelijalnim stanicama (Andreis i sur., 2004).

Kako bi limfociti T prepoznali strani antigen, on mora biti pocijepan na male

peptidne fragmente koji će formirati kompleks s molekulama HLA razreda I ili

molekulama HLA razreda II (Germain, 1994). Konverzija stranog antigena u peptidne

fragmente vezane na molekulu HLA naziva se procesiranje i predočivanje antigena.

7

Strani antigen može biti predočen u kompleksu s molekulom HLA razreda I ili

molekulom HLA razreda II, ovisno o načinu njegovog ulaska u stanicu. Egzogeni

antigeni su oni koji nastaju izvan stanice domaćina, te endocitozom ili fagocitozom

ulaze u antigen-predočne stanice (makrofagi, dendritičke stanice i limfociti B).

Antigen-predočne stanice zatim razgrađuju progutani egzogeni antigen u peptidne

fragmente endocitoznim procesiranjem. Peptidni fragmenti stranog antigena bit će

potom vezani na molekulu HLA razreda II. Taj kompleks prepoznaju receptori

limfocita T na čijoj se površini nalaze CD4 glikoproteini i općenito funkcioniraju kao

pomagački limfociti T. Endogeni antigeni nastaju unutar stanice domaćina, to su npr.

virusni proteini koji nastaju unutar stanice zaražene virusom ili jedinstveni proteini

koje stvaraju tumorske stanice. Endogeni antigeni se cijepaju na peptidne fragmente

koji se zatim vežu na molekule HLA razreda I. Nastali kompleks peptida s molekulom

HLA razreda I transportira se do stanične membrane. Citotoksični limfociti T s CD8

glikoproteinima prepoznaju strani antigen na površini stanica koje ih izražavaju u

kompleksu s molekulom HLA razreda I, te ih zatim napadaju i ubijaju (Janeway i sur.,

2005).

1.1.3.1. Molekule HLA razreda I

Kao što je prikazano na slici 4, molekula HLA razreda I sastoji se od α lanca

veličine 45 kDa koji je nekovalentno povezan s β2 mikroglobulinom veličine 12 kDa.

Nasljednu uputu za β2 mikroglobulinski lanac nosi visoko konzervirani gen koji se

nalazi na kromosomu 15. Dok je α lanac usidren u staničnoj membrani hidrofobnim

transmembranskim dijelom i hidrofilnim citoplazmatskim dijelom, β2 mikroglobulinski

lanac nalazi se i slobodan u serumu. Za ekspresiju molekula HLA razreda I

neophodno je nekovalentno vezivanje β2 mikroglobulina uz α lanac (Natarajan i sur.,

1999).

8

Slika 4. Shematski prikaz molekule HLA razreda I

(izvor: Goldsby, Kindt, Osborne, Kuby, 2003)

Strukturne analize α lanca pokazale su da se on sastoji od 3 izvanstanične

domene (α1, α2 i α3) od kojih se svaka sastoji od otprilike 90 aminokiselina,

transmembranski dio sastoji se od oko 25 hidrofobnih aminokiselina, a citoplazmatski

dio sastoji se od 30-ak aminokiselina (Goldsby i sur., 2003). Domene α1 i α2 tvore

platformu sastavljenu od 8 antiparalelnih β-nabora koju sa svake strane obuhvaća po

jedna α-uzvojnica tako da formiraju duboku pukotinu ili utor dovoljno velik da veže

peptid sastavljen od 8-10 aminokiselina (Madden, 1995). Ta pukotina je najvažniji dio

molekule jer služi kao vezno mjesto za prerađene strane peptide. Veličinom i

rasporedom aminokiselina β2 mikroglobulin je najsličniji domeni α3, samo što ne

posjeduje transmembranski dio i nekovalentno je vezan na molekulu HLA razreda I.

Zbog sličnosti u aminokiselinskom slijedu s imunoglobulinskim konstantnim regijama,

kompleks α lanca molekule HLA razreda I i β2 mikroglobulina ubrajamo u

imunoglobulinsku superporodicu (slika 6). Domena α3 je visoko konzervirana kod

svih molekula HLA razreda I. Unutar nje je slijed koji stupa u interakciju s CD8

molekulom na membrani citotoksičnih limfocita T (Goldsby i sur., 2003).

9

1.1.3.2. Molekule HLA razreda II

Slika 5. Shematski prikaz molekule HLA razreda II

(izvor: Goldsby, Kindt, Osborne, Kuby, 2003)

Molekule HLA razreda II svojom cjelokupnom trodimenzionalnom strukturom

polipeptidnih lanaca vrlo su slične molekulama HLA razreda I kao što je vidljivo na

slici 5. Po svojoj strukturi su heterodimeri i sastoje se od dva različita polipeptidna

lanca povezana nekovalentnim interakcijama. Molekularna težina lanca α je između

30-34 kDa, dok je lanac β veličine 26-29 kDa, ovisno o genskom lokusu. Poput α

lanca molekula razreda I, molekule razreda II su također glikoproteini koji imaju

izvanstaničnu domenu, transmembranski dio i citoplazmatski dio (Goldsby i sur.,

2003). Oba polipeptidna lanca molekula HLA razreda II imaju po dvije ekstracelularne

domene: α1 i α2 na jednom lancu te domene β1 i β2 na drugom lancu. Domene α2 i

β2 pokazuju strukturnu sličnost imunoglobulinskom slijedu, stoga i molekule HLA

razreda II ubrajamo u imunoglobulinsku superporodicu (slika 6). Domene α1 i β1 koje

su udaljenije od membrane formiraju antigen-veznu pukotinu. Za razliku od pukotine

kod molekule HLA razreda I koja je zatvorena na oba kraja, antigen-vezna pukotina

molekule HLA razreda II je otvorena i zbog toga se u nju mogu smjestiti nešto duži

peptidi duljine 13-18 aminokiselina (Madden, 1995). Domena β2 sadrži vezno mjesto

za molekulu CD4 pomoću kojeg molekule HLA razreda II na antigen-predočnim

10

stanicama stupaju u interakciju s limfocitima T, analogno interakciji molekula HLA

razreda I s molekulom CD8 (Brown 1993).

Slika 6. Neki članovi imunoglobulinske superporodice

(imunoglobulinske konzervirane domene osjenčane su sivom bojom, dok su antigen-

vezne domene osjenčane plavom bojom)

(izvor: Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter, 2002)

1.1.4. Nazivlje sustava HLA

Ubrzo nakon otkrića antigena HLA i nakon održavanja 1. Međunarodnog

radnog sastanka o tkivnoj podudarnosti (1st International Histocompatibility

Workshop – IHWS) 1965. godine ukazala se potreba za standardiziranim nazivljem

serološki definiranih antigena. Prvi istraživači sustava HLA su neovisno jedan od

drugog dodjeljivali vlastite oznake, tako da su različiti laboratoriji imali različite nazive

za iste antigene HLA (Thorsby, 2009).

Odbor za nazivlje HLA pod pokroviteljstvom Svjetske zdravstvene organizacije

(WHO Nomenclature Comitee for Factors of the HLA System) zadužen je za

imenovanje novih gena i alela HLA. Naziv svakog pojedinog alela HLA ima svoj

jedinstveni broj. Taj broj može se sastojati od najviše 4 seta brojeva međusobno

odijeljenih dvotočkom. Svi aleli dobivaju oznaku od najmanje četiri broja, što

odgovara duljini od prva dva seta brojeva, a dulji nazivi se dodjeljuju ukoliko je to

potrebno. Brojevi prije prve dvotočke opisuju tip alela koji u najvećem broju slučajeva

11

odgovara određenoj serološkoj specifičnosti. Nakon prve dvotočke slijedi set brojeva

koji opisuje podtipove nekog gena HLA. Podtipovi su dobivali brojeve redom kako su

im se određivali slijedovi DNA. Kako se vidi u tablici 1, neki aleli u svom nazivu imaju

sufiks koji ukazuje na ekspresiju dotičnog alela – npr. nul-aleli su oni za koje je

dokazano da nemaju ekspresiju pa dobivaju sufiks „N“ (Marsh i sur., 2010).

