sueÑo en el acocil: mapeo de la actividad …
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
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INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
DIRECTOR INTERNO: M. en C. YOLANDA DE LAS MERCEDES GÓMEZ Y GÓMEZ DIRECTOR EXTERNO: DR. JESÚS HERNÁNDEZ FALCÓN
México, D. F. Mayo 2008
PRESENTA: ITZEL ÁVILA CABELLO
SUEÑO EN EL ACOCIL: MAPEO DE LA ACTIVIDAD
CEREBRAL DURANTE EL SUEÑO UNA PREPARACIÓN NO DEAMBAULANTE
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AGRADECIMIENTOS
Primero que nada agradezco a Dios por permitir que llegará este momento
que desde niña anhele y por dejarme compartirlo con todos mis seres queridos,
que aunque falta una persona muy importante para mi, estoy segura, él también
estaría orgullosos de mi, gracias abuelito.
A mis padres, por el apoyo incondicional, por la motivación y la fuerza para
seguir adelante con mis estudios que siempre me han dado, pero sobretodo por
darme la vida y esforzarse brindarme lo mejor de ellos.
A mis hermanas por confiar en mí y por regalarme momentos felices
cuando llego a casa.
A mis abuelitos que aún están conmigo, a mis tíos y primos que siempre
me han confiado mi, seguros de que cumpliría esta meta.
A mis amigos por todos los momentos buenos y malos que compartimos a
lo largo de la carrera, por aguantar mis locuras y apoyo incondicional.
A la Doctora Karina Mendoza Ángeles, por su tiempo, paciencia, y
sobretodo por disposición para auxiliarme en la realización de este proyecto, sin su
ayuda esto no hubiera sido posible. Y por brindarme esta valiosa amistad.
A los Doctores Jesús Hernández Falcón y Fidel Ramón por aceptarme en el
laboratorio y apoyarme en mi proyecto.
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ÍNDICE
1. RESUMEN 1 2. INTRODUCCIÓN 2
2.1 Actividad eléctrica del cerebro 22.2. Vigilia y sueño 42.3. Actividad eléctrica en el cerebro del acocil 62.4. Sueño en el acocil 62.5. Análisis en tiempo-frecuencia 7
2.5.1. Transformada de Fourier en corto tiempo 72.5.2. Transformada Gabor 82.5.3. Transformada wavelet 8
2.6. Anatomía del sistema nervioso del acocil 9
3. JUSTIFICACIÓN 11 4. OBJETIVOS 12 5. MATERIAL Y MÉTODOS 13
5.1. Material biológico 135.2. Registros conductuales y electrofisiológicos 13
5.2.1. Preparación biológica 135.2.2. El electrodo 14
5.3. Mapeo cerebral 145.3.1. Preparación biológica 14
5.3.2. El electrodo 16 5.4. Manipulación de la actividad del complejo central: efectos de enfriamiento 16
5.4.1. Preparación biológica 175.4.2. El electrodo 17
5.5. Análisis de los registros de actividad eléctrica cerebral 17
6. RESULTADOS 196.1. Estudio de la anatomía del Sistema Nervioso Central del Acocil 19
6.2. Preparación deambulante 196.2.1. Análisis de los registros conductuales 19
6.2.2. Análisis de los registros eléctricos 206.1.2.2. Análisis tiempo-frecuencia 21
6.3. Mapeo cerebral 266.3.1. Registros 276.3.2. Transformada wavelet 28
6.4. Manipulación de la actividad del complejo central: efectos de enfriamiento 30 6.4.1. Registros 306.4.2. Transformada wavelet 31
7. DISCUSIÓN 337.1. Identificación de estados cerebrales 33
7.1.1. Análisis con transformada wavelet 337.2 Mapeo Cerebral 33
7.2.1. Preparación de acocil suspendido 337.2.2. Secuencia de sincronización del cerebro durante el sueño 34
7.3. Origen de las ondas lentas 34
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8. CONCLUSIONES 34 9. REFERENCIAS 36
ESTUDIO DEL SUEÑO EN EL ACOCIL: MAPEO DE LA ACTIVIDAD CEREBRAL DURANTE EL SUEÑO EN UNA PREPARACIÓN NO DEAMBULANTE
Itzel Ávila Cabello, Jesús Hernández Falcón, Yolanda de las Mercedes Gómez y Gómez. Dr. Jesús Hernández Falcón; Depto. Fisiología, Facultad de Medicina; Tel.: 56-220765; e-mail: [email protected]
Palabras clave: sueño, invertebrado, mapeo cerebral.
Introducción. El sueño es un estado durante el cual el cuerpo se encuentra inactivo, no así el cerebro, y se ha estudiado sobre todo en mamíferos y otros vertebrados. Diversos estudios muestran que en algunos invertebrados también está presente esta función, lo que implica que ella aparece muy pronto en el desarrollo evolutivo. El acocil es un invertebrado que duerme y en el que se han realizado diversos estudios sobre el sueño. Este animal es útil como modelo biológico, el cerebro es de fácil acceso y el número de neuronas es relativamente pequeño, lo que facilita realizar estudios electrofisiológicos (1). La actividad eléctrica del cerebro del acocil alerta consiste en multitud de espigas sobre una línea base plana. Durante el sueño, esta actividad es sustituida por ondas lentas y desaparición de las espigas (2). El propósito de este trabajo es obtener un mapa dinámico de las diferentes regiones del cerebro del acocil durante el sueño de ondas lentas, analizarlo mediante la transformada “wavelet”, que es el instrumento matemático ideal para este tipo de señales biológicas, y postular posibles vías de transmisión de las ondas lentas hacia las diferentes áreas del cerebro Metodología. Preparación biológica: Utilicé acociles machos adultos Procambarus clarkii en intermuda, de 8 a 10 cm de longitud del rostrum-telson. Un día antes del registro coloqué a los animales un corcho en el caparazón dorsolateral, que sirvió para sujetarlo a nivel de la superficie del agua en un soporte metálico. Luego, realicé una perforación en el caparazón dorsal para exponer el cerebro por completo. En estas condiciones coloqué un electrodo en un área cerebral seleccionada y obtuve el registro de la actividad eléctrica de la misma. Posteriormente moví el electrodo a otra posición y repetí el registro hasta cubrir al menos las tres áreas principales, protocerebro, complejo central del cerebro y deutocerebro (3). Registros eléctricos: Los electrodos fueron cánulas de acero inoxidable, en cuyo interior llevaban de 1 a 4 alambres de Pt-Ir, (75 µm de diámetro) recubiertos de teflón. La señal eléctrica se amplificó por técnicas convencionales y se filtró entre 3 Hz y 3 kHz. Mediante una tarjeta AD se almacenó en una computadora personal para su análisis posterior. Análisis de las señales: Para realizar el análisis de las señales eléctricas utilicé la Transformada Wavelet, mediante un algoritmo que explora frecuencias entre 5 y 1000 Hz (3). Resultados y discusión. Un acocil flotando a nivel de la superficie del agua, presenta dos estados, alerta y dormido. La actividad cerebral del acocil alerta está formada por múltiples espigas de amplitud variable, montadas sobre una línea basal plana. Cuando el animal duerme las espigas se reducen o desaparecen y aparecen ondas lentas de baja amplitud y con frecuencias de entre 20-35 Hz. (Figura 1). Estos resultados son similares a los observados en animales reambulantes (2), lo que implica que en mis condiciones experimentales el acocil duerme. Estudios previos han mostrado que la actividad eléctrica del cerebro del acocil no es estacionaria (3), y que la Transformada Wavelet es un método de análisis ideal para el tratamiento de
dichas señales. Mediante esta técnica pude determinar, sin errores de apreciación, cuándo estaba dormido un acocil desde el punto de vista electrofisiológico. Por otro lado, el mapeo cerebral me permitió determinar la secuencia de propagación de las ondas lentas durante el sueño. La secuencia tentativa es: complejo central – deutocerebro – protocerebro.
