supercomplejos villanueva alonso, Óscar calvo morales, maria dolores
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SUPERCOMPLEJOSSUPERCOMPLEJOS
Villanueva Alonso, ÓscarVillanueva Alonso, ÓscarCalvo Morales, Maria DoloresCalvo Morales, Maria Dolores
La mitocondriaLa mitocondria
El mtDNA es una molécula de doble hebra de DNA El mtDNA es una molécula de doble hebra de DNA circularcircular
El mtDNA no tiene intrones y los tRNAs sirven como El mtDNA no tiene intrones y los tRNAs sirven como elementos de procesamientoelementos de procesamiento
Tiene sus propios ribosomasTiene sus propios ribosomas El mtDNA posee su propio código genéticoEl mtDNA posee su propio código genético
DNA DNA mitocondrialmitocondrial
Características del mtDNACaracterísticas del mtDNA
Herencia maternaHerencia materna Las mitocondrias se heredan exclusivamente de la madreLas mitocondrias se heredan exclusivamente de la madre
PoliplasmiaPoliplasmia Cada célula con entre 100 y 10.000 copias de mtDNA Cada célula con entre 100 y 10.000 copias de mtDNA
dependiendo del tejido dependiendo del tejido
Alta tasa de mutaciónAlta tasa de mutación El mtDNA presenta una tasa de mutación espontánea 10 El mtDNA presenta una tasa de mutación espontánea 10
veces superior a la del DNA nuclear veces superior a la del DNA nuclear
Segregación mitóticaSegregación mitótica HomoplasmiaHomoplasmia HeteroplasmiaHeteroplasmia
El mtDNA no es manipulable “in vivo”:El mtDNA no es manipulable “in vivo”: No se pueden transformar mitocondriasNo se pueden transformar mitocondrias No se puede realizar mutagénesis dirigida.No se puede realizar mutagénesis dirigida.
El mtDNA de una especie es incompatible con el El mtDNA de una especie es incompatible con el nDNA de otra.nDNA de otra.
No se pueden hacer estudios de genética No se pueden hacer estudios de genética funcionalfuncional
Dificultad en la generación de modelos animales Dificultad en la generación de modelos animales de patologías mitocondrialesde patologías mitocondriales
Dificultades de la genética Dificultades de la genética mitocondrial en animalesmitocondrial en animales
RESPIRACIÓN AEROBIA:RESPIRACIÓN AEROBIA: cadena de transporte de electronescadena de transporte de electrones
Solo unas pocas subunidades de Solo unas pocas subunidades de los complejos respiratorios están los complejos respiratorios están
codificados por el mtDNAcodificados por el mtDNA
Estructura de los complejosEstructura de los complejos
MODELOS:MODELOS:
““estado líquido”estado líquido” todos los componentes de la cadena de electrones todos los componentes de la cadena de electrones
difunden libremente en la membrana interna de la difunden libremente en la membrana interna de la mitocondria y la transferencia de electrones entre mitocondria y la transferencia de electrones entre unos y otros depende de encuentros a azar unos y otros depende de encuentros a azar
““estado sólido”estado sólido” los complejos están asociados permanentemente los complejos están asociados permanentemente
formando supercomplejosformando supercomplejos
Ventajas de los supercomplejosVentajas de los supercomplejos
Estabilización de la estructura de los Estabilización de la estructura de los compuestos individualescompuestos individuales
Canalización de los reactivos intermediosCanalización de los reactivos intermediosLa ubiquinona y el citocromo c pasan La ubiquinona y el citocromo c pasan
directamente de un complejo al siguientedirectamente de un complejo al siguienteSecuestro de las especies intermedias Secuestro de las especies intermedias
Se evita que puedan reaccionar con el OSe evita que puedan reaccionar con el O22
para dar radicales librespara dar radicales libres
a) supercomplejo Ia) supercomplejo I11IIIIII22
b) supercomplejo Ib) supercomplejo I11IIIIII22IVIV11
Schägger et Peiffer (2001) JBC, 276, 37861-7
Schägger et Peiffer (2001) JBC, 276, 37861-7
Modelos para la estequiometria de Modelos para la estequiometria de los complejoslos complejos
Estudio de la interrelación entre el Estudio de la interrelación entre el CI y el CIIICI y el CIII
ObservacionesObservacionesPacientes con intolerancia al ejercicio con Pacientes con intolerancia al ejercicio con
deficiencias en el CIII en el tejido musculardeficiencias en el CIII en el tejido muscularDeficiencias en el CIII pueden que pueden Deficiencias en el CIII pueden que pueden
cursar solas pero suelen hacerlo como cursar solas pero suelen hacerlo como deficiencias combinadas en el CIII+CIdeficiencias combinadas en el CIII+CI
No existe simetria el fenotipo de las No existe simetria el fenotipo de las deficiencias en el CI que suelen cursar deficiencias en el CI que suelen cursar aisladasaisladas
La mayoría de las deficiencias en el CIII se La mayoría de las deficiencias en el CIII se deben a mutaciones en el gen mitocondrial deben a mutaciones en el gen mitocondrial del CIII, el gen del cit bdel CIII, el gen del cit b
