subcelluläre verteilung von noradrenalin und adrenalin im meerschweinchenherzen

Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Path. u. Pharmak. 249, 251--266 (1964)

Aus dem Pharmakologischen Institut der Universit~t Frankfurt (Main) (Direktor: Prof. Dr. P. HOLTZ)

SubeelluHire Verteilung yon Noradrenalin und Adrenalin im Meerschweinchenherzen* ** ***

Yon H. J. SCHUMANN~ K. SCHNELL und A. PHILIPPU

Mit 5 Textabbildungen

(Eingegangen am 27. Juni 1964)

Das Herz aller bisher untersuchten Situgetiere, auch das des Menschen, enth~lt neben kleinen Mengen Adrenalin Noradrenalin als sympathischen ~bertr£gerstoff (v. EULER; HOLTZ, KRONEBERG U. SCHI)MANN, McGooD- ALL; HSKFELT). Wie in anderen sympathisch innervierten Organen kann aueh im Herzen Noradrenalin gebildet werden. An isolierten, durchstrSmten Kaninchenherzen z .B. konnten MUSACCHIO U. GOLD- STETS die Synthese von Noradrenalin aus 14C-Tyrosin direkt nachweisen. Es besteht eine charakteristische Verteilung der Amine auf die einzelnen Herzabsehnitte. Der hSchste Amingehalt wird in den Vor- hSfen, besonders im reehten Vorhof gefunden; aueh die rechte Kammer enth~lt mehr Amine als die linke und das Kammersep tum (Mvsc~oLL; KLOUI)A). Mit Hiffe einer histologisehen Fluorescenzmethode zeigten ANGELAKOS, FUXE u. TORCHIANA, dab der Amlugehalt der verschiedenen Herzabschnitte gut mit ihrer unterschiedlich starken, sympathisehen Innervat ion fibereinstimmt. Es wird deshalb angenommen, dab das Noradrenalin des Herzens vorwiegend in den postganglion~ren, sympathischen Nerven lokalisiert ist. Dafiir sprechen auch chronisehe Denervierungsversuche: das Herz verliert nach postganglion£rer, sympathischer Denervierung, die bekanntlich mit einer Degeneration der sympathischen Fasern einhergeht, mehr als 850/0 seiner Amine (McGooI)ALL).

Wenn das Noradrenalin des Herzens haupts~ehlich in den postganglioniiren, sympathischen Nervenfasern vorkommt, so mfil3te es,

* Herrn Prof. Dr. O. KRAY~R zum 65. Geburtstag gewidmet. ** Uber einen Teil der Ergebnisse wurde bereits auf der Tagung der Deutschen

Pharmakologischen Gesellschaft in Wien, September 1962 berichtet [Naunyn- Schmiedebergs Arch. exp. Path. Pharmak. 245, 97 (1963)].

*** Ausgeffihrt mit Unterstiitzung der Deutschen Forschungsgemeinschaft.

252 H. J. SC~tYMA~, K. SCHNELL ulld A. PHILIPPU:

~hnlich wie in den sympath ischen Milznerven, zum gr6Bten Teil in be-

sonderen Organellen, sogenannten Granula, gespeichert sein. Unte r -

suchungen y o n WEGMANN U. KAKO an t Iundeherzen sowie y o n P O T T E R

u. AX~L~OD (1962 und 1963) an Ra t t enhe rzen habcn ergeben, dab ein

groBer Tell der Brenzca tech inamine part ikul i i r gebunden ist.

I n der vor l iegenden Arbe i t wird die subcellul~re Ver te i lung yon

Noradrena l in und Adrenal in in H o m o g e n a t e n yon Meerschweinchen-

herzen untersucht . Die Eigenschaf ten der durch Different ialzentr i fugieren gewonnenen Granula wurden mi t denjenigen yon Milz- und

Nebennie renmark-Granula verglichen.

Methodik 1. Herstellung der Homogenate. Die den durch Nackenschlag getSteten Meer-

schweinchen entnommenen Herzen wurden direkt in eiskalte, 0,3 M SaccharoselSsung gegeben. So blieben die Herzen nach wenigen Schl~gen, ohne dal~ Herzflimmern auf- trat, stehen und waren weitgehend blutleer. Darauf wurden Pericard und Gef~13- stfimpfe abpri~pariert, das Herz aufgeschnitten, mit Flie•papier abgetupft und ge- wogen. Je 3 g Herzgewebe wurde unter 3 ml eiskalter 0,3 M SaccharoselSsung 5 min mit der Sehere zerschnitten und 9 ml SaccharoselSsung zugesetzt, so da~ auf 1 Tell Gewebe 4 Teile Saeeharosel5sung kamen, und mit einem Ultra-Turrax (Fa. Jahnke & Kunckel, Staufen i. Br.) 15 see homogenisiert. Anschliei~end wurde durch weitere Zugabe yon SaccharoselSsung das Homogenat auf insgesamt 1 : 10 verdiinnt. Fiir jeden Versuch wurden 9--15 g Herzgewebe verwendet.

2. Extraktherstellung. Die dureh Differentialzentrifugieren der Homogenate gewonnenen Sedimente wurden mit 0,4 n Perchlors~ure -- Sediment 2000 g mit 80 ml, Sediment 15000 g und 100000 g mit je 20 ml -- und der Oberstand 100000 g mit 0,38 ml 70°/0iger HCIOJ10 ml versetzt. Ffir die Gewinnung von Extrakten aus Herzgewebe, das nicht fraktioniert werden sollte, wurde das Gewebe naeh Pre- paration und Einwaage nicht unter SaccharoselSsung, sondern sofort unter der fiinffachen Menge 0,4 n HCIO 4 zerschnitten und mit dem Ultra-Turrax homogenisiert. Nach 30 min langem Stehen bei 4 ° C wurden die Extrakte zentrifugiert, der Niederschlag nochmals mit der ffinffachen Menge Perchlors~ure extrahiert, erneut zentrifugiert und die ~berst~nde vereinigt. In den Niederschl~gen wurde der Eiweii~gehalt naeh KJELDAtIL bestimmt.

