Univerzitet u Nišu

Prirodno-matematički fakultet

Departman za hemiju

Radna sveska

Sekundarni metaboliti kore mandarine i iglica crnog bora

Predmet: Hemija sekundarnih metabolita

Profesor: Student:

Dr Gordana Stojanović Milan Jančić 96

Niš, 2016.

Teorijski deo

Mandora (Citrus reticulata ‘Ortanique’) je hibrid mandarine i pomorandže, koji je na naše tržište najverovatnije došao sa Kipra. Na osnovu izgleda se može pomešati sa Klementinom, sve dok se ne proba. Mandora je kiselija, njena kora je žilavija (teže se ljušti), i plod ima koštice. Sezona branja je mart/april (Španija i kipar) i avgust/septembar ( Južna Afrika i Urugvaj). Uzgaja se u Španiji, Maroku, na Kipru i u Južnoj Africi.

U izraelskim marketima plod se može naći pod nazivom Topaz ili Or, a u Južnoj Africi je plod poznatiji kao Tambor ili Orri. Drugi nazivi (sinonimi) su jamajčanska mandarina (Jamaican mandarin), Ortanique, Artounic, Australique, Mandor, Orantanique, Ormanda, Ortaline, Uruline, Urunique i Villa late.

U raznim istraživanjima je otkriveno da ekstrakti citrusnog voća imaju antikancerogeno, antitumorsko, antiinflamatorno dejstvo i imaju ulogu u sprečavanju nastanka tromba (Du and Chen, 2010; Huang and Ho, 2010). Ovi i razni drugi zdravstveni učinci uglavnom se pripisuju prisutnosti bioaktivnih supstanci u njima, kao što su flavonoidi i karotenoidi. Visok udeo i raznolikost vitamina čini ih vrlo poželjnim u svakodnevnoj ishrani. U sastavu mandore se nalazi obilje vitamina C, za koji je poznato da poseduje snažna antioksidativna svojstva. Antioksidativna svojstva mogu varirati u zavisnosti od vrste citrusnog voća- čak i unutar iste vrste, u zavisnosti od načina uzgajanja i od klimatskih uslova (1.citruspages).

Slika 1. Izgled Mandore

Crni bor (Pinus nigra) je visoko četinarsko drvo. Jedna je od najrasprostranjenijih vrsta borova koje rastu u Srbiji.U zavisnosti od uslova sredine crni bor može porasti i do 40 m. Ima široko kupastu kišobranastu krošnju. Kora stabla je debela, tamno siva, ispucala u nepravilnim brazdama. Kod starijih stabala brazde su i poprečne. Mlade grane su gole, sjajne, pokrivene sitnim ljuspama. Pupoljci su smolasti, pri vrhu oštro zašiljeni. Četine su tamno zelene i krute, duge 8-18 cm, po dve u rukavcu. Otpadaju posle 4-5 godina. Muške cvasti smeštene su pri vrhu ovogodišnjih grančica, a ženske (koje uobičajeno zovemo šišarke) su viseće i formiraju se duž cele grane. Cveta aprila-maja. Šišarke su okruglaste, duge 4-10 cm, sjajno smeđe. Seme sazreva do jeseni druge godine, a šišarke se otvaraju u proleće treće godine.

Areal crnog bora prostire se u južnoj Evropi, od istočne Španije i južne Francuske, preko Korzike i Kalabrije, Austrije i Balkanskog poluostrva do Male Azije i Krima. Najčešće raste na nadmorskoj visini od 400 do 1300 m, ali se na Kopaoniku mogu naći pojedini primerci i na 1650 m n.v.

Drvo crnog bora koristi se u primarnoj preradi drveta za proizvodnju furnira i rezane građe, dok se u finalnoj preradi drveta ovi proizvodi koriste za proizvodnju raznih vrsta nameštaja. Cenjeno je i kao građevinsko drvo. Zbog svoje trajnosti drvo srčevine posebno je cenjeno u proizvodnji prozora, vrata, krovnih konstrukcija, podova i drugih proizvoda izloženih promenljivim atmosferskim uticajima. Drvo je bogato smolom, trajno i otporno, naročito ako se nalazi ispod vode. Drvo panja, koje ima povećani sadržaj smole, koristi se za ekstrakciju, a u narodu je poznato pod nazivom “luč”. Luč se koristi za lako paljenje vatre.