Figura 1. Posiciones del acocil y su actividad cerebral
correspondiente. a) animal alerta; b) animal dormido. En el análisis con la TW encontré cambios en la actividad eléctrica en casi todas las regiones. En protocerebro la actividad es regular de potencias altas que disminuyen cuando el acocil duerme. En el cuerpo central la señal es regular en frecuencias bajas y alrededor de los 30-45 Hz; esta estructura oscila constantemente y solo cuando el animal duerme es que estas ondas lentas se propagan en la secuencia enunciada líneas arriba. Como en el caso del animal deambulante, durante el sueño de ondas lentas hay caídas de potencia alrededor de los 30-45 Hz. Conclusiones y perspectivas. La transformada Wavelet es útil para el análisis de series de tiempo no estacionarias. El sueño de ondas lentas en el acocil se caracteriza por una reducción en la potencia en la banda de frecuencias entre 30 y 45 Hz, que se desplaza del complejo central hacia deutocerebro y luego a protocerebro. Encontramos variaciones en la actividad eléctrica cerebral del acocil aún cuando se encuentra en estado de sueño. El acocil duerme aún en la preparación donde se encuentra suspendido. Pareciera que el complejo central funciona como un oscilador que es independiente del estado cerebral del animal. Agradecimientos. A los Dr. Karina Mendoza Ángeles, Dr. Jesús Hernández Falcón y Dr. Fidel Ramón, por su apoyo para la realización de este proyecto. Referencias. 1. Hernández, O. H., Serrato, J., and Ramón, F. (1996)
Chronic recording of electrical activity from the brain of unrestrained crayfish: The basal, unstimulated activity. Comp. Biochem. Physiol., 114A: 219-226.
2. Ramón, F., Hernández-Falcón, J., Nguyen, B., and Bullock, T. (2004) Slow wave sleep in crayfish. PNAS, 101: 11857-11861.
1. Mendoza-Angeles, K. (2008) Identificación y Caracterización de estados cerebrales en el acocil. Tesis doctoral, Facultad de Medicina, UNAM.
1
2. INTRODUCCIÓN 2.1 Actividad eléctrica del cerebro Desde hace muchos años la técnica más utilizada para registrar y estudiar la
actividad eléctrica del cerebro de los vertebrados es mediante la electroencefalografía,
término introducido por Hans Berger. Convencionalmente, la actividad eléctrica del
cerebro es recogida por electrodos colocados en la superficie del cuero cabelludo o en
el cerebro a diferentes profundidades.
La actividad eléctrica depende de la profundidad a la que han sido colocados
los electrodos y también de la región donde se localicen.
La señal obtenida representa la suma espacial y temporal de diferencias de
potencial debidas a corrientes sinápticas, principalmente de células piramidales, cuyas
dendritas atraviesan todas las capas de la corteza y permiten el flujo de esas
corrientes desde capas profundas de la corteza a capas más superficiales. Estas
neuronas están orientadas en paralelo unas con otras facilitando la suma espacial. La
corriente está limitada por la corteza, sin embargo una pequeña fracción penetra a
través de las meninges y cráneo. Llegando a el cuero cabelludo, donde debido a la
propia anatomía del cráneo se registran diferentes niveles de potencial, dependiendo
del área en que se coloquen los electrodos (Fisch, 1991).
El EEG de un humano, despierto o en descanso comúnmente está conformado
por una actividad rítmica, debida a interacciones corticotalámicas.
La actividad eléctrica del cerebro de vertebrados se puede analizar de
diferentes maneras. La Transformada de Fourier (Ec. 2.1) fue introducida por Dietsch
en 1932 como método de análisis de la señal de EEG, gracias a ella se clasificaron los
diferentes ritmos que muestra la actividad cerebral.
La transformada de Fourier está diseñada para analizar señales periódicas y
estacionarias. Definida por la suma de señales exponenciales de frecuencia definida.
dtetfF jwt−∞
∞−∫= )()(ω Ec. 2.1
donde:
es una función definida en tiempo )(tf
)(ωF es una función definida en frecuencia
, identidad de Euler )()cos( tjsente jwt ωω +=−
El análisis con la Transformada de Fourier es muy tardado, por ello se
desarrolló la Transformada Rápida de Fourier (TRF), que simplifica el análisis, ya que
2
elimina la información redundante y considera la suma de señales exponenciales
finitas.
Esto permitió construir espectrogramas confiables y de manera rápida (Figura
2.1).
Figura 2.1. Análisis del EEG mediante TRF (Modificada de del Águila, 1994).
Con los resultados obtenidos se le asignaron valores a la clasificación
cualitativa que ya existía y de está manera se convirtió en una clasificación cuantitativa
de las ondas del EEG (Figura 2.2).
Figura 2.2. Ondas características del EEG (Modificada de del Águila, 1994).
3
4
En la señal registrada mediante electroencefalografía se estudian básicamente
las ondas por segundo (frecuencia), la amplitud (diferencia de potencial) y la
distribución topográfica dependiendo de las áreas cerebrales.
2.2 Vigilia y sueño
El estado de vigilia en un individuo se caracteriza por que este se encuentra
alerta, respondiendo a los estímulos externos del medio que le rodea e interactuando
con el mismo.
Desde el punto de vista conductual, en la mayor parte de los mamíferos el
sueño se caracteriza por una postura más o menos estereotípica y por la pérdida de la
respuesta a los estímulos externos. Desde el punto de vista funcional hay dos tipos de
propiedades del sueño. Por un lado, hay una reducción de la mayor parte de las
funciones autonómicas, frecuencias cardiaca y respiratoria, control de la temperatura
corporal, etc. Por otro lado, destacan los cambios en la actividad cerebral. El sueño es
un estado durante el cual el cuerpo se encuentra inactivo, no así el cerebro y se ha
estudiado sobre todo en mamíferos y otros vertebrados (Rattenborg y Amianer, 2002).
En el individuo despierto y alerta, el EEG presenta un patrón dominado por
ondas rápidas y de bajo voltaje, denominado ritmo beta, cuya frecuencia está dentro
de márgenes relativamente estrechos: 15-60 Hz. El cierre de los ojos y la ausencia de
estímulos externos lleva a la sustitución del ritmo beta por una actividad de mayor
voltaje y menor frecuencia, el ritmo alfa (8-13 Hz). Cuando el sujeto entra en fase de
sueño, este tipo de actividad es sustituido por ondas de mayor voltaje y de frecuencia
progresivamente menor, el sueño de ondas lentas, en el que predominan ondas del
EEG entre 0.5 y 8 Hz y corresponden a los llamados ritmos theta (4-8 Hz) y delta (0.5-
2 Hz).
Existen dos tipos de sueño, el sueño MOR (movimientos oculares rápidos) o
paradójico, y el sueño no-MOR (no hay movimientos oculares rápidos) o de ondas
lentas, este último consta de cuatro fases.
La primera fase (1-7 minutos) es de sueño ligero, aún percibimos la mayoría de
estímulos que suceden a nuestro alrededor (auditivos y táctiles). La actividad cerebral
muestra ondas lentas de frecuencias bajas (3-7 Hz). En la fase II (10-25 minutos) la
actividad cerebral es predominantemente ritmo theta y los complejos K (12-14 Hz). El
sueño de fase III se caracteriza por la presencia de ondas delta de frecuencias muy
bajas (0.5-2 Hz) y amplitud mayor a 75μV. En la última fase (20-40 minutos) la
actividad cerebral es aún más lenta en la que predominan las ondas delta.
En general, cada ciclo dura unos 90 minutos de los cuales el sueño MOR
ocupa 5-10 minutos. En una noche los ciclos se presentan de 4 a 6 veces. El sueño
MOR es considerado el restaurador físico asociado al dormir (Kandel, 2000).
