sveučilite u zagrebu prirodoslovno-matematički fakultet ... · sveučilite u zagrebu...
TRANSCRIPT
Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek
Amel Zulji
Auksin-hidrolaze: analiza i regeneracija mutanata uročnjaka (Arabidopsis thaliana L.)
Diplomski rad
Zagreb 2017
Zahvaljujem se
... svojoj obitelji, koja mi je tijekom svih godina studiranja predstavljala neizmjernu podršku i
motivaciju.
... svojim prijateljima i kolegama, s kojima sam sam se uvjerio da ne postoji problem kojeg
studentska mudrost ne može riješiti.
... Ani koja je stvaranjem posebne atmosfere u labosu učinila svaki radni dan posebnim
iskustvom.
... i iznad svega, posebno se zahvaljujem svojoj mentorici Nataši Bauer na iznimnom teorijskom
i praktičnom znanju kojeg mi je pružila, na strpljenju i neizmjernoj podršci, i na savjetima koji
su mi pomogli učvrstiti kritičko znanstveno razmišljanje.
Ovaj rad je izrađen u Laboratoriju za biljnu razvojnu biologiju Zavoda za molekularnu biologiju
Prirodoslovno-matematičkog fakulteta u Zagrebu, pod vodstvom izv. prof. dr. sc. Nataše Bauer u
akademskoj godini 2015./2016. Rad je izrađen u okviru projekta “Fitohormoni u abiotskom stresu
kupusnjača: mehanizam tolerancije i primjena” (PhytoBraCro), Hrvatske zaklade za znanost (broj: IP-
2014-09-4359). Rad je predan na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta
Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja zvanja magistar molekularne biologije.
TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA
Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek Diplomski rad
Auksin-hidrolaze: analiza i regeneracija mutanata uročnjaka (Arabidopsis
thaliana L.)
Amel Zulji
Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Hrvatska
U ovom radu su opisani mehanizmi biosinteze, transporta i konjugacije indol-3-octene kiseline (IAA),
kao dominantnog oblika auksina, i njen učinak na razvojne i fiziološke procese, s posebnim osvrtom na
spoznaje o detaljima tih procesa kod eksperimentalne biljke Arabidopsis thaliana. Tehnologijom in-
fusion sintetiziran je binarni vektor pHOV:AtILL2-GFP, te su metodom floral dip regenerirane
transgenične biljke A. thaliana ekotip WS i Col-0 s pojačanom ekspresijom gena AtILL2 i
rekombinantnog gena AtILL2-GFP. Lokalizacija fuzijskog proteina AtILL2-GFP, praćena
fluorescencijskom mikroskopijom, sugerira endoplazmatski retikulum kao mjesto djelovanja hidrolaze
ILL2, što je u skladu s dosadašnjim rezultatima istraživanja. Analizirane su mutante s utišanom
ekspresijom gena AtILR1, AtILL2 i AtIAR3, te je metodama PCR-a i elektroforeze izdvojena jednostruka
nul mutanta ill2-1 u kojoj je identificirana insercijska mutacija u genu AtILL2 koja uzrokuje pomak u
okviru čitanja i sintezu krnjeg, nefunkcionalnog proteina. Metodama PCR-a i sekvenciranja izdvojene
su jednostruke mutante ilr1-1 i iar3-2 u kojima je identificirana mutacija Gly224Glu u genu AtIAR3
(mutanta iar3-2) i mutacija Gly139Asp u genu AtILR1 (mutanta ilr1-1) koje uzrokuju potpuni ili
djelomični gubitak funkcije hidrolaza ILR1 i IAR3. Kombinacijom PCR-a, elektroforeze i sekvenciranja
izdvojena je dvostruka mutanta ill2-1/iar3-2 koja ima mutaciju Gly224Glu u genu AtIAR3 i insercijsku
mutaciju u genu AtILL2, i trostruka mutanta ilr1-1/ill2-1/iar3-2 koja ima mutaciju Gly139Asp u genu
AtILR1, insercijsku mutaciju u genu AtILL2 i mutaciju Gly224Glu u genu AtIAR3. Mutante dobivene i
analizirane u ovom radu dalje će se koristiti za istraživanja metabolizam IAA naročito tijekom
izloženosti biljaka abiotskom stresu.
(54 stranice, 21 slika, 10 tablica, 54 literaturna navoda, jezik izvornika: hrvatski)
Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici
Ključne riječi: indol-3-octena kiselina, konjugati indol-3-octene kiseline, pojačana ekspresija,
floral dip
Voditelj: izv. prof. dr. sc. Nataša Bauer
Ocjenjitelji: izv. prof. dr. sc. Nataša Bauer
doc. dr. sc. Marin Ježić
doc. dr. sc. Ivana Šola
Rad prihvaćen: 16. veljače 2017.
BASIC DOCUMENTATION CARD
University of Zagreb
Faculty of Science
Department of Biology Graduation thesis
Auxin hydrolases: analysis and regeneration of Arabidopsis thaliana mutants
Amel Zulji
Rooseveltov trg 6, 10 000 Zagreb, Croatia
Indole acetic acid (IAA) is the most dominant form of the naturally occurring auxin in Arabidopsis
thaliana. Here, the mechanisms of biosynthesis, transport and conjugation of IAA in A. thaliana are
reviewed, and mutants involved in IAA-aminoacid hydrolyze analyzed and regenerated. Binary vector
pHOV:AtILL2-GFP was synthesized by using in-fusion technology, and transgenic A. thaliana plants,
ecotypes WS and Col-0, with overexpression of AtILL2 and AtILL2-GFP transgenes were regenerated
after floral dip transformation. Localization of protein AtILL2-GFP, tracked by fluorescence
microscopy, suggest endoplasmic reticulum as the site of action of hydrolase ILL2. Mutants with
reduced expression of AtILR1, AtILL2 and AtIAR3 genes were analyzed. Using PCR and electrophoresis
mutant ill2-1 with insertional mutation in gene AtILL2, which causes synthesis of truncated
nonfunctional protein, was confirmed. Mutants ilr1-1 and iar3-2 were analysed using PCR and
sequencing. The mutations Gly224Glu, and Gly139Asp were confirmed in AtIAR3 (iar3-2 mutant) and
AtILR1 gene (ilr1-1 mutant), respectively. The double mutant ill2-1/iar3-2 contained mutation
Gly224Glu in gene AtIAR3 and insertional mutation in gene AtILL2, and the triple mutant ilr1-1/ill2-
1/iar3-2 contained mutation Gly139Asp in gene AtILR1, insertional mutation in gene AtILL2 and
mutation Gly224Glu in gene AtIAR3. All mutants will be used further to investigate IAA metabolism,
especially during abiotic stress.
(54 pages, 21 figures, 10 tables, 54 references, original in: Croatian)
Thesis deposited in the Central Biological Library.
Key words: indole-3-acetic acid, indole-3-acetic acid conjugates, overexpression, floral dip
Supervisor: Dr. sc. Nataša Bauer, Assoc. Prof.
Reviewers: Dr. sc. Nataša Bauer, Assoc. Prof.
Dr. sc. Marin Ježić, Asst. Prof.
Dr. sc. Ivana Šola, Asst. Prof
Thesis accepted: 16. February 2017.
Sadržaj
1 UVOD ............................................................................................................................................ 1
1.1 Biosinteza auksina ................................................................................................................... 2
1.1.1 Triptofan-ovisni mehanizam sinteze IAA ....................................................................... 2
1.1.1.1 Put indol-3-piruvatne kiseline (IPA) ....................................................................... 2
1.1.1.2 Put indol-3-acetonitrila (IAOx) ............................................................................... 3
1.1.1.3 Put indol-3-acetamida (IAM) .................................................................................. 3
1.1.1.4 Put triptamina (TAM) .............................................................................................. 4
1.1.2 Triptofan-neovisni mehanizam sinteze IAA .................................................................... 4
1.2 Transport IAA ......................................................................................................................... 5
1.2.1 Polarni transport IAA ...................................................................................................... 6
1.2.2 Nepolarni transport IAA floemom .................................................................................. 7
1.3 Fiziološki učinci auksina ......................................................................................................... 9
1.3.1 Elongacija stanica i produžni rast .................................................................................... 9
1.3.2 Fototropizam ................................................................................................................... 9
1.3.3 Gravitropizam ................................................................................................................ 10
1.4 Razvojni učinci auksina ......................................................................................................... 11
1.4.1 Apikalna dominacija ...................................................................................................... 11
1.4.2 Razvitak bočnog i adventivnog korijenja ...................................................................... 11
1.5 Inaktivacija auksina ............................................................................................................... 12
1.6 Konjugacija IAA i hidroliza njezinih konjugata .................................................................... 13
2 Ciljevi rada .................................................................................................................................. 16
3 Materijali i metode ..................................................................................................................... 17
3.1 Materijali ............................................................................................................................... 17
3.1.1 Hranljivi mediji ............................................................................................................. 17
3.1.2 Oligonukleotidne početnice ........................................................................................... 18
3.1.3 Bakterije ........................................................................................................................ 20
3.1.3.1 Agrobacterium tumefaciens ................................................................................... 20
3.1.3.2 Escherichia coli ..................................................................................................... 20
3.1.4 Plazmidi ......................................................................................................................... 21
3.1.5 Biljke ............................................................................................................................. 23
3.1.6 Standard za određivanje veličine DNA ......................................................................... 25
3.2 Metode ................................................................................................................................... 25
3.2.1 Sterilizacija sjemenki Arabidopsis thaliana .................................................................. 25
3.2.2 Nasađivanje biljnog sjemena i uzgoj u uvjetima in vitro .............................................. 26
3.2.3 Uzgoj biljaka u zemlji ................................................................................................... 26
3.2.4 Uzgoj bakterija na krutom mediju ................................................................................. 27
3.2.5 Uzgoj bakterija u tekućem mediju ................................................................................. 27
3.2.6 Izolacija DNA ................................................................................................................ 27
3.2.6.1 Minipreparacija plazmidne DNA .......................................................................... 27
3.2.6.2 Izolacije biljne genomske DNA ............................................................................ 28
3.2.7 Lančana reakcija polimerazom (PCR) ........................................................................... 28
3.2.8 Restrikcijska analiza ...................................................................................................... 29
3.2.9 Agarozna gel elektroforeza ............................................................................................ 30
3.2.10 Izolacija DNA iz agaroznog gela................................................................................... 31
3.2.11 Mjerenje koncentracije DNA ........................................................................................ 32
3.2.12 Kloniranje gena tehnologijom In-fusion ........................................................................ 32
3.2.13 Transformacija bakterija ................................................................................................ 34
3.2.14 Floral dip ....................................................................................................................... 35
3.2.15 Fluorescencijska mikroskopija ...................................................................................... 36
4 Rezultati ....................................................................................................................................... 37
4.1 Stvaranje transgeničnih biljaka A.thaliana ekotip WS i Col-0 s konstitutivnom ekspresijom
gena At ILL2 i fuzijskog gene AtILL2-GFP ..................................................................................... 37
4.1.1 Konstrukcija vektora pHOV:AtILL2-GFP .................................................................... 37
4.1.2 Transformacija bakterija Agrobacterium tumefaciens................................................... 39
4.1.3 Transformacija i probiranje transgeničnih biljaka Arabidopsis thaliana ...................... 39
4.1.4 Detekcija transgena AtILL2 i AtILL2-GFP u transgeničnim biljkama A. thaliana ...... 40
4.1.5 Detekcija fuzijskog proteina AtILL2-GFP u transgeničnim biljkama A. thaliana ........ 41
4.2 Analiza mutanata A. thaliana s utišanom ekspresijom gena AtILR1, AtILL2 i AtIAR3 ......... 41
4.2.1 Mutante gena AtILR1 ..................................................................................................... 42
4.2.2 Mutante gena AtILL2 .................................................................................................... 43
4.2.3 Mutante gena AtIAR3 .................................................................................................... 44
5 Rasprava ...................................................................................................................................... 46
6 Zaključci ...................................................................................................................................... 49
7 Literatura .................................................................................................................................... 50
8 Životopis ...................................................................................................................................... 55
Popis kratica
2,4-D – 2,4-diklorfenoskioctena kiselina (engl. 2,4-dichlorophenoxyacetic acid),
2,4-DB –4-(2,4-diklorofenoksi)maslačna kiselina (engl. 4-(2,4-
dichlorophenoxy)butyric acid)
4-Cl-IAA – 4-klorindol-3-octena kiselina (engl. 4-chloroindole-3-acetic acid)
ABA – apscizinska kiselina
ABP – auksin vezujući protein (engl. auxin binding protein)
AUX1 – auksinska permeaza (engl. auxin permease)
CaMV – virus mozaika cvjetače (engl. Cauliflower mosaic virus)
Col-0 – ekotip Columbia
ER – endoplazmatski retikulum
IAA – indol-3-octena kiselina (engl. indole-3-acetic acid)
IAA-ak – IAA-aminokiselina
IAld – indol-3-acetaldehid (engl. indole-3-acetaldehyde)
IAM – indol-3-acetamid (engl. indole-3-acetamide)
IAN – indol-3-acetonitril (engl. indole-3-acetonitrile)
IAOx – indol-3-acetaldoksim (engl. indole-3-acetaldoxime)
IBA – indol-3-maslačna kiselina (engl. indole-3-butyric acid)
IPA – indol-3-piruvatna kiselina (engl. indole-3-pyruvic acid)
IPrA – indol-3-propionska kiselina (engl. indole-3-propionic acid)
LB – lijeva granična sekvenca (engl. left border),
NAA – 1-naftalenoctena kiselina (engl.1-naphthaleneacetic acid )
NIT – nitrilaza
OxIAA – oksiindol-3-acetilaspartat (engl. oxiindole-3-acetylaspartate)
PAA – fenil octena kiselina (engl. phenylacetic acid )
RB – desna granična sekvenca (engl. right border)
TAA1 – Triptofan aminotransferaza iz Arabidopsis1 (engl. Tryptophane
Aminotranferase of Arabidopsis 1)
TAM – triptamin
TDC – triptofan dekarboksilaza (engl. Tryptophan decarboxilase)
T-DNA – (engl. transfer DNA)
Trp – triptofan
WS – ekotip Wassilewskija
1
1 UVOD
Prve spoznaje o auksinu kao biljnom hormonu, koje su kasnije dovele do njegovog otkrića,
datiraju još iz doba kraja devetnaestog stoljeća, a proizašle su iz istraživanja ovisnosti rasta
biljnih organa o smjeru upada svjetlosti (fototropizam), kojeg su provodili Charles Darwin i
njegov sin Francis. Ponukani saznanjem da biljka svoj rast usmjerava prema izvoru svjetlosti,
proučavali su koleoptile kanarske trave (Phalaris canariensis), kao najosjetljivijeg organa na
svjetlo. Došli su do zaključka da se u vršku koleoptila sintetizira tvar koja ima potencijal
potaknuti elongaciju stanica u području ispod samog vrška, zvanom zona rasta (Darwin i
Darwin, 1880). Zbog činjenice da spomenuta tvar potiče produženi rast koleoptila, nazvana je
auksin od grčke riječi auxein, što znači „povećati“ ili „rasti“.
Danas je poznato da su auksini skupina biljnih hormona koji, osim u fototropizmu, sudjeluju u
gotovo svim stadijima rasta i razvoja biljaka regulirajući staničnu diobu i elongaciju,
diferencijaciju, tropizme, apikalnu dominaciju, senescenciju, opadanje lišća i cvjetanje (Enders
i Strader, 2015) . Bitno je naglasiti da auksini nisu primarno određeni kemijskom strukturom,
već predstavljaju skupinu organskih tvari koje na isti ili vrlo sličan način djeluju na biljni
organizam. Stoga se auksinom definira bilo koji spoji koji može u biljaka potaknuti elongaciju
stanica koleoptila i stabljike, staničnu diobu kalusa uz prisustvo citokina, te razvitak bočnog i
adventivnog korijena na otkinutim listovima i stabljikama (Taiz i Zeiger, 2002).
Najzastupljeniji prirodni oblik auksina koji se pojavljuje u svim biljkama je indol-3-octena
kiselina (IAA), te će se dalje u radu mehanizmi djelovanja i funkcije auksina objašnjavati na
primjeru IAA. Manje zastupljeni prirodni oblici auksina koji se pojavljuju u specifičnim
vrstama biljaka su: 4-klorindol-3-octena kiselina (4-Cl-IAA) i feniloctena kiselina (PAA) (slika
1 A). Indol-3-maslačna kiselina (IBA) i indol-3-propionska kiselina (IPrA) su skladišteni oblici
IAA i služe kao njegovi prekursori (slika 1 B). Također postoje i sintetski spojevi poput 2,4-
diklorfenoksioctene kiseline (2,4-D), 1-naftalenoctene kiseline (NAA) koji imaju auksinsku
aktivnost (slika 1 C). Premda auksini nisu određeni kemijskom strukturom, sve spojeve s
auksinskom aktivnosti, između ostalog, odlikuje aromatični prsten sa slabim pozitivnim
nabojem, bočni ogranak koji završava karboksilnom skupinom s jakim negativnim nabojem i
specifičan prostorni odnos između pozitivnog i negativnog naboja (Enders i Strader, 2015)
2
Slika 1. Struktura prirodnih i sintetskih auksina. A – prirodni auksini, indol-3-octena kiselina
(IAA), 4-klorindol-3-octena kiselina (4-Cl-IAA), feniloctena kiselina (PAA). B – prekursori IAA
koji služe za njegovo skladištenje indol-3-maslačna kiselina (IBA) i indol-3-propionska kiselina
(IPrA). C – sintetski oblici auksina 2,4-diklorfenoksioctene kiseline (2,4-D) i 1-naftalenoctena
kiselina (NAA), 4-(2,4-diklorofenoksi)maslačna kiselina (2,4-DB) sintetski spremišni oblik
auksina. Preuzeto i prilagođeno prema (Kasahara, 2015).
1.1 Biosinteza auksina
Iako se biosinteza auksina zbiva u gotovo svim tkivima, u malim koncentracijama, vršni
meristem izdanka, mladi listovi, plodovi i sjemenke u razvoju, kao tkiva koja brzo rastu i čije
stanice brzo proliferiraju, glavna su mjesta biosinteze auksina (Ljung i ostali, 2005). Postoje
dva glavna mehanizma sinteze auksina: triptofan (Trp)-ovisni mehanizam i Trp-neovisni
mehanizam (slika 2).