Etarsko ulje bora lekovito deluje pri svim infekcijama disajnih puteva, astme i bronhitisa. Koristi se i za masažu zglobova i mišića. U kombinaciji sa etarskim uljem eukaliptusa pojačava mu se delotvornost. Popravlja raspoloženje, umiruje. Rastvoreno u nekom od baznih ulja koristi se za relaks masažu (2. wikipedia).

Slika 4. Izgled crnog bora

Eksperimentalni deo

1) U ovom eksperimentu je ekstrahovana kora Mandore (Citrus reticulata ‘Ortanique’). Proizvod je kupljen u marketu ’’Idea,, marta 2016. godine.

Postupak izvođenja eksperimenta:

1.1) Ekstrakcija kore mandore

Kora Mandore je usitnjena i za ekstrakciju je uzeto 10 g te usitnjene kore. Ekstrakcija je vršena sa 50 ml etil-acetata u UV kadi tokom 40 min. Nakon ekstrakcije je izvršena filtacija (uklonjen je biljni materijal), a etil-acetat je uklonjen na vakuum uparivaču. 80 mg suvog ostatka je rastvoreno u 3 ml metanola.

1.2) Hidroliza kore mandore

Uzeto je 140 g materijala za hidrolizu i preliveno je sa 400 ml 2M HCl u balonu od 1000 ml uz refluktovanje od 40 min. Vršena je tečno-tečno ekstrakcija heksanom i utrošeno je 200 ml rastvarača. Nakon uparavanja heksana na vakuum uparivaču masa suvog ostatka je iznosila 0,0145 g. Zatim je izvršena još jedna tečno-tečno ekstrakcija etil-acetatom, pri čemu je utrošeno 400 ml rastvarača. Dobijen suvi ostatak nakon uparavanja etil-acetata je iznosio 0,5496 g.

1.3) HPLC analiza

Dobijeni koncentrati podvrgnuti su analizirani su tečnoj hromatografiji pod visokim pritiskom (HPLC). Svi uzorci su rastvoreni u metanolu do koncentracije 5 mg/mL. Pre injektovanja, svi uzorci su filtrirani kroz 0,45 µm membranski PTFE filter (Rotilabo-Spritzenfilter 13 mm, Roth, Karlsruhe, Germany). HPLC analiza je izvršena na termostatiranoj koloni Agilent, Zorbax Eclipse XDB-C18, 5 µm, 4.6×150 mm, koristeći aparat za tečnu hromatografiju (Agilent 1200 series). Ovaj tečni hromatograf je opremljen DAD detektorom (diode array detector), softverom Chemstation (Agilent Technologies), kvaternarnom pumpom, uređajem za automatsko uzorkovanje, sa protokom eluenta od 0.5 mL/min. Analiza je vršena uz gradijentno eluiranje sa kolone, koje je postignuto menjanjem odnosa eluenta A (0.27 M rastvor mravlje kiseline u vodi) i eluenta B (metanol), i to (v/v): inicijalno 70% A; 0-5 min, 70-30% A; 5-20 min, 30-10% A; 20-30 min. Temperatura kolone bila je 25ºC. Zapremina injektora je podešena na 5 µL. Spektri su dobijeni snimani u opsegu 190–400 nm, i zabeleženi na 254 nm.

2) U ovom eksperimentu smo koristili iglice crnog bora (Pinus nigra).

2.1) Dobijanje etarskog ulja

Etarsko ulje iz iglica crnog bora je izolovano destilacijom. 297g usitnjenih iglica u Klevendžer aparaturi. Destilacija je trajala 3 sata. Dobili smo 1,1 ml ulja. Nakon toga vršena je tečno- tečno ekstrakcija ulja etrom, zatim smo za sušenje koristili MgSO4, filtrirali i uparavali do suva.

Posle uparavanja, masa suvog ostatka iznosi 0,8065g.

Dobijeni prinos je 0,27%.

2.2) GC/MS analiza

Hemijski sastav etraskog ulja analiziran je pomoću GC/MS metode snimanjem na aparatu 7890/7000B GC/MS/MS triple quadrupole system (Agilent Technologies, USA), koji je opremljen Combi PAL uređajem za automatsko uzorkovanje i kapilarnom kolonom (Agilent 19091S-433-5MS, 5% fenilmetilsiloksan, 30 m x 0,25 mm, debljina filma 0,25 μm).

