strukturkjemiske metoder 1 - universitetet i oslo...raman, uv/synlig, mcd, dft, modellering, samt...

1

STRUKTURKJEMISKE STRUKTURKJEMISKE METODERMETODER

X-Ray, NMR, EM, AFM, CD, MS, EXAFS, Raman, UV/synlig, MCD, DFT, modellering, samt symmetri.

KJM5310 – F4, F5, F6Biologiske makromolekylers struktur

Høsten 2004 - Hans-Petter Hersleth

Strukturkjemiske metoder 1

• Hele 3D-strukturen

– Røntgendiffraksjon (Proteinkrystallografi)– NMR (Nukleær magnetisk resonans spektroskopi)– Homolog modellering

• Overflaten

– Elektronmikroskopi (Kryo-EM)– Atomic force microscopy

• Primær eller sekundærstruktur

– MS (massespektrometri)– CD (circulær dikroisme)– Algoritmer

for studie av makromolekylers struktur

2


• Delstrukturer / Aktivt sete– UV/synlig-spekroskopi– Resonance Raman/IR-spektroskopi– EXAFS (Extended X-ray Absorption Fine Structure)– EPR (Elektron paramagnetisk resonans spektroskopi)– MCD (magnetisk circulær dikroisme)– Mössbauer spektroskopi– DFT-beregninger (density functional therory) / Kvantekjemi– Modellering

for studie av makromolekylers struktur


• For å få hele strukturen er røntgendiffraksjon og NMR hovemetodene. De andre metodene er et utvalg av de mest utbredte.

• Det gis her kun en overfladisk beskrivelse av metodene med særlig henblikk på å få innsikt i hvilke metoder som finnes og hvilken informasjon en kan få fra de.

• Røntgendiffraksjon vektlegges sterkest i gjennomgangen. (ellers anbefales kurset KJM5300 Proteinkrystallografi og MBV4020 Arbeidsmetoder i molekylærbiologi og biokjemi II).

3

HELE 3DHELE 3D--STRUKTURENSTRUKTUREN

Røntgendiffraksjon 1

• Ved å plassere krystaller av makromolekyler i en røntgenstråle får man et sprednigsmønster (diffraksjon) av strålen som man registerer. I dette mønsteret ligger det informasjon om krystallenes oppbygging – og i dette også strukturen til molekylet(ene) som danner krystallen.

Proteinkrystallografi

4


• Man bruker røntgenstråler fordi bølgelengden til disse strålene er av samme størrelsesorden som de atomer man ønsker å ”se”. I et vanlig lysmikroskop kan man se objekter med størrelse ned til bølgelengden av vanlig lys – noe mer forstørrelse kan man ikke sette inn, slike linser finnes ikke.



• Begreper og bakgrunn:

– Krystaller: periodisk gitter med molekyler organisert sytematisk i såkalte enhetsceller

– Diffraksjon: fenomen som skyldes spredning av stråling fra et gitter

– Røntgenstråling: Diffraksjon er bare mulig hvis bølgelengden er at samme størrelsesorden som objektet man skal ”se”


5


– Faseproblemet: etter at strålen treffer krystallen og spres må de spredte strålene samles igjen slik at man kan lage et ”bilde” av molekylene i krystallen. Ingen linse kan fokusere røntgenstråling – dette må gjøres i en datamaskin (flere ulike metoder – ikke viktig i KJM5310). Det er kun amplituden (intensiteten) som kan måles, ikke fasen.

– Elektrontetthet: Det er elektroner som sprer strålen og dermed får vi et bilde av elektrontettheten (et konturkart) ut fra fokuseringsprosessen. Inn i denne tettheten plasseres aminosyrene slik at vi får en 3D-modell av molekylet. I og med at det er elektroner som sprer strålen er intensiteten avhenging av atomets antall elektroner.



– Krystallisering og krystaller: Krystaller dannes ved at en løsning av molekylet bringes langsomt over løselighetspunktet slik at fast stoff felles ut. Mange ulike forsøksbetingelser (pH, salt, buffere, additiver m.m.) må ofte prøves ut.