1.1.1 Triptofan-ovisni mehanizam sinteze IAA
Trp-ovisni mehanizam (slika 2 B) je način biosinteze u kojem je Trp glavni prekursor u
sintezi IAA. Postoje četiri različita Trp-ovisna puta sinteze IAA: put indol-3-piruvatne kiseline
(IPA), put triptamina (TAM), put indole-3-acetaldoksima (IAN) i put indol-3-acetamida (IAM)
put (Zhao, 2010).
1.1.1.1 Put indol-3-piruvatne kiseline (IPA)
Put IPA (slika 2 B) predstavlja dominantni mehanizam sinteze IAA ovisnom o Trp i
jedini je put čiji su detalji u potpunosti poznati (Zhao, 2012). Konverziju Trp do IPA, u dva
koraka, kataliziraju produkti gena TAA1 (Triptofan aminotransferaza iz Arabidopsis1) i
3
YUCCA (YUC). Geni TAA1 kodiraju triptofan aminotransferaze koji kataliziraju
reakciju deaminacije Trp do IPA. Geni YUC kodiraju monooksigenaze koje sadrže flavin i
kataliziraju reakciju konverzije IPA do IAA. Prvotno se smatralo da su geni TAA1 i YUC
uključeni u različitim putevima sinteze IAA međutim danas je poznato da zajedno sudjeluju u
putu IPA (Ljung, 2013). Kod biljke A. thaliana su identificirana 4 gena iz obitelji TAA1, TAR1-
TAR4 (Mano i Nemoto, 2012) i 11 članova obitelji gena sličnim monooksigenazama koje sadrže
flavin, YUC1-YUC11 od kojih je za YUC4 i YUC6 potvrđeno da kataliziraju reakciju pretvorbe
IPA u IAA u uvjetima in vitro (Kasahara, 2015). Indol-3-acetaldehid (IAld) se u putu IPA
spominje kao prekursor budući da neke bakterije koje koriste ovaj put sinteze IAA, koriste IAld
kao prekursor za sintezu IAA (Patten i Glick, 1996). Spomenuti geni TAA1 i YUC kod uročnjaka
imaju značajnu ulogu u embriogenezi, cvjetanju, formiranju vaskularnog tkiva, tropizmima,
klijanju i stvaranju bočnog korijenja, te se zbog toga smatra da je put IPA najznačajniji oblik
sinteze IAA kod A. thaliana (Mashiguchi i sur, 2011).
1.1.1.2 Put indol-3-acetonitrila (IAOx)
Prvi korak sinteze IAA u putu IAOx je konverzija Trp do indol-3-acetaldoksima (IAOx)
(slika 2 B) koju kataliziraju citokrom P450 monooksigenaze CYP79B2 i CYP79B3.
Pretpostavlja se da je ovaj put sinteze IAA ograničen samo na biljke iz porodice Brassicaceae,
budući da su geni CYP79B uglavnom identificirani samo kod pripadnika te porodice (Kasahara,
2015). Tu pripada i A. thaliana pa se smatra da je pored puta IPA, IAOx drugi najznačajniji
oblik sinteze kod uročnjaka (Zhao i sur., 2002). Iz IAOx nastaje IAN koji pored što sudjeluje u
stvaranju IAA sudjeluje još i u adaptaciji u uvjetima biotičkog stresa (Ljung, 2013). Detalji
reakcije konverzije IAN u IAA nisu poznati, međutim smatra se da kod A. thaliana, tu reakciju
katalizira nitrilaza (NIT) (Normanly i sur., 1997).
1.1.1.3 Put indol-3-acetamida (IAM)
Put IAM (slika 2 B) je način sinteze IAA karakterističan samo za bakterije (Mano i
Nemoto, 2012). Za proizvodnju IAA kod bakterija nužan je gen iaaM koji kodira triptofan 2-
monooksigenazu i gen iaaH koji kodira indol-3-acetamid hidrolazu. Enzim iaaM katalizira
reakciju konverzije Trp u IAM a zatim enzim iaaH katalizira pretvorbu IAM u IAA (Patten i
Glick, 1996). Sintetizirani auksin bakterije koriste za morfološke promjene organizma
domaćina u kojemu se nalaze. Postoje indicije da IAM put postoji i kod biljaka, naime kod
Arabidopsis thaliana je identificirana amidaza 1 (AMI1) koje može konvertirati IAM u IAA u
uvjetima in vitro. No, ne postoje izravni dokazi za fiziološki značaj i biološku aktivnost AMI1
4
u uvjetima in vivo, stoga se IAM put za sada navodi kao specifičan samo za bakterije (Kasahara,
2015)
1.1.1.4 Put triptamina (TAM)
Smatra se da konverziju Trp do TAM (slika 2 B 1) katalizira triptofan dekarboksilaza
TDC, međutim to nije potvrđeno u uvjetima in vivo. Dalje reakcije pretvorbe TAM do IAA su
vrlo slične kao u putu IPA. Razina TAM kod biljke A. thaliana je relativno niska u odnosu na
razinu IAA ili Trp, pa je moguće da put TAM nema značajnu ulogu u sintezi IAA kod
A.thaliana (Ljung, 2013).
1.1.2 Triptofan-neovisni mehanizam sinteze IAA
Triptofan-neovisni mehanizam je mehanizam sinteze IAA u kojem se, umjesto trp, koriste
drugi prekursori za sintezu IAA. Otkriće ovog mehanizma je usko povezano s mutantima orp,
auksotrofnim mutantama kukuruza kojima nedostaju funkcionalni enzimi za sintezu trp. Unatoč
tome imaju 50 puta veću koncentraciju IAA u odnosu na divlji tip (Scott i sur., 1990) što
sugerira postojanje alternativnog puta sinteze IAA neovisnog o trp. Uzgajanjem mutanata na
podlozi s [15N]antranilatom, te praćenjem dušikovog izotopa ustanovljeno je da se on ugrađuje
u krajnji produkt IAA ali ne i trp (Taiz i Zeiger, 2002). Izostanak ugradnje dušikovog izotopa
15N u trp, sugerira da mutante nisu iskoristile [15N]antranilat za sintezu trp koji će poslužiti kao
prekursor za sintezu IAA, već su ga izravno koristile za sintezu IAA, što potvrđuje postojanje
alternativnog mehanizma sinteze IAA neovisnog o trp. Za sada se zna da su prekursori za
sintezu IAA, mehanizmom neovisnom o trp, indol i indol-3-glicerol fosfat, međutim detalji o
čitavom mehanizmu i dalje ostaju nepoznati.
Iako postoje dokazi da se npr. kod mrkve tijekom rane embriogeneze IAA sintetizira
trp-neovisnim mehanizmom, dok se trp-ovisnim mehanizmom sintetizira IAA tek nakon
uspostave apikalno-bazalne osi, točna povezanost između ova dva mehanizma i dalje se ne zna
(Michalczuk i sur, 1992). Međutim postojanje velikog broja načina sinteze IAA je svakako
adaptacija biljke da u svakom trenu osigura dovoljnu količinu IAA, što je ujedno i pokazatelj
da je IAA jedan od najbitnijih biljnih hormona.
5
Slika 2. Shematski prikaz sinteze auksina. A – sinteza auksina neovisna o Trp. B – sinteza auksina
ovisna o Trp koja uključuje četiri različita puta, TAM, IAM, IPA i put IAOx. Put IPA jedini je
potpuno okarakterizirani put sinteze IAA. Put IAOx je specifičan za porodicu biljaka
Brassicaceae a prikazani mehanizam se odnosi na biljku A. thaliana. Punim strelicama su
označene reakcije u kojim su okarakterizirani enzimi koji ih kataliziraju. Isprekidanim
strelicama su označene reakcije za koje se ne zna kojim enzimima su katalizirane. Preuzeto i
prilagođeno prema (Kasahara, 2015).
1.2 Transport IAA
Postojanje koncentracijskog gradijenta IAA duž apikalno-bazalne osi je nužno za
odvijanje razvojnih procesa, elongaciju stanica, apikalnu dominaciju, zacjeljivanje rana,
senescenciju, itd. Stoga se IAA iz vršnih meristema izdanka, glavnog mjesta njegove sinteze,
transportira do korijena. Transport IAA, odvija se na dva načina: polarni transport i nepolarni
transport floemom.
6
1.2.1 Polarni transport IAA
Polarni transport predstavlja usmjereno, bazipetalno kretanje u kojemu se IAA duž
stanica prenosi od mjesta njegove sinteze (vršni meristem izdanka) prema bazalnim dijelovima
biljke (korijen), uspostavljajući koncentracijski gradijent. Među biljnim hormonima ovakav
oblik transporta je karakterističan samo za auksin. Za ovakvo bazipetalno kretanje IAA je
potrebna energija te je neovisno o gravitaciji.
Polarni transport se temelji na kemiosmotskom modelu, i na postojanju specifičnih
proteinskih nosača isključivo na bazalnim dijelovima stanice kojima se IAA prenosi, a bez kojih
polarni transport ne bi bio moguć. Za razumijevanje samog mehanizma bitno je naglasiti
procese koji se zbivaju tijekom ulaska i izlaska IAA iz stanice te da oni uvelike ovise o pH.
Ulazak IAA u stanicu je prvi korak polarnog transporta i prema kemiosmotskom modelu
auksin ulazi u stanicu na dva različita načina.
Prvi način prijenosa je difuzijom. S obzirom da pK za IAA iznosi 4,75 te da je pH u području
stanične stjenke 5, onda je kod tog pH otprilike polovica IAA protonirano (IAAH) te u takvom,
nenabijenom obliku može prolaziti kroz staničnu membranu, kretati se niz koncentracijski
gradijent i ulaziti u stanicu (citosol). Međutim, preostala polovica IAA je u disociranom obliku
(IAA-) te u takvom, ionskom obliku ne može prolaziti kroz nepolarni fosfolipidni membranski
dvosloj, te se u stanicu prenosi aktivnim transportom. Aktivni transport je način prijenosa
disociranog oblika auksina (IAA-) u stanicu pomoću specifičnog 2H+ -IAA- simportera, koji uz
utrošak energije unosi IAA- i to uz koncentracijski gradijent, pritom prebacujući još dva
vodikova iona unutar stanice (slika 3).
Izlazak IAA iz stanice. Nakon što IAA uđe u stanicu (citosol), u kojem je pH 7,2, gotovo sav
prisutan IAA je u disociranom obliku, te kao takav ne može prolaziti kroz membranu i dolazi
do njegove akumulacije u citosolu. Međutim, gore spomenuti proteinski nosači nalaze se na
bazalnom dijelu membrane i omogućavaju izlaz disociranog oblika IAA- iz stanice. Takvi
nosači su proteini PIN i osnova su polarnog transporta auksina (Křeček i sur., 2009). Ulazak
IAA u stanicu difuzijom ili aktivnim transportom, njihov izlazak posredovan specifičnim
nosačima, proteinima PIN, koji se nalaze isključivo na bazalnom dijelu membrane omogućava
polarno kretanje IAA, neovisno o gravitaciji (slika 3).
S obzirom da su vršni meristemi izdanka glavna mjesta sinteze IAA, te da se
koncentracijski gradijent auksina uspostavlja duž apikalno-bazalne osi, s njegovim maksimum
u vršnom meristemu i minimumom u korijenu, dugo se smatralo da je polarni transport jedini
7
Slika 3. Shematski prikaz kemiosmotskog modela kojim se objašnjava polarni transport. Sika
prikazuje glavne procese u stanici tijekom polarnog transporta auksina od apikalnog prema
bazalnom dijelu biljke Preuzeto i prilagođeno prema (Taiz i Zeiger, 2002).
način prijenosa IAA. Međutim, danas se zna da postoji alternativni način prijenosa IAA, koji
se odvija puno većom brzinom i na znatno veće udaljenosti nego polarni transport.
1.2.2 Nepolarni transport IAA floemom
Većina IAA koja se sintetizira u listovima, do ostatka biljke se prenosi nepolarnim
transportom floemom. IAA se zajedno s ostalim asimilatima floemom prenosi do udaljenih
dijelova biljke, puno većom brzinom i na znatno veće udaljenosti nego polarnim transportom.
Ovakav prijenos IAA na velike udaljenosti je iznimno važan za diobu stanica kambija,
nakupljanje i/ili uklanjanje kaloze iz sitastih cijevi floema i grananje korijena (Swarup i suri,
2001).
Sprega između polarnog i nepolarnog transporta nedvojbeno postoji, i dokazana je u
pokusima koji su rađeni na uročnjaku (Swarup i suri, 2001). Naime, utvrđeno je da su permeaze
AUX1 asimetrično lokalizirane na apikalnim (vršnim) dijelovima stanica protofloema (najraniji
stadij floema formiran iz prokambija). IAA koji se prenosi floemom, dolazi do protofloema u
razvojnom dijelu korijena. U stanicama protofloema kreće njegov polarni transport zahvaljujući
asimetričnoj lokalizaciji permeaza AUX1 (Taiz i Zeiger, 2002). Time se postiže polarni
8
transport, u ovom slučaju akropetalno (od bazalnog dijela biljke prema vršnim dijelovima
korijena). Ovo istraživanje je potvrdilo postojanje sprege između polarnog i nepolarnog oblika
transporta, u kojem nepolarni oblik transporta služi kao nespecifični dotok IAA, nakon čega
IAA biva transportirana polarnim putem, te se specifično doprema na mjesta na kojima će
potaknuti specifične fiziološke i razvojne procese.
9
1.3 Fiziološki učinci auksina
1.3.1 Elongacija stanica i produžni rast
Jedan od glavnih učinaka IAA je elongacija stanica i produžni rast. Uzgojem koleoptila
u mediju s IAA opaža se znatno veći rast u odnosu na mediji bez auksina. Također je poznato
da je nužna optimalna koncentracija IAA za odgovarajuće učinke. Npr. optimalna koncentracija
za elongaciju stanica koleoptila je 10-6-10-5 M, veća koncentracija djeluje inhibitorno i
sprječava elongaciju stanica. Nadalje, optimalna koncentracija za elongaciju stanica je tkivno
specifična, stoga specifična koncentracija koja potiče elongaciju stanica koleoptila ujedno
inhibira elongaciju stanica korijena (Taiz i Zeiger, 2002). Međutim, da bi se objasnio
mehanizam kojim IAA omogućava elongaciju stanica i produžni rast, potrebno je spomenuti
procese koji prethode elongaciji stanica. Naime, elongacija stanica se zbiva u tri koraka.
Najprije dolazi do ulaska vode u stanicu uslijed razlike u vodnom potencijalu. Posljedično se
povećava turgor, nakon čega slijedi slabljenje stanične stijenke čime se omogućava ekspanzija
stanica zbog prethodno povećanog turgora. Opće prihvaćena teorija kiselog rasta smatra da IAA
djeluje na posljednji korak tj. na slabljenje stanične stijenke. Taj učinak postiže povećanjem
aktivnosti i broja samih membranskih H+-ATP crpki, koje uz utrošak energije u obliku ATP-a,
prenose H+ iz citosola u međustanični prostor, što dovodi do zakiseljavanja i slabljenja stanične
stijenke (Taiz i Zeiger, 2002).
Aktivacija H+-ATP crpke. Aktivaciju crpke IAA postiže neizravno, preko adaptorskih
proteina. Istraživanje rađeno na proteinu ABP57 (auxin binding protein) je potvrdilo da se preko
spomenutog proteina postiže povećana aktivnost samo u prisutnosti IAA (Kim i sur., 2001).
Ukoliko IAA nije prisutana, ne dolazi do konformacijske promjene proteina ABP57 koja je
nužna za aktivaciju H+-ATP crpke. Još jedan mogući način djelovanja IAA na produžni rast je,
smatra se, povećana sinteza samih H+-ATP crpki, čime se u kombinaciji s povećanom aktivnosti
crpke postiže sinergistički učinak.
1.3.2 Fototropizam
Fototropizam predstavlja usmjereni rast potaknut jednosmjernom osvijetljenošću. Ako
je rast usmjeren prema izvoru svjetlosti što je slučaj s izdancima, radi se o pozitivnom
fototropizmu, ako je pak rast usmjeren od izvora svjetlosti, što je slučaj s korijenom, radi se o
negativnom fototropizmu. Naime, uslijed jednosmjernog osvjetljenja npr. koleoptila, dolazi do
elongacije stanica samo na neosvjetljenoj strani, te se rast usmjerava prema izvoru svjetla, kako
bi se svjetlost što bolje iskoristila u svrhu fotosinteze. Na molekularnoj razini fototropizam je
10
posljedica svijetlom potaknute sinteze IAA u vršku, i njegovog lateralnog transporta u smjeru
neosvjetljenog dijela biljke (Christie, 2007). Za takav lateralni transport su odgovorni
flavoproteini, fototropin 1 i 2. To su autofosforilirajuće kinaze ovisne o svijetlu. Na osvijetljenoj
strani dolazi do, svjetlom inducirane, autofosforilacije i aktivacije kinazne domene fototropina,
čime se stvara gradijent aktivnih fototropina na osvijetljenom dijelu biljke. Aktivirani
fototropini na tom dijelu, nizom fosforilacija utječu na relokalizaciju PIN proteina i na njihovo
dovođenje u takav položaj da se polarni transport lateralno usmjeri prema neosvijetljenom
dijelu biljke (Blakeslee i sur., 2004). Jednom kada IAA dođe na neosvijetljeni dio biljke, gdje
fototropini nisu aktivni i gdje je lokalizacija PIN proteina na bazalnom dijelu stanice, kreće
normalni bazopetalni polarni transport IAA prema dijelu zvanom zona rasta. U tom dijelu
stimulira elongaciju stanica (vidi poglavlje 1.3.1) i dolazi do produžnog rasta samo
neosvijetljenog dijela, što dovodi do „savijanja“ i usmjerenog rasta biljke prema
jednosmjernom izvoru svjetlosti.
1.3.3 Gravitropizam
Gravitropizam predstavlja usmjereni rast i kretanje
biljke ovisno o smjeru djelovanja gravitacijske sile. Kod
izdanka uočava se negativni gravitropizam, dok se kod
korijena izražava pozitivni gravitropizam. Za razliku od
fototropizma, gdje osvjetljenje samo jednog dijela biljke
dovodi do asimetrične raspodjele auksina, kod
gravitropizma gravitacijska sila je jednaka na svim
dijelovima organa bez obzira na njihovu orijentaciju. Stoga,
jedini način da se percipira smjer djelovanja gravitacijske
sile je percepcija kretanja gušćih tijela i njihove
relokalizacije do kojih dolazi uslijed djelovanja
gravitacijske sile prilikom promjene položaja određenog
organa. Amiloplasti čija je gustoća veća od gustoće
citoplazme, su organeli pomoću kojih biljka percipira smjer
djelovanja gravitacije i nazivaju se statoliti. Stanice u
kojima se statoliti nalaze se pak nazivaju statociste. Budući
da su statoliti gušći od ostatka citoplazme uslijed djelovanja
gravitacijske sile oni uvijek sedimentiraju na dno stanice.