3. Adsorption der Brenzcatechinamine an Aluminiumoxyd. Vor der Adsorption wurden die perehlorsauren Extrakte mit 20°/0iger KaliumearbonatlSsung auf pH 4,0 gebracht und das in der K~lte ausgefallene Kaliumperchlorat abzentrifugiert. Zu je 10 ml Extrakt wurden 0,25 g Aluminiumoxyd und 0,1 g EDTA gegeben, der Extrakt mit 2% iger Natronlauge unter st~ndigem Riihren auf pH 8,5 gebraeht und 7 min auf diesem pH gehalten. Danach wurde das Aluminiumoxyd abfiltriert und die adsorbierten Brenzcatechinamine mit 1 ml 0,25 n Salzs~ure/10 ml Extrakt eluiert.

Die Ausbeute bei Adsorption aus Wasser betrug bei 25 Versuchen mit Kon- zentrationen von 25 ng -- 100 ng/ml im Mittel 63,6 ± 1,3°/o (mittlerer Fehler des Mittelwertes) ffir Adrenalin und 60,0 ± 1,4°/0 fiir Noradrenalin, in (~bereinstim- mung hiermit der ,,Internal Standard" fiir Noradrenalin 62,8°/0. In der vorliegenden Arbeit wurden die niehtkorrigierten Werte angegeben.

4. Bestimmung der Brenzcatechinamine. Der Noradrenalin- und Adrenalingehalt der Eluate wurde mit einer modifizierten Fluorescenzmethode in Anlehnung an

Eigensehaften noradrenalinhaltiger Herzgranula 253

v. EULrR U. FLODI~G bestimmt. Die Fluorescenz wurde durch monochromatisches Licht von 365 bzw. 436 m# Wellenltinge angeregt und mit Hilfe eines Zeiss-Spektral- photometers PQM I I m i t Fluorescenzzusatz ZFM 4 gemessen. Das fluorescenz- anregende Licht wurde durch Sperrfilter (Fa. Schott & Gem : Filter GG 13 bzw. VG 5, 2 mm GlasstKrke) abgefangen.

5. Inkubation. Granula aus 2 g Meerschweinchenherz, 2 g Rindermilznerven bzw. 70 mg Rindernebennierenmark wurden durch Differentialzentrifugieren ge- wonnen (siehe auch SCI~i~MANN U. WEmMA~; SCHtiMANN 1958a) und in 3,5 ml isotonischer SaccharoselSsung (0,3 M mit NaOH auf pH 6,8 eingestellt) suspendiert. Die Granula der nicht inkubierten Kontrollans~tze (0 ° C, 0 min) wurden sofort durch 30 min langes Zentrifugieren mit 15000 g bei Nebennierenmark-Granula, 30000 g bei Nervengranula und durch 45 min langcs Zentrifugieren mit 100000 g bei Herzgranula nicdergeschlagen, 4er (~berstand abgegossen und die sedimentierten Granula mit 3 ml 0,4 n Perchlorsiiure 15 min lang extrahiert. Die Kontroll- ans~tze und die Versuchsans~tze wurden in 25 ml ErlenmeyerkSlbchen bei 22 ° C unter st~ndigem Sch/itteln (Frequenz 100/min) inkubiert, nach der Inkubation sofort auf 0°C abgekiihlt, quantitativ in ZentrifugenrShrchen iibertragen, die Granula mit entsprechender g-Zahl abzentrifugiert und ebenfalls mit Perchlors~ure extrahiert. Der Brenzcatechinamingehalt wurde bei Nebennierenmarkgranula colorimetrisch nach v. EULER U. HAMBERG, bei Herzgranula und Nervengranula fiuorimetrisch nach v. EULER U. FLODING bestimmt. Bei Extrakten aus Herz- granula wurden die Brenzcatechinamine vor der fluorimetrischen Bestimmung an Aluminiumoxyd adsorbiert, bei Nebennierenmark- und Nervengranula dagegen konnten sie ohne vorherige Adsorption an Aluminiumoxyd gcmessen werden.

6. Verwendete Substanzen. Aluminiumoxyd Aktivit~tsstufe II dcr Fa. Giulini; Calcium und Magnesium als Chloride, EDTA (~thylcndiamintetraessigs~ure) als Dinatriumsalz der Fa. Merck; Ribonuclease der Fa. Worthington, New Jersey; Reserpin: Scdaraupin der Fa. Boehringer, Mannheim; Segontin [N-(3'-Phenyl- propyl-(2'))-l,l-diphenyl-propyl-(3)-amin] als Segontinlactat der Fa. Farbwerke Hoechst; Guanethidin (Ismelin) der Fa. Ciba A.G., Basel. Ffir die l~berlassung yon Sedaraupin, Segontin und Ismelin danken wir den Herstellerfirmen.