Molekylene (protein, DNA-fragment, tRNA, viruspartikler) danner regelmessige mønster – gjerne med symmetri – når de krystalliserer. Symmetrien kan være av to typer: ren rotasjon og rotasjon + translasjon [For krystaller generelt har vi også speiling og inversjon, men det går ikke med våre kirale makromolekyler]


Salt concentration

6

Symmetri i krystaller og makromolekyler

• Det finnes tre ulike symmetri-typer for isolerte objekter:

– Rotasjoner (2,3,4,5,6-tallig er de vanligste)– Speilplan– Inversjon

• Det er bare symmetri av den første typen som kan forekommer for biologiske makromolekyler pga deres kiralitet som ikke blir bevart ved speiling og inversjon.

• For krystaller kommer i tillegg translasjon/forskyvning langs akser. Dette kalles skruakser. Symbolet for dette er Nr hvor N er rotasjonens orden mens r forteller hvor mange r/N-deler forflytningen er fra et objekt til neste.– Eksempel: 41 betyr 4-tallig symmetri med translasjon ¼. Dette kommer

vi tilbake til når vi ser på α-helikser og DNA-typer

Symmetri i krystaller og makromolekyler

• Mange makromolekyler danner såkalte oligomerer, dvs at det aktive molekylet finnes i flere symmetri-relaterte kopier i en enkelt partikkel. Dette har flere fordeler:

– Flere aktive seter pr. partikkel– Lavere osmotisk trykk– Mulighet for kommunikasjon mellom enhetene– Mer stabil struktur

• Eksempler:

– Hemoglobin består av 2x(a+b) enhet. Kommunikasjon mellom de to kopiene forbedrer oksygenopptak og frigjøring

– Transkripsjonsfaktorer har ofte 2-tallig symmetri for å binde bedre til DNA som da har tilsvarende symmetri på bindingsstedet.

– Mange ionekanaler, membranproteiner og andre sirkulære molekyler har symmetri (mindre genom, symmetrisk omgivelser)

7

Røntgendiffraksjon 6• Instrument og datainnsamling

– Diffraksjosmønsteret samles inn ved hjelp av enten et hjemmeinstrument med røntgengenerator eller på et synkrotronanlegg. Resultater er en liste med intensiteter for 10.000 til 100.000 spredte stråler. Disse inneholder informasjon om elektrontettheten.

– Diffraksjon og spredning av stråling:Krystallen vil fungere som et gitter med mange krystallplan som reflekterer strålen i ulike retninger. Jo tettere disse planene ligger, jo større blir spredningsvinkelen. Samtidig øker oppløsningen og detaljnivået i strukturdataene.



• Faseproblemet og løsning av fokuseringsproblemet

– Ved å bruke denne ligningen kan man regne ut et kart som man bruker til modellbygging. Desto tettere bølger man legger sammen jo merdetaljert blir modellen. Dette måles ofte i Ångstrøm. At en struktur har en oppløsning på 2.2 Å betyr at de tetteste bølgene som ble lagt sammen for å regne ut kartet kom fra krystallplan med 2.2 Å avstand og har tilsvarende detaljrikdom.

)()()( hklh k l

V lzkyhxcoshklFxyz απρ −++= �� 21


8


• Fordeler og ulemper+ Gir ofte svært gode og nøyaktige bilder av makromolekyler

+ Modellene er ”korrekte” i den forstand at data ikke skal tolkes, slik som i NMR

+ Kan lage modell av hele molekylet – både overflaten og de indre deler, molekylene er ”gjennomsiktige”

– Må ha krystaller av molekylet

– Relativt dyrt instrument

– Destruktiv teknikk, proteinprøven ødelegges av stråleskade

– Ser et stivt gjennomsnittsmolekyl – ikke et dynamisk pulserende og fleksibelt molekyl

– Ser ikke molekylet i sitt rette element – i vannløsning – men det er mye vann i krystallene og det har vist seg å være god overensstemmelse mellom krystallstruktur og strukturer av protein i løsning

NMR 1

• Kjernemagnetisk resonans – observasjon av overganger mellom energinivåer for atomkjernespinn i et sterkt magnetisk felt.