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Al sueño se le han atribuido funciones esenciales como las que de un papel
restaurador, reforzador del aprendizaje, adaptación y consolidación de la memoria,
entre otras. La función reparadora sugiere que el sueño es una forma básica de
restaurar lo que el cuerpo o el cerebro han gastado durante el día, ya que existen
cambios hormonales que lo sustentan (Aldrich, 1999; Muzur, 2005).
Aún cuando no se conoce a ciencia a cierta el por qué dormimos, se ha
comprobado que el sueño se presenta de manera cicardiana en los vertebrados
estudiados. Dormir es vital para los animales y su privación prolongada en animales
experimentales, da como resultado la muerte (Rechtschaffen y cols., 1989).
Una característica común durante el sueño en los vertebrados es la aparición
de ondas lentas, que indican la sincronización de grandes grupos neuronales, sin
embargo, en la mayoría de los animales estudiados el sueño no es un estado cerebral
uniforme y estático (Mendoza-Ángeles, 2008).
Surge, sin embargo, la pregunta sobre si los invertebrados duermen (Aréchiga,
1995). Los estudios en los invertebrados son escasos y principalmente de tipo
conductual con algunos abordajes electrofisiológicos (Campbell y Tobler, 1984; Tobler
y Stalder, 1988), pues resulta difícil colocar electrodos en el cerebro, o su equivalente,
de la mayoría de los invertebrados y permitir que el animal deambule. Sin embargo, en
estudios que combinaron un abordaje conductual con algunas mediciones funcionales,
se encontró que en el escorpión la frecuencia cardiaca se reduce durante los periodos
de inmovilidad de tipo sueño (Tobler y Stalder, 1988), de manera similar a lo que
ocurre durante el sueño en los vertebrados. Otros estudios conductuales mostraron
que las abejas pasan por periodos de reposo de tipo sueño que se caracterizan por
una postura estereotípica y durante la cual hay una aparente reducción del tono motor
que mantiene erguidas las antenas (Kaiser, 1988).
Trabajos recientes aportan más datos sobre la existencia de sueño en
invertebrados. Así, la mosca de la fruta muestra todo un repertorio conductual que
parece indicar que el animal pasa por periodos de sueño (Hendricks y cols., 2000;
Shaw y Cols., 2000; Greenspan y cols., 2001). Estos periodos pueden coincidir con el
ritmo circadiano de actividad locomotriz, pero se diferencian del puro reposo por la
presencia de cambios en el umbral para estímulos sensoriales, una sensibilidad a
fármacos que típicamente bloquean el sueño o lo inducen y la evidencia de
mecanismos homeostáticos como el rebote después de la privación de sueño. En
estos animales se han podido encontrar genes que se expresan durante el sueño de
manera similar a como ocurre en la rata. Estos hallazgos indican que los invertebrados
tienen periodos de sueño, lo que implica que se trata de una función que aparece muy
pronto en el desarrollo evolutivo (Hendricks y cols., 2000; Shaw y cols., 2000;
Greenspan y cols., 2001).
2.3 Actividad eléctrica en el cerebro del acocil En el acocil se ha logrado implantar electrodos, por periodos prolongados, que
permiten registrar la actividad eléctrica de la superficie del cerebro aún cuando este se
encuentra realizando actividades cotidianas (Hernández y Cols., 1996), como
deambular por el acuario.
La preparación del acocil deambulante (Hernández y Cols., 1996), ha permitido
registrar patrones de actividad eléctrica asociados a estados de sueño, caracterizada
por ondas lentas de bajo voltaje (Ramón y cols., 2004) y vigilia, en la que se muestra
una señal de múltiples espigas de diferentes magnitudes montadas sobre una línea
basal plana, respuestas a estímulos omitidos y emitidos (Hernández-Falcón y cols.,
1999; Ramón y cols., 2002), inclusive a potenciales evocados tanto de tipo visual
como de tipo olfatorio.
El espectro de potencias de la actividad eléctrica del cerebro del acocil
despierto muestra prevalencia de ondas de alta frecuencia (mayor a 100 Hz), pero
cuando el animal está de lado las frecuencias dominantes se encuentran entre 10 y 20
Hz.
2.4 Sueño en el acocil El acocil presenta una conducta que por medio de la observación se le ha
relacionado con el estado de sueño, en la que el acocil se encuentra inmóvil por
periodos variables, caracterizándose por una posición estereotípica (de lado sobre la
superficie del agua).
Esta conducta muestra registros de la actividad eléctrica diferentes a cuando el
animal esta alerta, se observa un incremento en el umbral a estímulos mecánicos y
ausencia de la respuesta a potenciales evocados.
Esta conducta ha sido definida como sueño, en la medida que cumple con los
criterios convencionales. En condiciones de laboratorio, los acociles la adoptan con
frecuencia y duración variables que no parecen depender dela hora del día (Figura 2.3,
Ramón y cols., 2004).
Figura 2.3. Periodos de sueño de un acocil (barras oscuras) durante un periodo de 6 días.
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En el animal alerta (Figura 2.4a), es notable la presencia de espigas de
amplitud variable sobre una línea basal plana. Sin embargo cuando el acocil duerme,
el patrón de señal es sustituido por ondas lentas de amplitud baja (Figura 2.4b).
Figura 2.4. Posiciones del acocil y su actividad cerebral correspondiente.
a) animal alerta; b) animal dormido.
Las ondas lentas en el acocil dormido no tienen una morfología constante e
incluso el sueño no parece tener las mismas características en todos los casos, ya que
en algunos momentos el animal presenta movimientos rítmicos de quelas y de patas
ambulatorias.
Las señales registradas del cerebro del acocil indican que las técnicas
convencionales para el análisis de estas, como la Transformada de Fourier y la
Transformada Rápida de Fourier no se pueden aplicar para su análisis, ya que su
diseño matemático no nos permite obtener información cuando el espectro varia en
tiempo, es decir cuando la señal es no estacionaria.
2.5. Análisis en tiempo-frecuencia Como mencioné, para el análisis de estas señales no es aplicable la TF, la cual
esta enfocada a las señales estacionarias, es decir a aquellas señales que mantienen
constantes sus parámetros estadísticos a lo largo del tiempo.
Sin embargo contamos con alternativas que nos ayudan con el análisis de
señales no estacionarias o cuasi-estacionarias, como lo son la Transforma de Fourier
en corto tiempo (TFCT), la transformada Gabor y la transformada Wavelet (TW), entre
otras (Goswami y Chan, 1999).
2.5.1. Transformada de Fourier en corto tiempo La transformada de Fourier en corto tiempo, definida por la ecuación 2.2, se
basa en el hecho de que al tomar pequeños segmentos de una señal f(t) es posible
asumir que dicho segmento es estacionario y por lo tanto, calcular su transformada de
Fourier.
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dtttfbfG b∫∞
∞−
= )()(:),( ,ξφ φξ Ec. 2.2
donde: es la ventana tiempo-espectral. tj
b ebtt ξξ φφ )()(, −=
La ecuación muestra que es necesario fijar un ancho en el tamaño de la
ventana, lo cual no nos garantiza una buena resolución, el principio de incertidumbre
nos dice que para obtener buena resolución en tiempo, es necesario elegir una
ventana pequeña, mientras que para obtener buena resolución en frecuencia es
necesario utilizar una ventana grande.
2.5.2. Transformada Gabor Introducida por el físico inglés de origen húngaro Dennis Gabor en la década
de los cuarenta.