Ergebnisse I. SubcellulSre Verteilung der Brenzcatechinamine des Herzens

1. Normalverteilung der Gesamtbrenzcatechinamine. 9- -15 g Herz- gewebe je Versuch wurden, wie bereits beschrieben, homogenisiert u n d die t tomogena te durch Differentialzentrifugieren fraktioniert . Durch 30 min langes Zentr i fugieren mi t 2000 g wurde ein grobpart ikul~res Sediment abge t rennt , das aus Gewebsfragmenten, Blutzel len und Zell- kernen besteht . Der ~]berstand 2000 g wurde durch Differentialzentri- fugieren weiter aufge t rennt : dabei wurde jeweils der beim vorangehenden Zentrf fugat ionsgang gewonnene l~bers tand mi t hSherer g-Zahl - - 15000 g, 30000 g, 60000 g, 100000 g u n d 150000 g - - 20 mi n zentr i fugier t u n d das entsprechende Sediment abget rennt . I n den so erhal tenen f/ inf Sedimenten sowie im Ube r s t and 150000 g u n d im Gesamthomogena t wurden Amine u n d EiweiB bes t immt u n d der Amin-Eiweil~quotient (ng/mg) errechnet (Abb. 1).

254 H. J. SCHi)MANN, •. SCHNELL uD, d A. PHILIPPU:

Ein hoher Amin-EiweiBquotient findet sieh in den Sedimenten 30000--150000 g, der hSchste im Sediment 60000 g. Demgegeniiber ist der Quotient in dem Sediment 15000 g und im Uberstand 150000 g niedrig und entspricht etwa demjenigen des Gesamthomogenates. Be- sonders niedrig ist er im grobpartikul~ren Sediment 2000 g. Der hohe

Amin/Eiweif] ng/mg

8O

?O

60

5O

4O

30

20

9,1 10

75

IIIII]111 60

38

11,6

Gesamt- Sed. Sed. Secl. Sed. Sed. Sed. (Jber- homogenat stand

2 15 30 60 100 150 150 xlOOOg

Abb. i. Amin-Eiwei#-Ouotient der dutch Di//erentialzentri]ugieren au~ Herzhomogenaten gewonnenen Fraktionen

Amln-EiweiBquotient der Sedimente 30000--150000 g spricht daffir, dab diese Partikel enthalten, in denen die Brenzcateehinamine spezifisch angereichert sind. Zur Gewinnung dieser Par~ikel haben wir in weiteren Versuehen die Sedimente 30000--150000 g zusammengefaBt, indem wir den (~berstand 15000 g 45 min mit 100000 g zentrifugierten und damit auch die Partikel sedimentierten, die bei 20 min 150000 g niedergeschla- gen werden.

Das Ergebnis der Amin- und EiweiBbestimmungen in den so erhalte- nen Fraktionen und im Gesamthomogenat des Herzens ist in der Tab. 1 dargestellt. Den grSBten Anteil der Amine und des EiweiBes mit entspreehend niedrigem Amin-EiweiBquotienten (7,1) finder man im Sediment 2000 g, das neben unspezifiseh adsorbierten Aminen aueh spezifiseh gespeicherte in solchen Partikeln enth~lt, die in grSBeren Gewebsfragmenten zuriiekgehalten werden. Da die in diesem Sediment

Eigenschaften noradrenalinhaltiger Herzgranula 255

enthaltenen Amine sich keinen bestimmten Strukturen zuordnen lassen, wurde in weiteren Versuchen das grobpartikul/~re Sediment nicht berficksichtigt. - - Einen hohen Amin- und niedrigen EiweiBgehalt hat das Sediment 100000 9- Es enth/~lt 230/0 der gesamten Amine und 490/0, wenn man das grobpartikul/~re Sediment 2000 g unberficksichtigt 1/~flt (Tab. 1). Dem hohen Amingehalt dieser Fraktion (249 ng/g) entspricht ein niedriger EiweiBgehalt (3,4 rag/g), so dab der Amin-EiweiBquotient

Tabelle 1. Verteilung yon Brenzcatechinaminen und Eiweifl au/ die durch Di//erentialzentri/ugieren gewonnenen Fraktionen de~ Meerschweinchenherzens

Die Werte sind pro g Herz (Frischgewicht) angegeben. Mittel aus 5 Versuchen und mittlerer Fehler des Mittelwertes. Die Zahlen in Klammern geben die prozentuale

Verteilung der Amine nach Abzug yon Sediment 2000 g wieder

Gesamt- homogenat

Sediment (2000 g)

Sediment (15000g)

Sediment (100000 g)

lJberstand (100000 g)

Summe der Fraktionen

Brenzcatechinamine

ng/g °/o

1175±114

599-4-38 54 (--)

69±12 6 (14)

249~:35 23 (49)

190±31 17.(37)

1107 100 (100)

EiweiB

mg/g

121,5 ± 2,8

83,8 ± 5,4

7,1 t 1,3

3,4 ± 0,2

21,2 ~= 0,6

115,5

°/0

73

6

3

18

100

n g Amin

mg Eiweil3

9,7

7,1

9,7

73,2

9,0

73,2 betr~gt, was ffir eine speziilsche Aminspeicherung in den par- tikuli~ren Elementen der Fraktion 100000 g spricht, - - ira Gegensatz zur Fraktion 2000 g mit einem Amin-Eiweil3quotienten von nur 7,1 (siehe Tab. 1). Die spezifisch schwereren Partikel der Fraktion 15000 g, in der sich bei der Fraktionierung von Nebennierenmarkhomogenaten der grbBte Tell der Amine fand (HILLARP, LAGERSTEDT U. NILSON), enthalten nur 6 bzw. 14°/0 der Brenzcatechinamine, -- mit einem ebenfalls niedrigen Amin-Eiweil3quotienten von 9,7.

