399台灣林業科學 22(4): 399-411, 2007

研究報告

1) 本文為第二作者碩士論文之部分研究成果 This report is a partial conclusion of the Master’s degree

thesis writ ten by the second author.2) 國立嘉義大學森林暨自然資源學系，60004嘉義市學府路300號 Department of Forestry and Natural

Resources, National Chiayi University, 300 Syuefu Rd., Chiayi 60004, Taiwan.3) 通訊作者 Corresponding author, e-mail:ykliao@mail.ncyu.edu.tw

2007年1月送審 2007年7月通過 Received January 2007, Accepted July 2007.

以農桿根群菌轉殖泡桐之研究1)

廖宇 2,3) 莊翠婷2)

摘 要

取泡桐(Paulownia fortunei)種子苗不同組織部位之培殖體利用農桿根群菌(Agrobacterium rhizo-genes) BCRC 15011感染後，培養於MS基礎培養基上可成功誘導出毛狀根(hairy root)。其中以葉片中

段作為培殖體之轉殖根產生效率最佳(85.71%)，其次依序為葉片連接葉柄(70%)、節間(30.55%)或葉尖

(33.33%)培殖體。誘導出之毛狀根可在不添加任何植物生長調節劑的培養基中，呈現快速的生長並具

高度分枝等特性。本研究並探討了培養基鹽基濃度、碳水化合物種類與濃度，以及在光照或黑暗培養

條件下對於毛狀根生長或型態之影響。於毛狀根癒傷組織之誘導及芽體再生方面，TDZ (thidiazuron)

為有效之細胞分裂素(cytokinin)，不論是單獨以TDZ處理或利用NAA (naphthaleneacetic acid)與TDZ之

組合，均可誘導綠色之癒傷組織產生，並持續繼代培養於低濃度NAA (0.5 μM)與TDZ (≦ 5 μM)之培養

基中可誘導芽體再生。此外本研究並以已知的rolC基因片段序列比對與鑑定誘導所得之毛狀根以及由毛狀根再誘導發生之癒傷組織其DNA序列，證明確屬農桿根群菌轉殖而來。

關鍵詞：泡桐、毛狀根、芽體再生、基因轉殖。

廖宇 、莊翠婷。2007。以農桿根群菌轉殖泡桐之研究。台灣林業科學22(4):399-411。

Research paper

Study of the Agrobacterium rhizogenes-mediatedTransformation of Paulownia fortunei1)

Yue-Ken Liao,2,3) Cuei-Ting Jhuang2)

【Summary】

Different seedling parts of Paulownia fortunei were used to induce hairy roots when cul-tured on MS basal medium after infection by the Agrobacterium rhizogenes strain, BCRC 15011. Lamina (middle 1/3 section) explants produced transformed roots at a higher frequency (85.71%) compared to lamina with a petiole (70%), internode (30.55%), or leaf apex (33.33%). Hairy roots exhibited vigorous growth and abundant lateral branching on hormone-free medium. The opti-mized culture conditions for hairy roots were examined by varying the factors of salt concentration

400 廖宇 、莊翠婷―以農桿根群菌轉殖泡桐之研究

in the medium, type and amount of carbohydrates, and illumination conditions that influenced root growth and morphology. TDZ (thidiazuron) was the most effective cytokinin for inducing green calli. Adventitious shoots were occasionally induced from these calli that were initially treated with a high dosage of TDZ or TDZ + NAA (naphthaleneacetic acid) and then transferred onto medium containing NAA (0.5 μM) and TDZ (≦5 μM). Transformation events in hairy roots and calli de-rived from these hairy roots were comfirmed by identification of a known DNA sequence of a rolC gene fragement from the examined transformants. Key words: Paulownia fortunei, hairy root, shoot regeneration, genetic transformation.Liao YK, Jhuang CT. 2007. Study of the Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of

Paulownia fortunei. Taiwan J For Sci 22(4):399-411.

緒言

泡桐(Paulownia fortunei)為玄蔘科(Scroph-

ulariaceae)落葉性喬木，生長快速，木材可供

家具、樂器、合板工業等高經濟價值利用，為

優良造林樹種。惟本屬之樹種易遭受由擬菌質

體(mycoplasma-like organism)所引發的簇葉病

(witches’ broom disease)感染或是受根瘤線蟲

(Meloidogyne incognita)入侵危害，因此大大減

損了造林收益。為了對抗這二種嚴重的疾病，

研究人員曾嘗試以轉殖外源抗性基因的方式作

為遺傳改良手段來抵禦之(Hang 2002, Du et al.