Gabor apunta el hecho de que el mejor candidato a ser ventana es una función
gaussiana, por el hecho de ser no nula y donde se alcanza la máxima concentración
simultánea en tiempo y frecuencia, llevando al mínimo el principio de incertidumbre. La
transformada Gabor se define:
.
dtebtgtfbfG tj∫∞
∞−
−−= ξαφ ξ )()(:),( Ec. 2.3
donde, αα πα
4
2
21 t
eg−
=
2.5.3. Transformada Wavelet La Transformada Wavelet de una función f(t) es la descomposición de f(t) en un
conjunto de funciones ψs,τ (t), que forman una base y son llamadas las “Wavelets” . La
Transformada Wavelet se define como:
Ec. 2.4
Las Wavelets son generadas a partir de la traslación y cambio de escala de
una misma función wavelet ψ(t), llamada la “Wavelet madre”, y se define como:
Ec. 2.5
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donde: s es el factor de escala
τ es el factor de traslación
Las wavelets ψs,τ (t) generadas de la misma función wavelet madre ψ(t) tienen
diferente escala s y ubicación τ, pero tienen todas la misma forma. Se utilizan siempre
factores de escala s > 0. Las Wavelets son dilatadas cuando la escala s > 1, y son
contraídas cuando s < 1. Así, cambiando el valor de s se cubren rangos diferentes de
frecuencias. Valores grandes del parámetro s corresponden a frecuencias de menor
rango, o una escala grande de ψs,τ (t). Valores pequeños de s corresponden a
frecuencias de menor rango o una escala muy pequeña de ψs,τ (t).
2.6 Anatomía del sistema nervioso del acocil
El sistema nervioso del acocil (Figura 2.5) muestra una estructura formada por
6 ganglios abdominales, 5 torácicos, 1 subesofágico y el cerebro, el cual esta formado
por 2 ganglios circumorales, uno subesofágico y el otro supraesofágico.
Figura 2.5. A) Vista dorsal del acocil. B) Sistema nerv oso del acocil. i
Modificada de Cattaert y LeRay, 2001.
El supraesofágico es en sí la unión de tres ganglios embrionarios: el más
rostral es el protocerebro, le sigue el deutocerebro y el más caudal es el tritocerebro
(Figura 2.6).
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Figura 2.6. Vista dorsal del Cerebro del acocil. Modificada de Sandeman y cols., 1992.
El protocerebro tiene dos lóbulos laterales, donde esta la médula terminal y el
cuerpo elipsoidal) y una parte media.
En el protocerebro podemos encontrar el ganglio óptico (lámina, médula interna
y externa).
La parte media del protocerebro lo forman el puente del protrocerebro y el
cuerpo central.
El deutocerebro contiene los lóbulos olfatorios, los neuropilos de la antena 1
(mecanoreceptores y neuronas motoras) y los lóbulos accesorios.
Al proteocerebro y al deutocerebro llega información sensorial de todo tipo y, al
parecer, también son centros de integración y procesamiento de la información.
El tritocerebro contiene el neuropilo tegumentario y los neuropilos de la antena
II (mecanoreceptores, propioceptores y neuronas motoras).
El tritocerebro forma un par de conectivos que se extiende alrededor del
esófago hacia el ganglio subesofágico, los cuales permiten la comunicación entre el
cerebro y la cadena nerviosa toracoabdominal. Al tritocerebro también llegan algunos
nervios antenulares así como ciertos nervios sensoriales de la región anterior y de la
cabeza.
El ganglio subesofágico controla los movimientos de la mandíbula, la maxila y
los maxilípedos. El primer ganglio torácico maneja los quelíceros y los siguientes
cuatro ganglios torácicos inervan los apéndices motores del cefalotórax. En los
primero 5 ganglios abdominales se encuentra el control de los apéndices asociados a
cada segmento de está región del cuerpo y también cada uno de los músculos
abdominales. El sexto ganglio se encarga de los urópodos, del telson, de la
musculatura anal y de la parte posterior del tubo digestivo (Sandeman, 1992; Delgado
Morales, 2004).
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3. JUSTIFICACIÓN Se han hecho numerosos estudios del sueño en mamíferos y vertebrados, pero
en el caso de los invertebrados son muy escasos, esto debido a las características de
los mismos; sin embargo la pregunta sobre si los invertebrados duermen pareciera
estar respondida, hallazgos indican que los invertebrados tienen periodos de sueño, lo
que implica que se trata de una función que aparece muy pronto en el desarrollo
evolutivo.
El acocil es un invertebrado que parece reunir todos los requerimientos para el
estudio del sueño, particularmente de sus aspectos electrofisiológicos.
La actividad eléctrica del cerebro del acocil es totalmente distinta a la
registrada en el cerebro de cualquier vertebrado, por lo que para el análisis de estas
señales es recomendable hacer un estudio, sobre qué tipo de análisis es más
conveniente aplicar a las señales recogidas, dándonos gráficas con buena resolución,
de tal manera que permitan observar cambios importantes en tiempo y frecuencia. Sin
embargo aún falta por responder muchas preguntas acerca del seño en este
invertebrado, como en qué parte del cerebro se originan las ondas lentas –patrón de la
señal indicativa de que el animal está dormido- y de qué manera está involucrado el
complejo central del cerebro en el sueño del acocil, cómo y cuáles son las vías de
transmisión en algunas partes del cerebro del acocil, etc.
El mapeo cerebral y el análisis de las señales con la transformada Wavelet
son herramientas muy importantes que nos puede ayudar a responder muchas de
nuestras preguntas.
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4. OBJETIVOS
• Hacer un mapa dinámico de las diferentes regiones del cerebro del acocil.
• Registrar la actividad eléctrica durante el estado de sueño en diferentes áreas
del cerebro del acocil.
• Hacer registros de actividad eléctrica del acocil durante el estado de sueño en
diferentes áreas del cerebro, lesionando de manera reversible el complejo
central.
• Analizar las señales obtenidas mediante la transformada Wavelet, creando un
algoritmo que se ajuste al tipo de señal obtenida.
• Hacer un estudio de correlación entre el estado y la posición del acocil con la
actividad eléctrica registrada.
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5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1. Material biológico Utilicé acociles machos adultos Procambarus clarkii en intermuda. Los
animales midieron entre 8 y 10 cm de longitud del rostrum al telson, y los apéndices
completos.
5.2. Registros conductuales y electrofisiológicos Para llevar a cabo los registros conductuales y electrofisiológicos
simultáneamente y hacer una comparación de ambos registros; previamente
implanté electrodos fijos en la superficie del cerebro, coloque a los amnimales en
acaurios individuales y para determinar los cambios de posición de un acocil a lo
largo del nictámero obtuve videos ininterrumpidos durante 24 horas, con una cámara
sensible a luz infrarroja (CCD-TRV138, Sony), al mismo que obtenía su registro
eléctrico.
La señal recogida por los electrodos era enviada a amplificadores de AC (P511,
Grass Instruments, Quincy, MA) con filtros pasabanda colocados a 3 Hz y a 3 kHz.
Desplegué la señal en un osciloscopio (Gould, Mod. 1604) de rayos catódicos y en
paralelo la envié a una tarjeta convertidora A/D (6024E, National Instruments), para
muestrear usé una frecuencia de 2 KHz para su almacenamiento en una
computadora y su análisis posterior.
5.2.1. Preparación biológica Inicialmente anestesiaba a los acociles por frío, por aproximadamente 30 min,
posteriormente. Para tener acceso al cerebro, realizaba una perforación amplia en el
caparazón dorsal, que abarcaba toda la región cefálica, después retraje las vísceras
internas y las mantuve en esta posición mediante un sujetador de plástico, por último
retiré la hemolinfa. Bajo el microscopio estereoscópico descendí un electrodo hacia la
posición adecuada. Por último sellé la perforación, pegando parafilm (American Can
Co., Greenwich, CT) al caparazón a modo de crear una capa protectora y la que
recubrí posteriormente, con una capa de acrílico.