Ukoliko se biljka postavi u horizontalni položaj, dolazi do
Slika 4. Percepcija gravitacije
statocistama. Slika prikazuje
promjene koje se dešavaju
tijekom promjene položaja
organa iz okomitog u horizonatlni.
Kad je stanica u okomitom
položaju statoliti vrše jednolični
pritiak na ER, prilokom prelaska
u horizonatlni položaj dolazi do
relokalizacije statolita i pritisak
na ER više nije jednoličan što
predstavlja informaciju za
asimetričnu raspodjelu IAA.
11
kretanja statolita, i njihovog sedimentiranja na drugi dio stanice. Upravo to kretanje i
sedimentiranje pretstavlja signal za asimetričnu raspodjelu IAA, i samim tim prodženi rast u
određenom smjeru. Postoje dvojbe oko načina na koji statoliti svojim premještanjem dovode
do asimetrične raspodjele auksina. Zasad postoje dva modela, prvi model pretpostavlja da kada
se biljka nalazi u okomitom položaju, statoliti jednakom silom djeluju na endoplazmatski
retikulum (ER), ukoliko se biljka pomakne iz okomitog položaja dolazi do relokalizacije
statolita i time sila kojom statoliti djeluju na ER više nije jednolična, i upravo je to signal koji
dovodi do asimetrične raspodjele auksina i produžnog rasta u određenom smjeru (Taiz i Zeiger,
2002) (slika 4). Drugi model pretpostavlja da samo kretanje statolita uslijed promjene položaja,
narušava postojeću citoskeletnu mrežu u stanici i to ustvari predstavlja signal za asimetričnu
raspodjelu IAA (Yoder, 2001).
1.4 Razvojni učinci auksina
Pored brojnih fizioloških učinaka i njegove povezanosti s produžnim rastom, IAA i
njeno prisustvo odnosno odsustvo, povezano je i s brojnim razvojnim procesima. Tako su
razvojni procesi kao što su: apikalna dominacija, razvitak bočnog i adventivnog korijenja,
razvoj provodnog tkiva i plodova također pod kontrolom IAA.
1.4.1 Apikalna dominacija
Apikalna dominacija, koja je prisutna kod gotovo svih viših biljaka, je pojava u kojoj
vršni pup, u većoj ili manjoj mjeri, inhibira bočne pupove i razvoj bočnih izdanaka iz njih.
Uklanjanje vršnog pupa dovodi do razvoja bočnih izdanaka. Budući da je vršni pup mjesto u
izdanku u kojem se u najvećoj mjeri sintetizira IAA, dugo se smatralo da je IAA izravno
povezan s inhibicijom rasta bočnih izdanaka. Međutim kasnija istraživanja su pokazala da se
nakon uklanjanja vršnog pupa u bočnim pupovima koncentracija IAA povećava (Gocal i sur.,
1991), čime se potvrdilo da IAA nema izravan učinak na inhibiciju bočnih pupova i razvoj
bočnih izdanaka. Potvrđivanjem da se nakon uklanjanja vršnog pupa povećava koncentracija
citokina i smanjuje koncentracija apscizinske kiseline (ABA), dokazuje se da IAA nema izravni
učinak s inhibicijom bočnih pupova, te da postoji sprega između IAA, citokina i ABA-e koja
regulira razvoj bočnih izdanaka (Taiz i Zeiger, 2002).
1.4.2 Razvitak bočnog i adventivnog korijenja
Koncentracija IAA veća od 10-8 M inhibira rast korijena, no rast bočnog i adventivnog
korijenja je potaknut visokom koncentracijom IAA. Bočno korijenje se razvija iznad područja
12
korijenovih dlačica iz skupine stanica pericikla. IAA stimulira diobu tih stanica i razvija se
bočno korijenje. Adventivni korijen se pak razvija na različitim mjestima iz skupine
diferenciranih stanica. Takve stanice moraju ponovno steći sposobnost za staničnu diobu kako
bi nizom mitoza stvorile adventivno korijenje. Za povratak sposobnosti stanične diobe upravo
je potrebana IAA (Taiz i Zeiger, 2002).
1.5 Inaktivacija auksina
Poznato je da je
optimalna koncentracija IAA
tkivno specifična, te da
koncentracija koja potiče rast
jednog organa može inhibirati
rast drugog organa (Taiz i Zeiger,
2002). Stoga za normalnu
homeostazu IAA, potrebno je
razinu IAA držati optimalnom te
se određena količina sintetizirane
IAA mora inaktivirati. Jedan od
načina inaktivacije IAA je
njegova razgradnja. Dugo se
smatralo da su peroksidaze
glavni enzimi koji su uključeni u
proces razgradnje auksina (slika
5 A), međutim istraživanja u
kojima se manipuliralo genima
za peroksidaze su pokazala da
deseterostruko povećanje ili
smanjenje koncentracije
peroksidaza nema utjecaj na
razinu IAA u eksperimentalnim
biljkama (Normanly i sur.,
1995). Danas je poznato da
postoje dva različita puta
Slika 5 Mehanizmi razgradnje auksina. A – razgradnja
auksina peroksidazama. B, 1 – razgradnja auksina do
konačnog produkta OxIAA bez prethodne dekarboksilacije.
B, 2 razgradnja auksina kojoj prethodi konjugiranje auksina
s Aspartatom nakon čega slijedi oksidacija naprije do
dioksiindol-3-acetilaspartat a zatim od konačnog produkta
OxIAA. Preuzeto i prilagođeno prema (taiz i Zeiger, 2010)
13
oksidativne razgradnje (slika 5 B), koji predstavljaju dominantne mehanizme degradacije IAA
(Novák i sur., 2012). Krajnji produkt u oba puta oksidativne degradacije je oksiindol-3-
acetilaspartat (OxIAA). U jednom putu IAA se, bez dekarboksilacije, oksidira do OxIAA (slika
5 B), dok u drugom putu dolazi do konjugacije IAA s Asp nakon čega slijedi oksidacija najprije
do međuprodukta dioksiindol-3-acetilaspartata a zatim do krajnjeg produkta oksidacije,
OxIAA.
1.6 Konjugacija IAA i hidroliza njezinih konjugata
Kod biljaka se u prosjeku 25 % IAA nalazi u slobodnom obliku (Ludwig-Müller, 2011),
dok se ostatak veže s različitim spojevima, odnosno konjugira se. Konjugati auksina se dijele
na (i) konjugate male molekulske mase koji nastaju vezivanjem sa šećerima, stvaranjem
esterske veze, (ii) konjugate male molekulske mase koji se stvaranjem amidne veze vežu s
aminokiselinama i (iii) konjugate velike molekulske mase koji nastaju također stvaranjem
amidne veze a vežu se s polipeptidima (Bajguz i Piotrowska, 2009). Uloga konjugacije IAA je
višestruka i događa se prilikom degradacije, skladištenja, transporta, kompartmentalizacije i
zaštiti auksina od oksidativne razgradnje (Kasahara, 2015)
Biljka A. thaliana koja je korištena u ovom radu, sadrži samo 1 % IAA u slobodnom
obliku, oko 10 % IAA se stvaranjem esterske veze konjugira sa šećerima, dok se oko 90 % IAA
stvaranjem amidne veze konjugira s aminokiselinama i/ili polipeptidima (Tam i sur., 2000). Što
se tiče konjugata sa šećerima kod biljke A. thaliana potvrđeno je postojanje konjugata IAA-
glukoza (Tam i sur., 2000), a stvaranje esterske veze između IAA i glukoze katalizirano je
enzimom UDP-glukoza transferazom (Ludwig-Müller, 2011). Postoje indicije da je konjugacija
IAA s glukozom reverzibilan proces (Kowalczyk i sur., 2003) te da služi za privremenu
inaktivaciju IAA i njeno skladištenje. Od konjugata koji nastaju stvaranjem peptidne veze, kod
A. thaliana, identificirani su uglavnom konjugati male molekulske mase odnosno IAA-
aminokiselina (IAA-ak) konjugati, IAA-Leu, IAA-Ala, IAA-Asp, IAA-Glu i IAA–Trp čije je
postojanje potvrđeno (Kasahara, 2015), i konjugati IAA-Val i IAA-Phe, čije je postojanje
pretpostavljeno na temelju identifikacije oksidativnih metabolita 6-OH-IAA–Val i 6-OH-IAA–
Phe (Ludwig-Müller, 2011).
Reakcije konjugacije IAA s aminokiselinama katalizirane su enzimima članovima
obitelji GH3 (Gretchen Hagen3). Obitelj gena GH3 se kod A .thaliana sastoji od 19 članova
od kojih je za najmanje sedam potvrđeno da kataliziraju reakcije konjugacije IAA s
aminokiselinama (Staswick i sur, 2005).
14
U pokušaju da se istraži potencijalna uloga IAA-ak konjugata, stvorene su mutante čiji
korijen naknadno gubi osjetljivost na pojedine IAA-ak konjugate, te su tom prilikom otkriveni
enzimi IAA-ak konjugat hidrolaze (Bartel, 1995) koji kataliziraju reakciju hidrolize amidne
veze i oslobađanje IAA. IAA-ak konjugat hidrolaze su kodirane genima obitelji M20 peptidaza
(Ludwig-Müller, 2011), a proces konjugacije IAA je reverzibilan, te slijede istraživanja koja će
dovesti do razumijevanja nastanka i degradacije IAA-ak konjugata kao i podrobnijeg
razmatranja njihove funkcije.
Činjenica da uzgojem A. thaliana u mediju s visokom koncentracijom slobodnog IAA
dolazi do nakupljanja IAA-Asp i IAA-Glu (Barratt i sur., 1999) i da IAA-Asp i IAA-Glu
egzogenom primjenom ne mogu inhibirati rast korijena (LeClere i sur., 2002), sugerira da
konjugati IAA-Asp i IAA-Glu nisu biološki aktivni i da sudjeluju u razgradnji IAA, gdje Asp i
Glu konjugacijom trajno inaktiviraju IAA usmjeravajući ju u oksidativni put razgradnje IAA
(vidi 1.5 Inaktivacija auksina). S druge strane uzgojem uročnjaka na mediju bogatom
slobodnom IAA ne dolazi do nakupljanja konjugata IAA-Ala i IAA-Leu (Ostin i sur., 1998) a
njihova egzogena primjena može inhibirati rast korijena (LeClere i sur., 2002). Stoga, može se
zaključiti da konjugati IAA-Ala i IAA-Leu posjeduju biološku aktivnost te da sudjeluju u
skladištenju IAA. Konjugacijom Ala i Leu s IAA stvara se zaliha, privremeno inaktiviranog,
IAA-ak konjugata koji se u svakom trenutku može hidrolizirati IAA-ak konjugat hidrolazama
i poslužiti kao izvor aktivnog IAA za potrebe razvojnih i fizioloških procese ili pak u uvjetima
stresa. Konjugat IAA-Trp djeluje kao inhibitor rasta induciranog auksinom (Staswick, 2009).
Kod A. thaliana identificirano je sedam gena ILR1, ILL1, ILL2, ILL3, IAR3 (ILL4), ILL5
i ILL6 koji kodiraju za IAA-ak konjugat hidrolaze (Sanchez Carranza i sur, 2016). Gen ILR1
(IAA-Leu resistant) otkriven je kod mutanata koji gube osjetljivost na konjugat IAA-Leu. Gen
IAR3 (IAA-Ala resistant) otkriven je kod mutanta koji gube osjetljivost na IAA-Ala. Geni ILL
(ILR1 like) su otkriveni tijekom analize genoma A. thaliana kao geni s DNA sekvencom vrlo
sličnom genu ILR1 (Rampey i sur., 2004). Od svih sedam, samo hidrolaze ILR1, ILL2 i IAR3
kataliziraju hidrolizu u uvjetima in vitro, pri koncentracijama konjugata koji su od fiziološkog
značaja (LeClere i sur., 2002), stoga će predmet istraživanja u ovom radu biti hidorlaze ILR1,
ILL2 i IAR3. Geni ILL3 i ILL6 kodiraju hidrolaze koje ne kataliziraju hidrolizu IAA-ak
konjugata u uvjetima in-vitro, a gen ILL5 je pseudogen koji je prisutan u A.thaliana ekotipa
Col-0 (Rampey i sur., 2004). Hidrolaze ILR1 i IAR3 su međusobno slične 46 %, dok hidrolaza
ILL2 dijeli ≈57 % sličnosti s IAR3 (LeClere i sur., 2002). Dolje opisana svojstva hidrolaza se
odnose na A. thaliana ekotip WS.
15
Hidrolaza ILR1, čiji su supstrati IAA-Leu i IAA-Phe (Sanchez Carranza i sur., 2016), se
eksprimira u centralnim dijelovima kotiledona i hipokotila, u radikuli (klicin korijen) zrelog
embrija i u klijancima starim jedan dan (Rampey i sur., 2004), što upućuje na značaj hidrolaze
ILR1 u oslobađanju IAA potrebnog za procese klijanja. Analiza jednostrukih, dvostrukih i
trostrukih mutanta uročnjaka, pokazala je da je hidrolaza ILR1 jedina potrebna za hidrolizu
IAA-Leu u hipokotilu te da, pored hidrolaze IAR3, sudjeluje u hidrolizi IAA-Leu u korijenu
pritom pokazujući veći afinitet za IAA-Leu od hidrolaze IAR3 (Rampey i sur., 2004). Što se
tiče konjugata IAA-Phe, njegova endogena prisutnost nije potvrđena, ali hidrolaza ILR1
uspješno hidrolizira egzogeno aplicirani konjugat IAA-Phe u korijenu i hipokotilu, pritom
pokazujuću najveći afinitet za IAA-Phe od svih hidrolaza. (Rampey i sur., 2004)
Hidrolaza ILL2, koja ima najveći afinitet za IAA-Ala, i znatno manji za IAA-Phe (Sanchez
Carranza i sur., 2016), se eksprimira u distalnim dijelovima kotiledona i listova klijanca a
posebice u hidatodama listova zrelih biljaka, što sugerira zajedničku aktivnost hidrolaza ILR1
i ILL2 u procesima klijanja (Rampey i sur., 2004). Jednostruka mutanta ill2-1 je jednako
osjetljiva na egzogeno primjenjene konjugate kao i divlji tip, što sugerira da hidrolaze ILR1 i
IAR3 nadomještaju nedostatak hidrolaze ILL2 (Rampey i sur., 2004).
Hidrolaza IAR3, s najvećim afinitetom prema IAA-Ala i IAA-Leu (Sanchez Carranza i sur.,
2016), se eksprimira u osam dana starim kotiledonima i korijenu kao i u razvijenim listovima,
i to se prvenstveno uočava u provodnom tkivu upućujući na njenu ulogu u hidrolizi konjugata
u tom tkivu i u oslobađanju IAA potrebne za rast i oblikovanje provodnog tkiva (Rampey i sur.,
2004). Analizom dvostruke i trostruke mutante pokazalo se da je hidrolaza IAR3 bitna za
hidrolizu IAA-Ala u korijenu te da djelomično hidrolizira IAA-Leu i IAA-Phe u odsustvu
hidrolaze ILR1 (Rampey i sur., 2004).
16
2 Ciljevi rada
Cilj ovog rada je regenerirati transgenične biljke A.thaliana ekotip WS i Col-0, s pojačanom
ekspresijom gena AtILL2 i rekombinantnog gena AtILL2-GFP.
Drugi cilj je da se iz dostupnih biljaka koje imaju mutirane gene ILR1, ILL2 i IAR3 izdvoje
homozigotne mutante koji su nosioci bialelnih mutacije spomenutih gena.
Specifični ciljevi:
1. Sintetizirati binarni vektor pHOV:AtILL2-GFP pogodan za transformaciju A.thaliana
u kojem će rekombinantni gen AtILL2-GFP biti pod kontrolom jakog konstitutivnog
promotora 35S.
2. Transformirati biljke A.thaliana ekotipa WS i Col i regenerirati transgenične biljke s
pojačanom, konstitutivnom ekspresijom gena AtILL2 te mutante s pojačanom
ekspresijom rekombinantnog gena AtILL2-GFP.
3. Analizirati mutante A.thaliana s mutiranim genima ILR1, ILL2 i IAR3 te izdvojiti
homozigotne trostruke mutantne (ill2-1/iar3-2/ilr1-1) koje imaju mutacije u sva tri
gena, dvostruke mutante s mutiranim genima AtILL2 i AtIAR3 (ill2-1/iar3-2), te
jednostruke mutante koje imaju mutiran gen AtILR1 (ilr1-1), gen AtILL2 (ill2-1) ili gen
AtIAR3 (iar3-2).
17
3 Materijali i metode
3.1 Materijali
3.1.1 Hranljivi mediji
Za uzgoj bakterija koristio sam kruti medij LB, tekući medij LB (bez agara) (Bertani,
1951) i mediji SOC. Njihov sastav je prikazan na tablici 1 i 2.
Za uzgoj klijanaca A.thaliana koristio sam krutu hranljivu podlogu MS0 (Murasnige i
Skoog, 1962) čiji je sastav prikazan na tablici 3.