2005)，但是連同泡桐在內的幾個泡桐屬的樹

種如：白桐(P. kawakamii)、毛泡桐(P. tomen-tosa)、台灣泡桐(P.×taiwaniana)以及蘭考泡桐

(P . elongata)；或是這些樹種的若干種間雜交

種其組織培養雖然容易(Rao et al. 1993, Ho et

al. 1994, Rao et al. 1996, Bergmann and Moon

1997)，卻在進行基因轉殖工作時遭遇若干問

題。檢視Hang (2002)以及Mohri et al. (2003)在

轉殖泡桐；Prakash and Kumar (2002)與Du et

al. (2005)各別在轉殖白桐及泡桐×毛泡桐雜交

種所做的研究，其建立轉基因植物(transgenic

plant)的方法，大致都是利用農桿腫瘤菌(Agro-bacter ium tumefaciens)在不同之程序下完成的。農桿腫瘤菌的轉殖程序需先誘導受轉殖之

植物組織發生癒傷組織，接著再以抗生素篩選

這些癒傷組織以獲得轉殖細胞，然後誘導這些

細胞發生不定芽及長根以形成完整植株。Hang

(2002)及Mohri et al. (2003)都發現到在使用抗生

素篩選細胞時易引發芽體再生功能的喪失，使

得轉殖植株的數量稀少。而Prakash and Kumar

(2002)以及Mohri et al. (2003)更指出抗生素甚

至會在最後一個階段妨礙轉殖之不定芽發根。

因此謹慎的使用抗生素進行篩選工作或是能避

開這個篩選過程應該是一個提高轉殖成功率可

以考慮的方向。

有相當多的報告指出，利用農桿根群菌

(A. rhizogenes)而非腫瘤菌轉殖植物細胞並完成

植株再生，也有很好的結果(Ohara et al. 2000,

Choi et al. 2004, Lee et al. 2004)。Christey

(1997)更進一步述及利用農桿根群菌引發的毛

狀根性狀作為表現型直接判斷轉殖成功與否，

可以免除使用抗生素針對癒傷組織進行篩選的

這個步驟而獲得轉殖成功之組織或器官。而連

續性的將毛狀根根尖切下進行幾次的繼代培

養，可以確定培養的根群均為轉殖而來的細

胞，此時若經由這種繼代培養過的毛狀根來誘

導形成不定芽而再生植株，可減少未轉殖株的

發生或是將轉殖細胞與未轉殖細胞並存的鑲嵌

體混雜在系統中的問題排除。因此當Bergmann

et al. (1999)在一篇試驗性的報告中描述到蘭考

泡桐亦可以被農桿根群菌感染並獲致33%的感

染率時，我們乃認為用農桿根群菌進行泡桐基

因轉殖的概念應屬可行，若能在泡桐屬相關樹

種之間發展以農桿根群菌為媒介的轉殖方法，

應能解決前述使用農桿腫瘤菌轉殖基因時的

困難。

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本研究著重利用農桿根群菌感染泡桐不

同組織部位之培殖體，誘導發生毛狀根，並建

立泡桐毛狀根之培養系統，於接續之工作中發

展植株再生技術以建構完整之基因轉殖流程，

目前雖已從轉殖之毛狀根中誘導芽體再生，惟

其再生之效率在後續之研究中仍有改善空間，

始能與農桿腫瘤菌轉殖芽體再生的情形互作比

較，文中也討論了芽體再生情形不佳的可能原

因及改善方法。

材料與方法

一、植物材料

本研究使用之泡桐種子來自農委會林業試

驗所，係2002年11月於該所蓮華池研究中心採

集泡桐2號母樹開放授粉所獲得之種子，該母樹

係由中國大陸貴州採集之泡桐種子經播種栽培

育成。採集之種子乾燥後於當月份儲藏在台北

總所之種子庫中至2003年10月本研究開始進行

時止。取此種子以流水沖洗一天後，以表面殺

菌處理並培養在添加0.8% agar (Difco Bacto)之

MS (Murashige and Skoog 1962)固體培養基上，

種子發芽後再切取小苗頂芽部分插入相同培養

基中繼代培養作為實驗之材料。試驗時取無菌苗

(高度5 cm)之葉片，將其分成前1/3葉尖部分、

葉片中段1/3及後1/3段葉片連接葉柄，並另切

取無菌苗節間部分一同作為感染用之培殖體。

二、農桿根群菌之接種及共培養

農桿根群菌BCRC 15011 (ATCC 43057)，

購自財團法人食品工業研究所。將菌種活化後

形成之菌落接種於含25 mL BP液體培養基(每

1000 mL含有beef extract 3.0 g，peptone 5.0

g；pH 7.0)的50 mL三角錐瓶中，在黑暗中以

28℃、170 rpm振盪培養24小時，至菌液濃度

於可見光600 nm下的吸光值(OD600nm)達0.5~1.0

止。將此菌液以離心機轉速5000 rpm離心5分

鐘，取沉澱之菌體以添加了3%蔗糖及100 μM乙

醯丁香酮(acetosyringone，簡稱AS)的等量MS

液體培養基重新懸浮。