Tablica 1. Nazivlje HLA

(prema: http://hla.alleles.org/nomenclature/naming.html)

Nazivlje Značenje

HLA regija HLA ili prefiks koji se odnosi na gene HLA

HLA-DRB1 određeni lokus HLA, dakle lokus DRB1

HLA-DRB1*13 skupina alela koja kodira antigen DR13

HLA-DRB1*13:01 alel HLA

HLA-DRB1*13:01:02 alel HLA koji se razlikuje u sinonimnoj mutaciji od alela DRB1*13:01:01

HLA-DRB1*13:01:01:02 alel HLA koji sadrži mutaciju izvan kodirajuće regije u odnosu na alel

DRB1*13:01:01

HLA-A*24:09N „Nul alel“, alel HLA koji nema ekspresiju

HLA-A*30:14L alel HLA koji kodira protein čija je zastupljenost na površini stanice niska

HLA-A*24:02:01:02L alel HLA koji kodira protein čija je zastupljenost na površini stanice

niska, gdje je mutacija utvrđena izvan kodirajuće regije

HLA-B*44:02:01:02S alel HLA koji kodira protein koji je zastupljen samo kao „sekretorna“

molekula

HLA-A*32:11Q

alel HLA koji ima mutaciju za koju je ranije utvrđeno da ima značajan

učinak na zastupljenost proteina na površini stanice, ali to nije potvrđeno

pa njegova zastupljenost ostaje „upitna“

http://hla.alleles.org/nomenclature/naming.html

12

1.2. Osobine sustava HLA

Osnovna uloga molekula HLA je vezivanje peptidnih fragmenata proizašlih od

patogena i njihovo predočivanje na staničnoj membrani kako bi ih prepoznali

odgovarajući limfociti T. To gotovo uvijek rezultira uništavanjem patogena tako da

stanice zaražene virusom budu ubijene, makrofagi se aktiviraju i ubijaju bakterije koje

eventualno žive u unutarstaničnim vezikulama, a limfociti B se aktiviraju tako što

proizvode antitijela koja eliminiraju ili neutraliziraju izvanstanične patogene. Prema

tome, postoji jak selektivni pritisak u korist bilo kojeg patogena da mutira na takav

način koji će mu omogućiti da izbjegne prezentaciju od strane molekule HLA (Franco

i sur., 1995). No, postoje dvije vrlo važne osobine sustava HLA koje onemogućuju

patogenima da izbjegnu imunosni odgovor. U prvom redu zbog velikog broja gena

HLA, a potom zbog velikog broja alela na svakom od tih gena. Prema tome svaka

jedinka posjeduje set molekula HLA koje mogu vezati veliki broj različitih peptida

(Potts i Slev, 1995).

1.2.1. Polimorfizam

Nakon što su se metode serološke tipizacije upotpunile direktnim

sekvenciranjem gena HLA, pronađen je ogroman broj novih alela. Ovi aleli razlikuju

se u DNA slijedovima između dvije različite jedinke od 5-10%. Broj aminokiselina u

kojima se proteinski produkti različitih alela HLA međusobno razlikuju može iznositi

čak do 20 aminokiselinskih ostataka. Broj novootkrivenih alela HLA razreda I u

posljednjih nekoliko godina pokazuje eksponencijalni rast (slika 7). Zanimljivo je da

razlike u slijedovima parova baza između različitih alela HLA nisu nasumično

raspoređene uzduž čitavog polipeptidnog lanca, već su uglavnom smještene u onim

dijelovima gena koji kodiraju domene α1 i α2 molekula HLA razreda I, odnosno kod

gena HLA razreda II u onom dijelu odgovornom za kodiranje domena α1 i β2

molekule. Primjenom rendgenske kristalografije utvrdilo se da je od 17 aminokiselina

koje su pokazivale značajan polimorfizam unutar molekule HLA-A2, čak njih 15

smješteno unutar procjepa u molekuli koji ima ulogu veznog mjesta za strane

13

peptide. Uslijedio je zaključak da različitost alela HLA doprinosi uočenoj sposobnosti

molekula HLA da stupe u interakciju sa stranim antigenom (Parham, 1988).

Slika 7. Grafički prikaz broja novoimenovanih alela od 1987. do listopada 2015.

(prema: http://hla.alleles.org/inc/images/graph_hires.png)

Ako upotrijebimo broj poznatih alela HLA-A, -B i -C iz tablice 2, možemo izračunati

teoretski broj kombinacija koje mogu postojati. Množenjem brojeva 3285, 4077 i 2801

dobit ćemo gotovo 3,75x1010 mogućih različitih haplotipova gena HLA razreda I u

općoj populaciji. Ako uzmemo u obzir lokuse gena HLA razreda II i pomnožimo s

brojem alela HLA-DRB1 (1825 alela) s brojem alela gena HLA-DQA1 (54 alela) i

-DQB1 (876 alela) te brojem alela gena HLA-DPB1 (587 alela) dobit ćemo gotovo

5,07x1010 različitih kombinacija HLA razreda II. Pošto se svaki pojedini haplotip

sastoji od gena HLA razreda I i II, množenjem svih brojeva dobivamo broj od gotovo

19,01x1020 mogućih kombinacija HLA (Goldsby i sur., 2003).

http://hla.alleles.org/inc/images/graph_hires.png

14

Tablica 2. Broj poznatih alela HLA do listopada 2015.

(prema: http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html)

regija broj alela regija broj alela

HLA razred I 10297 HLA razred II 3543

lokus broj alela lokus broj alela lokus broj alela

A 3285 DRA 7 DRB1 1825

B 4077 DRB 1932 DRB2 1

C 2801 DQA1 54 DRB3 60

E 18 DQB1 876 DRB4 17

F 22 DPA1 42 DRB5 22

G 51 DPB1 587 DRB6 3

DMA 7 DRB7 2

DMB 13 DRB8 1

DOA 12 DRB9 1

DOB 13

1.2.2. Rekombinacija

Genetička rekombinacija je termin kojim se označava neroditeljski poredak

alela HLA u potomaka. Rekombinacija može nastati ili kao posljedica nezavisne

segregacije homolognih parova kromosoma ili kao posljedica krosingovera između

http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html

15

homolognih dijelova DNA. Krosingover (engl. crossing over) je postupak u kojem

dolazi do izmjene dijelova nesestrinskih kromatida homolognih kromosoma u profazi I

mejoze.

Svaki par kromosoma koji ulazi u proces mejoze uslijed prethodnog

udvostručenja sastoji se od 4 kromatide. Takvi kromosomi nazivaju se bivalenti ili

tetrade. Kromatide dva homologna kromosoma su međusobno spojene pomoću

proteinske strukture, tzv. sinaptonemskog kompleksa. U profazi I mejoze dolazi do

sparivanja homolognih kromosoma na karakterističan način što se naziva sinapsa, pri

čemu se određeno područje na jednom kromosomu poklapa s istim područjem na

drugom kromosomu. Tako nastaje ključni trenutak mejoze u kojem se stvara

prekriženje između dvije nesetrinske kromatide homolognih kromosoma. Na

mjestima prekriženja dolazi do izmjene genskog materijala između nesestrinskih

kromatida – dolazi do krosingovera. Nakon rekombinacije genskog materijala niti

jedna kromatida nije više identična drugoj. Krosingoverom nastaju dvije vrste

rekombinanata u jednakom broju zbog načina na koje se na određenom mjestu u

bivalentu prekidaju, izmjenjuju i ponovno spajaju dvije nesestrinske kromatide. Nakon

mejoze nastat će dva produkta koji su rekombinantni i dva koji su roditeljski. Ukoliko

se ne dogodi krosingover, svi produkti mejoze bit će roditeljski. Značaj procesa

krosingovera je da on znatno može povećati genetičku raznolikost u gametama

povezujući alele koji prije njega nisu bili skupa (Tamarin, 2002).

Ako uspoređujemo parove gena koji su smješteni blizu jedan drugome na

istom kromosomu i time ne poštuju Mendelov zakon nezavisne segregacije, kažemo

da su to vezani geni, jer su manje ili više usko povezani u procesu prenošenja na

sljedeću generaciju u kojoj će prevladavati određeni roditeljski haplotip. Upravo

saznanje o postojanju vezanih gena i rekombinaciji najviše je doprinijelo genetičkim

istraživanjima kojima se određivao relativan položaj gena na kromosomu –

uspoređivanjem frekvencija rekombinacije mnogo genskih parova (Pierce, 2003).

Vidljivi fizički znakovi nastanka krosingovera su hijazme (slika 8). Ukoliko

pretpostavimo da se hijazme mogu pojaviti bilo gdje uzduž kromosoma može se

zaključiti da će se što su neka dva gena udaljenija, hijazme formirati većom

učestalošću. To je razlog zašto veća frekvencija rekombinacije nekog para gena

odražava veću udaljenost između njih. Općenito, frekvencija rekombinacije varira od

0-50%, s tim da statistički značajne vrijednosti veće od 50% ukazuju na činjenicu da

su dva gena koja promatramo vezana i da se moraju nalaziti na istom kromosomu.

16

Neka dva gena koja pokazuju frekvenciju rekombinacije od 50% nisu genetički

vezana, bilo zbog činjenice da se nalaze na različitim kromosomima ili zbog toga što

leže na istom kromosomu, ali su prilično udaljeni (Tamarin, 2002).