2. Adrenalin- und Noradrenalingehalt der verschiedenen Fraktionen. Bestimmt man die Brenzcatechinamine Adrenalin und Noradrenalin im Gesamthomogenat des Herzens und in den einzelnen Fraktionen getrennt (siehe Methodik), so erhalt man eine charakteristische Verteflung (Tab.2). Das Gesamthomogenat enthalt, in Ubereinstimmung mit der IAteratur (HoLTZ, KRONEBERG U. SCHUMANN; MUSCHOLL) 900/0 I~oradrenalin und 10°/o Adrenalin. Dem weitaus hSheren Noradrenalingehalt

256 tI. J. SCniiMAN~, K. SCH17ELL ulld A. PHILIPPU:

entspricht ein hoher Noradrenalin-EiweiBquotient (8,2). Ffir die Nor- adrenalin- bzw. Adrenalinverteilung auf die einzelnen Fraktionen ergibt sich, dab der Haupttei l des Noradrenalins (660/0) auf das Sediment 100000 g entf~llt, die Hauptmenge des Adrenalins (630/0) dagegen sich im Oberstand befindet. Die Berechnung des Adrenalin- bzw. Nor- adrenalin-EiweiBquotienten ergibt, dab der Adrenalin-EiweiBquotient

Tabelle 2. Verteilung von Noradrenalin, Adrenalin und Eiweifl au] die dutch Di/- /erentialzentri/ugieren gewonnenen Fra]ctionen des Meerschweinchenherzens

Die Werte sind pro g Herz (Frischgewicht) angegeben. Mittel aus 3 Versuchen und mittlerer Fehler des Mittelwertes

Gesamt- homogenat

Sediment (15000 g)

Sediment (100000 g)

Uberstand (100000 g)

Summe der Fraktionen

Noradrenalin

ng/g %

874-112 --

524-9 14

554-55 66

784-5 20

385 100

Adrenalin

ng/g °/o

104±13 --

23±9 23

144-5 14

64±7 63

101 100

Eiwei/3 I ng Noradr. I ng Adr. mg/g [mg EiweiI] [ mg EiweiB

120,0±3,2

8,5±1,6

3,5±0,3

22,1±1,0

34,1

8,2

6,1

73,0

3,5

0,9

2,7

4,0

2,9

in allen Fraktionen praktisch gleich groB ist, d. h. dab Adrenalin wahrscheinlich unspezifisch adsorbiert ist, w/ihrend Noradrenalin im Sediment 100000 g offensichtlich spezifisch gespeichert ist. Der Noradrenalin- EiweiBquotient in dieser Frakt ion ist mehr als zehnmal gr6Ber als in den beiden anderen Fraktionen.

3. Wirkung von Reserpin und Guanethidin. Nach Reserpin kommt es, wie seit langem bekannt ist (BERTLER, CARLSSON U. ROS]~NGREN; PAASONEN U. K~AYER), ZU einer Abnahme der Brenzcatechinamine des Iterzens. Eigene Versuche an Meerschweinchen, die w/ihrend der Ver- suchszeit bei konstanter Raumtempera tur yon 22°C gehalten wurden, ergaben, dab schon 4 #g/kg Reserpin i.m. nach 20 Std den Amingehalt des Herzens um 780/0 des Ausgangsgehaltes vermindern. Best immt man jetzt die subcellul/ire Verteilung yon Amin und EiweiB, so findet man den Amingehalt in allen Fraktionen prozentual fast gleich stark herab- gesetzt :um 720/0, 660/0 und 730/0 (Tab. 3). Der EiweiBgehalt der Fraktionen dagegen bleibt unveri~ndert. Auch Versuche unter Variierung der Re- serpindosis und der Einwirkungszeit hat ten das gleiche Ergebnis. So verursachten 500/~g/kg Reserpin i.m. nach 90 min eine fast 90°/0ige Ab- nahme des Amingehaltes im Gesamthomogenat des tterzens, 100/~g/kg

Eigenschaften aoradren~linhaltiger Herzgraaula 257

I ~

v

~ i ~ = =

< % %

c~ 2

~ ef

o

d ~ ~ "~ ~ -H ~ ~ - m

.~ "~

Reserpin nach 30 min eine etwa 50°/0ige Abnahme. In beiden Versuchen waren alle Frakt ionen in prozentual ann~hernd gleichem Umfang verarmt. Ein ~hnliches Ergebnis hatte ein Versuch mit Guane- thidin (0,3 mg/kg i.m.): nach 20 Std war der Amingehalt im Gesamthomogenat ebenso wie in den einzelnen Fraktionen um etwa 400/0 vermindert.

I I . Freisetzung yon Brenzcatechinaminen aus isolierten Herz-, Nebennierenmark-

und Milznervengranula

1. Temperaturabh~ingige Spontan/reisetzung. Werden isolierte Herzgranula (Sediment 100000 g, 45 min) bei verschiede- ner Temperatur in isotonischer Saccharose- 15sung 45 min lang inkubiert, so kommt es zu einer temperaturabh~ngigen, sponta- nen Brenzcatechinaminfreisetzung (Abb. 2).

100

90

80

70

~ 6o

~ 5o

~ 40

20

tNN N H f LNN N H j N N N H ,

OoC * 22oC +37°C

Abb. 2. Spontane Brenzcatechinamin#elsetzun# aus isolierten Nebennierenmark-(~VN), Milznerven-(N) und Herzgranula (H) in AbMlngigkeit yon der Inkubationstemperatur. Inku - ba t ion 45 rain in 0,3 M SaccharoselSsung. :Mittelwert und mi t t l e re r Feh | e r des Mit te lwertes v o a mindes tens je v i e r

Versuchen

258 H.J. SCHOMAN~, K. SCHNELL und A. PmLIPPU:

Bei 0 ° C, 22°C bzw. 37°C betr~gt sie im Mittel 16, 36 bzw. 100°/o des Ausgangsgehaltes. Vergleichsversuche mit Nerven- (Sediment 30000 g, 30 min) und Nebennierenmarkgranula (Sediment 15000 g, 30 rain) ergaben, dab die spontane Aminfreisetzung aus Herz- und Nervengranula prozentual etwa gleich grol~ ist, w£hrend Nebennieren- markgranula eine wesentlich geringere Spontanfreisetzung zeigen.