泡桐無菌苗之葉片或幼莖於含有此再懸浮

菌液之培養皿中切開，將切開之培殖體放入含

有25 mL再懸浮菌液的50 mL三角錐瓶中，以

28℃、110 rpm的速度於黑暗下振盪培養1 h。

接著取出培殖體，以滅菌過的濾紙吸乾多餘之

菌液，轉移至添加AS (100 μM)的MS固體培養

基上，於28℃黑暗下共培養48 h。

共培養後之培殖體，先以無菌水清洗2~3

次，接著以含有300 mg L-1 cefotaxime的MS液

體培養基清洗10 min，重複約3~4次，直至液體

培養基呈現透明不混濁為止。將培殖體以滅過

菌的濾紙吸乾多餘液體後，移至含有相同濃度

cefotaxime的MS固體培養基。隔2週繼代至相

同之培養基，約2次之繼代培養後可達無菌之情

況。對照組之培殖體以不含農桿根群菌的MS培

養基，依上述之條件進行感染、清洗除菌及培

養等動作。

三、毛狀根之培養

(一)毛狀根之離體培養

培殖體長出毛狀根後，切下1.0~2.0 cm之

根尖，離體培養於含有300 mg L-1 cefotaxime的

MS固體培養基，再持續除菌4~6 wks。此最初

切下之每一段根尖及由其後繼長出之組織即個

別為一單株品系(line)，並以不加抗生素之MS

固體培養基每隔4週繼代培養一次，繼代時切取

其根尖約4~5 cm移置新培養基即可。六個月後

調查其生長情形及外觀。

(二)毛狀根生長條件之測試

1. 不同鹽基濃度試驗

本試驗主要探討MS基礎培養基中，不同

鹽基濃度對於泡桐毛狀根生長之影響。將 ful l

或1/2 MS固體培養基添加3%蔗糖及0.8% Difco

Bacto agar，培養不同形態之泡桐毛狀根3-2及

7-6品系。培養時切下長約3 cm之毛狀根，並切

除其根尖及側根，放置於培養基上。每處理具8

重覆，每三週繼代培養一次，培養6週後觀察並

比較毛狀根之生長情形，分別量取其鮮重後置

於65℃烘箱中烘乾至重量不再變化為止，量取

其乾重。

402 廖宇 、莊翠婷―以農桿根群菌轉殖泡桐之研究

2. 光照與黑暗培養試驗

為了解毛狀根於光照或黑暗培養下之生長

狀況，將毛狀根3-2及7-6品系取約3~4 cm之長

度培養於前述MS培養基上。光照處理者置於培

養室以人工光源照光(光照條件如後述)，而黑暗

處理者則以鋁箔紙包覆培養皿。壹個月後，觀

察其生長情形及形態變化。

3. 糖類及濃度試驗

將毛狀根品系3-2及7-6分別切取約3 cm大

小，放置於各含有1、2、3、4及5%濃度的蔗

糖或葡萄糖之MS固體培養基中，每處理具8重

覆，每3週繼代培養一次，培養6週後量取鮮、

乾重並觀察比較毛狀根之生長情形。

四、毛狀根之遺傳鑑定

本試驗農桿根群菌Ri質體DNA (正向對照

組；positive control)之萃取是採用鹼性溶菌法

(alkaline lysis method)。挑取單一菌落培養於

BP液體培養基中24 h以活化菌株，並採用Wang

(2001)之質體分離法以獲得Ri質體DNA。同時

參考Cheng (2000)的報告中genomic DNA之純化

方式來萃取泡桐植物體之DNA，分別採取泡桐

不同品系毛狀根以及由毛狀根所誘導出之癒傷

組織為材料，並以未轉殖之泡桐植株根部所抽

取之genomic DNA作為對照組。萃取後之Ri質

體及泡桐植物體之DNA分別以70及100%酒精清

洗後風乾，溶於適量之無菌水中，測定DNA濃

度並保存於4℃。

P C R反應之引子序列是參考H o s o k a w a

et al . (1997)之文獻所設計，為rolC 5’-CTG-

TAC C T C TAC G T C G AC T- 3 ’及5 ’ - T C AG T C -

GAGTGGGCTCCTTG-3’。PCR反應液中所含

反應物及濃度如下：1 μL dNTP (10 mM)、1 μL

Taq polymerase (5 units)、2 μL primer (38 pmol

μL-1)、2 μL template DNA (25 ng μL-1)、5 μL

10×PCR buffer及37 μL ddH2O，PCR反應之條

件為94℃/5 min，循環1次；94℃/20 s，55℃/

40 s，72℃/90 s，循環30次；72℃/10 min，循

環1次。PCR反應後進行DNA膠體電泳並將電泳

後剩餘的PCR產物送交定序，此定序結果並與

NCBI (National Center for Biotechnology Infor-

mation)資料庫中rolC基因的序列進行比對。

五、自毛狀根誘導轉殖芽體再生

本試驗利用泡桐之毛狀根誘導芽體再

生之途徑有二種設計，第一種係直接自毛狀

根誘發不定芽，培養基所添加之細胞分裂素

(cytokinin)分別為20、40、60、80及100 μM之