Slika 8. Shematski prikaz krosingovera

(izvor: http://year12biologyatsmc.wikispaces.com/Crossing+Over)

Pošto do rekombinacije dolazi tijekom profaze I mejoze, nakon što je završila

replikacija DNA, taj proces mora uključivati lom i ponovno spajanje homolognih

nesestrinskih kromatida. Uočeno je da do rekombinacije dolazi isključivo između

homolognih regija uz visoku točnost, što pretpostavlja važnu ulogu sparivanja baza

između komplementarnih lanaca. Važnu ulogu sparivanja parova baza u procesu

rekombinacije potvrđuje i činjenica da se mjesta rekombinacije uvijek nalaze u

regijama heterodupleksa, a to implicira i da je proces iniciran lomovima u jednom

lancu DNA. Naposljetku, pojava regija heterodupleksa povezanih s procesom

konverzije gena bez rekombinacije upućuje na to da su u nekim slučajevima

pokrenuti događaji koji ne vode nužno do rekombinantnog ishoda (Pierce, 2003).

http://year12biologyatsmc.wikispaces.com/Crossing+Over

17

Prema jednom molekularnom modelu krosingovera, rekombinacija je vjerojatno

uvijek pokrenuta zarezivanjem lanca DNA kojeg za vrijeme mejoze cijepaju specifični

enzimi na točno određenim mjestima. Ta mjesta su tzv. preferirana mjesta

rekombinacije i kod sisavaca se nazivaju „hot spots“ (eng. hot spot = vruće mjesto)

Na molekularnom nivou, rekombinacija se sastoji od loma, invazije, migracije i

razdruživanja komplementarnih lanaca DNA koji potječu od različitih homolognih

kromosoma. U tom procesu važnu ulogu imaju sparivanje baza i popravak DNA

(Carrington, 1999).

Otkriće krosingovera između pojedinih gena HLA bilo je najjači dokaz da

unutar sustava HLA postoji nekoliko segregantnih skupina alelomorfnih gena.

Zahvaljujući tom otkriću bilo je moguće na kromosomu 6 točno odrediti položaj

pojedinih lokusa HLA. Premda je učestalost rekombinacije unutar sustava HLA koja

je nastala kao posljedica krosingovera vrlo niska i iznosi približno 1% na 1x106

parova baza DNA po mejozi, značajno doprinosi raznolikosti HLA. Genska

rekombinacija razlog je nastanka novih kombinacija alela, tj. haplotipova HLA.

Učestalost krosingovera između lokusa HLA-A i -B iznosi oko 1%, između lokusa

HLA-B i -C oko 0,2%, te između lokusa HLA-B i -DRB1 oko 0,5%, koliko iznosi i

učestalost krosingovera između lokusa HLA-A i –C (Kaštelan, 1983).

1.2.3. Neravnoteža udruživanja

Teoretski izračun raznolikosti opisan u poglavlju o polimorfizmu pretpostavlja

činjenicu da su kombinacije alela potpuno nasumične. U stvarnosti je raznolikost

manja zbog toga što se određeni aleli u haplotipovima HLA pojavljuju češće nego što

se to može predvidjeti nasumičnim kombiniranjem i ta pojava se naziva neravnoteža

udruživanja (eng. linkage disequilibrium). Ukratko, neravnoteža udruživanja je razlika

između učestalosti koja je uočena za određenu kombinaciju alela i one frekvencije

koja je bila očekivana s obzirom na frekvenciju pojedinačnih alela. Očekivana

frekvencija kombinacije neka dva alela može se izračunati množenjem pojedinačnih

frekvencija tih alela. Npr. ako se HLA-A1 pojavljuje u 16% osoba u nekoj populaciji

(dakle frekvencijom koja iznosi 0,16%), a HLA-B8 se pojavljuje kod 9% osoba u toj

skupini (dakle frekvencijom od 0,09%), može se očekivati da će otprilike 1,4% jedinki

te skupine imati oba alela HLA. Podaci pokazuju da se kombinacija alela HLA-A1 i

18

HLA-B8 pronalazi kod 4,5% pojedinaca u populacijama europskog porijekla. Ova

razlika je mjera neravnoteže udruživanja između ova dva navedena alela HLA

razreda I. Navedeni aleli su sastavni dio haplotipa HLA-A*01, -B*08, -DRB*0301, -

DQB1*0201 koji je primjer jedne od najjače neravnoteže udruživanja među

populacijama europskog porijekla (Shankarkumar, 2004).

Visokoj učestalosti određenih kombinacija alela HLA prema jednoj teoriji mogli

su doprinijeti učinci selekcije jer su npr. određene kombinacije omogućile otpornost

na neke bolesti, ili su naprotiv, neki drugi haplotipovi HLA mogli proizvesti štetne

učinke poput osjetljivosti na autoimune bolesti (Abbas, 2004).

1.2.4. Segregacija

Prema Mendelovom prvom zakonu nasljeđivanja princip segregacije navodi da

svaki pojedini diploidni organizam posjeduje dva alela za neko nasljedno svojstvo.

Prilikom formiranja gameta ova dva alela se odvajaju – segregiraju, tako da po jedan

alel odlazi u svaku od gameta. Prema Suttonovoj kromosomalnoj teoriji nasljeđivanja

diploidne stanice posjeduju dva seta kromosoma, s tim da svaki kromosom posjeduje

odgovarajući homologni kromosom s kojim se sparuje. Jedan kromosom iz svakog

homolognog para nasljeđen je od majke, a drugi od oca. Dakle, diploidne stanice u

kojima postoje dvije kopije svakog kromosoma posjeduju po dva alela za svaki lokus

koji čine genotip. Pošto u diploidnom organizmu svaki gen postoji u dvije kopije,

moguće su varijacije u fenotipu – izraženim osobinama tog gena. Ukoliko su obje

kopije gena identične, dakle neki organizam ima dva ista alela, taj je organizam

homozigotan za navedeni gen, dok je organizam koji ima dva različita alela

heterozigotan. Princip segregacije navodi da se od svakog roditelja nasljeđuje po

jedan alel genotipa. Tijekom S-faze mejotičke interfaze svaki kromosom se

udvostručuje producirajući dvije kopije svakog alela, po jednu na svakoj sestrinskoj

kromatidi. Tijekom anafaze I mejoze homologni kromosomi se odvajaju i to

predstavlja temelj principa segregacije (Tamarin, 2002). Ukoliko se za vrijeme

profaze I mejoze dogodio krosingover, tada dvije kromatide koje potječu od svakog

udvostručenog kromosoma nisu više identične i nastupa segregacija različitih alela

tijekom anafaze I i anafaze II.

19

Upravo metoda klasične genske analize segregacije gena bila je jedna od

polaznih metoda za utvrđivanje položaja sustava HLA unutar genoma, te za

određivanje udaljenosti između pojedinih lokusa HLA (Hartwell i sur., 2000).

Analiza segregacije nekog lokusa HLA provodi se na uzorku od 100 ili više

obitelji s minimalno 2 djece u kojima su roditelji heterozigoti na tom lokusu. Kroz više

generacija promatrano je da li je segregacija gena HLA pravilna. Pošto je

ustanovljeno da je iz generacije u generaciju očuvana uvijek ista količina nekog

gena, mnogim istraživanjima dokazano je da je segregacija gena HLA pravilna.

20

1.3. Primjena istraživanja sustava HLA

Istraživanje antigena i gena HLA ujedno je i glavno područje rada

imunogenetike upravo zbog činjenice da poznavanje i proučavanje tkivnih antigena

ima praktičnu primjenu u:

transplantacijskoj medicini

dijagnostici brojnih bolesti povezanih s genima HLA

populacijskim istraživanjima

1.3.1. Transplantacija tkiva i organa

Transplantacija je postupak prenošenja tkiva ili organa s jedne jedinke na

drugu ili s jednog mjesta na drugo unutar iste jedinke.

Transplantacija tkiva i organa u svrhu zamjene oboljelih organa u današnje

vrijeme je važna grana medicine. Najveća zapreka uspješnoj transplantaciji u većini

slučajeva je odgovor mehanizma stečene imunosti na presađeno tkivo, pošto su

glavni cilj imunosnog odgovora primatelja upravo molekule HLA eksprimirane na

površini stanica davatelja (Mahdi, 2013).

Nakon otkrića da je raspoznavanje vlastitog od tuđeg glavna odrednica za

odbacivanje transplantata, ulagalo se mnogo napora u određivanje podudarnosti

između davatelja i primatelja. Podudarnost u alelima HLA znatno poboljšava rezultate

transplantacije organa (Andreis i sur. 2004).

Kod čovjeka se od nelimfnih organa presađuje najčešće bubreg, zatim srce,

pluća, jetra, gušterača, koža i rožnica. Pri presađivanju se nastoje pronaći HLA što

podudarniji davatelj i primatelj. Kako oni gotovo nikada nisu potpuno HLA podudarni,

najčešće se razvija reakcija odbacivanja koju se nastoji potisnuti imunosupresijom

primatelja. Kod većine transplantiranih organa jednogodišnje preživljavanje

transplantata je 80-90% (Barshes i sur., 2004).

Uspjeh presađivanja bubrega poklapa se s podudarnosti davatelja i primatelja

u genima HLA. Kao uvjet za presađivanje bubrega uzima se potpuna podudarnost u

genima HLA razreda II uz što je moguće veću podudarnost u genima HLA razreda I,

a posebice se to odnosi na lokus HLA-B (Andreis i sur., 2004).