Después de implantar los electrodos (Figura 5.1), regresaba a los animales a
sus acuarios individuales donde permanecían aislados para su recuperación durante al
menos 24 horas.
Figura 5.1. Electrodo implantado en la superficie del
cerebro del acocil. 5.2.2. Electrodo Usé un electrodo diseñado previamente en el laboratorio, consta de una cánula
de acero inoxidable dentro de la cual inserté 1 alambre de platino-iridio (75 μm de
diámetro) recubierto con teflón. La cánula está doblada en un extremo en un ángulo de
30-40 grados. Fijé el alambre con parafilm (American Can Co., Greenwich, CT) para
evitar el movimiento dentro de la cánula (Figura 5.2).
Figura 5.2. Diagrama del electrodo de un solo alambre.
5.3. Mapeo Cerebral Los resultados que encontré hicieron necesario un mapeo de las diferentes
regiones del cerebro del acocil. Esto no es posible en el animal deambulante (porque
la ventana del caparazón es relativamente pequeña y la cánula obstruye la visión de
buena parte del cerebro), por lo que utilicé otra preparación para poder obtener
registros de diferentes regiones de un animal inmóvil, además modifiqué las
características del electrodo y de la preparación.
5.3.1. Preparación biológica La preparación que hemos ideado en el laboratorio consiste en un acocil que
no puede deambular libremente por el acuario pero que puede mover cualquiera de
sus apéndices (patas ambulatorias, quelas, antenas o anténulas) e incluso el abdomen
o el telsón (Figura 5.3).
14
Anestesié por frío acociles intactos en los que previamente se fijé un corcho en
el caparazón dorsal – en la cara lateral del mismo –, el cual sujeté a un estativo
mediante una barra metálica. Esto me permitió mantener al animal sumergido en agua
(para que pudiera respirar), móvil y tener acceso prácticamente libre al cerebro.
Para tener este acceso se hace una perforación amplia en el caparazón dorsal,
que abarque toda la región cefálica, se retraen las vísceras internas y se mantienen en
posición mediante un sujetador de plástico. Bajo el microscopio estereoscópico
descendí un electrodo múltiple hacia la posición adecuada y bañé la preparación con
solución salina para acocil (Van Harreveld, 1936) e hice el registro, para
posteriormente realizar el análisis.
En estas condiciones pude colocar el electrodo en el área seleccionada, obtuve
el registro y posteriormente moví el electrodo a otra posición y repetí el registro.
Al concluir con el registro, cubrí el orificio con parafilm (American Can Co.,
Greenwich, CT) y regresé a cada acocil a un acuario individual, para su recuperación.
Figura 5.3. Preparación del acocil suspendido, diseñada en el laboratorio.
La posición de los electrodos en relación a las áreas cerebrales del acocil se
muestra en la Figura 5.3. Los electrodos E1, E2, E3 y E4 se encontraban en el
protocerebro; E1 y E3 sobre la región superior lateral (izquierda y derecha
respectivamente), E2 en la región superior; que incluye el puente y el cúmulo celular 6
y, E4 en la región media del complejo central, por lo que la señal puede provenir del
tracto olfatorio o del cuerpo central. Los electrodos E5 y E6 se encontraban en
deutocerebro y, E7 y E8 en tritocerebro.
15
Figura 5.4. Ubicación de los electrodos de registro. Las combinaciones de electrodos de registro
fueron: E1-E5, E3-E6, E2-E4, E1-E5-E7, E3-E6-E8 y E1-E4-E6
5.3.2. El electrodo Construí electrodos cuádruples. Para ello, usé una cánula de acero inoxidable
dentro de la cual inserté de 4 alambres de platino-iridio (75μm de diámetro)
recubiertos con teflón. La cánula estaba doblada en un extremo en un ángulo de 30-40
grados. Fijé los alambres con agar dejándolo enfriar por 24 horas para que
endureciera y de está manera fijar los alambres.
El diámetro de los electrodos me permitió colocarlos dentro de la cánula
sobresaliendo aproximadamente 0.05 mm de ella, por lo que al implantarlos quedaban
dentro del cerebro pasando la vaina de tejido conectivo (Figura 5.5).
Figura 5.5. Diagrama del electrodo cuádruple.
5.4. Manipulación Para poder determinar si las ondas de sueño se originan y diseminan a partir
del complejo central del cerebro fue necesario reducir la actividad de esta región. Ello
lo conseguí mediante enfriamiento de la misma como relato a continuación.
16
5.4.1. Preparación biológica Después de anestesiar los animales con frío (30 minutos), hice una
perforación en el caparazón, separé y retraje los músculos con un separador de
plástico, para tener acceso al cerebro.
Después fijé al acocil un soporte metálico por medio de un corcho pegado a la
cara lateral del caparazón dorsal del acocil. A continuación, bajo control microscópico,
coloqué el electrodo múltiple sobre el cerebro utilizando un micromanipulador,
asegurándome de que las puntas penetrarán la vaina que cubre el cerebro y que la
guarda formará un sello sobre la superficie del tejido, de tal manera que el registro
proviniera ya no de la superficie del cerebro sino de la porción interna del mismo.
Finalmente, bañé la preparación con solución salina de van Harreveld (NaCl 205mM,
KCl 5.4mM, MgCl2 2.6mM, HEPES 5mM; van Harreveld, 1936) a temperatura
ambiente (aproximadamente 21 ºC).
Con está preparación pude obtener registros de varias zonas del cerebro, hice
el registro control durante media hora y después procedí a enfriar una región cerebral.
Para ello, tomé el electrodo que se encontraba en dicha región y en serie
coloque una malla de cobre (buen conductor), la cual metí en agua-hielo
(aproximadamente 4ºC), estos registros tuvieron una duración de 30 minutos. Al
término de cada registro cerraba el orificio con parafilm (American Can Co.,
Greenwich, CT) y regresaba a cada acocil a un acuario independiente, para su
recuperación.
5.4.2. El electrodo Para este tipo de preparación utilice el mismo electrodo diseñado para el
mapeo cerebral (Figura 5.5).
5.5. Análisis de los registros de actividad eléctrica cerebral. Para el análisis en tiempo-frecuencia de las señales cerebrales, utilicé
transformada wavelet (TW). Elegí segmentos de la señal recogida sin importar su
grado de estacionariedad.
Para el análisis con representación Wavelet utilicé un algoritmo diseñado en el
laboratorio, que calcula la TW de una serie de tiempo f(n) con N=o,…N; donde N es el
número de puntos en la serie de tiempo con un espaciamiento; este algoritmo se basa
en:
∑ ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ −
=N
n atbnnfabfW δψψ
)()(:),( Ec. 5.1
17
usando una ventana Morlet definida por:
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛= −−
ab-tos)( 2/)(
,
2
cet ajbtabψ Ec. 5.2
Se seleccionó una Wavelet madre, para este caso la Morlet (Figura 5.5) debido
a que es no-ortogonal (lo que permite observar cambios suaves y continuos en la
potencia) y compleja (mejor adaptada para capturar cambios oscilatorios), además de
presentar características similares a la señal de registro extracelular del cerebro del
acocil (Mendoza-Ángeles, 2008).
Figura 5.5. Función Morlet (Modificada de Goswami y Chan, 1999).
18
19
6. RESULTADOS 6.1. Estudio de la anatomía del Sistema Nervioso Central del Acocil Para estudiar los principales detalles anatómicos del cerebro del acocil trabajé
con acociles adultos Procambarus clarkii, de aproximadamente 8-10 cm rostrum –
telson, muertos recientemente y con preparaciones vivas anestesiadas, el método de
anestesia consiste en colocar al acocil en un recipiente con hielo hecho escarcha y
meterlo al refrigerador por al cabo de 30 minutos aproximadamente.