BAP (6-benzylaminopurine)或9、18、27、36及

45 μM之TDZ (thidiazuron)。將毛狀根切成約

1 cm大小之片段，去除根尖部分，放置於含有

前述不同cytokinin之MS培養基中並以3.0 g L-1

Sigma PhytagelTM固化，每2週繼代培養一次，

一個月後觀察其側根及形成癒傷組織數量之變

化。接著再繼代培養於Table 1中不同之培養基

繼續誘導芽體產生，以不同濃度BAP處理之培

殖體先繼代培養於MS-1、2、3或4培養基中4

週，接著移至MST-1及MST-2培養基中2週，並

於MST-3、4或5培養基中持續培養。以不同濃

度TDZ處理之毛狀根根段，在一個月的培養之

後，則將培殖體移至MST-3、4、5培養基中持

續繼代。以上之培養階段皆是以2週為一次繼代

週期。

Table 1. Different MS culture media with their plant growth regulator regime applied for adventitious shoot induction from hairy root segments of Paulownia fortuneiMedium NAA (μM) BAP (μM) TDZ (μM)MS-1 1 22.2 MS-2 1 33.3 MS-3 1 44.4 MS-4 1 55.5 MS-5 1 8.88 MS-6 2.7 22.2 MST-1 1 1MST-2 1 5MST-3 0.5 1MST-4 0.5 3

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第二種誘導芽體再生之途徑是先從毛狀

根誘導產生癒傷組織，再由其中誘發不定芽，

本途徑所使用之培殖體及培養基與前述相同，

但是在誘導癒傷組織的培養基中是添加植物生

長調節劑NAA (0.54 μM)與TDZ (45 μM)，培

養一至二個月後可獲得由毛狀根所產生之癒傷

組織，並利用Table 1中培養基之組合進行誘導

芽體再生，首先是將癒傷組織培養於MS-5及

MS-6培養基中，接著移至MS-2、3、4培養基

中1個月，再以MST-1及MST-2處理2週，並於

MST-3、4、5培養基中持續繼代培養。癒傷組

織之繼代培養，也是以每2週為一次繼代週期。

六、統計分析

在不同鹽基濃度的試驗中，以完全逢機複

因子(2×2)設計檢測2種培養基濃度與2個毛狀

根品系之培養效應。在不同碳源種類培養毛狀

根之試驗中，則以完全逢機複因子(2×5)設計

檢測2種碳源種類及5個濃度之培養效果。各以

SPSS軟體提供之GLM一般化因子分析模式進行

ANOVA分析，以比較處理間是否有顯著差異，

當差異顯著時再使用鄧肯(Duncan)新多變域檢

定比較各處理間之效應。

七、培養條件

本試驗進行農桿菌感染及共培養階段以及

泡桐組織培養所使用之固體培養基，除配方替

換另有說明之外均使用MS基礎培養基添加3%

蔗糖及0.8% Difco Bacto agar。除養菌之培養液

以外、文中所謂MS液體培養基則為前述固體培

養基配方移除洋菜。培養基在蒸煮前均調整酸

鹼值至5.8。若無特別說明試驗中所使用之培養

容器為25×90 mm之無菌培養皿，泡桐無菌苗

繼代培養之容器為Sigma Magenta GA7之培養

盒。培養環境之溫度設定為23±1℃，並以冷白

螢光燈混合白熱燈泡提供55.6 μmol m-2 s-1光度

及16/8 h之光週期。培養過程中，為防止培養皿

中水份凝結，於其上方疊放一個內含水加洋菜

之透明凝膠的培養皿。

結果與討論

一、泡桐毛狀根之誘導與培養

泡桐培殖體與農桿根群菌共培養後，約

2~3週左右培殖體表面陸續會出現腫大之現象，

接著長出白色毛狀根，其表面佈滿細小根毛。

毛狀根產生的位置，大部分位於切口或是葉脈

Fig. 1. Hairy root induction and growth from explants of Paulownia fortunei incubated in a 9 mm diameter Petri dish. (A) Control plate and (B) Agrobacterium rizogenesis-infected plate.

404 廖宇 、莊翠婷―以農桿根群菌轉殖泡桐之研究

部位，特別會在傷口處叢生，少部分則是由葉

面受傷位置出現，而對照組之培殖體無毛狀根

出現並在逐漸褐化後死亡(Fig. 1)。泡桐不同部

位之培殖體均能被感染而長出毛狀根(Fig. 2)，

但是我們觀察到毛狀根發生之百分比並不相

同，以葉片中段(n = 21)誘導毛狀根發生之效率

最高(85.71%)，其次為葉片連接葉柄部位(n =

30, 70%)，而以節間(n = 36)及葉尖部位(n = 21)