21

Presađivanje limfatičkog tkiva specifično je po tome što i sam transplantat

može reagirati protiv različitih molekula HLA jednako kao što i primatelj reagira na

različite molekule HLA davatelja. Od limfnih tkiva najčešće se presađuju krvotvorne

matične stanice. Postoje tri vrste transplantata u odnosu na razloge mogućeg

presađivanja, a to su alogenična koštana srž, autologna koštana srž ili matične

stanice izdvojene iz periferne krvi. Alogenična koštana srž presađuje se samo ukoliko

su davatelj i primatelj podudarni u genima HLA, jer razlike u genima HLA mogu

dovesti do odbacivanja transplantata, kao i do reakcije transplantata protiv primatelja

(engl. Graft versus host desease, GVHD). Optimalni davatelj krvotvornih matičnih

stanica je brat ili sestra koji je s njim HLA identičan. Za primatelje koji nemaju

davatelja u obitelji, potencijalne davatelje podudarne u alelima HLA moguće je naći i

među nesrodnim osobama zahvaljujući postojanju registra dobrovoljnih nesrodnih

davatelja. Izbor nesrodnog davatelja temelji se na podudarnosti za gene HLA lokusa

HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 – takozvana podudarnost 10/10 (Nowak, 2008).

1.3.2. Geni HLA i bolesti

Regiju HLA povezuju s puno više bolesti nego bilo koju drugu regiju unutar

humanog genoma. Većinom se ta povezanost odnosi na autoimunosne bolesti, ali i

neke druge bolesti (tablica 3). Tako na primjer osobe koje imaju gen HLA-B*27 imaju

90 puta veću vjerojatnost za razvoj ankilozantnog spondilitisa, nego što ju imaju

osobe koje nemaju taj gen. Dakle, relativni rizik nosioca gena HLA-B*27 da oboli od

ove bolesti iznosi 90. No, postojanje povezanosti između nekih gena HLA i određenih

bolesti ne smije se interpretirati na način da je ekspresija dotičnog gena HLA

uzrokovala nastanak bolesti. Veza između gena HLA i bolesti je složena. Postoje dva

općenita objašnjenja veze između HLA i nekih bolesti (McDevitt, 1985). Prvo je

mogućnost postojanja neravnoteže udruživanja između alela točno određenog lokusa

odgovornog za nastanak bolesti i pojedinog gena HLA povezanog s tom bolesti.

Drugo moguće objašnjenje je da molekula HLA sama po sebi ima neku ulogu u

nastanku bolesti i to na način sličan jednom od predloženih modela. Prvi model

pretpostavlja da molekula HLA slabo predočuje određeni virusni ili bakterijski antigen,

dok drugi opisuje dotičnu molekulu HLA na staničnoj površini kao vezno mjesto za

virusni ili bakterijski uzročnik bolesti. Prema trećem modelu neka molekula HLA

22

omogućuje transport virusa u stanicu dok prema četvrtom modelu molekularna

podudarnost molekule HLA s patogenom dovodi do neuspješnog prepoznavanja

stranog patogena od strane domaćina. Iz svega navedenog se nameće pretpostavka

da su najvjerojatnije uključeni svi predloženi mehanizmi, ali u različitim razmjerima

kod različitih bolesti (Thorsby, 1997).

Tablica 3. Povezanost molekula HLA i određenih bolesti

(prema: Andreis i sur., 2004)

Bolest Podložna molekula HLA Relativni rizik

Ankilozantni spondilitis B27 90-100

Akutni prednji uveitis B27 10,04

Goodpastureov sindrom DR2 15,9

Multipla skleroza DR2 4,8

Autoimunosna hipertireoza DR3 3,7

Miastenija gravis DR3 2,5

Sistemni eritematozni lupus DR3 5,8

Šećerna bolest ovisna o inzulinu DR3,DR4,

heterozigoti DR3/DR4 5-25

Reumatoidni artritis DR4 4,2

Pemphigus vulgaris DR4 14,4

Hashimotoov tireoiditis DR5 3,2

1.3.3. Populacijska istraživanja

Određivanjem raspodjele antigena/gena, tj. alela HLA na reprezentativnom

uzorku nesrodnih osoba provode se populacijska istraživanja. Dosadašnja

populacijska istraživanja ukazuju na različitu zastupljenost pojedinih gena HLA u

različitim populacijama i etničkim skupinama. Pojedini aleli HLA karakteristični su za

određene populacije, a neki drugi aleli HLA prisutni su u gotovo svim do sada

istraživanim populacijama. Upravo analizom raspodjele alela HLA došlo se do

zaključka da se aleli HLA mogu podijeliti u tri skupine. Prva skupina obuhvaća alele

HLA s relativno visokom zastupljenošću unutar svih populacija kao što je npr. HLA-

23

A*02:01. Druga skupina uključuje alele koji su prisutni kod većine populacija, ali s

različitom učestalošću kao npr. HLA-A*24:02. Npr. gen HLA-A*34 prisutan je

učestalošću od 78% kod australskih Aboridžina, dok je njegova frekvencija manja od

1% kod australskih bijelaca. Treću skupinu sačinjavaju aleli HLA karakteristični samo

za pojedine populacije kakav je npr. HLA-B*42:01 karakterističan za populacije

afričkog porijekla (Shankarkumar, 2004).

Na temelju dosadašnjih istraživanja koje obuhvaćaju populacije afričkog,

europskog i azijskog porijekla, brojne populacije, izolirane populacije kao i etničke

skupine mogu se izvesti važni antropološki zaključci o smjerovima seoba

stanovništva i interakcijama između različitih populacija. Populacije vrlo sličnih

učestalosti pojedinih alela HLA imaju zajedničko porijeklo (Pierce, 2003).

Populacijskim istraživanjima sustava HLA otkriveno je da je broj HLA

homozigotnih osoba znatno manji od broja heterozigotnih osoba. Ta činjenica je

pokazatelj da je na gene HLA djelovala selekcija u korist polimorfizma i

heterozigotnosti. Proučavanje raspodjele alela HLA među različitim populacijama

dovelo je do spoznaje koje kombinacije alela HLA najčešće dolaze vezane u

haplotipove. Na osnovu toga se mogla odrediti i evolucijska stabilnost pojedinih

haplotipova.

24

2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA

1. Analizirati rodoslovlje obitelji ispitanika i odrediti haplotipove HLA-A, -B, -DRB1

2. Istražiti učestalost krosingovera između lokusa HLA u obiteljima s dvoje i više

djece

3. Analizirati porijeklo krosingovera unutar obitelji

4. Utvrditi postoji li povezanost pojedinih haplotipova HLA s određenim

krosingoverom

5. Usporediti dobivene rezultate s podacima iz literature

25

3. MATERIJALI I METODE

3.1. Ispitanici

Za potrebe izrade ovog diplomskog rada korišteni su podaci iz registra obitelji

bolesnika mogućih primatelja krvotvornih matičnih stanica koji su u Zavod za

tipizaciju tkiva Kliničkog bolničkog centra Zagreb došli u okviru obavljanja pretrage

određivanja antigena/gena HLA.

Ukupan broj analiziranih obitelji bio je 2049, a ukupan broj djece 5936.

3.2. Metode

3.2.1. Određivanje antigena HLA

3.2.1.1. Test mikrolimfocitotoksičnosti

Dovesti u kontakt antigene HLA prisutne na membrani limfocita s protutijelima

HLA koji se nalaze u serumu je osnovni princip testa mikrolimfocitotoksičnosti

(MLCT) (Kaštelan, 1983). Od osobe kojoj ispitujemo antigene HLA uzima se mala

količina periferne krvi s heparinom i zatim se na gradijentu gustoće izdvoje limfociti.

Suspenzija limfocita T i limfocita B se pročišćava uzastopnim ispiranjem i

centrifugiranjem, te joj se podesi koncentracija. Sam test izvodi se tako da se u

svaku jažicu Terasakijeve pločice dodaje suspenzija limfocita osobe kojoj

određujemo antigene HLA. Terasakijeva pločica je prethodno pripremljena na način

da se na dno svake jažice nanose različiti antiserumi s protutijelima HLA specifičnim

za različite antigene HLA prema točno utvrđenom planu. Nakon toga slijedi inkubacija

za vrijeme koje dolazi do reakcije antigen-protutijelo u onim jažicama na pločici u

kojima su upravo oni antiserumi HLA koji sadrže protutijela HLA specifična za

antigene HLA osobe koju tipiziramo. Zatim se u svaku jažicu dodaje kunićji serum i

slijedi inkubacija. Za vrijeme druge inkubacije se na kompleks antigen-antitijelo, koji

26

je u prvoj inkubaciji nastao na membrani stanica, veže komplement iz seruma kunića

i time dolazi do lize stanica. Kako bismo ih mogli promatrati pod mikroskopom,

potrebno ih je obojiti. To se čini dodavanjem tripanskog modrila koji će mrtve lizirane

stanice obojiti plavo, dok se žive stanice neće obojiti i pod mikroskopom će biti

vidljive kao blijedožute. Iz odnosa broja živih i mrtvih stanica dobiva se rezultat testa.