Tablica 1. Sastav medija LB, za uzgoj bakterija (pH 7,0)
Sastojci medija Koncentracija (g/l)
Bakto-tripton 10,0
Ekstrakt bakto-kvasca 5,0
NaCl 10,0
Agar 15,0
Tablica 2 Sastav medija SOC za uzgoj bakterija
Sastojci medija Koncentracija (g/l)
Bakto tripton 20,0
Ekstrakt kvasca 5,0
NaCl 0,5
MgCl2 0,95
KCl 0,186
Glukoza 2,0
18
Tablica 3. Sastav krute hranljive podloge MS0 za uzgoj klijanaca
A.thaliana (pH 5,7-5,8)
Sastojci podloge MS0 Koncentracija (mg/l)
MAKROELEMENTI
KNO3 1900
NH4NO3 1650
CaCl2 x H2O 755
KH2PO4 170
MgSO4 x 7 H2O 370
MIKROELEMENTI
H3BO3 6,2
CoCl2 x 6 H2O 0,025
KI 0,83
Na2MoO4 x 2 H2O 0,25
CuSO4 x 5 H2O 0,025
MnSO4 x 4 H2O 16,9
ZnSO4 x 7 H2O 8,6
FeSO4 x 7 H2O 27,8
Na2EDTA 37,3
ORGANSKI DODACI
Saharoza 20000
m-inozitol 100
nikotinska kiselina 0,5
piridoksin-HCl 0,5
tiamin-HCl 0,1
Glicin 2
agar 8000
pH 5,7-5,8
3.1.2 Oligonukleotidne početnice
Početnice koje sam koristio za umnažanje gena GFP lančanom reakcijom polimeraze
(PCR) u svrhu njegovog kloniranja u vektor pHOV:AtILL2 tehnologijom in-fusion prikazane
su u tablici 4.
Početnice koje sam koristio da bih potvrdio uspješnost transformacije kod biljaka A.
thaliana ekotip WS i Col-0, odnosno potvrdio prisustvo gena AtILL2 i AtILL2-GFP u njima,
prikazane su u tablici 5.
Početnice koje sam koristio za umnažanje gena AtILR1, AtILL2 i AtIAR3 reakcijom
PCR radi potvrde njihove prisutnosti u jednostrukim, dvostrukim i trostrukim mutantama, kao
i veličine očekivanih umnoženih fragmenta za divlji tip i mutirani oblik gena, navedene su u
tablici 6.
19
Tablica 4. Nukleotidni slijed i naziv početnica za umnažanje gena GFP rpomoću PCR. Prvih 15
nukleotida (crvena boja) komplementarno je s vektorom pHOV:AtILL2 u koji se gen GFP treba
ugraditi. Ostatak sekvence (crna boja) komplementaran je kalupu (genu GFP) iz kojeg se
umnožava gen GFP.
Gen Početnica Nukleotidni slijed početnica Očekivana veličina fragmenta
GFP
GFP_IF_Fw_SalI
5' TCACCATCACGTCGACATGGTG
AGCAAGGGCG 3'
752 pb
GFP_IF_Rev_SalI 5' AAATTCGTCAGTCGACTTACTT
GTACAGCTCGTCCATG 3'
Tablica 5. Nukleotidni slijed i naziv početnica za umnažanje gena AtILL2 i AtILL2-GFP radi
potvrde njihove prisutnosti u transformiranim biljkama A.thaliana ekotip WS i Col-0.
Gen Početnica Nukleotidni slijed početnice Očekivana veličina
fragmenta (pb)
AtILL2
FwAtill2/355 5' AGGAAGGTGTTGAGTGGGAGC 3'
1042 AtILL2rev_SalI 5' GATCGGGGAAATTCGTCAGTCGACGTGA
TGGTGATGGTGATGACCCTGAAAATACA
AATTCTCGTGTTCTTCATGAAAGCCTGAG 3
'
AtILL2-GFP
FwAtill2/355 5' AGGAAGGTGTTGAGTGGGAGC 3'
1745
GFP_IF_Rev_SalI 5' AAATTCGTCAGTCGACTTACTT
GTACAGCTCGTCCATG 3'
Tablica 6. Nukleotidni slijed i naziv početnica za umnažanje gena AtILR1, AtILL2 i AtIAR3
reakcijom PCR radi potvrde njihove prisutnosti u mutantima. Prikazane su i očekivane veličine
fragmenta za divlji tip gena i mutirani oblik gena.
Gen Početnica Nukleotidni slijed početnica Očekivana veličina fragmenta (pb)
Mutirani gen Divlji tip
AtILR1 FwAtiar3/585 5' CCTGTGGCGAAGACTGGCG 3'
696 696 RevAtilr1/621 5' ACCACCTGATGGGATCGATGG 3'
AtILL2
FwAtill2 5' ATGGCTCTAAACAAGCTCCTCAG 3'
670 943 Revill2-1LB 5' TATATCCATGAAGCCATGGTGGCG 3'
RevAtill2/699 5' GGCAGCATGACCTCCTTTCCC 3'
AtIAR3 FwAtiar3/585 5'CACAAATCAATTGGCATTAGGTCAAG3'
513 513 RevAtiar3Davies 5' GCTCGCTTGCCTTGTGATAACCTG 3'
20
3.1.3 Bakterije
3.1.3.1 Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens (agrobakterije) su gram pozitivne bakterije koje prebivaju
u zemlji, i imaju sposobnost da normalne biljne stanice transformiraju u tumorske, insercijom
kratke sekvence DNA, T-DNA (engl. transfer DNA) u biljni genom. T-DNA koja je omeđena
desnom graničnom sekvencom RB (engl. right border) i lijevom graničnom sekvencom LB
(engl. left border) nalazi se na Ti (engl. tumor inducing) plazmidu, koji pored T-DNA sadrži i
gene vir koji su potrebni za prijenos T-DNA i inserciju u biljni genom. Zbog svog potencijala
da insertiraju određeni dio DNA sekvence u biljni genom, agrobakterije imaju široku primjenu
u genetičkom inženjerstvu te se koriste za transformaciju biljka, prethodno modificiranom T-
DNA (ovisno o cilju istraživanja). Međutim, budući da je veličina nemodificiranog Ti plazmida
≈ 200 - 800 kb (Gelvin, 2003) te da ne sadrži jedinstvena restrikcijska mjesta, što je za
manipulacije T-DNA u uvjetima in vitro prilično nepraktično, za potrebe genetičkog
inženjerstva postojeće agrobakterije su modificirane te je stvoren sustav binarnih vektora. U
takvom sustavu modificirani Ti plazmid sadrži sve svoje gene, osim sekvence T-DNA.
Sekvenca T-DNA se pak nalazi na zasebnom plazmidu, binarnom vektoru (koji je puno manji
od Ti plazmida, te je jednostavniji za manipulaciju), i njime se manipulira u bakterijama
Escherichia coli. Nakon manipulacije u E. coli, plazmid se transformacijom prebacuje u
agrobakterije metodom elektroporacije. Kad takav plazmid dospije u agrobakterije, T-DNA s
tog plazmida biva insertirana u biljni genom posredstvom proteina kodiranih genima s Ti
plazmida. Budući da je za opstanak plazmida nužna njegova replikacija, binarni vektori moraju
imati ishodišta replikacije koje prepoznaju organizmi u kojima se oni nalaze, pa stoga ovi
vektori moraju imati ishodište replikacije koje prepoznaje E.coli i ishodište replikacije koje
prepoznaju agrobakterije, te su stoga nazvani binarni vektori.
U ovom radu sam za potrebe transfomracije biljaka A.thaliana ekotip WS i Col-0
koristio soj elektrokompetentnih agrobakterija GV3101 (pMP90) (Koncz i Schell, 1986).
GV3101 označava soj agrobakterija koje na svom kromosomu nose gen za rezistenciju na
rifampicin, pMP90 označava Ti plazmid u kome je deletirana sekvenca T-DNA te sadrži gen
za rezistenciju na gentamicin, a u agrobakterijama služi kao pomoćnički plazmid i posreduje u
prenošenju i inserciji T-DNA s binarnog vektora u biljni genom.
3.1.3.2 Escherichia coli
Prilikom transformacije biljaka agrobakterijama, nužan je sustav u kome će se binarni
vektor (plazmid koji nosi T-DNA koja će se pak ugraditi u biljni genom) umnožiti. Za tu svrhu
21
bakterije E.coli su se pokazale kao najbolji organizmi koji omogućavaju prinos željenog
plazmida do izrazito visokih koncentracija što je nužno za uspješnu transformaciju. Metodom
kemijske transformacije željeni plazmid se unosi u E.coli. Inkubacijom E.coli u određenim
uvjetima i određeno vrijeme dolazi do umnažanja unesenog plazmida. Slijedi selekcija uspješno
transformiranih bakterija te izolacija plazmida iz njih. Izoliranim plazmidima će se
transformirati agrobakterije, a agrobakterijama će biti transformirane biljke.
U ovom radu sam koristio komercijalno dostupne, kemijski kompetentne bakterijske
stanice Stellar™ Competent Cells (Clontech). To je bakterijski soj E. coli HST08 genotipa: F–
, endA1, supE44, thi-1, recA1, relA1, gyrA96, phoA, Φ80d lacZΔ M15, Δ(lacZYA-argF) U169,
Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), ΔmcrA, λ– koji ima vrlo široku primjenu u genetičkom inženjerstvu te
je pogodan za kloniranje i umnažanje plazmida od interesa.
3.1.4 Plazmidi
Prilikom transformacije biljaka od presudnog je značaja izbor plazmida. Tijekom izbora
plazmida potrebno je uzeti u obzir nekoliko uvjeta koje plazmid mora zadovoljavati kako bi
transformacija bila uspješna.
i. Plazmid mora sadržavati T-DNA sekvencu omeđenu s RB i LB.
ii. Veličina plazmida bi trebala biti najviše 15-20 kb (Gelvin, 2003)
iii. Budući da se plazmidom manipulira u dva različita organizma (agrobakterije i E.coli)
plazmid mora sadržavati ishodište replikacije koje prepoznaju oba organizma.
iv. S obzirom da se plazmid u E.coli treba umnožiti do izrazito visoke koncentracije,
potrebno je da ishodište replikacije koje prepoznaje E.coli bude prilagođeno za visoku
reprodukciju plazmida (engl. high copy number plasmids).
v. Plazmid mora sadržavati gene za rezistenciju na antibiotike, radi selekcije uspješno
transformiranih bakterija.
vi. Potrebni su geni za rezistenciju na antibiotike radi selekcije uspješno transformiranih
biljaka. Taj gen se mora nalaziti unutar sekvence T-DNA (dio DNA koji se prenosi u
biljke) i to što je više moguće bliže LB sekvenci. Budući da prilikom transformacije
prijenos T-DNA kreće svojom RB sekvencom, moguća razgradnja dijela sekvence koja
je blizu RB, a također je povoljno da se gen za rezistenciju nalazi bliže LB sekvenci, iza
gena od interesa koji se nalazi bliže RB sekvenci.
vii. Postojanje jedinstvenih restrikcijskih mjesta na MCS (engl. multiple cloning site).
22
Plazmid pHOV:AtILL2 (slika 6) kojeg sam koristio kao binarni vektor u procesu
transformacije biljaka A. thaliana ekotip WS i Col-0, i kao početni materijal za stvaranje
vektora pHOV:AtILL2-GFP tehnologijom in-fusion, ispunjava sve gore navedene uvjete.
Veličina plazmida je 11626 pb. Sekvenca T-DNA omeđena graničnim sekvencama RB i LB
sadrži gen za auksin hidrolazu AtILL2 (AT5G56660), i gen za rezistenciju na antibiotik
higromicin HygR. Gen AtILL2 je u plazmid kloniran tehnologijom in-fusion i nalazi se pod
kontrolom promotora 35S koji je jaki konstitutivni promotor porijeklom iz virusa mozaika
cvjetače (CaMV). Nizvodno od gena AtILL2 nalazi se sekvenca koju prepoznaje i reže proteaza
TEV kao i heksahistidinski privjesak (His 6). TEV sekvenca i polihistidinski privjesak služe za
pročišćavanje proteina i proučavanje međuproteinskih interakcija. Gen HygR koji služi za
selekciju uspješno tranformiranih biljaka, nalazi se pod kontrolom promotora NOS (engl.
nopaline synthase) porijeklom iz agrobakterija. Terminator NOS je porijeklom također iz
agrobakterija i terminira transkripciju oba gena, AtILL2 i HygR.
Izvan T-DNA sekvence nalaze se geni koji kodiraju proteine potrebne za replikaciju (StaA i
RepA porijeklom iz plazmida pVS1 (Heeb i sur., 2000)), dva ishodište replikacije (OriV
porijeklom iz pVS1 plazmida (Heeb i sur., 2000) te Ori porijeklom iz bakterije E.coli koji služi
za visoku reprodukciju plazmida i dobivanje visoke koncentracije plazmida od interesa. Izvan
T-DNA sekvence se nalazi i gen SmR za rezistenciju na antibiotike streptomicin i spektinomicin
koji služi za selekciju uspješno transformiranih bakterija. Plazmid sadrži i veliki broj
restrikcijskih mjesta koje prepoznaju različite restrikcijske endonukleaze (na slici je prikazano
samo restrikcijsko mjesto SalI).
23
Slika 6 Prikaz binarnog vektora pHOV:AtILL2 (11626 pb) napravljena u programu Snapgene® .
T-DNA sekvenca koja sadrži gen za auksin hidrolazu AtILL2 i gen za rezistenciju na higromicin
HygR radi selekcije transformiranih biljaka, omeđena je graničnim sekvencama LB i RB. Izvan
T-DNA nalaze se dva različita ishodišta replikacije (pVS1 oriV i ori), geni koji kodiraju proteine
za kontrolu replikacije kao i gen SmR za rezistenciju na streptomicin i spektinomicin radi selekcije
transformiranih bakterija
3.1.5 Biljke
Za transformaciju biljaka u svrhu regeneracije transgeničnih biljaka s pojačanom
ekspresijom gena AtILL2 i rekombinantnog gena AtILL2-GFP koristio sam biljke divljeg tipa
A. thaliana ekotip WS i Col-0.
Za potrebe izdvajanja jednostrukih mutanata ilr1-1, ill2-1 i iar3-2, dvostruke mutante
ill2-1/iar3-2 i trostruke mutante ill2-1/iar3-2/ilr1-1, te potvrde mutacije u genima AtILR1,
AtILL2 i AtIAR3 analizirao sam biljke A. thaliana ekotip WS. Sjeme iz kojih sam uzgojio biljke
za analizu dobio sam od Bartel (1995)
24
Jednostruke mutante imaju mutacije u samo jednom genu redom AtILR1, AtILL2 ili
AtIAR3, dvostruka mutanta ima mutaciju u dva gena AtILL2 i AtIAR3 a trostruka mutanta ima
mutacije u sva tri gena AtILR1, AtILL2 i AtIAR3.
Gen AtILR1
Mutirani gen ilr1-1 ima točkastu mutaciju koja je nastala primjenom mutagena etil
metansulfonat (EMS) te uzrokuje smanjenu ili nikakvu funkcionalnost hidrolaze ILR1 kodirane
ovim genom. Iz literaturnih podataka nije potpuno jasno gdje se točno mutacija nalazi. U
jednom radu se navodi da točkasta mutacija uzrokuje zamjenu aminokiseline na poziciji 139
(Gly139Asp) (Baretl i sur., 1995), u drugom radu (Rampey i sur., 2004) se navodi da točkasta
mutacija uzrokuje promjenu aminokiseline Leu u aminokiselinu Arg, točno mjesto mutacije se
ne navodi, osim da se mutacija nalazi u drugom eksonu gena.
Gen AtILL2
Mutirani gen ill2-1 ima insercijsku mutaciju. T-DNA insercija je locirana +644 pb od
start kodona i nalazi se blizu 3' kraja drugog eksona (Rampey i sur., 2004) te uzrokuje pomak
u okviru čitanja i sintezu krnjeg, nefunkcionalnog proteina ILL2 (slika 7). Insercijska sekvenca
sadrži gen za rezistenciju na kanamicin pa je svaka mutanta koja ima mutirani oblik gena ill2
rezistentna na kanamicin.
Slika 7 A – Shematski prikaz mutiranog gena AtILL2. Deblje linije pretstavjaju eksone, tanje linije
između njih predstavljaju introne. Trokutom je označeno mjesto insercije T-DNA. Lijeva
granična sekvenca (LB) locirana je na oba, 3' i 5', kraja insercijske sekvence. B – Nukleotidni i
aminokiselinski slijed divljeg tipa gena ILL2. C – Nukleotidni i aminokiselinski slijed mutiranog
gena ill2-1. Vertikalna linija označava mjestu insercije T-DNA. Preuzeto i prilagođeno prema
(Rampey i sur., 2004)
Gen AtIAR3
Mutirani gen iar3-2 također ima točkastu mutaciju i nastao je primjenom mutagena
EMS, i uzrokuje sintezu hidrolaze IAR3 sa smanjenom ili nikakvom funkcionalnošću. Prema
(Davies i sur., 1999) točkasta mutacija uzrokuje promjenu aminokiselina na poziciji 124
(Gly124Glu). U radu (Rampey i sur., 2004) se navodi da se mutacija događa na poziciji 224
25
(Gly224Glu). Posljedično ova mutanta ima manju osjetljivost na IAA-Ala konjugate (Davies i
sur., 1999).
3.1.6 Standard za određivanje veličine DNA
Prilikom razdvajanja DNA u agaroznom gelu koristio sam ljestvičasti biljeg Gene ruler 1 kb DNA
ladder (Thermo Scientific) prikazan na Slici 8.
3.2 Metode
3.2.1 Sterilizacija sjemenki Arabidopsis thaliana
Sterilizacija sjemenki je proces kojim se uklanjaju kontaminacija u vidu različitih
mikroorganizma, a koji mogu utjecati na ishod istraživanja. Sterilizaciju sam provodio
sterilizacijskom otopinom Izosana G (Pliva) i mukazola u sterilnim uvjetima laminara.
Sjemenke biljaka divljeg tipa A. thaliana ekotip WS i Col-0 i sjemenke mutantnih
biljaka (jednostruke, dvostruke i trostruke mutante) razdvojio sam u zasebne mikroepruvete 1,5
ml. U epruvete sa sjemenkama dodao sam 1 ml 70% etanola i inkubirao 1 min. Potom sam
odstranio etanol i na sjemenke dodao 1 ml vodene otopine izosana i mukazola (1% Izosan G
(Pliva); 0,1% mukazol) i inkubirao 10 min na sobnoj temperaturi (22 ºC) uz miješanje na rotoru.
Slika 8 Ljestvičavi biljeg veličine DNA Gene
ruler 1 kb DNA ladder (Thermo Scientific).
Brojevima su označene duljine fragmenata
DNA (pb). Preuzeto i prilagođeno prema
https://www.lifetechnologies.com/hr/en/hom
e.html
26
Nakon inkubacije odstranio sam supernatant te sam sjemenke isprao pet puta s 1 ml destilirane,
sterilne vode. Sjemenke u epruvetama s ≈ 200 µl sterilne, destilirane vode sam pohranio na +4
°C, 48 sati radi vernalizacije.