Režim rada GC/MS aparata bio je sledeći: temperature injektora i interfejsa održavane su na 250°C, odnosno 300°C. Temperatura peći je programirana linearno, 50-290°C, sa brzinom zagrevanja od 4°C/min, a zatim "back flash" 1.89 min, na 280°C, uz pritisak helijuma od 50 psi (noseći gas sa konstantnim protokom 1,0 mL/min). 1 μl rastvora ulja u dietil-etru je injektovan u jednoj porciji. Uslovi rada elektron impakt (EI) detektora su sledeći: jonizacioni potencijal 70 eV, pun maseni sken beležen je u intervalu m/z 40–650 (brzina skeniranja 5 skena/s), vreme skeniranja 0,32 s.

Identifikacija komponenata je vršena poređenjem masenih spektara sa spektrima iz biblioteke Mainlib i Wiley6, pomoću AMDIS softvera, kao i na osnovu slaganja izračunatih retencionih indeksa sa literaturno dostupnim retencionim indeksima (AI) (Adams, 2007). Retencioni indeksi komponenti frakcija ekstrakta su izračunati na osnovu njihovih retencionih vremena (RI) i retencionih vremena n-alkana (C8-C40) snimljenih pod istim uslovima (Van den Dool i Kratz, 1963).

Prikaz dobijenih rezultata1) Analiza ekstrakta mandore

HPLC hromatogram i etil-acetatnog ekstrakta kore mandore pre i nakon hidrolize dati su na slici 5.

Slika 5. HPLC hromatogrami etil-acetatnog ekstrakta kore mandore pre i nakon hidrolize

Najintenzivniji pikovi ekstrakta su na Rt 19.810 i 27.562 min. Poređenjem UV spektara (Slike 6 i 7) i redosleda eluiranja komponenti naših uzoraka i jedinjenja identifikovanih u prethodnim istraživanjima (Sun et al. 2010) može se pretpostaviti da se radi o tangeretinu i tetrametilskutelareinu.

Slika 6. UV spektri komponenti na 19.810 I 27.562

Slika 7. UV spektar tangeretina

Najintenzivniji pikovi hidrolizovanog ekstrakta su na Rt 4.223 i 6.554 min (slika 5). Poređenjem UV spektara (slike 8 i 9) i redosleda eluiranja komponenti naših uzoraka i jedinjenja identifikovanih u prethodnim istraživanjima (Sun et al.,2007) može se pretpostaviti da se radi o katehinu i epikatehinu.

Slika8. UV spektri komponenti na 4.223 i 6.554

UV Katehina

Strukture najzastupljenijih komponenti u etil−acetatnom ekstraktu kore mandore:

Tangeretin Katehin

Epikatehin Tetrametilskutelarein

2) Analiza etarskog ulja crnog bora

Analizom hromatograma (slika 10) dobijeni su rezultati prikazani u tabeli.

Slika 10. Totalni jonski hromatogram etarskog ulja crnog bora

Tabela. Procentni sastav etarskog ulja crnog bora.

R.br. Rt AI EI Jedinjenje %1 9.877 932 933 α-pinen 53.72 11.323 974 975 -pinen 15.03 13.146 1024 1027 limonen 1.94 26.578 1417 1423 (E)-

kariofilen4.8

5 28.489 1484 1486 Germakren D

22.0

ukupno 97.4

Strukture najzastupljenijih komponenti u etarskom ulju crnog bora:

α-PINENE β-Pinene limonen

(E)-Caryophyllene GERMACRENE-D

Literatura:

1. http://citruspages.free.fr/mandarinhybrids.html#tangor

2. https://sh.wikipedia.org/wiki/Crni_bor

Du, Q., and Chen, H. (2010). The methoxyflavones in Citrus reticulata Blanco cv. Ponkanand their antiproliferative activity against cancer cells. Food Chemistry, 119,567–572.

Huang, Y. S., and Ho, S. C. (2010).Polymethoxy flavones are responsible for the anti-inflammatory activity of citrus fruit peel. Food Chemistry, 119, 868–873.

Sun, Y., Wang J.,ShuboGu1, Liu Z., Zhang Y and Zhang X (2010). Simultaneous Determination of Flavonoids in Different Parts of

Citrus reticulata‘Chachi’ Fruit by High Performance Liquid.Molecules, 15, 5378-5388.

Sun, J., Liang, F., Bin, Y., Li, P., Duan, C. (2007).Screening Non-colored Phenolics in Red Wines using liquid chromatography/ultraviolet and mass Spectrometry/Mass Spectrometry libraries, 12, 679-693.