Na osnovi dobivenih reakcija prema planu baterije za tipizaciju odredimo antigene

HLA osobe koju smo tipizirali. Dobiveni rezultat predstavlja fenotip HLA dotične

osobe. Ukoliko se tipiziraju i članovi obitelji, tada na temelju dobivenih tipizacija

dedukcijom možemo odrediti i genotip HLA, tj. haplotipove HLA.

3.2.2. Određivanje gena HLA

3.2.2.1. Metoda PCR-SSO

Metoda PCR-SSO (engl. Polymerase Chain Reaction – Sequence Specific

Oligonucleotides) razvijena je u cilju poboljšanja postojećih tehnika za analizu

proteina i nukleinskih kiselina. Temelji se na umnožavanju specifičnog dijela DNA uz

biotinom obilježene dimere koji se za vrijeme hibridizacije inkubiraju sa suspenzijom

mikrosfera. Mikrosfere su polistirenske kuglice veličine 5,6 mikrona čija je

unutrašnjost ispunjena crvenim ili infracrvenim fluorokromom, a na površini sadrže

vezane ili proteine ili oligonukleotidne sekvence, već prema tome za što se

primjenjuju. U našem slučaju za određivanje gena HLA na površini mikrosfera nalaze

se oligonukleotidne sekvence. Kad završi hibridizacija, reakcijskoj smjesi se dodaje

fluorescentna boja SAPE (engl. Streptovidin Phycoeritrin) koja se veže za biotinom

označeni dio DNA. Nakon hibridizacije ovako označeni dio DNA ostao je specifično

vezan s probama na određenim mikrosferama. U Luminex aparatu provodi se

očitavanje rezultata na način da aparat detektira fluorescenciju pomoću dva lasera i

očitava koje su se probe vezale na uzorak DNA. Analiza rezultata i određivanje gena

HLA u ispitivanom uzorku DNA provodi se analitičkim programom Quicktype for

Lifecodes 3.0 (IMMUCOR®).

27

3.2.2.2. Metoda PCR-SSP

Temelj metode PCR-SSP (engl. Polymerase Chain Reaction – Sequence

Specific Primers) je da se za pokretanje reakcije PCR koriste oligonukleotidne

početnice koje imaju komplementaran slijed onome koji je karakterističan za određeni

alel HLA. Tipizacijski set PCR-SSP sastoji se od određenog broja reakcija za svaki

pojedini lokus, što znači za lokuse HLA-A i -DRB1 po 24 različite reakcije, a za lokus

HLA-B 48 različitih reakcija. Svaka reakcija zasebno predstavlja jednu reakciju PCR

kojom se ispituje prisustvo jednog ili skupine alela HLA, a u svakoj reakciji su

prisutne: dvije početnice koje su specifične za pojedini alel ili za grupu alela, kontrolni

par početnica koje će nam pokazati da li smo u reakciju stavili sve potrebno, smjesa

deoksiribonukleotida (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), komercijalni pufer, termostabilna

Taq polimeraza i genomska DNA koncentracije 50 μg/ml. Očitavanje pozitivnih

reakcija tipizacije metodom PCR-SSP izvodi se elektroforezom na agaroznom gelu

(1,5%). Naziv programa za interpretaciju rezultata je Helmberg Score SSP.

3.3. Statistička obrada podataka

Učestalost krosingovera određena je izravnim brojanjem. Upotrebom χ2 testa

utvrđene su razlike između pojedinih čimbenika. U slučaju kad je broj bio manji od 5,

korišten je Fischer-ov test. U slučaju da je vrijednost „p“ bila manja od 0,05

usporedba dva čimbenika smatrana je statistički značajnom.

Učestalost krosingovera u ispitivanoj skupini izračunali smo prema niže

navedenoj formuli:

28

4. REZULTATI

4.1. Zbirni prikaz ispitivane skupine obitelji

Ovim radom obuhvaćeno je 2049 obitelji s ukupno 5936 djece (2998 kćeri i

2938 sinova). Prosječaj broj djece po obitelji iznosio je 2,9, a omjer spolova bio je

podjednak, tj. 1,02 : 1,00 u korist kćeri (tablica 4).

Svim ispitanicima određeni su antigeni/geni HLA jednom od navedenih

metoda. Provedena je analiza rodoslovlja obitelji ispitanika i određeni su haplotipovi

HLA-A, -B i -DRB1 u obiteljima s dvoje ili više djece.

Unutar ispitivane skupine od 2049 obitelji kod njih 74 (3,61%) ustanovljeno je

prisustvo krosingovera. Kod 3 (0,15%) obitelji pronađen je krosingover kod 2 djece. U

tablici 4 također su prikazani i podaci o porijeklu rekombinantnog haplotipa.

Potrebno je naglasiti da je za istraživanja krosingovera HLA u obiteljima

neophodno da obitelji imaju najmanje dvoje djece, a tek unutar obitelji s minalno troje

djece možemo utvrditi kod koga je došlo do krosingovera, tj. koji je haplotip

rekombinantan.

Tablica 4. Zbirni prikaz podataka za ispitivanu skupinu

N %

Ukupan broj obitelji 2049

Ukupan broj djece 5936

Broj ♀ djece 2998 50,51

Broj ♂ djece 2938 49,49

Obitelji kod kojih je ustanovljen krosingover 74 3,61

Obitelji s jednim krosingoverom 71 3,47

Obitelji s dva krosingovera 3 0,15

Krosingover u oogenezi 44 57,14

Krosingover u spermatogenezi 25 32,47

Nepoznato porijeklo rekombinantnog haplotipa 8 10,39

Krosingover između lokusa HLA-A i HLA-B 37 48,05

Krosingover između lokusa HLA-B i HLA-DRB1 40 51,95

Legenda: ♀ - ženski spol, ♂- muški spol, N – broj

29

4.2. Analiza obitelji s krosingoverom nastalim u oogenezi

Unutar ispitivane skupine od 71 obitelji, kod njih 39 (54,93%) utvrđeno je

postojanje rekombinantnog haplotipa HLA naslijeđenog od majke. Od toga je kod 18

(46,15%) obitelji utvrđen krosingover između lokusa HLA-A i -B, te je kod 21

(53,85%) obitelji utvrđen krosingover između lokusa HLA-B i HLA-DRB1. Na slici 9 je

prikazano nasljeđivanje rekombinantnog majčinog haplotipa HLA između lokusa

HLA-A i -B unutar obitelji broj 29. Iz slike 9 se vidi da je kod kćeri br. 5 došlo do

rekombinacije i nastanka haplotipa HLA-A25-B5-DRB1*15.

Slika 9. Primjer rodoslovlja HLA obitelji s krosingoverom u oogenezi između lokusa

HLA-A i -B (obitelj broj 29)

Legenda: C.O. – krosingover

U obitelji broj 55, prikazanoj na slici 10, došlo je do krosingovera između

lokusa HLA-B i -DRB1. Obitelj je imala čak sedmero djece te je dedukcijom bilo

moguće odrediti kod kojeg djeteta (broj 6) je došlo do krosingovera.

30

Slika 10. Primjer rodoslovlja HLA obitelji s krosingoverom u oogenezi

između lokusa HLA-B i -DRB1 (obitelj broj 55)


4.3. Analiza obitelji s krosingoverom nastalim u spermatogenezi

U ovoj skupini obitelji (N= 24, 33,8%) rekombinacija između lokusa HLA

dogodila se na haplotipovima HLA koje su djeca naslijedila od svojih očeva. Kod 11

obitelji (45,83%) krosingover se dogodio između lokusa HLA-A i -B, a kod njih 13

(54,17%) krosingover je bio između lokusa HLA-B i HLA-DRB1.

Na slici 11 prikazana je obitelj br. 25 koja je imala troje djece te smo mogli

utvrditi da se krosingover dogodio tijekom spermatogeneze i to između lokusa HLA-A

i -B. Iz slike se vidi da je dijete „1“ naslijedilo rekombinantni haplotip HLA-A2-B27-

DR7. Primjer obitelji s krosingoverom između lokusa HLA-B i -DRB1 nastao tijekom

spermatogeneze prikazan je na slici 12.

31

Slika 11. Primjer rodoslovlja HLA obitelji s krosingoverom u spermatogenezi između

lokusa HLA-A i -B (obitelj broj 25)


Slika 12. Primjer rodoslovlja HLA obitelji s krosingoverom u spermatogenezi između

lokusa HLA-B i HLA-DRB1 (obitelj broj 63)


32

4.4. Analiza obitelji s rekombinantnim haplotipom HLA nepoznatog

porijekla

Ovim istraživanjem obuhvaćena je i grupa od 8 (11,27%) obitelji s

krosingoverom ali kod kojih nismo mogli utvrditi porijeklo rekombinantnog haplotipa

HLA, tj. kada je nastao krosingover (tijekom oogeneze ili spermatogeneze). Naime,

riječ je bila o obiteljima bez živih roditelja gdje smo tipizirali samo braću i sestre. Kod

5 obitelji radilo se o krosingoveru između lokusa HLA-A i -B, a kod 3 obitelji je bio

utvrđen krosingover između lokusa HLA-B i -DRB1.