3.2.2 Nasađivanje biljnog sjemena i uzgoj u uvjetima in vitro
Sterilizirano i vernalizirano sjeme nasađivao sam na krutim hranljivim podlogama MS0
(tablica 3) s različitim vrstama i koncentracijama antibiotika ovisno o vrsti prisutnih gena za
rezistenciju kod različitih linija.
Tablica 7 Prikaz vrste podloge, antibiotika i njihove koncentracije za uzgoj različitih ekotipova i
linija A. thaliana.
Linija/ekotip Hranljiva podloga Antibiotik Koncentracija antibiotika (mg/l)
Divlji tip A. thaliana
WS MS0 / /
Col-0 MS0 / / Transgenične biljke s pojačanom ekspresijom gena AtILL2 i AtILL2-GFP nakon floral dip transofrmacije
WS MS0 higromicin B 50
Col-0 MS0 higromicin B 50
Mutante s mutacijama u genima AtILR1, AtILL2 i AtIAR3
ilr1-1 MS0 / /
iar3-2 MS0 / /
ill2-1 MS0 Kanamicin 50
ill2-1/iar3-2 MS0 Kanamicin 50
ilr1-1/ill2-1/iar3-2 MS0 Kanamicin 50
Nasađivanje sam radio s pipetama s odrezanim vrškom nastavka. Nasađivao sam oko 100
sjemenki po ploči (ϕ 9 cm). Ploče sam omotao parafilmom, položio vertikalno te ih uzgajao u
ujvetima dugog dana (16 sati dan, 8 sati noć) s intenzitetom svijetla 25-45 µE m-2s-2 na
temperaturi od 22 ºC.
3.2.3 Uzgoj biljaka u zemlji
Nakon što su se na podlogama razvili klijanci s dužinom korijena 3-4 cm, prebacio sam
ih na komercijalno dostupnu zemlju (Steckmedium). Prebacivanje s krute hranljive podloge u
zemlju radio sam s pincetom pazeći da im ne polomim korijen. Biljke sam položio u zemlju
tako da se osim listova čitava biljka nalazila pod zemljom. Biljke sam uzgajao u uvjetima dugog
dana s intenzitetom osvjetljenja (25-45 µE m-2 s-2 ) na temperaturi 22 – 25 ºC. Prvih 7 dana
biljke sam poklopio prozirnim poklopcem tako da se održavala 100% vlaga.
27
3.2.4 Uzgoj bakterija na krutom mediju
Za potrebe selekcije transformiranih bakterije, bakterije sam uzgajao na pločama (ϕ 9
cm) s krutim medijem LB (tablica 1). U rashlađeni medij dodao sam filtar sterilizirane
termolabilne antibiotike. Za selekciju E.coli dodao sam antibiotik streptomicin konačne
koncentracije (50 mg/l). Za selekciju bakterija A. tumefaciens dodao sam antibiotike gentamicin
(50 mg/l), streptomicin (100 mg/l) i rifampicin (50 mg/l). Transformirane bakterije sam na
medij nasađivao u sterilnim uvjetima i sterilnim priborom. Nakon nasađivanja bakterije E.coli
su inkubirane preko noći na 37 °C, a A. thumefaciens su inkubirane 3 dana na 28 ºC. Nakon
inkubacije ploče su omotane parafilmom i čuvane na 4 ºC.
3.2.5 Uzgoj bakterija u tekućem mediju
Nakon selekcije na krutom mediju LB, kolonije bakterija su presađene u tekući medij
LB radi umnažanja konstruiranog plazmida (E.coli) ili radi pripremanja bakterija za floral dip
(agrobakterije). S krutog medija bakterijske kolonije sam sterilnim čačkalicama prebacio u
epruvete u 3 ml tekućeg medija LB u koji sam prethodno dodao odgovarajuće antibiotike. Za
uzgoj bakterija E.coli u medij sam dodao antibiotik streptomicin konačne koncentracije 50 mg/l
a za uzgoj bakterija A. tumefaciens dodao sam antibiotike rifampicin (50 mg/l), gentamicin (50
mg/l) i streptomicin (100 mg/l). Epruvete u kojima su se nalazile bakterije E.coli inkubirao sam
16 h na 37 ºC, dok sam epruvete u kojima su se nalazile bakterije A. tumefaciens inkubirao 2
dana na 28 ºC.
3.2.6 Izolacija DNA
U svrhu analize ili daljnje manipulacije gena, DNA je izolirana iz bakterija metodom
minipreparacije a biljna genomska DNA izolirana je metodom „Rapid DNA preparation“.
3.2.6.1 Minipreparacija plazmidne DNA
Minipreparacija je metoda kojom se izolirala plazmidna DNA pomoću komercijalnog
kompleta The Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega). Protokol s
detaljnim opisom čitavog procesa izolacije plazmidne DNA dostupan je na
(https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/0/wizard-plus-sv-
minipreps-dna-purification-system-protocol/ preuzeto 20.12.2016)
28
3.2.6.2 Izolacije biljne genomske DNA
Biljna genomska DNA je izolirana metodom „Rapid DNA preparation“ (Edwards i sur.,
1991). Čitav proces izolacije biljne DNA provodio sam na sobnoj temperaturi (22 ºC). Otkinuo
sam komadić lista i stavio u epruvetu od 1,5 ml. Malim tučkom usitnio sam biljno tkivo u
epruveti. Na zdrobljeno tkivo u epruveti sam dodao 400 µl ekstrakcijskog pufera (tablica 8),
smjesu sam vorteksirao 5 sec. Uslijedilo je centrifugiranje na 16000 g u trajanju od 1 min.
Prebacio sam 300 µl supernatanta u novu epruvetu od 1,5 ml. Dodao sam 300 µl izopropanola,
lagano promiješao te inkubirao na sobnoj temperaturi 2 min potom centrifugirao na 16000 g 5
min. Uklonio sam supernatant a talog posušio inkubacijom epruveta s otvorenim čepovima na
37 ºC. Na kraju sam na osušeni talog (nukleinske kiseline) dodao 100 µl pufera T10E1 (10 mM
Tris; 1 mM EDTA; pH 8). Talog je otopljen laganim miješanjem bez vorteksiranja.
Tablica 8 Sastav ekstrakcijskog pufera za izolaciju genomske DNA
Sastojci pufera Koncentracija (mol/l)
NaCl 0,250
EDTA 0,025
*SDS *0,5
* udio SDS-a izražen je u postotcima (%)
3.2.7 Lančana reakcija polimerazom (PCR)
PCR je metoda za eksponencijalno umnožavanje ciljanog fragmenta DNA u uvjetima
in vitro. Za samu reakciju potreban je pufer, magnezij, deoksitrinukleotidi (dNTP),
oligonukleotidne početnice, kalup (fragment DNA koji će se umnožavati) i termostabilna DNA
polimeraza koja ne gubi integritet i funkcionalnost na temperaturama do 98 ºC, i u tu svrhu se
najčešće koristi Taq DNA polimeraza izolirana iz bakterije Thermus aquaticus. Reakcija se
odvija u uređaju koji automatski i precizno regulira temperaturu i trajanje pojedinog koraka u
ciklusu umnažanja DNA. Prvi korak u ciklusu je denaturacija DNA na temperaturi od (95-98)
ºC, u kojem dolazi do odvajanja lanaca DNA. U drugom koraku temperatura se spušta na oko
58 ºC i dolazi do hibridizacije oligonukleotidnih početnica s komplementarnim dijelom
jednolančane molekule DNA. U trećem koraku temperatura se podiže na 72 ºC i dolazi do
sinteze komplementarnog lanca DNA katalizirane enzimom Taq DNA polimerazom, čime se
završava jedan ciklus umnožavanja DNA. Broj ciklusa ovisi o početnoj koncentraciji kalupa.
U radu su napravljene tri različite reakcije PCR korištenjem uređaja PCR 2720 Thermal
Cycler (Applied biosystem)
29
Gen GFP sam umnažao kako bih dobio dovoljnu količinu gena za potrebe tehnologije
in-fusion. Kao kalup za umnažanje koristio sam plazmid pNGKM/NAPI:GFP-GUS.
Ukupni volumen PCR reakcije je bio 50 µl, a reakciju sam priredio tako da sam pomiješao 25
µl otopine CloneAmp™ HiFi PCR Premix (Clontech) (sadrži pufer, magnezij,
deoksitrinukleotide (dNTP) i termostabilnu DNA polimerazu), po 2 µl nizvodne i uzvodne
početnice (tablica 4) koncentracije 10 mM, 0,5 µl plazmida pNGKM/NAPI:GFP-GUS (40,5
ng/µl) i 20,5 µl sterilne, destilirane vode. Početna denaturacija DNA bila je na 98 °C 1 min,
umnažanje gena GFP odvijalo se kroz 30 ciklusa prema programu: 98 °C na 10 sec, 58 °C na
10 sec i 72 °C na 5 sec. Na kraju su uzorci inkubirani na 72 °C 7 min.
Umnažanje gena AtILL2, AtILR1, AtIAR3 sam provodio radi potvrde njihove prisutnosti
u jednostrukim, dvostrukim i trostrukim mutantima. Kao kalup za umnažanje koristio sam
biljnu genomsku DNA izoliranu metodom „rapid DNA preparation“ iz jednostrukih dvostrukih
i trostrukih mutanta. Ukupni volumen reakcije je bio 25 µl (12,5 µl EmeraldAmp® GT PCR
Master Mix (Clontech) (sadrži pufer, magnezij, deoksitrinukleotide (dNTP) i termostabilnu
DNA polimerazu), po 0,5 µl nizvodne i uzvodne početnice (tablica 6) koncentracije 10 mM, 2
µl biljne genomske DNA i 9,5 µl sterilne, destilirane vode). Početna denaturacija DNA bila je
na 98 °C 3 min, umnažanje gena odvijalo se kroz 40 ciklusa prema programu: 98 °C 10 sec, 58
°C na 30 sec i 72 °C na 1 min. Na kraju su uzorci inkubirani na 72 °C 7 min.
Umnažanje gena AtILL2 i AtILL2-GFP sam provodio kako bi detektirao njihovo
prisustvo u transgeničnim biljkama transformiranim s AtILL2 i AtILL-GFP (T-DNA sekvenca)
i time potvrdio uspješnost transformacije. Ukupni volumen reakcije je bio 25 µl (12,5 µl
EmeraldAmp® GT PCR Master Mix (Clontech) (sadrži pufer, magnezij, deoksitrinukleotide
(dNTP) i termostabilnu DNA polimerazu), po 0,5 µl nizvodne i uzvode početnice (tablica 5)
koncentracije 10 mM, 2 µl biljne genomske DNA i 9,5 µl sterilne, destilirane vode). Početna
denaturacija DNA bila je na 98 °C 3 min, umnažanje gena odvijalo se kroz 40 ciklusa prema
programu: 98 °C 10 sec, 58 °C na 30 sec i 72 °C na 2 min. Na kraju su uzorci inkubirani na 72
°C 7 min.
3.2.8 Restrikcijska analiza
Restrikcijska analiza je analitička metoda koja se temelji na uporabi restrikcijskih
endonukleaza. To su enzimi koji kataliziraju reakciju cijepanja dvolančane molekule DNA na
restrikcijskim mjestima, specifičnim sljedovima DNA (palindromima) koji su jedinstveni za
svaki enzim. Ukoliko znamo sekvencu DNA te lokaciju restrikcijskih mjesta unutar sekvence,
30
može se predvidjeti duljina fragmenta DNA nakon cijepanja restrikcijskih enzima. Na taj način
se restrikcijskom analizom može potvrditi prisustvo/odsustvo određene sekvence DNA u
uzorku.
U ovom radu napravljena je preparativna, potpuna restrikcijska digestija plazmida
pHOV-AtILL2 koji sadrži samo jedno restrikcijsko mjesto koje prepoznaje restrikcijska
endonukleaza SalI. Na taj način dolazi do linearizacije plazmida što je uvjet za kloniranje gena
GFP u plazmid tehnologijom in-fusion. Volumen preparativne restrikcijske smjese bio 50 µl, a
sadržavao je 30 µl vektora pHOV:AtILL2 (62 ng/µl), 1 µl restrikcijskog enzima SalI (Roche),
5 µl pripadajućeg pufera H (Roche), 14 µl destilirane, sterilne vode. Reakcijska smjesa je
inkubirana 3 h na 37 ºC pri čemu je došlo do cijepanja svih palindroma enzima SalI. Očekivane
veličine fragmenta prikazane su u tablici 9.
Kontrolnu rekcijsku digestiju sam koristio kako bi provjerio autentičnost plazmida
pHOV:AtILL2-GFP i pHOV:AtILL2 kojima sam transformirao agrobakterije. U tom slučaju
volumen reakcijske smjese je bio 10 µl i sastojao se od 5 µl plazmida (oko 100 ng/µl), 0,1 µl
odgovarajućeg restrikcijskog enzima (Thermo Scientific), 1 µl odgovarajućeg pufera (Thermo
Scientific) i 3,9 µl destilirane vode. Reakcijska smjesa je inkubirana 15 min na 37 ºC i potom
analizirana gel elektroforezom. Veličine očekivanih fragmenta nakon restrikcijske digestije
prikazane su u tablici 9.
Tablica 9 Očekivane veličine fragmenta nakon potpune digestije plazmida pHOV:AtILL2 te
nakon kontrolne restrikcijske digestije vektora pHOV:AtILL2 i pHOV:AtILL2-GFP,
odgovarajućim restrikcijskim endonukleazama.
Plazmid Restrikcijska endonukleaza Očekivana veličina fragmenta (pb)
pHOV:AtILL2 SalI 11626
pHOV:AtILL2-GFP SalI 11626 + 752
pHOV:AtILL2 HindIII 9690 + 1936
3.2.9 Agarozna gel elektroforeza
Gel elektroforeza u agaroznom gelu je analitička i kvantitativna metoda za analizu i/ili
izolaciju DNA i RNA. Uzorci se nanose u jažicama na gelu koji se sastoji od polimeriziranih
polisaharida agaroze. Gel se uranja u kadicu za elektroforezu u kojoj se nalazi elektroforetski
pufer. Sastav pufera je takav da provodi struju i održava pH konstantnim. Spajanjem uređaja u
strujno kolo dolazi do uspostave konstantnog električnog polja i to je osnova za razdvajanje
nukleinskih kiselina koje se nalaze u gelu. Zbog prisustva negativno nabijene okosnice fosfatnih
skupina, nukleinske kiseline se pod utjecajem električnog polja počinju kretati prema pozitivno
31
nabijenoj elektrodi (anodi). Brzina kretanja nukleinskih kiselina ovisi o veličini nukleinske
kiseline i o stupnju zavijenosti molekule (kraće i superzavijene molekule nukleinskih kiselina
najbrže putuju kroz gel), koncentraciji agaroze, ionskoj jakosti pufera i jačini električnog polja.
Elektroforeza je provođena u 1%-tnom agaroznom gelu. Gel sam pripremio tako dam
sam u 100 ml pufera TAE (0,04 M Tris, 0,02 M octena kiselina, 1 mM EDTA, pH 8,0) dodao
1 g agaroze. Agaroza je otopljena zagrijavanjem do ključanja i potom izlivena i kalup. Nakon
polimerizacije gela u jažice sam nanosio uzorak. Restrikcijske smjese su prije nanošenja na gel
pomiješane s puferom 6×Loading Dye (Thermo Scientific) u omjeru 5:1. Uzorke PCR-a
nanosio sam direktno na gel jer u sebi sadrže sve potrebne komponente za provođenje
elektroforeze u agarozonom gelu. Uz uzorke na gel sam nanosio i 3 µl DNA markera Gene
ruler 1 kb DNA ladder (Thermo Scientific). Nakon nanošenja uzorka primijenjeno je električno
polje napona 25 V u trajanju od 5 min radi sabijanja uzorka, nakon toga napon je povećan na
100 V u trajanju od 30-40 min (ovisno o veličini uzorka). Nakon završetka elektroforeze gel
sam uronio u otopinu etidij bromida konačne koncentracije 10 µg/l u puferu TAE i inkubirao
15 min. Nakon inkubacije gel je fotografiran pod UV svjetlom transiluminatora. Slike su
obrađene u programu Kodak 1D.
3.2.10 Izolacija DNA iz agaroznog gela
Izolacija DNA iz gela je metoda kojom se DNA izolira iz agaroznog gela za daljnje
manipulacije, nakon što se potvrdi njena autentičnost. Izolaciju DNA iz gela radio sam s
komercijalno dostupnim kompletom Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega).
Postupak izolacije DNA iz gela je sljedeći: gel se osvijetli UV svjetlom, fragmenti DNA na
gelu postaju vidljivi i onda se izrezuju iz gela korištenjem čiste pincete i skalpela. Izrezani dio
gela se stavlja u prethodno obilježene i izvagane epruvete od 1,5 ml. Ponovnim vaganjem
epruveta odredi se masa gela te se na svakih 10 mg gela dodaje 10 µl otopine (engl. Membrane
binding solution). Epruvete se potom inkubiraju na 50-65 ºC sve dok se gel u potpunosti ne
otopi te se sadržaj epruveta prebacuje u kolone za centrifugiranje, i centrifugiraju se 1 min na
16000 g. Slijedi ispiranje s otopinom (engl. Membrane wash solution) i centrifugiranje ponovno
na 16000g 1 min. U zadnjem koraku kolone se centrifugiraju s otvorenim poklopcem kako bi
etanol prisutan u otopinu potpuno ishlapio. Na samom kraju dodaje se 50 µl vode (engl.
nuclease-free water), centrifugira se 1 min na 16000 g te se eluat (DNA) prikupi u čistu
obilježenu epruvetu od 1,5 ml i čuva se na +4 ºC. Detaljan postupak izolacije DNA iz gela, kao
i sastav svih otopina koje se u procesu koriste navedeni su u protokolu dostupnom na:
32
(https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-
and-pcr-cleanup-system-protocol/ Preuzeto 20.12.2016) .
3.2.11 Mjerenje koncentracije DNA
Za mjerenje koncentracije izolirane plazmidne ili DNA umnožene reakcijom PCR
korišten je spektrofotometar NanoVue™ Plus Spectrophotometer (GE Healthcare). Prethodno,
čistom vodom baždareni uređaj, mjeri koncentraciju DNA na temelju izmjerene apsorbancije
na valnoj duljini 260 nm. Čistoća uzorka računa se iz omjera apsorbancija 260/280 nm i za čisti
uzorak DNA iznosi 1,7-1,9.