效率最差(各為30.55及33.33%)。推論可能是由

於葉片培殖體具有較大斷面積之切口，使農桿

根群菌感染之機率增加，此情形與枸杞(Lycium chinense) (Wu 2000)及何首烏(Polygonum mul-tiflorum) (Lin 2003)誘導毛狀根發生是有相同之

結果。

本試驗結果共繼代保存了 1 6個品系之

毛狀根，每一根從培殖體上長出的毛狀根被

視為一個品系，從同一個培殖體培養出之不

同毛狀根，則在賦予相同的一個號碼之後給

予-1、-2、-3等依序編排之編號。這些毛狀根

均可持續繼代培養於不含任何植物生長調節劑

的MS培養基中超過半年以上，我們觀察到其

外觀型態及生長速度在不同品系間顯現了極大

的差異，這些差異並未和培殖體是來自何種部

位之組織有關，而從同一個培殖體上形成之不

同品系毛狀根也會有外觀及生長速率的差異。

本研究選擇了二個外觀型態及生長情形互異的

品系(3-2及7-6號，Fig. 3)進行後續試驗，3-2品

系表面多呈分支及蓬鬆之結瘤狀；容易斷裂，

褐色或淺黃色。而7-6品系之毛狀根細長且表

面平滑呈現鮮綠色，側根少發生但主根系圍繞

培養皿內緣週邊連續增長，其露出培養基挺空

部分則佈滿根毛。探討這些生長特徵差異之原

因可能是在每一個轉殖個體中，農桿根群菌

T-DNA插入植物細胞核染色體的位置和套數會

不相同(Jouanin et al. 1987, Chang 2005)，或是

由於T-DNA在轉殖進行中發生斷裂而造成非整

段嵌入植物染色體內所致(Durand-Tardif et al.

1985)。因此導致T-DNA片段上與毛狀根致病及

影響根群生長的rol基因群在轉移進入植物細胞核染色體時發生質或量的差異，而當此基因群

發生不同之表達時便使得毛狀根的外觀及生長

發生如此巨大的差別。

Fig. 2. Hairy root induction and growth from explants of Paulownia fortunei collected from different parts of seedlings. (A) Leaf apex, (B) lamina (middle 1/3 section), (C) lamina with petiole and (D) internode. Bars = 0.2 cm.

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二、毛狀根生長條件之探討

(一)鹽基濃度試驗

比較鹽基濃度對於泡桐毛狀根生長之影

響，如Fig. 4所示，3-2及7-6品系之毛狀根培養

於1/2 MS培養基上其鮮重及乾重之增加均比培

養於MS培養基者具有較佳之生長速率，惟在

本試驗中此差異在統計上並未達顯著水準(p >

0.10)。就二品系而言，3-2品系的毛狀根生長速

率較快，不過其鮮、乾重增加情形僅較7-6品系

之毛狀根稍高(p < 0.10)。在人蔘(Panax ginseng ×P. quinquefolium) (Washida et al. 1998)毛狀

根之培養中得知，1/2 MS培養基比MS培養基

更能讓根系生長良好，但也有不少的研究報告

認為，MS全濃度的培養基因為含有相對較多的

養分，在培養毛狀根時是比1/2 MS培養基為佳

(Merkli et al. 1997, Kittipongpatana et al. 1998,

Zárate 1999, Lin et al. 2002)，本試驗以泡桐2個

品系毛狀根進行測試，並未見培養基之間的差

異，據此可知毛狀根的培養在培養基濃度的選

擇上是因物種而異的。

(二)光照與黑暗培養試驗

毛狀根於光照與黑暗下培養一個月後觀察

其生長及型態變化，發現7-6毛狀根品系在光照

下培養，根系呈鮮綠色，根尖部分為乳白色，

根系佈滿細小根毛；而黑暗處理之毛狀根則呈

現黃色並呈半透明狀，根系較為細小，在根尖

部位有深黃色之色素累積。3-2毛狀根品系在光

照培養下根系呈現黃白色，黑暗培養之毛狀根

顏色則為深黃色，且側枝明顯增多，在根尖部

分同樣有深黃色之色素累積。Wu (2000)培養枸

杞之毛狀根，與本試驗有同樣之結果，在光照

及黑暗下培養之毛狀根色澤不同；但其在光照

下培養者生長速率較黑暗處理者稍快。在誘導

轉殖芽體從墨西哥萊姆(Citrus aurantifolia)的毛

狀根發生(Pérez-Molphe-Balch and Ochoa-Alejo

1998)或是進行藜豆(Stizolobium hassjoo)之毛狀

根培養(Sung 2000)，則是以黑暗培養較光照培

養具有較佳之效果。

(三)糖類與濃度試驗

培養基中添加糖類的主要目的是為了提供

碳源及調節滲透壓。3-2品系毛狀根培養於含有

不同濃度之蔗糖或葡萄糖之培養基中，其鮮重

及乾重增加情形如Table 2，添加不同碳源對於

毛狀根之生長並無差異性，但是在濃度方面則

有顯著之影響，二種不同碳源均以40 g L-1之濃

度培養毛狀根具有最佳的生長效應，而以低濃

度(10 g L-1)培養時毛狀根生長最差。7-6品系毛

狀根培養於二種碳源中之生長情形，也是在低

濃度時(10 g L-1)其乾、鮮重增加量最低(Table

Fig. 3. Entire view of 2 hairy root culture lines of Paulownia fortunei exhibiting different growth characteristics as described in the text.