• Kan observere omgivelsene til utvalgte atomkjerner (vanligvis 1H og 13C, men også 15N, 17O og 31P er av biologisk interesse)

• Fra mønsteret på spekteret (et 2-dimensjonalt spekter) kan man lese av såkalte koplingskonstanter – som viser vekselvirkning mellom ulike magnetiske kjerner som er i nærheten av hverandre.

Nuclear Magnetic Resonance

9

NMR 2

• Når molekylet plasseres i et magnetisk felt så ordner kjernenes spinn seg med feltet. Ved å sende inn radiofrekvens så kan man eksitere. Når kjernen faller ned igjen til likevektstilstanden sendes det så ut en stråling som kan observeres. Frekvensen til strålingen fra hver kjerne er forskjellig for hvert atom og er avhengig av miljøet rundt kjernen. Frekvensverdien relativt til en referanse kalles kjemisk skift.

• Kobling med n andre like kjerner gir en splitting i n+1 antall topper

1D 1H-NMR spektrum


NMR 3

• Det er to typer av slike koplingskonstanter:

– Direkte gjennom kovalente bindinger (2 eller 3 bindinger i avstand, eks. H-C-C-H) (COSY, correalation spectroscopy)

– Indirekte gjennom rommet (NOE-kopling, Nuclear Overhauser Effekt)


10

NMR 4

• Siden avstanden mellom hydrogenatomene i to påfølgende aminosyrer i proteiner er 4 bindinger vil COSY eksperiment kun gi koblinger mellom atomer i samme aminosyreresidue. Dette gir ”fingerprint” signaler for hver aminosyre.


NMR 5

• NOE koblingene kan være mellom naboaminosyrer eller mellom aminosyreresiduer som er sekvensmessig langt fra hverandre, men som er nærme hverandre i rommet:


11

NMR 6

• 2D 1H NMR NOE spektrum viser kobling mellom H-atomer som er nærmere hverandre enn 5 Å i rommet.


NMR 7

• Koplingskonstantenes størrelse forteller om avstanden mellom atomkjernene

• Man setter opp en avstandstabell for molekylet

• Fra denne tabellen konstruerer man en 3-dimensjonal modell av molekylet hvor alle avstandene stemmer med observasjonene.

• Flere modeller kan være aktuelle. I tillegg kan modellene gi indikasjoner på fleksibilitet i bestemte områder av proteinet (for eksempel i looper).


12

NMR 7

• Flere modeller kan være aktuelle. I tillegg kan modellene gi indikasjoner på fleksibilitet i bestemte områder av proteinet (for eksempel i looper).


NMR 8

• Fordeler og ulemper

+ Utføres på molekyler i løsning – relativt enkelt eksperiment rent praktisk, ikke-destruktiv teknikk

+ Kan gi detaljert strukturinformasjon om hele makromolekylet, både overflate og indre deler. Viser informasjon om dynamiske prosesser.

– Komplisert spekter som er vanskelig å tolke

– Relativt dyrt instrument

– Modellen behøver ikke være korrekt, man kan få flere alternativemodeller som alle passer til observerte data

– Dyrt instrument


13

OVERFLATENOVERFLATEN

Kryo-EM 1

• Spredning av elektroner fra 2-dimensjonal flate. Fotografering ved hjelp av elektroner istedenfor vanlig lysbølger.

– En-partikkel elektronmikroskopi (midler mange like kopier)

– Elektrontomografi (f.eks bilde av en hel celle, enkeltbilder)

• Bestråling av prøver med elektroner fører til stråleskader, de reagerer med prøven. Derfor kryo-EM.

• For å bygge 3D-modeller av molekylære komplekser trengs mange objekter (forsterkning av signal + flere synsvinkler). Gjennom en matematisk prosess dannes en 3D-modell som viser hvordan molekylet ser ut.