Primjer rodoslovlja obitelji s rekombinantnim haplotipom HLA nepoznatog

porijekla između lokusa HLA-A i -B prikazan je na slici 13, dok je primjer rodoslovlja

obitelji s rekombinantnim haplotipom HLA (krosingover između lokusa HLA-B i HLA-

DRB1) čije porijeklo nismo mogli utvrditi prikazan na slici 14.

Slika 13. Primjer rodoslovlja HLA obitelji s krosingoverom nepoznatog porijekla

između lokusa HLA-A i -B (obitelj broj 05)


33

Slika 14. Primjer rodoslovlja HLA obitelji s krosingoverom nepoznatog porijekla

između lokusa HLA-B i -DRB1 (obitelj broj 38)


4.5. Analiza obitelji s dva krosingovera

Kod tri obitelji uočili smo po dva krosingovera. Primjer takve obitelji je na slici

15 u kojoj je krosingover nastao u oogenezi i to kod dvoje djece (kćeri broj 4 i sina

broj 5). Unutar ove obitelji nije moguće odrediti je li kod oboje potomaka krosingover

nastao između istih lokusa HLA ili je kod jednog djeteta nastao između lokusa HLA-A

i -B, a kod drugog između lokusa HLA-B i -DR. Razlog tome je što je majka

homozigot na lokusu HLA-B.

34

Slika 15. Rodoslovlje obitelji s dva krosingovera u oogenezi (obitelj broj 06)


Obitelj broj 11 (slika 16) imala je dvoje djece kod kojih je kod oboje došlo do

krosingovera tijekom oogeneze. Sin broj 1 naslijedio je rekombinantni majčin haplotip

HLA s krosingoverom između lokusa HLA-A i HLA-B (HLA-A*11-B*35-DRB1*04), dok

je drugi sin također naslijedio rekombinantni majčin haplotip HLA s krosingoverom

između lokusa HLA-B i -DRB1 (HLA-A*11-B*51-DRB1*04). U ovoj obitelji testiran je i

dodatni član proširene obitelji (majčina sestra) te smo mogli utvrditi da je prvotni

majčin haplotip bio HLA-A*11-B*35-DRB1*01.

Slika 16. Rodoslovlje obitelji s dva krosingovera u oogenezi između lokusa HLA-A i

HLA-B, te između lokusa HLA-B i -DRB1 (obitelj broj 11)


35

Obitelj broj 13, prikazana na slici 17, imala je troje djece i kod bolesnice (kćer

broj 1) se dogodila rekombinacija majčinog i očevog haplotipa.

Slika 17. Rodoslovlje obitelji s dva krosingovera u spermatogenezi i oogenezi između

lokusa HLA-A i -B (obitelj broj 13)


36

4.6. Analiza haplotipova HLA u obiteljima s krosingoverom između

lokusa HLA-A i -B

U tablici 5 prikazani su haplotipovi HLA u 23 obitelji s krosingoverom između

lokusa HLA-A i -B kod kojih smo mogli utvrditi haplotipove HLA (obitelji s troje i više

djece). Od toga je 15 (65,22%) krosingovera bilo u oogenezi, a 8 (34,78%) u

spermatogenezi.

Na slici 18 prikazana je raspodjela alela HLA-B kod kojih je došlo do

rekombinacije između lokusa HLA-A i -B. Najčešće je krosingover uočen na onim

haplotipovima koji su imali gen HLA-B27.

Slika 18. Raspodjela gena HLA-B u haplotipovima kod kojih je došlo do krosingovera

između lokusa HLA-A i -B

37

Tablica 5. Prikaz haplotipova HLA u obiteljima s krosingoverom između lokusa

HLA-A i -B

Obitelj Porijeklo

rekombinantnog haplotipa HLA

1. haplotip HLA 2. haplotip HLA Rekombinantni haplotip HLA

01 majka A1-B17-DR4 A2-B35-DR11 A1-B35-DR11



16 majka A25-B27 A3-B18 A25-B18

19 majka A2-B18 A11-B38 A2-B38


25 otac A2-B13-DR16 A9-B12-DR7 A2-B12-DR7


29 majka A25-B12-DRB1*14 A2-B51-DRB1*15 A25-B51-DRB1*15

31 otac A28-B8-DRB1*03 A25-B18-DRB1*15 A28-B18-DRB1*15











67 majka A*33-B*14-DRB1*01 A*02-B*08-DRB1*03 A*33-B*08-DRB1*03

69 otac A*31-B*08-DRB1*03 A*24-B*35-DRB1*14 A*31-B*35-DRB1*14


38

4.7. Analiza haplotipova HLA u obiteljima s krosingoverom između

lokusa HLA-B i -DRB1

Od svih obitelji s krosingoverom između lokusa HLA-B i -DRB1, kod njih 20

mogli smo dedukcijom odrediti haplotipove HLA (tablica 6). U ovoj skupini obitelji kod

njih 11 (55,0%) krosingover se zbio tijekom oogeneze, a kod njih 9 (45,0%) tijekom

spermatogeneze. Haplotipovi s genom HLA-DR13 pokazali su najveću učestalost

rekombinacije (5 puta, 25%) što je prikazano na slici 19.

Slika 19. Raspodjela gena HLA-DR u haplotipovima kod kojih je došlo do

krosingovera između lokusa HLA-B i -DR

39

Tablica 6. Prikaz haplotipova HLA u obiteljima s krosingoverom između lokusa

HLA-B i -DRB1

Obitelj Porijeklo

rekombinantnog haplotipa HLA

1. haplotip HLA 2. haplotip HLA Rekombinantni haplotip HLA


09 majka A25-B12-DRB1*11:01 A3-B51-DRB1*11:04 A25-B12-DRB1*11:04








45 majka A19.2-B35-DR11 A3-B27-DR1 A19.2-B35-DR1









71 majka A2-B18-DRB1*11 A -B39-DRB1*12 A*02-B*18-DRB1*12


40

5. RASPRAVA

U ovom radu istraživana je učestalost krosingovera u uzorku od 2049 obitelji iz

registra obitelji bolesnika mogućih primatelja krvotvornih matičnih stanica. U

obiteljima je bilo ukupno 5936 djece s podjednakim omjerom spolova. Veličina

uzorka je bila dovoljna za dobivanje točnih rezultata o frekvenciji rekombinacije

unutar neke populacije što nam potvrđuju i primjeri iz literature (Thomsen i sur., 1989;

Thomsen i sur., 1994). Naime, navedeni autori su analizirali skupinu od 1332 obitelji i

utvrdili da je uzorak dovoljan za praćenje rekombinacija unutar gena HLA. Ukupan

broj rekombinacija u našem uzorku bio je 3.76% što je u skladu sa zaključkom kojeg

je naveo Carrington o učestalosti rekombinacije (<5.0%) unutar regije HLA

(Carrington, 1999). Istovremeno autor ukazuje na nužnost ovakvih istraživanja s

velikim brojem informativnih mejoza, na temelju kojih bi mogli dobiti uvid o učestalosti

rekombinacija u ovoj regiji. Iz tog razloga treba istaknuti važnost ovog istraživanja

provedenog u našoj populaciji, kojim smo po prvi put na ovako velikom uzorku obitelji

dobili podatak o rekombinacijama između lokusa HLA.

Jedan od ciljeva istraživanja bio je i analizirati rodoslovlje obitelji ispitanika.

Rodoslovlja obitelji ispitanika su analizirana na način da su u obiteljima s dvoje ili više

djece, s roditeljima ili bez njih, nakon tipizacije HLA određeni haplotipovi HLA-A, -B i

-DRB1. Za istraživanje su „vrijednije“ obitelji u kojima smo imali roditelje jer smo u

njima mogli odrediti porijeklo rekombinantnog haplotipa. Prisustvo krosingovera

utvrđeno je kod 3,61% obitelji, od toga je kod 3,47% obitelji utvrđen krosingover kod

jednog djeteta, a kod 0,15% obitelji utvrđeno je prisustvo krosingovera kod dvoje

djece. Pojava dva krosingovera unutar iste obitelji je vrlo rijetka pojava i obično ne

dolazi do krosingovera na istom mjestu unutar regije HLA. U ovom istraživanju je

unutar obitelji 06 (slika 15) utvrđeno prisustvo dva rekombinantna haplotipa HLA

porijeklom od majke s krosingoverom između lokusa HLA-B i -DRB1. S obzirom da

su ova dva lokusa HLA udaljena postavlja se pitanje je li do rekombinacije došlo na

istom mjestu tzv. „hot spot“ mjestu na kromosomu 6 ili je pak do rekombinacije došlo

na različitim mjestima. Konačan zaključak nije moguće donijeti već bi trebalo testirati

druge genske markere (npr. lokuse STR-Short Tandem Repeats ili SNP-Single

Nucleotide Polymorphism) unutar ove regije. S druge strane unutar obitelji broj 11

(slika 16) kod oboje djece je uočen krosingover ali između različitih lokusa HLA što je

41

češća pojava u literaturi (Ikeda i sur., 2015). Obitelj broj 13 (slika 17) je vrlo zanimljiva

jer je kod jednog djeteta došlo do dva krosingovera tj. i majčinog i očevog haplotipa

što je iz literaturnih navoda vrlo rijedak slučaj (Ikeda i sur., 2015).