406 廖宇 、莊翠婷―以農桿根群菌轉殖泡桐之研究

2)，不過在7-6品系中不論是碳源種類或是濃

度，在統計分析上均沒有顯著影響毛狀根鮮重

及乾重之增加，只是在乾重增加方面，我們觀

察到碳源與濃度有交感效應(Table 2)，當糖類

Fig. 4. Influence of the medium effect (full or half-strength) on (A) fresh- and (B) dry-weight increases in hairy root cultures of Paulownia fortunei.

Table 2. Effects of sugar types and their concentrations on growth of Paulownia fortunei hairy root lines 3-2 and 7-6 based on increases in the fresh weight (FW) and dry weight (DW)

Concentration Weight increase1) (g)

(g L-1)

Line 3-2 Line 7-6 FW2) DW2) FW2) DW2)

Sucrose 10 0.40±0.02 0.01±0.00 0.07±0.02 0.01±6×10-3

20 1.20±0.29 0.07±0.02 0.18±0.14 0.01±6×10-3

30 1.20±0.34 0.08±0.03 0.54±0.13 0.05±2×10-3

40 1.92±1.35 0.14±0.04 0.30±0.09 0.03±10×10-3

50 1.13±0.64 0.09±0.08 0.35±0.26 0.05±27×10-3

Glucose 10 0.43±0.05 0.02±0.00 0.14±0.08 0.02±7×10-4

20 1.03±0.65 0.06±0.05 0.32±0.06 0.03±25×10-4

30 2.03±1.31 0.11±0.07 0.14±0.03 0.02±25×10-4

40 2.57±1.06 0.19±0.07 0.17±0.06 0.02±71×10-4

50 0.36±0.01 0.01±0.02 0.22±0.14 0.01±0.0000Significance3)

Sugar type (S) n.s. n.s. n.s. n.s.Concentration (C) ＊ ＊ n.s. n.s.S×C n.s. n.s. n.s. ＊

1) Data collected form 2 repeated experminents.2) Mean±standard error.3)＊: Significantly different at p < 0.05 detected by Duncan’s new multiple range test. n.s., Not sig-

nificantly different (p > 0.05).