Línea celular de ratón L929Línea celular de ratón L929Obtención de la linea A22Obtención de la linea A22
Glu 373 Lys
Creación de la línea Creación de la línea transmitocondrial FA22transmitocondrial FA22
A22 y FA22 son A22 y FA22 son homoplásmicas para la homoplásmicas para la mutación en el cit bmutación en el cit b
No se observa actividad No se observa actividad enzimática del CIII ni del enzimática del CIII ni del CI CI
A22 tiene el mismo fenotipo que las A22 tiene el mismo fenotipo que las deficiencias combinadas del CIII + CI deficiencias combinadas del CIII + CI
debidas a mutaciones en el cit bdebidas a mutaciones en el cit b
El complejo III no se forma en A22 ni en FA22El complejo III no se forma en A22 ni en FA22 Los niveles de complejo I en A22 y FA22 están Los niveles de complejo I en A22 y FA22 están
seriamente reducidasseriamente reducidas
Existe interdependencia en la Existe interdependencia en la formación/estabilidad entre los 2 complejosformación/estabilidad entre los 2 complejos
Inhibimos el CIII de forma Inhibimos el CIII de forma farmacológicafarmacológica
Después de 2 semanas de tratamiento de de Después de 2 semanas de tratamiento de de las células con el inhibidor específico de la las células con el inhibidor específico de la actividad del CIII, el CI no esta afectadoactividad del CIII, el CI no esta afectado
Es la ausencia física del CIII y no Es la ausencia física del CIII y no la pérdida de su actividad lo que la pérdida de su actividad lo que
produce la pérdida del CIproduce la pérdida del CI
¿Es necesario el CIII para la formación ¿Es necesario el CIII para la formación del CI o solo lo estabiliza?del CI o solo lo estabiliza?
En las células control el CI aumenta con el En las células control el CI aumenta con el tiempo, en cambio en las A22 el CI disminuye a tiempo, en cambio en las A22 el CI disminuye a medida que pasa el tiempomedida que pasa el tiempo
En ausencia del CIII el CI si que se En ausencia del CIII el CI si que se forma, pero es inestableforma, pero es inestable
Estudio de la biopsia muscular de Estudio de la biopsia muscular de un paciente con mutación en el cit bun paciente con mutación en el cit b
Se produce la pérdida Se produce la pérdida concomitante del CIII y el CIconcomitante del CIII y el CI
La presencia del CIII es requerida La presencia del CIII es requerida para la estabilidad del CI en células para la estabilidad del CI en células
humanas diferenciadashumanas diferenciadas
Explicación del fenotipo de Explicación del fenotipo de pacientes con mutaciones en el CIIIpacientes con mutaciones en el CIII
CI CIVCIII CV
Pacientes tipo A + - +Pacientes tipo B - - +
El fenotipo de los pacientes estará modulado por el grado de heteroplasmia de la mutación
La existencia de la asociación entre los dos La existencia de la asociación entre los dos complejos respiratorios, ya documentada, complejos respiratorios, ya documentada, es coherente con estos descubrimientos es coherente con estos descubrimientos
ESTUDIO DE LA ESTUDIO DE LA ARQUITECTURA DE ARQUITECTURA DE
SUPERCOMPLEJOS MEDIANTE SUPERCOMPLEJOS MEDIANTE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICAMICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
(a), BN-PAGE (poliacrilamida gradiente de concentración T: El 3-13 %) de mitocondrias de corazón bovinas solubilizadas.
(b), BN-PAGE (T: El 3-5 %).
Ambas tiras de supercomplejos estaban en la proximidad
cercana en una BN-PAGE (la T: El 3-13 %).
Para la caracterización bioquímica y estructuralPara la caracterización bioquímica y estructural
La separación fue mejorada en una BN-PAGE con la T: El 3-5 %, BN- PAGE (T:
El 3-13 %) de los supercomplejos aislados I1III2 y I1III2IV1.
El Supercomplejo I1III2IV1 (BANDA 2) está intacto después de la electroelución, pero el supercomplejo I1III2 (BANDA 1) muestra dos bandas adicionales muy débiles de I y III2.
La actividad del complejo NADH deshidrogenasa fue mostrada por bandas púrpuras que son resultado de la precipitación en gel de formazan
Para la actividad enzimáticaPara la actividad enzimática
El la actividad de la citocromo c oxidasa del complejo IV fue determinada por la oxidación del citocromo c dependiente de 3,3 '-diaminobenzidina al óxido marrón e indamina precipitada
La actividad del complejo I en el supercomplejo I1III2 y I1III2IV1 así como la actividad del complejo IV para el supercomplejo I1III2IV1
en las muestras aisladas fue demostrada:
Ensayos espectofotométricos para evaluar la actividad de la NADH:UBIQUINOL reductasa del complejo I y la
actividad de la citocromo c reductasa del complejo III en las muestras electroeluidas. En las condiciones usadas,
se obtuvo:
Para concluir ambos supercomplejos aislados mostraron actividad, pero el supercomplejo I1III2IV1 era considerablemente más activo.