Analiza porijekla rekombinantog haplotipa (majka ili otac) koju smo mogli

pratiti u 2041 obitelji, jer kod osam obitelji nismo imali niti jednog roditelja, pokazala je

veću učestalost rekombinacija tijekom oogeneze nego tijekom spermatogeneze

(44:25; 1,76) što je u skadu s očekivanjima i rezultatima iz literature (Strachan i

Read, 1996, Thomsen i sur. 1994). Navedeni autori su utvrdili da se krosingover

javlja 1,8 puta češće u oogenezi nego u spermatogenezi.

Naredni cilj našeg rada bio je utvrditi učestalost krosingovera između praćenih

lokusa HLA. S obzirom na međusobnu udaljenost lokusa HLA-A i -B, odnosno HLA-B

i -DRB1, na kraćem kraku kromosoma 6, bilo je za očekivati da će učestalost biti

podjednaka što je i rezultat pokazao i što je u skladu s podacima iz literature

(Carrington, 1999; Pierce 2003).

Istraživanje je također obuhvatilo i analizu haplotipova HLA na kojima je došlo

do krosingovera, odnosno postoji li povezanost određenih haplotipova HLA s

učestalošću i mjestom nastanka krosingovera. U skupini od 23 obitelji s troje ili više

djece u kojima smo uočili krosingover između lokusa HLA-A i -B kod najvećeg broja

obitelji riječ je bila o haplotipu koji je nosio antigen/gen HLA-B27. Istovremeno je

unutar skupine od 20 obitelji s krosingoverom između lokusa HLA-B i -DRB1

najčešće bio slučaj rekombinacije na haplotipovima pozitivnim za antigen/gen HLA-

DR13. Istraživanje Thomsena i sur. (1994) navodi da rekombinantni haplotipovi

između lokusa HLA-B i -DR često nose HLA-DR3 i -DR11, a HLA-DR2 (specifičnosti

HLA-DR15 i -DR16) i -DR7 su puno rjeđe prisutni kod rekombinantnih haplotipova

HLA (Thomsen i sur., 1994). Naši podaci su djelomično u skladu s navedenim radom

jer je kod nas bio prisutan krosingover na haplotipovima pozitivnim za antigen/gen

HLA-DR15 dok niti jedan haplotip pozitivan za HLA-DR16 nije bio rekombinantan.

Važno je istaknuti da je antigen/gen HLA-DR16 jedan od najčešćih u našoj populaciji

(10.4%) što ukazuje da su takvi haplotipovi HLA manje podložni rekombinaciji

(Grubic i sur., 2014). Na temelju svojih rezultata Thomsen i sur. (1994) pretpostavlja

da bi razlike u učestalosti rekombinacije ovisno o određenim alelima ili haplotipovima

HLA mogle donekle objasniti konzerviranost nekih haplotipova u europskim

populacijama (Thomsen i sur., 1994). Ostali primjeri iz literature donose informacije

da unatoč sugestijama o tome da bi učestalost krosingovera mogla varirati ovisno o

42

određenim haplotipovima kod ljudi, takav zaključak se ne može donijeti zbog velikog

broja haplotipova i zbog prirode križanja u ljudskoj vrsti koja se nikako ne može

kontrolirati (Carrington, 1999). Prema jednom istraživanju u kojem se 266 haplotipova

povezivalo s 133 krosingovera između lokusa HLA-A i HLA-B zaključeno je da

učestalost krosingovera nije ovisna o određenom haplotipu (Bender, 1982).

Kako bismo naše istraživanje mogli usporediti s ostalim istraživanjima

učestalosti krosingovera u sustavu HLA morali smo izračunati učestalost

rekombinacije između lokusa HLA-A i HLA-B, te učestalost rekombinacije između

lokusa HLA-B i HLA-DRB1 tako da podijelimo broj rekombinantnih potomaka s

ukupnim brojem potomaka. Rezultat koji smo dobili u ovom istraživanju za učestalost

krosingovera između lokusa HLA-A i HLA-B iznosi 0,61% a za učestalost

krosingovera između lokusa HLA-B i HLA-DRB1 iznosi 0,77% što se uklapa u

standard od 1% na 1x106 parova baza DNA po mejozi (Pierce, 2003). Prema

podacima iz literature (Milner i sur., 2000) frekvencija rekombinacije između lokusa

HLA-A i HLA-B je ipak nešto niža od očekivane za odsječak DNA od 1,4x106 parova

baza DNA i iznosi 0,31%. Prema istom autoru učestalost rekombinacije između

lokusa HLA-B i HLA-DRB1 iznosi 0,94%. Veća učestalost krosingovera između

lokusa HLA-A i HLA-B u našem istraživanju od one navedene u literaturi vjerojatno je

i posljedica toga što određivanje antigena/gena HLA razreda I ima dužu povijest od

određivanja antigena/gena HLA razreda II. Predmetom rasprave mogla bi biti i

priroda samog uzorka koji nije nasumično odabran iz opće populacije, već se radi o

registru obitelji mogućih primatelja krvotvornih matičnih stanica.

I na kraju možemo reći da je za donošenje konačnog zaključka ovakva

istraživanja nužno nastaviti, kako u našoj populaciji, tako i u drugim populacijama u

svijetu, te uključiti i druge lokuse HLA (HLA-C, -DQA1, -DQB1 i -DPB1).

43

6. ZAKLJUČAK

1. U svim ispitivanim obiteljima (N=2049) s dvoje ili više djece mogli smo odrediti

haplotipove HLA-A-B-DRB1.

2. Prisustvo krosingovera utvrđeno je u 74 (3,61%) obitelji, od toga je kod 71

(3,47%) obitelji utvrđen krosingover kod jednog djeteta, a kod 3 (0,15%)

obitelji je krosingover otkriven kod dvoje djece.

3. Učestalost rekombinacije između lokusa HLA-A i -B iznosila je 0,6%, a između

lokusa HLA-B i -DRB1 iznosila je 0,8% što je u skladu s očekivanom.

4. Krosingover na majčinim haplotipovima HLA uočen je u 57,14% slučajeva, na

očevim haplotipovima HLA u 32,47% slučajeva, dok za 10,39% krosingovera

nismo mogli utvrditi porijeklo.

5. Učestalost krosingovera bila je 1,8 puta češća tijekom oogeneze nego tijekom

spermatogeneze.

6. Povezanost haplotipova HLA s učestalošću i točnim mjestom nastanka

krosingovera pokazala je najveću učestalost krosingovera između lokusa

HLA-A i -B na HLA-B27 pozitivnim haplotipovima.

7. Haplotipovi s krosingoverom između lokusa HLA-B i -DRB1 najčešće su bili

HLA-DR13 pozitivni.

8. Rezultati ovog istraživanja su u skladu s rezultatima sličnih istraživanja

provedenih u drugim populacijama u svijetu.

44

7. LITERATURA

Abbas A. K., Lichtman A.H. (2004): Basic immunology. Funcions and disorders of the

immune system. W.B. Saunders, Philadelphia

Abbas A. K., Lichtman A.H. (2003): Cellular and molecular immunology. W.B.

Saunders, Philadelphia

Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2002): Molecular

Biology of the Cell. Garland Science, New York

Ambriović Ristov A. (2007): Metode u molekularnoj biologiji. Institut Ruđer Bošković,

Zagreb

Andreis I., Batinić D., Čulo F., Grčević D., Marušić M., Taradi M., Višnjić D. (2004):

Imunologija. Medicinska naklada, Zagreb

Barshes N. R., Goodpastor S. E., Goss J. A. (2004): Pharmacologic

immunosuppression. Front Biosci 9: 411-420

Bender K. (1982): The HLA-A: HLA-B crossovers and their contribution in analyzing

possible haplotype-specific recombination rates. Hum Genet, 61: 127-134

Brown J. H. Jardetzky T. S., Gorga J. C., Stern L. J., Urban R. G., Strominger J. L.,

Wiley D. C. (1993): Three-dimensional structure of the human class II

histocompatibility antigen HLA-DR1. Nature, 364: 33-39

Carrington M. (1999): Recombination within the human MHC. Immunological

Reviews, 167: 245-256

Germain R. N. (1994): MHC-dependent antigen processing and peptide presentation:

providing ligands for T lymphocyte activation. Cell, 76: 287-299

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jardetzky%20TS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8316295

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gorga%20JC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8316295

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Stern%20LJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8316295

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Urban%20RG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8316295

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Strominger%20JL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8316295

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wiley%20DC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8316295

45

Griffiths A. J. F. (2002): Modern genetic analysis: integrating genes and genomes, W.