Elektronmikroskopi

14

Kryo-EM 2

• Kryo-EM av ribosomet til 11 Å oppløsning

• De senere år har utviklingen vært stor på EM-området, og mange kombinerer nå EM med NMR/krystallografi for å bygge modeller av molekylære komplekser hvor hver del bestemmes i detalj fra krystallografi/NMR mens komplekset rekonstrueres vha disse byggesteinene og EM-eksperimenter

Elektronmikroskopi

Kryo-EM 3

• Strukturen av ”cell-puncturingdevice” til bakteriofag T4

– Krystallstruktur til 2.9 Å er kombinert inn i 17 Å kart fra kryo-EM:

Elektronmikroskopi

15

Kryo-EM 4Elektronmikroskopi


+ Har ikke behov for krystaller, kan ta bilde direkte av molekyler i en vannløsning/membran. Spennende teknikk for membranproteiner, proteinkomplekser og viruspartikler. Molekylet i sitt rette element.

– Relativt lav oppløsning, kan ikke se fine detaljer i makromolekylene, får et omriss av overflaten av objektet. Oppløsningen forberedes med nye instrumenter.

– Matematisk krevende, skal konstruere 3-dimensjonal figur fra mange ”flate” bilder av partikkelen i ulike orienteringer

– Dyrt instrument

AFM 1

• Atomic force microscopy er en visualiseringsmetode som tilhører gruppen scanning probe microscopy (SPM).

• Prøvens skannes med en prøvetip som interagerer med strukturelle trekk med overflaten gjennom ”aggregat-atomære krefter” slik at prøvetippen forskyves vertikalt.

Atomic Force Microscopy

Undersøkelse av krystallgroing, og defekter ved viruskrystaller

16

AFM 2


+ Unike ”real-time” in situ visualiserings muligheter. Store muligheter for ”real-time” studier av biomolekylære fenomener.

– Relativt lav oppløsning, kan ikke se fine detaljer i makromolekylene, får et omriss av overflaten av objektet.

Atomic Force Microscopy

PrimærPrimær-- og sekundærstrukturog sekundærstruktur

17

MS• MS-instrumentet produserer ioner fra en prøve som injiseres – ofte ved at

molekylet splittes i fragmenter.

• De ulike fragmentene separeres etter deres masse/ladnings-forhold (m/z-verdi) og intensitet til hvert signal forteller hvor store mengder det dannes av hvert fragment.

• Ut fra fragmenteringsmønsteret – spekteret – kan man utlede molekylets struktur. Denne utledningen fungerer best for relativt små molekyler.

• Metoden kan brukes til å sekvensbestemme proteiner (primærstruktur)


+ Kan finne svært nøyaktige molekylvekter (Elektronspray for proteiner).

+ Svært følsom teknikk, krever minimalt med prøvemengde

– Destruerer prøven

– Kan ikke utlede 3-dimensjonal struktur, kun hvilke fragmenter molekylet er bygget opp av.

Massespektrometri

CD-spektroskopi• Måler forskjell mellom absorpsjon av venstre- og høyredreiende polarisert

lys om funksjon av bølgelengde på lyset.

• Siden proteiner er kirale molekyler med kirale elementer (α-heliks, β-strands) vil ikke absorpsjon av de to typene lys være like stor.

• Benyttes for å bestemme hvor stor del av et protein som danner slike helikser.

• Benyttes også mye for å studere denaturering (nedbrytning) av proteiner siden helikser da brytes ned – stabilitetsstudier.


+ Enkel metode

+ Bevarer prøven

– Gir lite detaljert informasjon kun %-vis fordeling av heliksstruktur

Circular Dichroism

18

Algoritmer• Bruker algoritmer for å predikere sekundærstruktur. Hver

aminosyre tildeles en sannsynlighet for å være i α-heliks og β-plate.

Sekundærstruktur prediksjon

DELSTRUKTUR DELSTRUKTUR ––AKTIVT SETEAKTIVT SETE

19

UV/synlig-spektroskopi• Observerer elektroniske overganger i aromatiske/kongjungerte

systemer og kofaktorer som haemgruppen.