Uređaj se prvo baždari s 2 µl vode (destilirane i sterilne), čime se postavlja referentna
vrijednost. Nakon toga dodaje se 2 µl željenog uzorka i očitava se koncentracija.
3.2.12 Kloniranje gena tehnologijom In-fusion
Tehnologija in-fusion predstavlja metodu za brzo i izravno kloniranje jednog ili više
fragmenta u željeni vektor. Tehnologija se temelji na korištenju lineariziranog vektora i
željenog fragmenta koji na 5' i 3' kraju ima 15 pb koji su komplementarni s krajevima
lineariziranog vektora u koji se fragment želi ugraditi. Fragmenti koji posjeduju 15 pb
komplementarnosti sa željenim vektorom konstruiraju se pomoću PCR-a i specifičnih
početnica. Prednost metode je ta što je za čitav proces potrebno samo 15 pb komplementarnosti,
na krajveima fragmenta i lineariziranog vektora, koje prepoznaju specifični in-fusion enzimi te
na njima rade jednolančane krajve. Zbog komplementarnosti dolazi do sparivanja
jednolančanih krajeva fragmenta i lineariziranog vektora, a zatim se nativnim bakterijskim
enzimima katalizira popravljanje lomova stvaranjem fosfodiesterske veze i dolazi do ugradnje
željenog fragmenta u linearizirani vektor. Metoda nije ograničena veličinom fragmenta i
veličinom vektora. Pojedini koraci in-fusion kloniranja su prikazani na slici 9.
33
Slika 9 Shemataski prikaz kloniranja tehnologijom In-fusion. Korak 1 – Linearizacija vektora
odgovarajućim restrikcijskim enzimima. Korak 2 – dizajn specifičnih početnica za umnažanje
gena (fragmenta) od interesa, koje na krajevima imaju 15 pb homologije s krajevima
lineariziranog vektora. Korak 3 – umnažanje fragmenta PCR-om korištenjem specifičnih
početnica (korak 2). Korak 4 – Postavljanje in-fusion reakcije koja se sastoji od 5x in-fusion HD
enzyme premix (Clontech), lineariziranog vektora i PCR-om umnoženog fragemnta. Korak 5 –
inkubacija 15 min na 50 ºC. Korak 6 – transformacija komepetentnih bakterija E.coli
reakcijskom smjesom in-fusion. Korak 7 – provjera uspješnosti reakcije in-fusion i uspjesnošti
transformacije E.coli. preuzeto i prilagođeno prema
www.clontech.com/xxclt_ibcGetAttachment.jsp?cItemId=17497
34
Tehnologiju in-fusion sam koristio kako bih gen GFP ugradio u linearizirani vektor
pHOV:AtILL2 te u konačnici dobio plazmid (binarni vektor) pHOV:AtILL2-GFP kojim ću
transformirati biljke A. thaliana ekotip WS i Col-0. Vektor pHOV:AtILL2 je lineariziran
restrikcijskim enzimom SalI. Fragment koji se ugrađuje u vektor, umnožen je reakcijom PCR.
Ukupni volumen reakcijske smjese In-fusion je bio 10 µl a sastojao se od 2 µl 5x in-fusion HD
enzyme premix (Clontech), 7 µl lineariziranog vektora pHOV:AtILL2 (10 ng/µl) i 1 µl
umnoženog i pročišćenog gena GFP ( 40,5 ng/µl). Reakcijska smjesa je inkubirana 15 min na
50 ºC. Nakon inkubacije reakcijskom smjesom transformiraju se bakterije E.coli u kojima će
djelovanjem bakterijskih enzima doći do konačnog stvaranja stabilnog plazmida
pHOV:AtILL2-GFP i njegovog umnažanja. Protokol s detaljnim opisom svih kemikalija i
čitavog procesa kloniranja dostupan je na
www.clontech.com/xxclt_ibcGetAttachment.jsp?cItemId=17497 preuzeto 20.12.2016.
3.2.13 Transformacija bakterija
Transformacija bakterija predstavlja proces unošenja egzogene, slobodne molekule
DNA u kompetentne bakterijske stanice koje se nalaze u logaritamskoj fazi rasta. Sam proces
transformacije se može postići na dva načina, elektroporacijom i kemijskom transformacijom.
Elektroporacija je transformacija stanica posredovana električnim poljem. Bakterije se izlažu
kratkom električnom pulsu visoke voltaže, čime se stvaraju pore na membrani bakterije i time
se stvara prostor za ulazak molekula DNA unutar bakterijskih stanica. S druge strane, kemijska
transformacija je proces unošenja egzogene DNA u bakterijske stanice koja je posredovana s
CaCl2 i temperaturnim šokom pri temperaturi od 42 ºC. Temperaturnim šokom se stvaraju pore
na membranama bakterijskih stanica, dok se kalcijevi ioni vežu za membranu stanica
neutralizirajući naboj na njima te smanjujući elektrostatsko odbijanje između negativno
nabijene molekule DNA i membrane bakterijske stanice čime se povećava učinkovitost
transformacije. Izbor tehnike kojom će se bakterije transformirati ovisi o tipu bakterijskih
stanica i o vrsti njihove kompetencije. U svojem radu koristio sam bakterije E.coli pogodne za
kemijsku transformaciju i bakterije A. tumefaciens pogodne za transformaciju
elektroporacijom.
Kemijski kompetentne bakterije E.coli HST08 (Stellar™ Competent Cells (Clontech)),
transformirao sam metodom kemijske transformacije. Bakterije sam transformirao smjesom In-
fusion koja je sadržavala vektor pHOV-AtILL2 i gen GFP. Kompetentne bakterije su cijelo
vrijeme držane na ledu. U epruvetu sam dodao 50 µl kompetentnih stanica i 2,5 µl smjese In-
fusion. U drugu epruvetu sam pipetirao 40 µl kompetentnih stanica i 3 µl lineariziranog vektora
35
pHOV:AtILL2 (bez gena GFP) te je ovaj uzorak služio kao negativna kontrola za provjeru
uspješnosti linearizacije vektora. Stanice sam inkubirao 30 min na ledu, a potom izložio
temperaturnom šoku na 42 °C 45 sec. Potom sam stanice inkubirao 2 min na ledu te im dodao
500 μl medija SOC (tablica 2) pregrijanog na 37 °C. Tako tretirane bakterije inkubirao sam na
tresilici 200 o/min na 37 °C u vremenu od 1 sata u svrhu regeneracije integriteta bakterijskih
membrana. Potom sam bakterije nasadio na kruti medij LB radi selekcije.
Elektrokompetentne bakterije A. tumefaciens transformirao sam metodom
elektroporacije. Transformirao sam ih vektorom pHOV:AtILL2-GFP i vektorom
pHOV:AtILL2. Alikvoti agrobakterija koje se nalaze u epruveti od 1,5 ml inkubirao sam na
ledu. Kivete za elektroporaciju u kojima se odvija transformacija sam također držao na ledu. U
epruvete s bakterijama sam dodao 1 µl vektora pHOV:AtILL2-GFP odnosno pHOV:AtILL2 i
smjesu inkubirao 10 min na ledu. Zatim sam smjesu vektora i agrobakterija prenio u kivete za
transformaciju. Kivete su postavljene na elektroporator i izložene električnom pulsu od 2200 V
u trajanju od oko 5 ms. Nakon električnog pulsa u kivetu za elektroporaciju sam dodao 500 µl
pregrijanog medija SOC (tablica 2), resuspendirao i čitavu smjesu prebacio u obilježenu
epruvete. Tako transformirane stanice sam inkubirao na tresilici 200 o/min 3 sata na 28 ºC radi
regeneracije integriteta bakterijskih membrana. Nakon inkubacije bakterije sam nasadio na
kruti medij LB kako bih izvršio selekciju uspješno transformiranih bakterija.
3.2.14 Floral dip
Floral dip je tehnika koja se koristi za transformaciju biljaka A. thaliana u
laboratorijskim uvjetima (Bent, 2006). Cvatovi biljke uranjaju se u suspenziju agrobakterija u
kojima se nalazi željeni binarni vektor s T-DNA koja sadrži sekvencu DNA s kojom se želi
transformirati biljka. Prilikom transformacije T-DNA se prenosi i nasumično ugrađuje u genom
jajne stanice ili zigote. Nakon transformacije, zigota izraste u transgenični embrio koji je
najvažniji dio sjemenke. Kad se takva sjemenka posadi iz nje će narasti transgenična biljka.
Za umnažanje bakterija A. tumefaciens u svrhu transformacije biljaka metodom floral
dip prethodno transformirane agrobakterije, vektorima pHOV:AtILL2-GFP odnosno
pHOV:AtILL2, uzgojio sam u tekućem mediju LB (tablica 1) s antibioticima rifampicin 50
mg/l, gentamicin 50 mg/l i streptomicin 100 mg/l. Nakon toga sam 500 µl uzgojenih bakterija
dodao u 200 ml tekućeg medija LB (bez antibiotika) i inkubirao 24 h na 28 ºC. Poslije
inkubacije suspenziju bakterija sam centrifugirao 20 min na 5500 g. Odlio sam supernatant
(medij) a talog sam resuspendirao u 200 ml vodene otopine saharoze i deterdženta Silwet (5%
saharoza; 0,003 % deterdženta Silwet). U takvu bakterijsku otopinu uronjene su biljke A.
36
thaliana ekotipa Col-0 i WS koje su bile u fazi cvjetanja. Nakon 2 min inkubacije cvijetića i
cvjetnih pupova u agrobakterijskoj suspenziji biljke su umotane u prozirnu najlonsku vrećicu i
inkubirane u tami 24 h kako bi se povećao učinak transformacije. Potom sam s biljaka skinuo
vrećice i dalje ih uzgajao u komori za uzgoj biljaka u uvjetima dugog dana (16 h dan / 8 h mrak).
Tehnikom floral dip svaku biljku sam transformirao dva puta (s razmakom od tjedan dana).
Nakon druge transformacije biljke sam uzgajao 3 tjedna. Zatim sam skupio sjemenke
transformanata te ih nakon sterilizacije selekcionirao na hranjivoj podlozi MS uz dodatak 50
mg/l higromicina B.
3.2.15 Fluorescencijska mikroskopija
Flurescnecijska mikroskopija je tehnika koja omogućava praćenje supstanci koje imaju
svojstvo fluorescencije, odnosno apsorbiraju svjetlost manje valne duljine a emitiraju svjetlost
veće valne duljine. Na taj se način u biološkim uzorcima može pratiti lokalizacija pojedinih
proteina koji su fuzionirani s nekom vrstom tvari koje fluoresciraju. Najčešće se u tu svrhu
koristi zeleni fluorescentni protein (engl. green fluorescent protein; GFP). Spajanjem gena GFP
s genom čija se lokalizacija želi pratiti, eksprimira se fuzijski protein te se zbog fluorescencije
GFP-a može pratiti mjesto njegove lokalizacije u stanici kao i interakcija s drugim proteinima
u stanici.
Fluorescencijskim mikroskopom promatrao sam stanice korijena transgeničnih biljaka
A. thaliana ekotipa WS koje eksprimiraju fuzijski protein AtILL2-GFP čiji se geni nalaze pod
konstitutivnim promotorom 35S. Kao negativna kontrola služile su biljke divljeg tipa WS koje
nemaju gen GFP. Sa selektivne podloge uzeo sam klijance i stavio na predmetno stakalce u
kapljicu pufera PBS-a (tablica 10) i prekrio pokrovnim stakalcem. Koristio sam fluorescencijski
mikroskop BX51 (Olympus), objektiv UplanFI 20x NA 0,25 (Olympus). Kao izvor svjetlosti
korištena je UV lampa u kombinaciji s filterom FITC (ekscitacijske valne duljine 467 – 498 nm
i emisijske valne duljine 513 – 536 nm).
Tablica 10 Sastav pufera PBS (pH 7,4)
Sastojci pufera Koncentracija (mol/l)
NaCl 0,14
KCl 0,0027
Na2HPO4 0,010
37
4 Rezultati
4.1 Stvaranje transgeničnih biljaka A.thaliana ekotip WS i Col-0 s
konstitutivnom ekspresijom gena At ILL2 i fuzijskog gene AtILL2-GFP
4.1.1 Konstrukcija vektora pHOV:AtILL2-GFP
Nakon umnažanja gena GFP produkt reakcije PCR sam detektirao elektroforezom u 1%
agaroznom gelu (slika 10, uzorak 2). Na gelu se vidi fragment DNA, veličine ≈ 750 pb što
odgovara očekivanoj veličini (752 pb) s dodacima od 15 pb na 5' i 3' krajevima. Fragment sam
pročistio iz agaroznog gela. Koncentracija pročišćenog fragmenta je bila 40,5 ng/µl i dalje je
korišten u reakciji in-fusion.
Vektor pHOV-AtILL2 lineariziran je restrikcijskim enzimom SalI. Nakon restrikcijske
digestije plazmid sam detektirao elektroforezom u 1% agaroznom gelu (slika 10, uzorak 1). Na
gelu se vidi fragment DNA, veličine ≈ 11500 pb što odgovara veličini lineariziranog vektora
pHOV-AtILL2 (11626 pb). Fragment sam pročistio iz agaroznog gela. Koncentracija
pročišćenog fragmenta je bila 11,2 ng/µl, i dalje je korišten u reakciji in-fusion.
Za kloniranje gena GFP u vektor pHOV-AtILL2 napravljena je reakcija in-fusion.
Bakterije E. coli transforamirao sam smjesom reakcije in-fusion, a kao kontrolu napravio sam
transformaciju E. coli s lineariziranim vektorom pHOV-AtILL2. Nakon transformacije, na
selekcijskoj ploči na koju sam nasadio bakterije transformirane s produktom rekacije in-fusion
naraslo je preko 100 kolonija. Na ploči na kojoj sam nasadio kontrolne bakterije bilo je 20-ak
kolonija, što potvrđuje visoku uspješnost linearizacije vektora pHOV-AtILL2 i uspješnost
reakcije in-fusion.
38
Slika 10 Detekcija gena GFP umnoženog rekacijom PCR i vektora pHOV-AtILL2 lineariziranog
restrikcijskom digestijom, na 1%agaroznom gelu. M – DNA marker (Gene ruler 1 kb DNA ladder),
1 – linearizirani vektor pHOV-AtILL2, 2 – gen GFP umnožen rekacijom PCR.
Na ploči na kojoj su narasle kolonije transformiranih bakterija, odabrao sam i obilježio
pet kolonija. Obilježene kolonije sam uzgojio u tekućem mediju LB te sam iz njih izolirao
rekombinantne plazmide metodom minipreparacije. Plazmide sam potom podvrgnuo
restrikcijskoj digestiji enzimom SalI, nakon koje je slijedila elektroforeza u 1% agaroznom gelu
(slika 11) radi potvrde autentičnosti plazmida. Detektirao sam fragmente veličine ≈750 pb i ≈
11500 pb što je u skladu s očekivanim veličinama fragmenata (tablica 9). Kao negativnu
kontrolu koristio sam pHOV-AtILL2 bez gena GFP, u tom uzorku nisam detektirao fragment
veličine ≈750 pb (slika 11 uzorak NK) što dodatno potvrđuje uspješnost ugradnje gen GFP u
vektor pHOV-AtILL2.
Slika 11 Detekcija fragmenata nakon restrijkcijske digestije vektora pHOV:AtILL2-GFP, na 1%
agaroznom gelu. M – DNA marker (Gene ruler 1 kb DNA ladder), 1-5 – replike pHOV:AtILL2-
GFP izoliranih iz pet neovisnih transformanata E. coli, i restriktiranih restrikcijskim enzimom
SalI. U uzorcima se uočavaju fragmenti veličine ≈750 pb što odgovara veličini gena GFP, i
fragmenti veličine ≈11500 pb što odgovara veličini ostatka plazmida. NK predstavlja negativnu
kontrolu odnosno vektor pHOV:AtILL2, tu se uočava samo jedan fragment veličine ≈11500 što
odgovara veličini lineariziranog vektora. Nakon restrikcijske digestije uzorci su analizirani u 1%
agaroznom gelu i obojani etidij bromidom.
39
4.1.2 Transformacija bakterija Agrobacterium tumefaciens
Agrobakterije sam transformirao vektorima pHOV:AtILL2 i pHOV:AtILL2-GFP
metodom elektroporacije. Vrijeme izloženosti električnom pulsu tijekom transformacije je bilo
5,1 ms. Nakon što su narasle bakterijske kolonije presađene su u tekući medij te sam iz
agrobakterija izolirao plazmidnu DNA metodom minipreparacije. Plazmidnu DNA sam
analizirao metodom restrikcijske analize i elektroforeze u 1% agaroznom gelu. Identifikacijom
fragmenata ≈750 pb što odgovara veličini gena GFP (752 pb), i fragment veličine ≈11500 što
odgovara veličini ostatka vektora (11626 pb) potvrdio sam autentičnost plazmida
pHOV:AtILL2-GFP. Plazmid pHOV:AtILL2 sam dodatno restriktirao enzimom HindIII te sam
nakon elektroforeze identificirao fragmente veličine ≈ 10000 pb i ≈ 2000 pb (slika 12).
Usporedbom s veličinom očekivanih fragmenta (tablica 9) potvrđena je autentičnost plazmida
pHOV:AtILL2.
Slika 12 Detekcija fragmenata vektora pHOV:AtILL2 nakon restrikcijske digestije enzimom
HindIII, u 1% agaroznom gelu. M – marker. 1 – restriktirani plazmid pHOV:AtILL2.
4.1.3 Transformacija i probiranje transgeničnih biljaka Arabidopsis thaliana
Biljke A. thaliana ekotipa Col-0 i WS transformirao sam agrobakterijama koje sadrže
binarni vektor pHOV:AtILL2 ili pHOV:AtILL2-GFP. Transformaciju sam napravio metodom
floral dip. Nakon transformacije sakupio sam sjeme T0 generacije i selektirano na selektivnim
podlogama s higromicinom B kako bi se izdvojile uspješno transformirane biljke (slika 13).
40
Slika 13 Selekcija transformanata A. thaliana na selekcijskim podlogama s higromicinom B.
Lijevo na slici su transformanti transformirani agobakterijama s vektorom pHOV:AtILL2 dok
se desno nalaze transformanti transformirani agrobakterijama s vektorom pHOV:AtILL2-GFP.