Las imágenes triangulares están indicadas por círculos rojos. Las formas L por círculos amarillos. Los círculos verdes en (a) indican las partículas que podrían ser el
complejo dimérico III proveniente de la disociación del supercomplejo I1III2.
Las barras de escala representan 100 nm.
Para la microscopía de electronesPara la microscopía de electrones
II11IIIIII22 II11IIIIII22IVIV11
Las dos vistas representan las dos orientaciones preferenciales de los supercomplejos.
Una orientación es preferida sobre la otra.
(a) vistas superiores (espacio intermembrana) del supercomplejo I1III2IV1 (con un promedio de 228 partículas).
(b) el Supercomplejo I1III2 encabezan la vista el promedio de 66 partículas).
(c) mapa diferencial entre I1III2IV1 y I1III2.
(d) vista superior del espacio de la matriz de I1III2IV1.
(e) Vista lateral de supercomplejo I1III2IV1 (promedio de 70 partículas).
(f) la vista superior del complejo bovino IV a través de rayos X, visto desde el espacio intermembrana.
Los mapas de proyección hechos en promedio de los supercomplejos.
300 partículas observada con menos frecuencia que las anteriores fueron seleccionadas. Después de la alineación y haciendo un promedio, la imagen mostró dos salientes grandes sobre un lado de la línea brillante, mientras que otra superficie apareció lisa.
Si comparamos con un mapa de proyección de tinción negativa del complejo I en corazón bovino (a) se identifica el saliente más grande (e) como el brazo de la matriz de complejo I.
El dominio de la membrana del complejo I en el supercomplejo se extiende a lo largo del saliente más pequeño en esta vista.
La línea brillante alrededor del supercomplejo puede ser interpretada como los dominios transmembrana de la proteína debido al detergente y posiblemente la mancha sea debida al azul de Coomassie de la BN-PAGE.
El saliente más pequeño encaja con los dominios de la matriz del complejo III dímero (2) (4e y 5f). El complejo IV tiene un dominio mucho más pequeño que la matriz (3), que no puede ser identificado en la vista lateral presente. Ni el complejo I, III2 ni IV tiene un dominio sensible expuesto al espacio interno de membrana, que es compatible con el aspecto liso de esta superficie en las vistas laterales.
La asimetría de la vista lateral (e) claramente explica las distintas vistas triangulares (a y d), que puede ser interpretado como la vista perpendicular a la membrana del lado de la matriz y el espacio intermembrana, respectivamente.
(a) proyección de la estructura del complejo I.
(b) las vistas laterales de las estructuras de rayos X del complejo IV (verde) y (c) el complejo III dimérico (rojo) dibujado en la misma escala que los mapas de proyección.
(d) Estructura de rayo X de complejo IV complejo (verde) (e) complejo III2 (rojo), ambos vistos desde el espacio intermembrana.
Las disposiciones alternativas de los complejos I y III2 en supercomplejo I1III2IV1.
(f) las estructuras de rayo X de complejo III2 y IV superpuesto sobre el mapa de proyección del supercomplejo I1III2IV1 (vista lateral).
(g) Modelo 1: El complejo III2 y IV superpuesto sobre el supercomplejo I1III2IV1 (como mirando desde el espacio
intermembrana).
[contacto con el complejo I y IV, menos contacto con III2]
(h) Modelo 2: El complejo III2 está en la parte superior del supercomplejo. La masa restante en la parte inferior es el brazo de la membrana de complejo I. Así el complejo IV comparte una superficie de contacto grande con III2, pero hay poco contacto con el complejo I.
Vista superior del supercomplejo: complejo I (amarillo).
la otra mitad integrada por la membrana inferior de complejo III (la estructura que llena espacio) visto desde el lado de la matriz.
Densidad de las proyecciones adicionales del complejo I se representan en color naranja.
El contorno de los dominios hidrófilos de complejo III dentro de la matriz son indicadas por una línea de puntos verde.
Modelo para la estructura del supercomplejo I+IIIModelo para la estructura del supercomplejo I+III22 de Arabidopsis thaliana de Arabidopsis thaliana,, incorporando la estructura de rayos X del complejo III y la densidad de 3D de EM del complejo I del corazón bovino.
Complejo I (amarillo) y complejo III (verde), visto a un ángulo de 45 ° desde el plano de la membrana.
Los componentes de los complejos I y III y de la membrana fuera del supercomplejo son indicados en azul.
CONTINUARÁ …CONTINUARÁ …