Con el primer tipo de preparación pude extraer cerebros completos los que
analicé bajo el microscopio estereoscópico comparándolos con trabajos ya publicados
(Sandeman y cols., 1992).
Sin embargo las preparaciones vivas me permitieron identificar las mismas
regiones pero en los momentos que anteceden a la implantación del electrodo (Figura
2.6).
6.2. Preparación deambulante Antes de implantar los electrodos en una preparación no deambulante, fue
necesario aprender a implantar exitosamente electrodos fijos en preparaciones
deambulantes y tener un 60 % de sobrevivencia a de los animales después de la
cirugía, para poder hacer análisis de registros conductuales y electrofisiológicos.
6.2.1. Análisis de los registros conductuales En condiciones de laboratorio es posible encontrar a un acocil en cualquiera de
dos conductas. En la primera el animal se encuentra deambulando por el acuario por
periodos variables (Figura 6.1A), responde a estímulos externos y explora el entorno.
En la segunda, el acocil se pone de lado durante periodos variables (Figura 6.1B).
Como este animal no flota, para ponerse de lado coloca las patas ambulatorias de un
lado del cuerpo sobre la pared del acuario y se apoya en las patas contralaterales, las
cuales se encuentran en el fondo del acuario. Las quelas quedan péndulas, las
antenas se relajan y yacen fláccidas hacia el fondo del acuario y las anténulas se
mantienen inmóviles y relajadas.
(Figura 6.1B). La actividad locomotriz de un acocil muestra una fuerte relación
con los ciclos de luz y oscuridad. En animales sincronizados a ciclos de 12 horas de
luz por 12 horas de oscuridad, la actividad locomotriz incrementa significativamente en
las transiciones luz-oscuridad y oscuridad-luz (Ramón y cols., 2004).
Figura 6.1. Acociles inmóviles. A) Dos animales parados y B) Un acocil de lado.
Como previamente fue reportado (Mendoza-Angeles y cols., 2007; Ramón y
cols., 2005), la duración de estos periodos es muy variable (Figura 6.2). Para ilustrar
los registros conductuales, elaboré una gráfica usando una técnica ya publicada
(Mendoza-Angeles, 2008) la cual consiste en asignar un valor de 0 para la posición de
parado y de 1 para la posición de lado, y correlacionarlas con la hora a la que inició y
terminó cada una de ellas.
Figura 6.2. Posición de un acocil durante el ciclo de 24 horas (La barra oscura
indica las horas de oscuridad); modificada de Mendoza-Ángeles, 2008.
6.2.2. Análisis de los registros eléctricos Al hacer la comparación entre la conducta y la actividad cerebral del acocil
encontré que cuando el acocil se encuentra en estado de alerta (parado) muestra una
actividad eléctrica conformada por múltiples espigas montadas en una línea basal
plana (Figura 6.3A). El tipo de actividad eléctrica es similar entre protocerebro y
deutocerebro, no así en tritocerebro donde predominan ondas muy lentas que
corresponden a la actividad respiratoria de los escafognatitos (Figura 6.3A, Ramón y
cols, 2004).
Al cambiar a la posición de lado (Figura 6.3B), la actividad registrada en
protocerebro o en deutocerebro se modifica, reduciéndose la cantidad y amplitud de
las espigas y apareciendo ondas lentas con frecuencias alrededor de 15 Hz.
20
Figura 6.3. Actividad eléctrica del cerebro del acocil A) Parado y B) De lado.
P=Protocerebro, D=Deutocerebro y T=Tritocerebro.
6.2.2.1. Análisis tiempo-frecuencia En el laboratorio se hizo un estudio previo de parámetros estadísticos para
acociles alerta y dormidos, con el fin de verificar si las señales registradas de la
actividad eléctrica del acocil era de tipo estacionario o no y, de esta manera tomar la
decisión de sobre con que transformada hacer el análisis dicha actividad, de tal
manera que nos mostrarán la mayor cantidad de información sobre los estados
cerebrales presentes en el acocil.
Los estudios realizados con la media y la desviación estándar móviles (Figura
6.4), como se pude observar en las gráficas resultantes, indicaron que tanto para el
acocil parado como de lado, la señal tiene variaciones con respecto al tiempo, pero
con algunos segmentos en los que la señal se mantiene constante, que reciben el
nombre de segmentos cuasi-estacionarios. Esto confirmó que las señales registradas
de la actividad cerebral del acocil para ambos estados son no estacionarias.
21
Figura 6.4. Media y desviación estándar móviles de la actividad
eléctrica del acocil parado (A) y de lado (B), de Mendoza-Ángeles, 2008.
Transformada de Fourier en corto tiempo (TFCT). Sin embargo como ya
explique antes la TFCT esta diseñada para análisis de señales no estacionarias por lo
que la apliqué se le aplicó sólo a los segmentos cuasi-estacionarios y se obtuvieron los
siguientes espectrogramas Figura 6.5.
Figura 6.5. Espectrograma con TFCT de la actividad correspondiente al acocil parado (A) y de lado
(B). Nótese que la potencia para todas las frecuencias disminuye cuando el acocil está de lado, tomada de Mendoza-Ángeles, 2008.
22
23
Se utilizaron diferentes longitudes de ventana (128, 256, 512 y 1024 muestras
respectivamente) y se graficaron sus espectrogramas correspondientes. Se Trabajó
con frecuencias de 0 a 60 Hz, el tiempo en segundo, mientras que la potencia la se
graficó mediante un código de color de acuerdo al espectro natural de la luz visible.
Podemos observar como es que la resolución varía con respecto al número de
muestras que limitan la ventana (Figura 6.5).
En los espectros se observan líneas horizontales y las líneas verticales, que
indican componentes de frecuencia y tiempo respectivamente. De acuerdo con estas
gráficas, la ventana que produce mejor resolución para las frecuencias de interés (0 a
60 Hz) es la de 256 muestras para el caso del acocil parado y de 512 muestras para el
animal de lado. Al hacer una comparación entre el espectro del acocil parado con el
del acocil de lado, se ve con claridad como es que para todas las ventanas, no
importando el número de muestras, disminuye la potencia significativamente.
Sin embargo en estas gráficas no es posible observar cambios de transición de
un estado a otro, esto indica que la TFCT no nos ayuda a analizar los segmentos
cuasi-estacionario de la señal adquirida. Y la resolución que nos brinda no es la mejor,
ya que es necesario fijar un ancho de la ventana.
Transformada Gabor. Por las características de esta transformada es posible
hacer un mejor análisis, ya que como sabemos con ella tenemos una reducción al
mínimo del principio de incertidumbre (Goswami y Chan, 1999).
Para saber si me sirve el análisis de las señales con está transformada, se
obtuvieron espectrogramas similares a los obtenidos con la TFCT, mediante un
algoritmo de la misma diseñado en el laboratorio.
En el espectrograma del acocil parado se observan potencias altas,
principalmente en la banda de 0 a 10 Hz y algunas transiciones representadas por
líneas verticales (Figura 6.6A)
Figura 6.6. Espectrograma con transformada Gabor de la actividad correspondiente al acocil
parado (A) y de lado (B). Nótese que la potencia para todas las frecuencias disminuye cuando el acocil está de lado.
Es claro el decremento en la potencia a todas la frecuencias cuando el acocil
cambia de estado alerta (Figura 6.6A) al de dormido (Figura 6.6B). Las gráficas qus se
obtuvieron indican variaciones en la banda de 0-10 Hz, en las que la potencia ya no
permanece constante, por lo que los eventos transitorios se localizan con mayor
precisión.
Este análisis resulto tener mejor resolución que el de la TFCT, pero sigue
teniendo las mismas limitaciones que la anterior, ya que se requiere limitar el ancho de
la ventana, con un cierto número de muestras.
Nota: me permití tomar los resultados anteriores, obtenidos por Mendoza-
Ángeles, 2008, con el fin de fundamentar el tratamiento de las señales que obtuve con
la wavelet.