2. Osmotische Lyse. Nebennierenmarkgranula sind nach elektronen- mikroskopischen Untersuchungen (SJ6sT~AND U. WETZSTEn~; KLEIN- SCHMIDT U. SCHOMANN) von einer Membran umgeben und lassen sich durch destilliertes Wasser osmotisch lysieren (H m L~P u. NILSON). Dabei geben sie neben dem 15slichen EiweiB den grSl~ten Tell ihrer Amine ab. Nach eigenen Versuchen verlieren sie innerhalb von 10 min bei 0 ° C im Mittcl 940/0 4-3,8 (n = 14) ihrer Amine. Herzgranula geben unter diesen Bedingungen nur 31°/0 ~= 4,5 (n = 5) ihres Noradrcnalins ab; sie verhalten sich wie Nervengranula, die nach v. EULER U. LISttAJKO (1960) unter den gleiehen Bcdingungen 40--500/0 ihrer Amine vcrlieren.

3. Calcium und Magnesium. Calcium und Magnesium setzen aus isolierten Nebennierenmarkgranula sowohl bei 0°C als auch bei 37°C Amine frei (ScH(~M~N U. PHrLIPPU). Wir haben untersucht, ob die beiden Ionen auch einen Einflu8 auf die Brenzcatechinaminabgabe aus isolierten Herz- und Nervengranula haben.

Inkubiert man isolierte Nebennierenmark-Granula 45 min lang bei 22 ° C in 0,3 M SaccharoselSsung mit 5 #Mol/ml Calcium, so kommt cs zu einer deutlichen Steigerung der Aminfreisetzung auf 38,6°/o gegeniiber 5,5°/0 Spontanfreisetzung. Im Gegensatz hierzu wird die hohe spontan erfolgende Aminabgabe aus isolierten Herz- und Nervengranula durch 5/~Mol/ml Calcium nicht beeinfluBt (Abb. 3). Selbst in zehnfach hSherer Konzentration (50 /~Mol/ml) hatte Calcium keine Wirkung auf die Brenzcatechinaminfreisetzung der Herz- und Nervengranula. -- Auch bci geringerer spontaner Brenzcatechinaminfreisetzung aus Herz- und Nervengranula, die sieh durch Senkcn der Inkubationstemperatur auf 0 ° C erreichen l£l~t (vgl. Abb. 2), war Calcium, selbst in Konzentrationen yon 20 und 50 #Mol/ml, nicht in der Lage, die Aminabgabe zu erhShen. Demgegenfiber genfigten 5/~Mol/ml Calcium, um aus Nebenniercnmark- Granula auch bei 0 ° C eine deutliche Steigerung der Aminfreisetzung zu verursachen.

Magnesium (20 /~Mol/ml) setzt wie Calcium (5 #Mol/ml) nur aus Nebennierenmark-Granula, nicht aber aus Herz- und Nervengranula Amine frei (Abb. 3).

4. Ribonuclease. Auch durch Ribonuclease (150/~g/ml) l~$t sich nach PHILIPPU U. SCttOMANN aus Nebennierenmarkgranula bei 37°C eine Freisctzung von Brenzcatechinaminen erzielen. Wegen der bei dieser

70

60

5O

40

30

10

20

I NN N H ]

IUIII


Ca

iiiJll

I NN N H I

Mg

Abb. 3. Ein/luB yon Calcium (Ca) und Magnesium (Mg) au! die Brenzcatechinamin/reisetzung aus isolierten ~ebennierenmark.(NN), Milznerven.(N) und Herzgranula (H). I n k u b a t i o n 45 rain bei 22 ° C in 0,3 ~¢I SaccharoselSsung. Mi t te lwer t und mi t t l e re r Fehler des Mit te lwer tes aus je drei Ver-

suchen. [ ] Spontane Fre i se tzung; ~ 5 ~Mol/ml Calcium bzw. 20 ~Mol/ml Magnes ium

9O

80

70

60

= 50 ~ ,

~ 4o

ao

2o

1o

NN N H

Abb. 4

t 0 300j L 0 50 100= pg/rn[ Segontin

N H

Abb. 5

100

90

8O

70

60

5O

4O

30

2O

10

io 30 I NN

Abb. 4. Brenzcatechinamin/reisetzuna aus isolierten Nebennierenmark. ( N N ) , Milznerven-(N) und Herz- granula (H) dutch Ribonuclease (1 mg/ml). I n k u b a t i o n 45 rain bei 22 ° C in 0,3 M SaccharoselSsung. Mi t te lwer t und mi t t l e re r Fehler des Mit te lwertes aus je drei Versuchen. [ ] Spontane Fre i sc tzung;

l~ibonuclease

Abb.5 . Brenzca2echinamin/reisetzung aus isolierten Nebennierenmark-(NN), Milznvrven-(N) und Herzgranula (H) dutch Segontin. I n k u b a t i o n 45 rain bel 22 ° C ia 0,3 M Saccharosel6sung. Mi t te lwer t und mi t t l e rc r Fehler des Mit te lwertes aus je drcI Versuchen. D Spontane Fre i se tzung; ~ 8c-

gont in lac ta t

260 H. J. SCHt2MAN~, K. SCKNELL und A. PIIILIPPU:

Temperatur hohen Spontanfreisetzung der Amine aus Herz- und Nerven- granula wurden die Inkubationsversuche bei 22 ° C ausgef/ihrt. Um eine deutliche Enzymwirkung zu erhalten, muI3ten unter diesen Bedingungen allerdings hohe Ribonuclease-Konzentrationen (1 mg/ml) verwendet werden. Als Aktivator wurden 1,5 /~Mol/ml Calcium zugesetzt, das in dieser Konzentrat ion keine Aminabgabe verursacht.