407台灣林業科學 22(4): 399-411, 2007

濃度增加到30 g L-1以上時，葡萄糖對增加7-6品

系乾重的優勢會被蔗糖取代。由測試二個泡桐

毛狀根品系所得之試驗結果可知，蔗糖及葡萄

糖都可以使用作為培養基中之碳源，但是使用

時濃度之高低可能會影響毛狀根的生長。

三、誘導轉殖芽體再生

在泡桐毛狀根再生芽體的試驗中，3-2品

系之毛狀根使用不同濃度的BAP處理一個月之

後並無顯著之變化。而7-6品系培養2週後，可

觀察到培殖體根段二端有膨大之現象，但是在

後續利用不同的培養基繼代培養期間，不論是

將根段或是膨大的癒傷組織切下培養，仍然見

到毛狀根持續自組織上長出，亦無芽體出現。

我們在本試驗中同時得知當BAP之濃度增加到

100 μM時對培殖體會產生毒害的作用，使培

殖體呈現黑褐色而壞死。因此，單一利用BAP

誘導芽體再生之結果並不理想。我們推測因為

農桿根群菌質體T-DNA上攜帶的rolB基因與提高細胞對生長素(auxin)的敏感度有關(Nilsson

and Olsson 1997)，而T-DNA另攜帶有製造IAA

的基因，因此被轉殖的毛狀根細胞除了對IAA

特別敏感之外，同時應該都具有相當高濃度的

IAA，這是它們不需要添加任何植物生長調節

劑就能以根的型態在培養基中不斷增生的原因

之一，而且生長速度比正常根系要快。據此推

測，添加單一cytokinin應無法誘導芽體再生。

以TDZ誘導芽體再生的試驗中，7-6品系

之根段經培養2週後，培殖體末端有鮮綠色腫大

的癒傷組織產生，切下癒傷組織分別繼代培養

於MST-3、4、5培養基中，癒傷組織呈現深綠

色、硬質狀。培養6週後，由TDZ 18 μM處理所

誘導出來的癒傷組織，繼代培養於MST-5的培

養基中可順利誘導芽體再生，這個過程漫長且

芽體產生的數量稀少，我們從34個接受處理的

培殖體中只獲得一個芽體，由此顯示TDZ的處

理並沒有完全改變毛狀根組織內的生理狀況，

被轉殖的組織可能仍然受到IAA的影響而不能

形成芽體。

我們參考Hosokawa et al. (1997)之報告設

計的第二個誘導芽體再生的途徑，是先利用

NAA (0.54 μM)與TDZ (45 μM)之組合來誘導

癒傷組織形成，並自癒傷組織誘導芽體發生。

試驗結果發現誘導不同的毛狀根品系形成癒傷

組織的情形也不盡相同，3-2品系的毛狀根在培

養一個月後，培殖體膨大且表面凹凸不平、呈

現灰色或黃灰色，之後出現綠色及白色透明狀

的癒傷組織。而7-6品系之毛狀根在相同處理

下約一個月左右即可誘導出綠色的癒傷組織。

若將從3-2及7-6品系毛狀根誘導出之癒傷組織

培養於NA A與BA P組合的培養基中 ( M S - 5、

6)，可快速的獲得增殖。但若利用含TDZ的培

養基(MST-1、2)處理癒傷組織二週，接著移往

MST-3、4或5的培養基中，7-6品系之癒傷組

織在MST-3培養基中培養約六週後能成功的誘

導出芽體再生，芽體是由黃色鬆軟之癒傷組織

中長出(Fig. 5)，不過芽體發生率仍然偏低(7個

培殖體形成的癒傷組織中發生1個 )；3-2品系

之癒傷組織在同樣的處理之後仍無芽體產生。

Christey et al. (1997)指出利用TDZ促進芽體從

毛狀根再生，其濃度之高低在不同品系間是不

一定的，有的毛狀根品系僅需三週即可誘導出

芽體產生，但是有些毛狀根品系則需培養好幾

個月才能再生芽體。因此我們認為3-2品系之癒

傷組織，可能為芽體再生較為困難之例子，需

要較長時間的誘導，或是需要更改植物生長調

節劑組合。

Fig. 5. Induction of adventitious shoots from Paulownia fortunei hair root line 7-6 previously treated with NAA + TDZ. Bar = 0.1 cm.

408 廖宇 、莊翠婷―以農桿根群菌轉殖泡桐之研究

四、毛狀根之遺傳鑑定

農桿根群菌在感染植物時，其Ri質體上之

T-DNA會轉移至植物體基因組內，此T-DNA片

段中有一組rol基因各與調整不同之植物生長調節劑含量有關(Nilsson and Olsson 1997)。因此

被轉殖成功的植物細胞或由其發展而成之毛狀

根系的核基因體DNA中會含有此基因片段。本

試驗是以Hosokawa et al. (1997)報告中所設計

rolC基因之引子，經由PCR放大該片段作為毛

狀根是否是受農桿根群菌感染之証據。PCR反

應中的DNA模板(template)分別抽取農桿根群菌

之質體DNA作為正向控制組(positive control)、

16個毛狀根品系之核基因體DNA，以及由3-2及

7-6毛狀根品系所誘導出來之癒傷組織的核基因

體DNA，並以未轉殖之泡桐植株根部所抽取之

核基因體DNA作為對照組(negative control)。

由Fig. 6之電泳分析結果顯示，農桿根群菌之質

體DNA、16個毛狀根品系中的13個樣本以及由

毛狀根所誘導出的癒傷組織之核基因體DNA均

在PCR反應之後出現一段與預期DNA片段大小

相近之條帶(1136 bp)，但是3-1、55-4及55-5之

毛狀根品系並無此條帶出現，而對照組未接受

農桿根群菌感染之根系無此條帶出現。將經由

PCR放大的DNA片段進行定序後可獲得一致的

DNA序列，並與NCBI資料庫中rolC基因的序列進行比對(assession no.: K03313.1)，所得的結

果相似度可達99%。因此可証實本研究中泡桐

之毛狀根確實是由農桿根群菌感染成功而產生

之器官，而其經由組織培養操作後產生之癒傷

組織亦含有相同基因片段，並無因操作而發生

變異。

五、改善誘導芽體再生體系之策略

本研究完成以農桿根群菌轉殖泡桐之程序

並嘗試了誘導轉殖植株再生，在探討農桿根群

菌轉殖效率之影響因子方面，菌株品系及培殖

體之種類是重要之因子。本試驗所用之農桿菌

株屬於agropine type之農桿根群菌，此類型之

農桿根群菌其T-DNA在質體上並不連貫，分別

由二個分開的DNA片段：TR T-DNA及TL T-DNA

組成。在TR T-DNA區域有合成auxin的基因，在

TL T-DNA上則有rolB基因使細胞對IAA敏感，

因此認為其具有較高之致病性，能夠感染較多

的植物種類，並能有效誘導毛狀根產生(Hamill

Fig. 6. Using rolC gene fragments as primers, the polymerase chain reaction (PCR) analysis of Paulownia fortunei transformed by Agrobacterium rhizogenes showed a clear band at about 1100 bp as expected. The following letters and series cell line numbers designated for each lane represent the source of the DNA templates used in the PCR reactions. P, plasmid DNA of A. rhizogenes; CK, genomic DNA of root tissues extracted from in vitro cultured plants not infected by A. rhizogenes; lanes 1, 3, 5 and 6~15 are genomic DNA obtained from hairy root lines 3-2, 7-6, 4-8, 11-1, 23-1, 23-2, 26-1, 46-1, 55-1, 55-2, 55-3, 55-7 and 55-8; lanes 2 and 4 are genomic DNA extracted from callus tissues derived from hairy root lines 3-2 and 7-6, respectively. Marker DNA showing a 100-bp DNA ladder and arrows indicating 1000-bp positions.