Transformada Wavelet (TW). Puesto que los análisis anteriores demuestran
que la actividad eléctrica del cerebro del acocil es de carácter no estacionario resulta
necesario usar un análisis no lineal para obtener información sobre la dinámica de
aparición de las ondas de sueño en este crustáceo. Como previamente lo relaté, las
bases para este análisis fueron desarrolladas en el laboratorio y para mis
experimentos modificamos algunos parámetros para poder estudiar segmentos de
diferentes duraciones y con límites de frecuencias un poco mayores.
24
Del análisis con TW obtuve gráficas tridimensionales que incluyen tiempo,
frecuencia (sólo la banda de 0-60 Hz) y potencia (codificada en color usando el
espectro de la luz visible).
La TW de la actividad eléctrica cerebral correspondiente al acocil parado,
muestra la relación entre las frecuencias del registro eléctrico del cerebro (30-45Hz),
su potencia y el tiempo durante el cual se realizó el registro (Figura 6.7).
En protocerebro, se observa una actividad constante a lo largo del tiempo, las
frecuencias dominantes están alrededor de los 30 y 8 45 Hz, y una más alrededor de
los 25 Hz. También es posible observar cambios transitorios al inicio del segmento.
Por otro lado en deutocerebro la actividad es más regular, alrededor de la
banda de los 25 Hz (que nos muestra la gráfica de contorno) la potencia es más alta
comparada con del caso protocerebro.
Figura 6.7. Gráficas tridimensionales y de contorno de la transformada wavelet, de la actividad
eléctrica de protocerebro y deutocerebro correspondientes al acocil parado.
Para la actividad cerebral que corresponde al acocil de lado, las gráficas de TW
(Figura 6.8) muestran un descenso en la potencia que es claro para todas las
frecuencias y para las dos regiones (protocerebro y deutocerebro).
25
Es posible observar que en el protocerebro se localizan grandes depresiones
en la banda 30-45 Hz. Pero en deutocerebro también se observan dichos cambios,
donde los valores de las potencias tienden a bajar más. Es posible observar estas
depresiones en ambas regiones cada vez que el animal adopta la posición de lado.
Figura 6.8. Gráficas tridimensionales y de contorno de la TW de la actividad eléctrica de
protocerebro y deutocerebro, correspondientes al acocil de lado. Nótese la reducción en la potencia para todas las frecuencias en ambas regiones. Compárese con las figuras 7.9 y 7.10.
Las gráficas anteriores me permiten decir que las ondas lentas o depresiones
aparecen primero en deutocerebro y después se expande al protocerebro.
6.3. Mapeo cerebral Los resultados obtenidos recientemente demuestran que la actividad eléctrica
producida por el sueño da inicio en deutocerebro y se transmite a protocerebro; por
esta razón fue necesario hacer un mapeo de las diferentes regiones del cerebro para
tener una idea de la dinámica del sueño desde el punto de vista electrofisiológico. Para
este caso se diseñé un electrodo múltiple, que me permitiera registrar diferentes
regiones cerebrales simultáneamente y recurrí nuevamente a la preparación del acocil
26
suspendido, ya que como mencione anteriormente, además permite la visualización
total del cerebro.
6.3.1. Registros En el laboratorio fue desarrollada una preparación de acocil suspendido
(Mendoza-Angeles, 2008) que permite tener fácil acceso al cerebro y modificar la
posición de los electrodos. Se ha demostrado que un acocil suspendido es capaz de
dormir y fue durante los periodos de sueño que pude cambiar la posición de los
electrodos, registrar de diferentes regiones y enfriar algunas con el propósito de
determinar los orígenes de las ondas lentas y la dinámica de su propagación.
En la figura 6.9 muestro los registros eléctricos correspondientes a la actividad
del cerebro en las regiones principales del cerebro del acocil cuando esta alerta; y la
señal es muy parecida a la registrada en los animales deambulantes.
El registro del protocerebro superior lateral (E1 y E2), está caracterizado por
espigas sobrepuestas en una base plana y, el protocerebro medio superior se
observan más espigas.
El complejo central registra ondas de baja frecuencia con una gran cantidad de
espigas de diferentes amplitudes. Esas ondas se presentan en deutocerebro aunque
con espigas de tamaños regulares.
Por último en tritocerebro hay pocas espigas sobre una onda de baja
freceuncia (alrededor de los 3 Hz).
Figura 6.9. Actividad eléctrica del cerebro del acocil alerta. Las posiciones de los electrodos son
las mismas de la figura 5.3.
27
Por otra parte en el acocil "dormido" se modifica la actividad eléctrica de las
regiones registradas, de tal manera que en el protocerebro superior, tanto lateral como
medio, disminuye la amplitud de las espigas. En deutocerebro, además de una
disminución similar, aparecen ondas de baja frecuencia. En el complejo central y en
tritocerebro no hay cambios significativos (Figura 6.10).
Figura 6.10. Actividad espontánea del cerebro del acocil dormido. Las posiciones de los electrodos
son las indicadas en la figura 5.3.
6.3.2. Transformada wavelet El análisis con transformada wavelet de las señales obtenidas de la
preparación no deambulante confirma resultados previamente obtenidos.
28
a) b)
E1
E2
E4
E5
E7
a) b)
E1
E2
E4
E5
E7
Figura 6.11. Graficas 3-D de la transformada Wavelet de la actividad eléctrica registrada en varias regiones del cerebro de acociles, a) alerta y b) dormido. Las posiciones de los electrodos son las
indicadas en la figura 5.3.
En el protocerebro superior lateral del animal alerta hay una actividad muy
regular, con potencias altas que disminuyen cuando el acocil está dormido. En el
protocerebro superior medio, la actividad es también muy regular, con potencias altas
que no cambian cuando el acocil está dormido. En el cuerpo central la actividad de
muy baja frecuencia es regular y alrededor de los 30-45 Hz se presentan las caídas en
29
potencia características del sueño, las que aparentemente están presentes en todo
momento, aunque son más pronunciadas cuando el acocil está dormido. Cuando el
acocil está alerta, la actividad eléctrica del deutocerebro es muy similar a la del
protocerebro superior, pero cuando el acocil está dormido, aparecen depresiones
alrededor de 30-45 Hz.
Por último, en tritocerebro la potencia es muy alta para las frecuencias más
bajas, alrededor de los 5 Hz, y permanece elevada cuando el acocil está dormido; el
cambio más significativo en esta región es un aumento en la homogeneidad de la
potencia de este intervalo de frecuencias (Figura 6.11).
6.4 Manipulación de la actividad del complejo central: efectos del enfriamiento. Los resultados anteriores me dicen que el complejo central es el que origina las
ondas lentas y al parecer el que inicia con la sincronización de la actividad de las
demás regiones del cerebro del acocil. Para demostrar esto modifique la preparación
del acocil suspendido y ocupando el mismo electrodo múltiple, enfrié zonas especificas
(Figura 6.12) y registré la actividad, después comparé registros control, con registros
de las zonas enfriadas, analizando los resultados obtenidos.
Figura 6.12. Posición de los electrodos, con un tache
se encuentra marcada la zona enfriada
6.4.1. Registros Los registros muestran que dependiendo de la región enfriada hay cambios en
las regiones adyacentes a esta.
En el registro control, antes de enfriar alguna región (Figura 6.13A), observe
que la señal de protocerebro y deutocerebro son similares, muestran numerosas
espigas de amplitud variable y con algunas oscilaciones, mientras que en el complejo
30
central las espigas disminuyen, al igual que su frecuencia y amplitud, y se observa una
señal
oscilante.
Figura 6.13. Registros eléctricos A) control, B) después de enfriar el complejo central.
Las posiciones de los electrodos son las indicadas en la figura 6.12.