Crvenim kružnicama su označene uspješno transformirane biljke. Kod njih se uočava znatno
bujniji rast korijena i intenzivnija zelena boja. Netransformirane biljke nemaju otpornost na
higromicin B i nakon klijanja ne mogu rasti na hranjivoj podlozi s dodatkom 50 mg/l higromicina
B.
4.1.4 Detekcija transgena AtILL2 i AtILL2-GFP u transgeničnim biljkama A. thaliana
Nakon selekcije na podlogama s higromicinom B iz transformanata sam izolirao
genomsku DNA metodom Rapid DNA preparation. Izolirana genomska DNA je umnožena
reakcijom PCR s početnicama AtILL2fw, GFPrev ili AtILL2rev (tablica 5) radi provjere
njihove prisutnosti odnosno uspješnosti transformacije. PCR produkti su analizirani
elektroforezom u 1% agaroznom gelu (slika 14) te je potvrđena prisutnost transgena AtILL2 i
rekombinantnog gena AtILL2-GFP.
Slika 14 Detekcija gena AtILL2 i AtILL2-GFP umnoženih reakcijom PCR, u 1% agaroznom gelu.
M – marker, 1-4 – fragmenti umnoženi iz transformanata A.thaliana ekotip WS trasnformiranih
s AtILL2-GFP, 6-9 – fragmenti umnoženi iz transformanata A. thaliana ekotip WS
transformiranih s AtILL2, 5 i 10 – negativna kontrola , 11 – pozitivna kontrola (pHOV:AtILL2)
41
4.1.5 Detekcija fuzijskog proteina AtILL2-GFP u transgeničnim biljkama A. thaliana
Nakon što sam potvrdio prisutnost gena AtILL2 i AtILL2-GFP klijance uročnjaka sam
analizirao fluorescencijskom mikroskopijom da potvrdim ekspresiju gena. U biljčicama
transformiranim s AtILL2-GFP uočio sam fluorescenciju fuzijskog proteina AtILL2-GFP (slika
15 A) što predstavlja dokaz da biljke uspješno eksprimiraju spomenuti fuzijski protein čime
sam nedvojbeno potvrdio uspješnost transformacije biljaka A. thaliana. S druge strane na slici
15 B je preparat biljke divljeg tipa koji je služio kao kontrola. Na tom preparatu se ne uočava
fluorescencija karakteristična za GFP.
Slika 15 Stanice korijena A.thaliana ekotip WS pod fluorescencijskim mikroskopom. A – stanice
korijena transformirane vektorom s AtILL2-GFP. Uočava se fluorescencija u području oko
jezgre. B – stanice korijena divljeg tipa. Uočava se pozadinska fluorescencija a fluorescencija
karakteristična za GFP izostaje. Skala je 10 µm
4.2 Analiza mutanata A. thaliana s utišanom ekspresijom gena AtILR1,
AtILL2 i AtIAR3
Prisustvo mutiranih gena AtILR1, AtILL2 i AtIAR3 u jednostrukim mutantima (ilr1-1;
ill2-1; iar3-2); dvostrukoj mutanti (ill2-1/iar3-2); i trostrukoj mutanti (ilr1-1/ill2-1/iar3-2)
A.thaliana ekotip WS potvrdio sam provođenjem PCR-a s gen specifičnim početnicama (tablica
6) i selekcijom na podlozi s dodatkom odgovarajućeg antibiotika (tablica 7). Mutacije u genima
AtILR1 i AtIAR3 potvrdio sam sekvenciranjem.
42
4.2.1 Mutante gena AtILR1
Gen AtILR1sam umnožio reakcijom PCR a produkte sam analizirao gel elektroforezom
(slika 16). U biljkama divljeg tipa, jednostrukim, dvostrukim i trostrukim mutantama detektiran
je fragment veličine ≈ 700 pb što odgovara veličini očekivanog fragmenta 696 pb.(tablica 6)
Slika 16 Detekcija gena AtILR1 umnoženog rekcijom PCR u divljem tipu, jednostrukim,
dvostrukoj i trostrukoj mutanti, na 1% agaroznom gelu. M – marker, NK – negativna kontrola,
1-2 – divlji tip (A.thaliana ekotip WS), 3 –mutanta (ilr1-1) , 4 – iar3-2, 5 – mutanta ill2-1, 6 –
dvostruka mutanta (ill2-1/iar3-2), 7-8 – trostruke mutante (ilr1-1/ill2-2/iar3-2).
Sekvenciranjem je u jednostrukim mutantama (ilr1-1) i trostrukim mutantama (ilr1-
1/ill2-2/iar3-2) potvrđeno prisustvo točkaste mutacije GGT u GAT koja uzrokuje promjenu
aminokiselina Gly u aminokiselinu Asp na poziciji 139 (Gly139Asp) (slika 17). Mutacija nije
uočena kod biljaka divljeg tipa, mutante iar3-2 i ill2-1, dvostruke mutantne (ill2-1/iar3-2).
Pikovi kod nukleotida u kojima se pojavljuje točkasta mutacija su vrlo jasni, nema nikakvih
preklapanja te ne postoji pozadinski šum što potvrđuje da su biljke u kojima je detektirana
mutacija nosioci bialelnih mutacija za gen AtILR1, odnosno homozigoti.
43
Slika 17. Kromatogram sekvence gena AtILR1. A – Dio sekvence divljeg tipa gena AtILR1, B –
kromatogram sekvence gena AtILR1 jednostruke mutante (ilr1-1); C – kromatogram gena AtILR1
dvostruke mutante (ill2-1/iar3-2), D – kromatogram gena AtILR1 trostruke mutante (ilr1-1/ill2-
2/iar3-2).
4.2.2 Mutante gena AtILL2
Mutacija u genu AtILL2 nastala je insercijom T-DNA. Budući da se na T-DNA nalazi
gen za otpornost na kanamicin sve sjemenke s T-DNA insercijom moraju rasti na hranjivoj
podlozi s kanamicinom. Sjemenke su nakon sterilizacije nasađene na selekcijsku podlogu (slika
18) te su prema očekivanju sve biljčice divljeg tipa i jednostruke mutante iar3-2 i ilr1-1 bile
osjetljive na kanamicin dok su sve biljke jednostruke mutante ill2-1 te dvostruke iar3-2/ill2-1 i
trostruke mutante ilr1-1/ill2-1/iar3-2 bile otporne.
Gen AtILL2 je umnožen rekcijom PCR. U reakciji su korištene tri početnice (tablica 6),
a produkti reakcije su analizirali gel elektroforezom (slika 19). U svim uzorcima osim u NK
uočava se umnažanje. U divljem tipu (uzorak 1 i 2) detektira se fragment veličine ≈ 1000 pb
što odgovara veličini očekivanog fragmenta divljeg tipa gena (943 pb). Kod ostalih uzoraka (3-
7) se detektira fragment veličine ≈ 700 pb što odgovara veličini fragmenta mutiranog oblika
gena (670 pb) što potvrđuje prisustvo mutacije u genu AtILL2. Pojavljivanje samo jednog benda
u uzorcima 3 – 7 potvrđuje da se radi o homozigotnim mutantnim biljkama nosiocima bialelnih
mutacija za gen AtILL2 (u slučaju heterozigota pojavljivala bi se dva benda, jedan koji odgovara
veličini fragmenta divljeg tipa gena, a drugi koji odgovara veličini fragmenta mutiranog oblika
gena).
44
Slika 18 Selekcija biljaka na podlozi s kanamicinom. Biljke, ill2-1, iar3-2/ill2-1 i ilr1-1/ill2-1/iar3-
2 koji imaju insercijsku mutaciju u genu AtILL2, obilježenu genom za razistenciju na kanamicin,
imaju znatno bujniji rast i intenzivniju zelenu boju. Biljke koje nemaju mutirani gen ILL2
pokazuju osjetljivost na kanamicin u obliku zakržljalog rasta i gubitka pigmentacije.
Slika 19 Umnažanje gena AtILL2 i provjera prisutnosti mutacija. M – marker, NK – negativna
kontrola, 1 – divlji tip (A.thaliana ekotip WS), 2 –mutanta iar3-2, 3 – mutanta ill2-1, 4-5 –
dvostruke mutante (ill2-1/iar3-2) 6-7 – trostruke mutante (ilr1-1/ill2-2/iar3-2).
4.2.3 Mutante gena AtIAR3
Gen AtIAR3 je umnožen rekcijom PCR, a produkti reakcije su analizirali gel
elektroforezom (slika 20). U svim uzorcima osim u NK detektiran je fragment veličine ≈ 500
pb što odgovara očekivanoj veličini fragmenta (513 pb) (tablica 6). Analizirane su biljke A.
thaliana ekotipa WS, divlji tip, jednostruka (iar3-2), dvostruka (ill2-1/iar3-2) i trostruka
mutanta (ilr1-1/ill2-1/iar3-2).
45
Slika 20 umnažanje gena AtIAR3 i provjera prisutnosti mutacija M – marker, NK – negativna
kontrola, 1-3 – divlji tip (A.thaliana ekotip WS), 4 – iar3-2, 5-7 – mutanta ill2-1/iar3-2 8 –
trostruke mutante ilr1-1/ill2-2/iar3-2.
Sekvenciranjem je u dvostrukim mutantama (ill2-1/iar3-2) i trostrukim mutantama
(ilr1-1/ill2-1/iar3-2) detektirana točkasta mutacija GGG GAG što dovodi do besmislene
mutacije Gly224Glu (slika 21).
Slika 21 Kromatogram sekvence gena AtIAR3. A – Dio sekvence divljeg tipa gena AtIAR3, B –
kromatogram gena AtIAR3 dvostruke mutante (ill2-1/iar3-2), C – kromatogram gena AtIAR3
trostruke mutante (ilr1-1/ill2-2/iar3-2).
46
5 Rasprava
Iako se o IAA-ak konjugat hidrolazama zna relativno malo, dosadašnji rezultati
nedvojbeno ukazuju na značaj IAA-ak konjugat hidrolaza i njihove pravilne ekspresije u
regulaciji homeostaze auksina. Trostruka mutanta ilr1-1/ill2-1/iar3-2 u kojoj hidrolaze ILR1,
ILL2 i IAR3 imaju smanjenu ili nikakvu aktivnost pokazuje fenotip koji je karakterističan za
biljke u kojima je smanjena razina IAA (Rampey i sur., 2004). Uzgojem uročnjaka u uvjetima
suše pojačava se ekspresija gena IAR3 kao i endogena razina slobodnog IAA koja posljedično
dovodi do inhibicije rasta korijena i poticanja rasta bočnog korijena što predstavlja prilagodbu
biljke na uvjete suše (Kinoshita i sur., 2012). Mutanta iar3-5, koja ne posjeduje hidrolazu IAR3
uslijed suše i osmotskog stresa, pokazuje 40 % manje preživljenje u uvjetima osmotskog stresa
u odnosu na divlji tip, što potvrđuje značaj gena IAR3 u prilagodbi biljke na stresne uvjete
(Kinoshita i sur., 2012).
Temperatura je također faktor koji dovodi do promjena u razinama konjugata i slobodnog IAA.
Uzgojem klijanaca uročnjaka na temperaturi od 29 ºC dolazi do produženog rasta hipokotila u
odnosu na biljku uzgajanu na 20 ºC. Ovaj temperaturno-ovisni produženi rast hipokotila u
potpunosti izostaje kod mutanata s poremećenom sintezom ili transportom IAA, što ukazuje na
promijenjenu dinamiku auksina, njegovih konjugata kao i aktivnosti njegovih hidrolaza u
uvjetima povećane temperature (Gray i sur., 1998). Također, postoji niz dokaza o sudjelovanju
IAA-ak konjugat hidrolaza u uvjetima biotskog i abiotskog stresa (Tognetti i sur., 2010).
Stoga su u ovom radu, za potrebe istraživanja funkcije IAA-ak konjugat hidrolaza,
njihove vremenske i prostorne ekspresije te njihovog utjecaja u homeostazi auksina,
regenerirane transgenične biljke A. thaliana ekotipa WS i Col-0 s pojačanom ekspresijom gena
AtILL2 i rekombinantnog gena AtILL2-GFP. Također, u radu su analizirane biljke A .thaliana
ekotipa WS s utišanom ekspresijom gena AtILR1, AtILL2 i AtIAR3, identificirane su
homozigotne biljke nosioci bialelnih mutacija, te su uspješno izdvojene jednostruke mutante
ilr1-1 s mutacijom u genu AtILR1, insercijske mutante ill2-2 s mutacijom u genu AtILL2 i iar3-
2 s mutacijom u genu AtIAR3; dvostruka mutanta ill2-1/iar3-2 s mutiranim genima AtILL2 i
AtIAR3 i trostruka mutanta ilr1-ill2-1/iar3-2 koja ima mutacije u sva tri gena.
Biljke s pojačanom ekspresijom gena AtILL2 i gena AtILL2-GFP su regenerirane
kombinacijom tehnologije in-fusion, kojom je konstruiran binarni vektor pHOV:AtILL2-GFP
pogodan za transformaciju uročnjaka, i metode floral dip kojom su biljke A. thaliana
transformirane agrobakterijama s binarnim plazmidima pHOV:AtILL2 ili pHOV:AtILL2-GFP.
47
Nakon selekcije transformanata na podlozi s higromicinom B, uspješnost transformacije je
potvrđena uspješnim umnažanjem transgena PCR-om i fluorescencijskom mikroskopijom
kojom se u stanicama korijena biljaka transformiranih s AtILL2-GFP potvrdila ekspresija
fuzijskog proteina AtILL2-GFP. Fluorescencija fuzijskog proteina AtILL2-GFP je u tim
stanicama uočena u području oko jezgre što je u skladu s izvješćem (Sanchez Carranza i sur.,
2016) da hidrolaza ILL2 posjeduje aminokiselinski slijed koji ju lokalizira u ER.
Prema izvješću (Rampey i sur., 2004) jednostruka mutanta ill2-1 ne pokazuje smanjenu
osjetljivost na IAA-Ala koji je preferentni supstrat hidrolaze ILL2 (Rampey i sur., 2004) te se
smatra da hidrolaze IAR3 i ILR1 nadomještaju nedostatak hidrolaze ILL2, ukoliko bi se
korištenjem biljaka s pojačanom ekspresijom gena AtILL2, regenerirane u ovom radu, pokazalo
da pojačana ekspresija AtILL2 dovodi do povećane osjetljivosti biljke na konjugat IAA-Ala to
bi potvrdilo konstataciju o preklapajućim funkcijama hidrolaza te bi tvrdnja da ILR1 i IAR3
mogu kompenzirati nedostatak ILL2 dodatno dobila na težini. Međutim kod tog istraživanja će
se morati voditi računa o posebnim karakteristikama konjugata IAA-Ala, jer je uočeno da
trostruka mutanta ilr1-1/ill2-1/iar3-2 djelimočno zadržava osjetljivost na konjugat IAA-Ala što
sugerira postojanje alternativnog puta aktivacije konjugata IAA-Ala koji je neovisan o hidrolizi
posredovanoj hidrolazama ILR1, ILL2 i IAR3. Također, postoje izvješća koje upućuju na to da
konjugat IAA-Ala posjeduje auksinsku potentnost i u konjugiranom obliku budući da se radi o
aminokiselini s malim bočnim ogrankom (Woodward i Bartel, 2005). Stoga, morat će se voditi
briga o gore navedenim činjenicama kako bi se izbjegli lažno pozitivni rezultati.
Nadalje, prema tvrdnjama (Rampey i sur., 2004) razina ekspresije hidrolaze ILL2 je jako mala
u korijenu, što je zanimljivo budući da se konjagat IAA-Leu, supstrat hidrolaze ILL2 u uvjetima
in vitro (LeClere i sur., 2002), nalazi u visokim koncentracijama u korijenu (Korasick i sur.,
2013). Biljke s pojačanom ekspresijom ILL2 u korijenu, regenerirane u ovom radu mogu imaju
transgen eksprimiran u korijenu, za razliku od divljeg tipa biljaka kod kojih je ILL2
eksprimirana u organima koji se nalaze iznad zemlje. Stoga transgenične biljke mogu poslužiti
da se ispita je li IAA-Leu in situ supstrat hidrolaze ILL2. Ukoliko daljnja istraživanja pokažu
da je kod takvih biljaka inhibiran rast korijena te potaknuto stvaranje bočnog korijenja (uslijed
prekomjerne hidrolize IAA-Leu i posljedičnog povećanja endogene razine IAA) to bi potvrdilo
in situ interakciju između IAA-Leu i ILL2 te bi razlog za smanjenu ekspresiju ILL2 u korijenu
trebalo tražiti novim istraživanjima.
Mutante u ovom radu su izdvojene kombinacijom metoda PCR-a, elektroforeze i
sekvenciranja. PCR-om u kombinaciji s elektroforezom su identificirane homozigotne biljke te
su izdvojene nul mutante ill2-1 koje imaju insercijsku mutaciju, dok je sekvenciranje bilo
48
potrebno da se identificiraju točkaste mutacije u genima ILR1 i IAR3 i izdvoje mutante koje
imaju mutirane gene ILR1 i IAR3. Sekvenciranjem se u mutantama koje imaju mutirani gen
IAR3 identificirala točkasta mutacija koja uzrokuje promjenu aminokiseline Gly u Glu na
poziciji 224 (Gly224Glu) što je u skladu s izvješćem (Rampey i sur., 2004) međutim ne
podudara se s rezultatima (Davies i sur., 1999) koji tvrde da do navedene mutacije dolazi na
poziciji 124 (Gly124Glu). Mutirana aminokiselina se prema
(https://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=aa_sequence&id=1009105192) nalazi
katalitičkoj domeni proteina te vrlo vjerojatno utječe na aktivnost hidrolaze budući da se radi
o promjeni Gly, aminokiseline s nepolarnim bočnim ogrankom, u aminokiselinu Glu s
negativno nabijenim bočnim ogrankom.
Sekvenciranjem gena AtILR1 iz izdvojenih mutanata ustanovilo se da točkasta mutacija
u genu dovodi do promjene aminokiseline Gly u Asp na poziciji 139 (Gly139Asp) što je u
skladu s rezultatima koje navodi (Bartel, 1999) međutim rezultati se ne podudaraju s izvješćem
(Rampey i sur., 2004) koji tvrdi da mutacija rezultira u promjeni aminokiseline Leu u Arg i
pritom ne naglašava točnu poziciju promijenjene aminokiseline. Aminokiselina na poziciji 139
se nalazi u katalitičkoj domeni
(https://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=aa_sequence&id=1009120696) te vrlo
vjerojatno pridonosi jako smanjenoj aktivnosti enzima ILR1 jer se radi o promjeni
aminokiseline s nepolarnim bočnim ogrankom u aminokiselinu s negativno nabijenim bočnim
ogrankom.