H. Freeman and Company, New York

Grubic Z., Burek Kamenaric M., Mikulic M. i sur. (2014): HLA-A, HLA-B and HLA-

DRB1 allele and haplotype diversity among volunteer bone marrow donors from

Croatia. International Journal of Immunogenetics, 41 (3): 211-221

Goldsby R. A., Kindt T. J., Osborne B. A., Kuby J. (2003): Immunology. Freeman,

New York

Hartwell L., Hood L., Goldberg M. L., Reynolds A. E., Silver L. M., Veres R. C.

(2000): Genetics: from genes to genomes. Mc Graw-Hill, New York

Horton R., Wilming L., Rand V., Lovering R. C., Bruford E. A., Khodiyar V. K., Lush

M. J., Povey S., Talbot C. C. Jr., Wright M. W. et al. (2004): Gene map of the

extended human MHC. Nat Rev Genet, 5, 889–899

Ikeda N., Kojima H., Nishikawa M., Hayashi K., Futagami T., Tsujino T., Kusunoki

Y., Fujii N., Suegami S., Miyazaki Y., Middleton D., Tanaka H., Saji H. (2015):

Determination of HLA-A, -C, -B, -DRB1 allele and haplotype frequency in Japanese

population based on family study. Tissue Antigens, 85: 252-259

Janeway Ch. A. Jr., Travers P., Walport M., Shlomchik M. J. (2005): Immunobiology.

Garland Science Publishing, New York

Kaštelan A. (1983): Imunogenetika. U: Zergollern-Čupak, LJ. (ur.) Humana Genetika.

Zagreb, Jugoslavenska medicinska naklada, str. 173-224

Klein J. (1986): Natural History of the Major Histocompatibility Complex. U:

Srivastava R., Ram B. P., Tyle P. (ur.) Immunogenetics of the major

histocompatibility complex. John Wiley, New York

Kumnovics A., Takada T., Lindahl K. F. (2003): Genomic organization of the

mammalian MHC. Annu. Rev. Immunol., 21: 629-657

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ikeda%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25789826

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kojima%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25789826

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nishikawa%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25789826

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hayashi%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25789826

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Futagami%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25789826

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tsujino%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25789826

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kusunoki%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25789826

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kusunoki%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25789826

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fujii%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25789826

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Suegami%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25789826

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Miyazaki%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25789826

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Middleton%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25789826

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tanaka%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25789826

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Saji%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25789826

46

Lefranc M. P. (2003): IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic

Acids Res., 31: 307-310

Madden D. R. (1995): The three-dimensional structure of peptide-MHC complexes.

Annu. Rev. Immunol., 13: 587-622

Mahdi B. M. (2013): A glow of HLA typing in organ transplantation. Clinical and

Translational Medicine, 2: 1-6

Marsh S. G. E., Albert E. D., Bodmer W. F., Bontrop R. E., Dupont B., Erlich H. A.,

Fernández-Vina M., Geraghty D. E., Holdsworth R., Hurley C. K., Lau M., Lee K. W.,

Mach B., Mayr W. R., Maiers M., Müller C. R., Parham P., Petersdorf E. W., Sasazuki

T., Strominger J. L., Svejgaard A., Terasaki P. I., Tiercy J. M., Trowsdale J. (2010):

Nomenclature for factors of the HLA system. Tissue Antigens, 75: 291-455

McDevitt H. O. (1985): The HLA system and its relation to disease. Hospital Practice,

20: 57-72

Middleton D. (2005): HLA typing from serology to sequencing era. Iranian Journal of

Allergy, Asthma and Immunology, 4: 53-66

Milner C. M., Campbell R. D., Trowsdale J. (2000): Molecular Genetics of the Human

MHC. U: Warrens A., Lechler R. (ur.) HLA in Health and Disease. Academic Press,

London

Natarajan K., Li H., Mariuzza R. A., Margulies D. H. (1999): MHC class I molecules,

structure and function. Rev. Immunogenet, 1: 32-46

Nowak J. (2008): Role of HLA in hematopoietic SCT. Bone Marrow Transplantation,

42: S71-S76

Parham P. (1988): Function and polymorphism of human leukocyte antigen-A,B,C

molecules. Am J Med, 85: 2-5

47

Pierce B. A. (2003): Genetics – a conceptual approach. W. H. Freeman and

Company, New York

Potts W. K., Slev P. R. (1995): Pathogen-based models favouring MHC genetic

diversity. Immunol Rev, 143: 181-197

Powis S. H., Trowsdale J. (1994): Human major histocompatibility complex genes.

Behring Inst Mitt 94: 17-25

Robinson J., Mistry K., McWilliam H., Lopez R., Parham P., Marsh S. G. E. (2011):

The IMGT/HLA database. Nucleic Acids Research, 39 Suppl 1: D1171-D1176

Robinson J., Halliwell J. A., Hayhurst J. H., Flicek P., Parham P., Marsh S. G. E.

(2015): The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases. Nucleic Acid

Research, 43: D423-431

Roitt I., Brostoff J., Male D. (2001): Immunology. Mosby, London

Shankarkumar U. (2004): The Human Leukocyte Antigen (HLA) System. Int J Hum

Genet, 4: 91-103

Strachan T., Read A. P. (1996): Human Molecular Genetics. Wiley-Liss, New York

Tamarin R. H. (2002): Principles of genetics. McGraw Hill, New York

Thomsen M., Abbal M., Neugebauer M., Cambon-Thomsen A. (1989):

Recombinations in the HLA system. Tissue Antigens, 33: 38-40

Thomsen M., Neugebauer M., Arnaud J., Borot N., Sevin A. (1994): Recombination

fractions in the HLA system based on the data set „Provinces Francaises“:

indications of haplotype-specific recombination rates. Eur J Immunogenet, 21: 33-43

Thorsby E. (2009): A short history of HLA. Tissue Antigens, 74: 101-116

48

Trowsdale J. (2001): Genetic and Functional Relationships between MHC and NK

Receptor Genes. Immunity, 15: 363-374

Yung Y. C., Yang Z., Blanchong C. A., Miller W. (2000): The human and mouse class

III region: a parade of 21 genes at the centromeric segment. Immunol Today, 21:

320-328

ELEKTRONSKI IZVORI PODATAKA:

http://hla.alleles.org/nomenclature/naming.html (23.10.2015.)

http://hla.alleles.org/inc/images/graph_hires.png (04.11.2015.)

http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html (04.11.2015.)

http://year12biologyatsmc.wikispaces.com/Crossing+Over (12.09.2015.)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Yang%20Z%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10871871

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Blanchong%20CA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10871871

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Miller%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10871871

http://hla.alleles.org/nomenclature/naming.html

http://hla.alleles.org/inc/images/graph_hires.png

http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html

http://year12biologyatsmc.wikispaces.com/Crossing+Over

49

8. ŽIVOTOPIS

Osnovni osobni podaci

Datum i mjesto rođenja: 6. ožujka 1975., Sisak, Republika Hrvatska

Obrazovanje

Završila sam Osnovnu školu 22. lipnja u Sisku 1989. godine.

Od 1989. do 1993. godine pohađala sam Gimnaziju Sisak, smjer jezična gimnazija.

Upisala sam studij biologije na Prirodoslovno-matematičkom fakultetu, smjer

molekularna biologija 1993. godine. Diplomirala sam 14. prosinca 2015. obranivši

diplomski rad: „Učestalost rekombinacija između gena glavnog sustava tkivne

podudarnosti u čovjeka“, pod mentorstvom prof. dr. sc. Zorane Grubić.

Zaposlenja

Kao apsolvent bila sam zaposlena 2005. godine u Osnovnoj školi Dragutina

Tadijanovića u Petrinji kao nastavnik biologije i kemije.

Od 2006. do 2015. godine bila sam zaposlena na poslovima Programa mjerenja

koncentracije peludi alergogenih biljaka u Zavodu za javno zdravstvo Sisačko-

moslavačke županije u Sisku.

Ostala znanja i vještine

Dobro poznajem češki, engleski i njemački jezik.

Posjedujem uvjerenje o usavršavanju za poslove ECDL specijaliste za uredsku

primjenu računala.

Komunikativna sam, kreativna, odgovorna.

Interesi

Aktivno sudjelujem u radu pjevačke, folklorne i kazališne skupine manjinske udruge u

kulturi Češke besede Sisak. Zastupam prava češke nacionalne manjine kao

Predstavnica češke nacionalne manjine grada Siska u drugom mandatu.

sveuČiliŠte u zagrebu - digre.pmf.unizg.hrdigre.pmf.unizg.hr/4604/1/marija mulanovic...

Documents