Sin embargo, cuando se enfría el complejo central (Figura 6.12), se ve
claramente que la señal de protocerebro se regulariza un poco, pero las espigas
aumentan de amplitud, no así en deutocerebro, donde la señal disminuye en
frecuencia, amplitud y número de espigas, haciéndose regular.
Pero algo muy interesante sucede en el complejo central, las señal deja de
oscilar y disminuyen las espigas (Figura 6.13B).
6.4.2. Análisis con la transformada Wavelet Al hacer una comparación de las wavelets de los registros control (Figura
6.14A) con las de los registros con enfriamiento (Figura 6.14B), me percaté de que la
potencia de la señal de protocerebro aumentó, de forma ligera, para las frecuencias
comprendidas entre 5 y 35 Hz. Hay que hacer notar que, para la frecuencia de 15 Hz,
no hubo aumento, por el contrario, fue persistente una disminución en la potencia de
esta frecuencia.
En deutocerebro se observa que la señal conserva el mismo patrón antes y
después del enfriamiento, pero con una disminución en la potencia de todas las
frecuencias exploradas.
31
Figura 6.14. Gráficas 3-D de las Transformada Wavelet de las señales de varias regiones del
cerebro, A) control y B) después de enfriar el complejo central. Las posiciones de los electrodos se muestran en la figura 6.12.
En el complejo central, las oscilaciones desaparecen por completo y solamente
son evidentes espigas de diferentes amplitudes. Es de suponer que estas espigas
estuvieron presentes todo el tiempo y que se hicieron evidentes al momento de
cancelar las ondas lentas. Resulta notable, sin embargo, que la amplitud de las
espigas remanentes sea similar a lo observado en las otras regiones del cerebro del
acocil. Se requieren más experimentos para explicar este resultado.
32
33
7. DISCUSIÓN
7.1. Identificación de estados cerebrales Fue posible distinguir dos estados cerebrales, el de vigilia caracterizado por
una actividad cerebral formada por múltiples espigas de amplitud variable montadas
sobre una línea basal plana (Hernández y cols., 1996), el animal deambula por el
acuario, moviendo las antenas o realizando labores de limpieza; el estado de sueño se
caracteriza por ondas lentas de baja frecuencia y amplitud, desaparición de espigas
(Ramón y cols., 2004), y una posición típica, de lado a nivel de la superficie del agua.
El análisis realizado me permitió caracterizar la actividad cerebral de las
diferentes áreas estudiadas y evaluar los efectos que tiene la reducción de la actividad
de regiones circunscritas, inducida por el frío, sobre el sueño de este invertebrado.
7.1.1. Análisis con transformada wavelet Como mencioné anteriormente, el estudio de la actividad eléctrica con los
métodos estadísticos me avalan para decir que dicha señal es no estacionaria pero
que segmentos son cuasi-estacionarios.
Elegí la función Morlet como wavelet madre ya que se asemeja a la forma de
señal de la actividad eléctrica cerebral del acocil.
Las propiedades que muestra a la TW la hacen sensible a los cambios en
frecuencia, tiempo y potencia, y esto lo podemos confirmar en las gráficas 3D, que me
muestran cambios importantes en el patrón de la señal cuando el acocil esta alerta,
donde vemos potencias altas a las frecuencias muestreadas y de cuando el acocil esta
dormido, la gráfica es reemplazada por una en la que observamos huecos, que indican
disminución en la potencia entre las frecuencias de 30 y 45 Hz, mientras que las
ondas lentas se ven como ondas entre las frecuencias de 15 a 20 Hz reportadas
(Ramón y cols., 2004) y, también se pueden observar con claridad las transiciones de
un estado a otro con muy buena resolución.
7.2. Mapeo cerebral
7.2.1. Preparación de acocil suspendido La preparación del acocil suspendido (Mendoza-Ángeles y cols., 2008),
diseñada en el laboratorio, me permitió hacer un estudio exhaustivo de la actividad
eléctrica del cerebro del acocil, tanto en estado de vigilia como de sueño y tratar de
para responder a las preguntas que me llevaron a hacer dicho estudio, respecto al
origen de las ondas lentas, de que si los cambios en la actividad eléctrica ocurren en
todo el cerebro del acocil o existe un sitio específico donde inicien y la secuencia de
34
propagación de la misma, de manera que pueda tener una idea de la dinámica del
sueño desde el punto de vista electrofisiológico.
En la preparación de acocil suspendido el animal se observan dos estados
conductuales, y lo más importante es que ahora podemos decir que el acocil duerme y
que los registros eléctricos son similares a los obtenidos en la preparación
deambulante en ambos estados.
La transformada wavelet de la actividad eléctrica del cerebro de acociles
suspendidos en estado de vigilia es muy similar a la obtenida de animales
deambulantes alertas, la única diferencia es que las espigas son de mayor amplitud y
más numerosas en la preparación de acocil suspendido, esto puede deberse a que los
electrodos atraviesan la vaina de tejido conectivo. Y en el estado de sueño son más
notorias las potencias bajas y oscilaciones en el complejo central.
7.2.2. Secuencia de sincronización del cerebro durante el sueño La preparación de acocil suspendido me permitió además registrar
simultáneamente tres o cuatro áreas del cerebro y por lo tanto establecer una
secuencia aproximada en que ocurren los cambios cuando el acocil duerme: Las
ondas lentas con frecuencias entre los 15 y 20 Hz y la depresión en potencia en las
frecuencias de 30 a 45 Hz están presentes en el complejo central independientemente
del estado cerebral del acocil, de esta área se “propagan” al deutocerebro y finalmente
al protocerebro posterior medio.
7.3. Origen de las ondas lentas Conforme al lo observado en los experimentos anteriores, en el complejo
central siempre presenta ondas lentas, que en el caso del estado de sueño son
propagadas y sincronizadas a las demás regiones del cerebro del acocil.
En el acocil no hay datos que indiquen el origen de las ondas lentas, pero las
dendritas están en la vecindad de grandes cantidades de glía (Sandeman y cols.,
1992) y podría especular que existen interacciones similares entre glía y neuronas a
través de ondas de calcio que resulten en ondas lentas en la actividad eléctrica del
cerebro del acocil (Mendoza-Ángeles, 2008).
7.4 Manipulación de la actividad del complejo central: efectos del
enfriamiento. Los experimentos que realicé me permiten decir que el complejo central en el
acocil es un oscilador, el cual sincroniza la actividad de las demás regiones del
cerebro cuando este se encuentra en el estado de sueño.
35
Al enfriar esta región las ondas lentas desaparecen y por tanto en el resto del
cerebro no se presentan, lo que pudiera decirnos que cuando no hay ondas lentas el
acocil no duerme.
Sin embargo no hay antecedentes que sustenten lo que obtuve en este parte
del trabajo, por lo que sólo queda como una hipótesis.
36
8. CONCLUSIONES
• La transformada Wavelet nos brinda información importante sobre la actividad
eléctrica del cerebro del acocil, que con otros métodos de análisis como la
TFCT y la transformada Gabor no nos permiten observar.
• El sueño de ondas lentas en el acocil se caracteriza por una reducción en la
potencia de la banda de frecuencias entre 30 y 45 Hz, desplazándose de
deutocerebro a protocerebro.
• El acocil suspendido es una preparación que permite hacer un mapeo de las
regiones cerebrales, comprobándose que el animal duerme ya que presenta
las mismas características que cuando colocamos electrodos fijos en el
cerebro.
• Pareciera que el complejo central funciona como un oscilador que es
independiente del estado cerebral del animal. Cuando el acocil duerme este es
el que origina las ondas lentas en las regiones adjuntas a este. • Cuando se enfría el complejo central este deja de oscilar, y por lo tanto no se
presentan oscilaciones en las demás regiones del cerebro.
37
9. REFERENCIAS
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