Također nije isključena mogućnost da uslijed točkaste mutacije hidrolaza mijenja
preferencije za supstrat (Ludwig-Müller, 2011). Jednostruka mutanta iar3-2 pokazuje smanjenu
osijetljivost za preferentni supstrat, konjugat IAA-Ala, dok trostruka mutanta ilr1-1/ill2-1/iar3-
2 i dalje posjeduje, doduše vrlo nisku, osjteljivost na IAA-Ala, što se može tumačiti gore
spomenutim potencijalnim svojstvom IAA-Ala konjugata da posjeduje auksinsku aktivnost
neovisnu o hidrolizi ili pak da mutacija Gly224Glu u genu AtIAR3 predstavlja propusnu
mutaciju te hidrolaza IAR3 u mutantama ipak posjeduje određenu bazalnu aktivnost. Daljnja
istraživanja u kojima će se koristiti biljni materijal iz ovog rada su potrebna da razriješe tu
dilemu, kao i ulogu hidrolaze ILL2 u odgovoru biljke na abiotski stres.
49
6 Zaključci
Sintetiziran je binarni vektor pHOV:AtILL2-GFP pogodan za transformaciju biljke
A.thaliana u kojem se rekombinantni gen AtILL2-GFP nalazi pod kontrolom
konstitutivnog promotora 35S.
Regenerirane su transgenične biljke A. thaliana ekotip WS i Col-0, s pojačanom
ekspresijom gena AtILL2 i rekombinantnog gena AtILL2-GFP
Praćenjem fluorescencije rekombinantnog proteina AtILL2-GFP potvrđena je njegova
lokalizacija u području oko jezgre, što je u skladu s novim istraživanjima da hidrolaza
ILL2 lokalizira u endoplazmatskom retikulumu.
Analizirane su mutante A. thaliana ekotipa WS s poremećenom ekspresijom gena
AtILR1, AtILL2 i AtIAR3.
U mutanti ilr1-1 je identificirana mutacija Gly139Asp, te je riješena dilema uslijed
nepodudaranja literaturnih podataka o točnoj poziciji mutacije.
U mutanti iar3-2 je identificirana mutacija Gly224Glu te je riješena dilema uslijed
nepodudaranja literaturnih podataka o točnoj poziciji mutacije.
Prikupljeno je i pohranjeno sjeme T1 generacije biljaka s pojačanom ekspresijom gena
AtILL2 i AtILL2-GFP, i sjeme homozigotnih mutanata 1ll2-1, ilr1-1, iar3-2, iar3-2/ill2-
1 te iar3-2/ill2-1/ilr1-1
50
7 Literatura
Bajguz, A. i Piotrowska, A. (2009) „Conjugates of auxin and cytokinin“, Phytochemistry, 70(8),
str. 957–969. doi: 10.1016/j.phytochem.2009.05.006.
Barratt, N. M., Dong, W., Gage, D. A., Magnus, V. i Town, C. D. (1999) „Metabolism of
exogenous auxin by Arabidopsis thaliana: Identification of the conjugate N-(indol-3-ylacetyl)-
glutamine and initiation of a mutant screen“, Physiologia Plantarum, 105(2), str. 207–217. doi:
10.1034/j.1399-3054.1999.105204.x.
Bent, A. (2006) „Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.“, Methods in
Molecular Biology, 343(1), str. 87–103. doi: 10.1385/1-59745-130-4:87.
Bertani, G. (1951) „Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic
Escherichia coli.“, Journal of Bacteriology, 62(3), str. 293–300. doi: citeulike-article-
id:149214.
Blakeslee, J. J., Bandyopadhyay, A., Peer, W. A., Makam, S. N. i Murphy, A. S. (2004)
„Relocalization of the PIN1 auxin efflux facilitator plays a role in phototropic responses.“,
Plant Physiology, 134(1), str. 28–31. doi: 10.1104/pp.103.031690.
Christie, J. M. (2007) „Phototropin Blue-Light Receptors“, Annual Review of Plant Biology,
58(1), str. 21–45. doi: 10.1146/annurev.arplant.58.032806.103951.
Davies, R. T., Goetz, D. H., Lasswell, J., Anderson, M. N. i Bartel, B. (1999) „IAR3 encodes
an auxin conjugate hydrolase from Arabidopsis.“, The Plant Cell, 11(3), str. 365–376. doi:
10.1105/tpc.11.3.365.
Darwin, C. Darwin, F. (1880) „The power of movement in plants“. London: John Murray.
Edwards, K., Johnstone, C. i Thompson, C. (1991) „A simple and rapid method for the
preparation of plant genomic DNA for PCR analysis“, Nucleic Acids Research, 19(6), str. 1349.
doi: 10.1093/nar/19.6.1349.
Enders, T. A. i Strader, L. C. (2015) „Auxin activity: Past, present, and future“, American
Journal of Botany, 102(2), str. 180–196. doi: 10.3732/ajb.1400285.
Gelvin, S. B. (2003) „Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the
‚gene-jockeying‘ tool.“, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67(1), str. 16–37. doi:
10.1128/MMBR.67.1.16.
Gocal, G. F., Pharis, R. P., Yeung, E. C. i Pearce, D. (1991) „Changes after Decapitation in
Concentrations of Indole-3-Acetic Acid and Abscisic Acid in the Larger Axillary Bud of
Phaseolus vulgaris L. cv Tender Green.“, Plant Physiology, 95(2), str. 344–350. doi:
10.1104/pp.95.2.344.
Gray, W. M., Ostin, A., Sandberg, G., Romano, C. P. i Estelle, M. (1998) „High temperature
promotes auxin-mediated hypocotyl elongation in Arabidopsis.“, Proceedings of the National
51
Academy of Sciences of the United States of America, 95(12), str. 7197–7202. doi:
10.1073/pnas.95.12.7197.
Heeb, S., Itoh, Y., Nishijyo, T., Schnider, U., Keel, C., Wade, J., Walsh, U., O’Gara, F. i Haas,
D. (2000) „Small, stable shuttle vectors based on the minimal pVS1 replicon for use in gram-
negative, plant-associated bacteria.“, Molecular Plant-Microbe Interactions, 13(2), str. 232–
237. doi: 10.1094/MPMI.2000.13.2.232.
Kasahara, H. (2015) „Current aspects of auxin biosynthesis in plants.“, Bioscience,
Biotechnology, and Biochemistry, 80(1), str. 34–42. doi: 10.1080/09168451.2015.1086259.
Kim, Y. S., Min, J. K., Kim, D. i Jung, J. (2001) „A soluble auxin-binding protein, ABP57:
Purification with anti-bovine serum albumin antibody and characterization of its mechanistic
role in the auxin effect on plant plasma membrane H+-ATPase“, Journal of Biological
Chemistry, 276(14), str. 10730–10736. doi: 10.1074/jbc.M009416200.
Kinoshita, N., Wang, H., Kasahara, H., Liu, J., MacPherson, C., Machida, Y., Kamiya, Y.,
Hannah, M. A. i Chua, N.-H. (2012) „IAA-Ala Resistant3, an Evolutionarily Conserved Target
of miR167, Mediates Arabidopsis Root Architecture Changes during High Osmotic Stress“,
The Plant Cell, 24(9), str. 3590–3602. doi: 10.1105/tpc.112.097006.
Koncz, C. i Schell, J. (1986) „The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific
expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector“,
Molecular and General Genetics, 204(3), str. 383–396. doi: 10.1007/BF00331014.
Korasick, D. A., Enders, T. A. i Strader, L. C. (2013) „Auxin biosynthesis and storage forms“,
Journal of Experimental Botany, 64(9), str. 2541–2555. doi: 10.1093/jxb/ert080.
Kowalczyk, S., Jakubowska, A., Zielinska, E. i Bandurski, R. S. (2003) „Bifunctional indole-
3-acetyl transferase catalyses synthesis and hydrolysis of indole-3-acetyl-myo-inositol in
immature endosperm of Zea mays“, Physiologia Plantarum, 119(2), str. 165–174. doi:
10.1034/j.1399-3054.2003.00158.x.
Křeček, P., Skůpa, P., Libus, J., Naramoto, S., Tejos, R., Friml, J. i Zažímalová, E. (2009) „The
PIN-FORMED (PIN) protein family of auxin transporters“, Genome Biology, 10(12), str. 249.
doi: 10.1186/gb-2009-10-12-249.
LeClere, S., Tellez, R., Rampey, R. A., Matsuda, S. P. T. i Bartel, B. (2002) „Characterization
of a family of IAA-amino acid conjugate hydrolases from Arabidopsis“, Journal of Biological
Chemistry, 277(23), str. 20446–20452. doi: 10.1074/jbc.M111955200.
Ludwig-Müller, J. (2011) „Auxin conjugates: Their role for plant development and in the
evolution of land plants“, Journal of Experimental Botany, 62(6), str. 1757–1773. doi:
10.1093/jxb/erq412.
Ljung, K. (2013) „Auxin metabolism and homeostasis during plant development“,
Development, 140(5), str. 943–950. doi: 10.1242/dev.086363.
52
Ljung, K., Hull, A. K., Celenza, J., Yamada, M., Estelle, M., Normanly, J. i Sandberg, G. (2005)
„Sites and regulation of auxin biosynthesis in Arabidopsis roots.“, The Plant Cell, 17(4), str.
1090–1104. doi: 10.1105/tpc.104.029272.
Mano, Y. i Nemoto, K. (2012) „The pathway of auxin biosynthesis in plants“, Journal of
Experimental Botany, 63(8), str. 2853–2872. doi: 10.1093/jxb/ers091.
Mashiguchi, K., Tanaka, K., Sakai, T., Sugawara, S., Kawaide, H., Natsume, M., Hanada, A.,
Yaeno, T., Shirasu, K., Yao, H., McSteen, P., Zhao, Y., Hayashi, K. -i., Kamiya, Y. i Kasahara,
H. (2011) „The main auxin biosynthesis pathway in Arabidopsis“, Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 108(45), str. 18512–18517. doi:
10.1073/pnas.1108434108.
Michalczuk, L., Ribnicky, D. M., Cooke, T. J. i Cohen, J. D. (1992) „Regulation of indole-3-
acetic acid biosynthetic pathways in carrot cell cultures“, Plant Physiology, 100(3), str. 1346–
1353.
Murasnige, T. i Skoog, F. (1962) „A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Agsays with
Tohaoco Tissue Cultures“, Physiologia Plantarum, str. 473–497. doi: 10.1111/j.1399-
3054.1962.tb08052.x.
Normanly, J., Grisafi, P., Fink, G. R. i Bartel, B. (1997) „Arabidopsis mutants resistant to the
auxin effects of indole-3-acetonitrile are defective in the nitrilase encoded by the NIT1 gene.“,
The Plant Cell, 9(10), str. 1781–1790. doi: 10.1105/tpc.9.10.1781.
Normanly, J., Slovin, J. P. i Cohen, J. D. (1995) „Rethinking Auxin Biosynthesis and
Metabolism.“, Plant Physiology, 107(2), str. 323–329. doi: 10.1111/j.1399-
3054.1980.tb02643.x.
Novák, O., Hényková, E., Sairanen, I., Kowalczyk, M., Pospíšil, T. i Ljung, K. (2012) „Tissue-
specific profiling of the Arabidopsis thaliana auxin metabolome“, Plant Journal, 72(3), str.
523–536. doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.05085.x.
Ostin, A., Kowalyczk, M., Bhalerao, R. P. i Sandberg, G. (1998) „Metabolism of indole-3-
acetic acid in Arabidopsis.“, Plant Physiology, 118(1), str. 285–296. doi: 10.1104/pp.118.1.285.
Patten, C. L. i Glick, B. R. (1996) „Bacterial biosynthesis of indole-3-acetic acid“, Canadian
Journal of Microbiology, 42(3), str. 207–220. doi: 10.1139/m96-032.
Rampey, R. A., LeClere, S., Kowalczyk, M., Ljung, K., Sandberg, G. i Bartel, B. (2004) „A
family of auxin-conjugate hydrolases that contributes to free indole-3-acetic acid levels during
Arabidopsis germination.“, Plant Physiology, 135(2), str. 978–988. doi:
10.1104/pp.104.039677.
Sanchez Carranza, A. P., Singh, A., Steinberger, K., Panigrahi, K., Palme, K., Dovzhenko, A.
i Dal Bosco, C. (2016) „Hydrolases of the ILR1-like family of Arabidopsis thaliana modulate
auxin response by regulating auxin homeostasis in the endoplasmic reticulum.“, Scientific
Reports. Nature Publishing Group, 6(April), str. 24212–24223. doi: 10.1038/srep24212.
53
Scott, D. H., Greeley, R., Guest, J. E., Scott, D. H., Fisher, D. S., Solomon, S. C., Hon, R. A.
De, Wilson, L., Peale, S. J., Reynolds, R. T. i Morrison, D. (1990) „orange pericarp, a“, Plant
Physiology 254(1986), str. 998–1000.
Staswick, P. E. (2009) „The Tryptophan Conjugates of Jasmonic and Indole-3-Acetic Acids
Are Endogenous Auxin Inhibitors“, Plant Physiology, 150(3), str. 1310–1321. doi:
10.1104/pp.109.138529.
Staswick, P. E., Serban, B., Rowe, M., Tiryaki, I., Maldonado, M. T., Maldonado, M. C. i Suza,
W. (2005) „Characterization of an Arabidopsis enzyme family that conjugates amino acids to
indole-3-acetic acid.“, The Plant Cell, 17, str. 616–627. doi: 10.1105/tpc.104.026690.
Swarup, R., Marchant, A., Marchant, A., Ljung, K., Ljung, K., Sandberg, G., Sandberg, G.,
Palme, K., Palme, K., Bennett, M. i Bennett, M. (2001) „Root Apex“, Genes and Development,
15(20), str. 2648–2653. doi: 10.1101/gad.210501.2648.
Taiz i Zeiger (2002) „Plant physiology, 3rd edition“, Cell, 1, str. 782. Dostupno na:
http://www.amazon.com/dp/0878938567.
Tam, Y. Y., Epstein, E. i Normanly, J. (2000) „Characterization of auxin conjugates in
Arabidopsis. Low steady-state levels of indole-3-acetyl-aspartate, indole-3-acetyl-glutamate,
and indole-3-acetyl-glucose“, Plant Physiology, 123(2), str. 589–596. doi:
10.1104/pp.123.2.589.
Tognetti, V. B., Van Aken, O., Morreel, K., Vandenbroucke, K., van de Cotte, B., De Clercq,
I., Chiwocha, S., Fenske, R., Prinsen, E., Boerjan, W., Genty, B., Stubbs, K. a, Inzé, D. i Van
Breusegem, F. (2010) „Perturbation of indole-3-butyric acid homeostasis by the UDP-
glucosyltransferase UGT74E2 modulates Arabidopsis architecture and water stress tolerance“,
The Plant Cell, 22(8), str. 2660–2679. doi: 10.1105/tpc.109.071316.
Woodward, A. W. i Bartel, B. (2005) „Auxin: Regulation, action, and interaction“, Annals of
Botany, 95(5), str. 707–735. doi: 10.1093/aob/mci083.
Yoder, T. L. (2001) „Amyloplast Sedimentation Dynamics in Maize Columella Cells Support
a New Model for the Gravity-Sensing Apparatus of Roots“, Plant Physiology, 125(2), str.
1045–1060. doi: 10.1104/pp.125.2.1045.
Zhao, Y. (2010) „Auxin biosynthesis and its role in plant development“, Annual Review of Plant
Biology, 61, str. 49–64. doi: 10.1146/annurev-arplant-042809-112308.
Zhao, Y. (2012) „Auxin biosynthesis: A simple two-step pathway converts tryptophan to
indole-3-Acetic acid in plants“, Molecular Plant, 5(2), str. 334–338. doi: 10.1093/mp/ssr104.
Zhao, Y., Hull, A. K., Gupta, N. R., Goss, K. A., Alonso, J., Ecker, J. R., Normanly, J., Chory,
J. i Celenza, J. L. (2002) „Trp-dependent auxin biosynthesis in Arabidopsis: Involvement of
cytochrome P450s CYP79B2 and CYP79B3“, Genes and Development, 16(23), str. 3100–
3112. doi: 10.1101/gad.1035402.
https://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=aa_sequence&id=1009105192
preuzeto 25.12.2016
54
(https://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=aa_sequence&id=1009120696)
preuzeto 25.12.2016
https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/0/wizard-plus-sv-
minipreps-dna-purification-system-protocol/ preuzeto 20.12.2016
https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-
and-pcr-cleanup-system-protocol/ preuzeto 20.12.2016
www.clontech.com/xxclt_ibcGetAttachment.jsp?cItemId=17497 preuzeto 20.12.2016
55
8 Životopis
Rođen sam 30. lipnja 1991. godine u Prizrenu, Republika Kosovo. Osnovnu i
srednješkolsku naobrazbu stekao sam u Prizrenu. Po završetku srednje škole, kao strani student
sam 2011. godine upisao Prirodoslovno-matematički fakultet na Sveučilištu u Zagrebu, smjer
molekularna biologija. Zvanje prvostupnika molekularne biologije stekao sam 2014. godine s
temom završnog seminara „Bioaktivne sastavnice hrane i tumori“. Iste godine sam upisao
diplomski studij molekularne biologije na Prirodoslovno-matematičkom fakultetu Sveučilišta
u Zagrebu.
Tijekom studiranja odradio sam labaratorijsku stručnu praksu u Labaratoriju za
biokemiju, Zavoda za biokemiju, Prirodoslovno-matematičkog fakulteta. Praksu sam također
radio i u Labaratoriju za biljnu razvojnu biologiju, Zavoda za molekularnu biologiju, Prirodoslovno-
matematičkog fakulteta u Zagrebu.
Jako dobro poznajem hrvatski, engleski i albanski jezik, nešto manje bugarski jezik te
sam djelomično upoznat s francuskim jezikom. Vrlo sam detaljno upoznat s operativnim
sustavom MS Windows te se izvrsno služim programima iz paketa MS Office.
U slobodno vrijeme bavim se šahom, stolnim tenisom i biciklizmom.