I m Gegensatz zu Calcium wirkt Ribonuclease auf alle drei Granula- arten aminfreisetzend (Abb.4).

5. Segontin. Vergleichende Versuche zwischen Nebennierenmark-, Nerven- und Herzgranula wurden auch mit Segontin [N-(3'-Phenyl- propyl-(2'))-l , l-diphenyl-propyl-(3)-amin] durchgeffihrt, das Neben- nierenmarkgranula in vivo und in vitro an Brenzcatechinaminen ver- a rmt (ScH6NE u. LI~DNER; P H m ~ r u , PALM U. SCI{~MANN).

Eigene Versuche ergaben, dal3 Segontin auch bei isolierten Herz- und Nervengranula zu einer Steigerung der Brenzcatechinaminfrei- setzung fiihrt, jedoch sind h6here Konzentrationen als bei Neben- nierenmarkgranula erforderlich (Abb.5). Wiihrend Nebennierenmark- granula schon auf 30 /~g/ml Segontinlactat mit einer starken Amin- abgabe reagieren, ben6tigt man bei Nervengranula eine zehnfach h6here Konzentrat ion (300 /~g/ml), um eine vergleichbare Freisetzung zu erzielen. Herzgranula liegen mit ihrer Empfindlichkeit zwischen Neben- nierenmarkgranula und Nervengranula.

6. Acetylcholin. Acetylcholin, das bekanntlich aus isolierten Neben- nierenmark- (BLASCHKO, HAGEN U. WELCH) und Nervengranula (ScHi2- MANN U. WEIGMANN) keine Brenzeatechinamine freisetzt, erwies sich auch an Herzgranula in Konzentrationen bis zu 1 mg/ml als wirkungslos.

Diskussion Adrenalin und Noradrenalin werden im Nebennierenmark (BLASCHKO

U. WELCH; H1LLARP, LAGERSTEDT U. •ILSON) und in postganglion~ren, sympathischen Milznerven (v. EULER U. HILLARP; SCHi2MANN 1958a und b) in besonderen Zellorganellen, sogenannten Granula, gespeichert. Nach Untersuchungen yon KAKO U. WEGMANN an Hundeherzen sowie yon POTTE~ U. AXEL~OD (1962 und 1963) an Rattenherzen ist ein grol3er Teil der Brenzcatechinamine auch des Herzens partikuliir gebunden.

In der vorliegenden Arbeit haben wir nachweisen k6nnen, dal3 sich aus Meerschweinchenherz-Homogenaten durch Differentialzentrifugieren Partikel gewinnen lassen, in denen Noradrenalin spezifisch angereichert ist. 66°/0 des gesamten im Herzen vorkommenden Noradrenalins fanden wir im Sediment 100000 g. Demgegeniiber finder sich das Adrenalin des Herzens, das nur zu etwa 10°/0 an der Zusammensetzung der Gesamt- Brenzcatechinamine beteiligt ist, fiberwiegend -- zu 630/0 - - nicht partikul~ir gebunden, frei im l~berstand der Frakt ion 100000 g (siehe


Tab.2). Auch die von uns best immten Quotienten ng Amin/mg EiweiB sprechen f/Jr die Spezifiti~t der Noradrenalinanrcicherung im Sediment der Frakt ion 100000 g, in der 73 ng Noradrenalin auf 1 mg EiweiB ent- fallen, d. h. 10--20mal mehr als im Sediment der Frakt ion 15000 g bzw. im Ubers tand der Frakt ion 100000 g; im Gcgensatz hierzu verteilt sich Adrenalin - - dem EiweiBgchalt entsprechend - - unspezifisch gleich- m~Big auf die einzelnen Fraktionen.

DaB wir nach Vorbehandlung der Tiere mit Reserpin eine prozentual glcich starke Abnahme des Amingehaltes in allen untersuchten Frak- tionen fandcn, spricht nicht gegen die Spezifititt der Noradrenalin- anreicherung im Sediment 100000 g. Reserpin wirkt in vivo wahrscheinlich durch Blockade des aktiven Transports der fiir die Noradrenalin- synthese erforderlichen Aminosi~uren und Amine in die Zelle (DENGLER, SPIEGEL U. TITUS) und vom Cytoplasma dcr Zelle in die Granula (KIRsHNER; CARLSSON, ~-IILLARP U. WALDECK; V. EULER U. LISHAJKO 1963) und ffihrt damit zu einer Verminderung des Amingehaltes der Gewebe. Eine spezifische Vcrarmung einer best immten Frakt ion kann demnach nicht erwartet werden.

Wie schon in der Einleitung erwi~hnt, ist anzunehmcn, dal~ der iiber- wiegendc Teil der Brenzcatcchinamine des Herzens aus postganglionaren, sympathischen Nerven s tammt. Wir haben deshalb das Verha]ten isolierter Herzgranula mit demjenigen von Nervengranula und von Nebennicrcnmarkgranula vergliehen.

Iterz- und Nervengranula weisen in ihrem Verhalten Gemeinsam- keitcn auf, die sic von Nebennicrenmarkgranula unterscheiden. So sind Herz- und Nervengranula gegcniiber osmotischer Lyse resistenter, zeigcn andercrseits eine hShere Spontanfreisetzung als Nebennieren- markgranula. Ubereinstimmend li~Bt sich durch Segontin bei allen drei Granulaarten eine Steigerung der Brenzcatcchinaminfrcisetzung erziclen, wiihrend Acetyleholin sowohl bei t terzgranula als auch bei Nebennieren- markgranula (BLASCHKO, HAGEN U. WELCH) und Nervengranula (ScHi:IMANN U. WEIGMANN) kcincn EinfluB auf die Brenzcatechinamin- abgabc hat.