409台灣林業科學 22(4): 399-411, 2007

and Lidgett 1997)。但是在誘導芽體發生時這個

優點可能會對芽體生長產生阻礙，因為一般的

認知，高auxin含量的生理環境應該不適合誘導

芽體增生。

利用農桿根群菌誘導毛狀根大量生產，並

從毛狀根誘導芽體再生已有許多成功的例子。

在許多作物及草本植物的例子中，不定芽體通

常不需要任何植物生長調節劑誘導就可自發性

的從毛狀根產生(Christey et al. 1997, Cui et al.

2001, Yu 2002, Bijelović et al. 2004, Lee et al.

2004)，而Moriuchi et al. (2004)則指出生長緩慢

或是增殖速率較低的毛狀根品系，才能在無添

加任何植物生長調節劑的培養基中自發性的長

芽，而生長具有活力之毛狀根品系可能會抑制

芽體之再生。似乎可以印證如果毛狀根在接受

農桿根群菌移轉T-DNA時，如果因故接受到不

完整的TR T-DNA而難以合成auxin或rolB基因缺損導致細胞對IAA的敏感性不高，或是這些基

因的套數在轉殖細胞中較低時，毛狀根之生長

應當相對緩慢，但這可能就是芽體自發性產生

的前提，因為此時植物細胞內IAA濃度不再高

到阻礙芽體發生，不過這種論述需要更進一步

之實驗驗證。

泡桐在林業經營上很容易利用其根段進行

不定芽繁殖法增生苗木，在形成毛狀根後如果

也能維持這種特點，則轉殖植株應該會很快產

生。但是顯然在接受農桿根群菌感染後，改變

了這種繁殖特性，本研究所接種產生的毛狀根

品系無一發生自發性的芽體。我們雖然嘗試過

利用不同濃度之BAP添加在培養基中誘導芽體

發生，但並未成功。由於毛狀根段之培殖體仍

不斷的產生新的根系，顯示毛狀根內IAA之含

量可能仍屬偏高。Christey et al. (1997)及Cho

and Widholm (2002)建議利用TDZ並且認為其

為誘導芽體再生更有效之cytokinin。在本研究

中，不管是單獨以TDZ或是TDZ與NAA之組合

均能誘導出綠色之癒傷組織，若持續繼代於低

濃度TDZ之培養基中的確可成功地誘導芽體再

生。但是，本試驗中再生芽體之效率仍低，不

排除芽體也有可能為偶發性的產生，或是TDZ

處理之濃度、時間並未達最適當的選擇。

本文緒言中述及有關泡桐類植物的基因轉

殖工作，在Hang (2002)、Prakash and Kumar

(2002)與Mohri et al. (2003)的報告中被提及，

他們都使用農桿腫瘤菌作為媒介，而結果從完

全沒有得到轉基因植株之再生到僅獲得少量之

轉殖株不等，其遭遇的困難不在農桿菌T-DNA

的感染，而是出自使用抗生素進行細胞篩選所

致。Du et al. (2005)的報告雖然也提出農桿腫瘤

菌接種泡桐植物的程序，但作者沒有討論這類

相關問題。從其呈現的數據中得知最少育成10

株轉殖株，但由於不知道接種培殖體的數量，

無從推估成功比率。對於一個對組織培養處理

反應良好且再生容易的經濟樹種來說，泡桐

的基因轉殖工作應該有很大的改善空間以及應

用價值。本研究使用野生型農桿根群菌轉殖泡

桐，避開抗生素篩選的步驟，雖然比Bergmann

et al. (1999)在蘭考泡桐所得到的成果更進一步

獲得轉殖的不定芽體，但是仍然沒有獲得轉殖

株。我們在後續的試驗中計劃測試修改過的質

體，希望修改過的質體在遞送DNA時不要在被

轉殖的植物細胞中形成過量生長素，若可藉此

提高這個轉殖系統芽體的發生比例並發展成為

一個有效率的方法，則在針對泡桐進行基因轉

殖的研究時將會有另一個有利的選項。

謝誌

本研究承蒙本校農業生物技術研究所古森

本博士、顏永福博士，農委會林業試驗所邱文良

博士及陳國峰先生支援實驗室儀器設備並提供實

驗操作技術之指導，謹此申謝。實驗工作之進

行亦感謝許菁芬小姐的協助始得以順利完成。

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