Nach den yon uns erhobenen Bcfunden besteht ein wesentlieher Unterschicd zwischen Nebennierenmarkgranula einerseits sowie Hcrz- und Nervengranula andererseits darin, dab Calcium und Magnesium aus Ncbennierenmarkgranula Brenzcatcchinamine freisetzen, nicht jedoeh aus Iterz- und Nervengranula. Die , ,Aminverarmung" der Ncbcn- nierenmarkgranula durch Calcium kSnnte die Folge einer erhShten Aminabgabe sein oder die Folge einer verminderten Wiederau]nahme von Brenzcatechinaminen in die Granula. Die Nebennierenmarkgranula besitzen n/tmlich einen ftir die Aminaufnahme in die Granula verant- wortliehen Transportmechanismus, der abhi~ngig ist yon ATP und

262 H. J. SCn~)MAN~, K. SCHNELL uIld A. P~.YpPu:

Magnesium (KIRSHNER; CARLSSON, HILLARP U. WALDECK). So k6nnte Calcium durch Verdrangung von Magnesium den Amintransport in die Nebennierenmarkgranula hemmen. Gegen die Vermutung, dab Calcium durch eine Hemmung der Aminwiederaufnahme wirkt, sprechen jedoch die Versuche von CARLSSON, HILLARP U. WALD]~CX. Sie ergaben, dab bei Nebennierenmarkgranula die Aktivierung der Aminaufnahme durch Magnesium auch in Gegenwart yon Calcium unbehindert stattfindet. Zudem ist die Temperaturunabhangigkeit der Calcium- und Magnesium- wirkung nicht mit der Annahme vereinbar, dab beide Ionen ihre Wir- kung durch Blockade eines aktiven Transportvorganges ausfiben. Es ist vielmehr wahrscheinlich, dab Calcium und Magnesium bei Nebennieren- markgranula eine Steigerung der Aminabgabe hervorrufen. Adrenalin und Noradrenalin werden namlich in den Granula des Nebennieren- markes in Form eines Amin-ATP-Komplexes gespeichert (H*LLARP, H6GBERG U. NILSON), der mSglicherweise mit Hilfe yon Calcium und Magnesium an ein Ribonncleoproteid der Granulastruktur gebunden ist. Calcium und Magnesium kSnnten aus diesem Komplex durch Ionen- austausch Brenzcatechinamine und in gleichem Verhaltnis ATP freisetzen (ScHOMANN U. I~ILIPPU). Ob Calcium und Magnesium an Herz- und Nervengranula deswegen nicht wirken, well sie nicht an der Bildung des Aminspeicherkomplexes teilnehmen, miissen weitere Untersuchungen klaren.

]~ber die Speicherung von Noradrenalin in Herz- und Nervengranula ist wenig bekannt. Herz- (POTTER U. AXELROD 1963) und Nervengranula (ScHi2MANN 1958a; v. EULER, STJ~NE U. LISHAJKO) enthalten zwar auch Amine und ATP in einem molaren Verhaltnis von etwa 4 : 1, was in Analogie zu tqebenniereumarkgranula ffir das Vorhandensein eines Amin-ATP-Speicherkomplexes spricht. Die Beobachtung jedoch, da2 die spontane Brenzcatechinaminabgabe aus Herz- und Nervengranula nicht von einer entsprechenden ATP-Freisetzung begleitet ist (POTTER U. AXELROD 1963; V. EULER, STJXRNE U. LISHAJKO), laBt vermuten, dal3 entweder die komplexe Bindung der Amine an ATP bei Herz- und Nervengranula labiler ist, oder daI3 die Brenzcatechinamine nicht als Komplex mit ATP gespeichert werden. Von Interesse ist in diesem Zusammenhang, daI3 Ribonucleinsauren wahrscheinlich auch bei Herz- und Nervengranula fiir die Speicherung von Noradrenalin von Be- deutung sind, da es nach unseren Versuchen durch Zugabe von Ribo- nuclease bei allen drei Granulaarten zu einer vermehrten Brenzcatechin- aminfreisetzung kommt.

Nach histologischen Untersuchungen von PALADE enthalten die Muskelfasern vor allem der Herzvorh6fe Granula, die mit einem Durch. messer von 100--250 m# annahernd gleich groB sind wie die Neben. nierenmarkgranula und mSglicherweise Brenzcatechinamine speichern


Die Sedimentationseigenschaften der Herzgranula sprechen jedoch daffir, dab es sich bei den Partikeln des Sedimentes 100000 g nicht um die yon PAL~DE beschriebenen Granula handelt, sondern um kleinere mi t einem Durchmesser yon 30--60 m~t, wie sie yon WOLFE U. POTTER in den postganglioniiren, sympathischen Nerven yon Rattenherzen beschrieben wurden. Auf Grund unserer Vergleichsversuche mit Nerven- granula und Nebennierenmarkgranula und der vorliegenden histologischen Befunde ist es deshalb sehr wahrscheinlich, dab es sich bei den Partikeln des Sedimentes 100000 g, den Herzgranula, im wesentlichen um Granula aus postganglion~ren, sympathischen Nervenfasern handelt.

Zusammenfassung 1. Homogenate von Meerschweinchenherzen wurden durch Dif-

ferentialzentrifugieren fraktioniert. Liiflt man das grobpartikul~re Sediment 2000 g unberiieksiehtigt, so erh~lt man folgende Verteilung der Gesamtbrenzcatechinamine (Adrenalin + 5[oradrenalin) auf die einzelnen Fraktionen: Sediment 15000 g enth~lt 14°/o, Sediment 100000 g 490/0 und der Uberstand 100000 g 370/0 . Auf mg Eiweil3 berechnet enthalt Sediment 100000 g etwa aehtmal mehr Amine als die anderen Frak- tionen.

2. Noradrenalin wird zu 660/0 in der Granulafraktion 100000 g gespeichert, der Noradrenalin-EiweiBquotient in dieser Frakt ion ist min- destens zehnmal so hoeh wie in den anderen Fraktionen. Adrenalin ist unspezifisch auf die einzelnen Fraktionen verteilt, dem EiweiSgehalt entspreehend.

3. Durch Vorbehandlung der Meersehweinchen mit Reserpin kommt es in Abhi~ngigkeit yon der Dosis und der Vorbehandlungszeit zu einer 50--9O°/oigen Abnahme der Brenzcatechinamine des Herzens, die alle Frakt ionen gleichmiiBig betrifft. Die nach Guanethidin auftretende Ver- armung von ca. 400/o betrifft ebenfalls alle Fraktionen prozentual gleich stark.

4. Aus Suspensionen isolierter I terzgranula (Sediment 100000 g) in isotonischer SaccharoselSsung werden bei Inkubat ion (45 min) in Abh/ingigkeit v o n d e r Temperatur Brenzcatechinamine freigesetzt, bei 0, 22 bzw. 37 ° C 16, 36 bzw. 100°/0 . Unter den gleichen Versuchsbedin- gungen ist die Aminfreisetzung aus isolierten Nervengranula etwa gleich grol3, w/~hrend diejenige aus isolierten Nebennierenmarkgranula wesentlich geringer ist. Durch osmotische Lyse mit Aqua dest. (0 ° C, 10 min) verlieren Herzgranula 31°/0, Nebennierenmarkgranula 940/0 ihrer Amine.

5. Aus isolierten Herz- und Nervengranula 1/iI~t sich durch In- kubat ion mit Calcium und Magnesium sowohl bei 22 ° C als auch bei 0 ° C ira Gegensatz zu Nebennierenmarkgranula keine Steigerung der Brenz- catechinaminabgabe erzielen.

]~aunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Path. Pharmak., Bd. 249 1 9

264 H.J. SC~iiMANN, K. SCHNELL und A. PHn~IPPU:

6. Ribonuclease und Segontinlactat setzen bei 22°C aus Herz-, Nerven- und Nebennierenmarkgranula Amine frei.

7. Das unterschiedliche Verhalten yon Herz-, Nerven- und Nebcn- nierenmarkgranula wird diskutiert und der Schlu~ gezogen, dal3 die Herzgranula (Sediment 100000 g) im wesentlichen Granula aus postganglioniiren, sympathischen Nerven sind.

Summary 1. Homogenates from guinea-pig hearts were fractionatcd by dif-

ferential centrffugation. The fractions obtained after removal of the low speed sediment 2000 g showed the following distribution of catecholamines: the sediment 15000 g contains 14°/0, the sediment 100000 g 49°/0 and the supernatant 100000 g 37°/0 of the catecholamines (adrenaline ~- noradrenalinc). The catecholamine content per mg protein of sediment 100000 g is about 8 times as high as that of the other fraction.

2. 66°/o of the noradrenaline are stored in the granular fraction 100000 g. The ratio noradrenaline/protcin in this fraction is at least 10 times as high as in the others. Adrenaline is unspeciilcally distributed to the fractions according to their protein content.

3. Pretreatment of the guinea-pigs with reserpine (4 #g/kg i.m.) causes after 20 hours a 70--800/0 decrease of the eatecholamine content of the hearts. All fractions are equally depleted. 30 min after 100 #g/kg reserpine a 500/0 loss, 90 min after 500 #g/kg a 900/0 loss of catecholamines is observed affecting all fractions to the same degree.

4. The spontaneous release of catecholamines from isolated heart granules (sediment 100000 g) during incubation (45 rain) is dependent on the temperature. At 0 ° C, 22°C and 37°C a release of 16°/0, 360/0 and 100°/o is observed. Under the same experimental conditions the release of eateeholamines from nerve granules is 14.5°/0, 52.50/0 and 100°/0, from medullary granules 3.2°/o, 8.50/0 and 220/0 respectively. Heart granules loose under osmotic lysis with water (0 ° C, 10 min) 31°/0, medullary granules 940/0 of their original cateeholamine content.

5. Calcium (5--50 /~Mol/ml) and magnesium (20 /~Mol/ml) do not enhance the catecholamine release either from heart or from nerve granules (incubation 45 min, 0°C and 22 ° C). On the contrary these cations release catecholamines from medullary granules at both tem- peratures.

6. Ribonuclease (1 mg/ml) and segontin lactate (30--300 /~g/ml) release at 22 ° C catecholamines from heart, nerve and medullary granules as well.

7. The properties of granules from heart, splenic nerves and suprarenal medulla are compared. The similarities between heart and nerve


g ranu l e s l e a d t o t h e conc lus ion t h a t h e a r t g r anu l e s o r i g i n a t e f r o m t h e

p o s t g a n g h o n i c s y m p a t h e t i c n e r v e s o f t h e h e a r t .

Wir danken Frau I-IEIDE KAISER und Fraulein SABINE TAUB~R fiir ihre ver- standnisvolle und geschickte 1YIitarbeit.

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Professor Dr. H. J . SCHti~ANN, Pharmakologisches Insti tut der Universit~t, 6 Frankfurt/Main, Ludwig Rehn-Str. 14

subcelluläre verteilung von noradrenalin und adrenalin im meerschweinchenherzen

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