• Kan brukes til å gi lokal informasjon om tilstander.

• Kan brukes på enkrystaller for å angi tilstanden til det aktive setet i proteinkrystallen som benyttes i røntgendiffraksjon.

EXAFS 1

• Det er vanligvis aktive seter med metallatomer som undersøkes.

• Når det sendes inn røntgenstråling med økende energi vil det ved et punkt absorberes kraftig. Dette tilsvarer ”utsparking” av et elektron (fotoelektrisk effekt). Plasseringen av denne toppen forteller noe om oksidasjonstilstanden (XANES).

Extended X-Ray Absoption Fine Structure

• EXAFS området er det på oversiden av absorpsjonskanten.

20

EXAFS 2

• EXAFS området gir informasjon om ligandområdet 4-5Å fra atomet som absorberer.

• Fenomenet skyldes tilbakespredning fra ligandene rundt det absorberende atomet.

• EXAFS besvarer: Hvor mange atomer av hvilket slag i hvilken avstand fra det absorberende atomet?

• En modell prøves å tilpasses de observerte dataene.

Extended X-Ray Absoption Fine Structure

Resonans Raman spektroskopi

• IR-spektroskopi: vibrasjonen til enkeltbindinger

• Raman-spektroskopi: Benyttes til å studere blant annet bindingstyper, vibrasjonskarakteristikken til metallsentre i proteiner.

21

EPR-spektroskopi

• Elektron paramagnetisk resonas (EPR), også kalt elektron spin resonans (ESR), brukes til å observere forbindelser som inneholder ett eller flere uparede elektroner.

Electron Paramagnetic Resonance

• Et elektron har spinn S=½ med to muligheter for magnetisk moment ms=±½. I et ytre påtrykt magnetisk felt B vil dette gi mulighet for to orienteringer av det magnetiske momentet: parallelt (β-spinn) eller antiparallelt (α-spinn) med det ytre feltet. Dette gir en splitting av energinivåene til elektronet som vist i figuren, kalt Zeeman-effekten.

• For å få elektronovergang fra parallel til antiparallel tilstand ved absorpsjon må en sende inn elektromagnetisk stråling med en energi lik differansen i energinivå (= mikrobølgefrekvens)

EPR-spektroskopi

• g-verdien reflekterer det elektroniske miljøet rundt et uparretelektron eller eventuelt flere magnetisk koblede elektroner.

• EPR spektroskopi er et viktig redskap i studier av biologiske systemer som inneholder paramagetiske forbindelser som radikaler, elektron-overføringssentre og metallioner.

Electron Paramagnetic Resonance

22

MCD

• Bruker et magnetisk felt i forbindelse med CD-spektroskopi.

• Dette kan gi informasjon om koordinasjonstallet for ligerte metallsentre i proteiner

Magnetic Circular Dichroism

Mössbauer spektroskopi• Teknikk som studerer overganger i atomenes kjerne og

forutsetter derfor kjerner med lavtligende eksiterte tilstander. Denne effekten er observert for 43 grunnstoffer hvor 57Fe er av størst relevans for proteiner.

• Kan gi informasjon om spinntilstand og oksidasjonstilstand.

23

Kvantekjemi

• For proteiner kan man gjøre kvantemekaniske beregninger av området rundt aktive seter (altså på et system med begrenset antall atomer, hele proteiner er umulige)

DFT - Density Functional Theory

Modellering• Energien til et molekyl regnes ut ved å sammenligne alle

bindinger og kontakter i molekylet med en rekke referanseverdier hentet fra ulike eksperimenter.

• Den totale energien er lik summen av alle energibidrag fra

– Kovalente bindinger– Bindingsvinkler– Torsjonsvinkler– Van der Waals kontakter– Elektrostatiske (ioniske) kontakter– Eventuelt andre bidrag (finjustering)

• Formelen som brukes til å regne ut energien kalles kraftfelt. Det finnes mange ulike kraftfelt laget for ulike formål.

Molekylmekanikk

24

Eksempel• Ofte kombinerer man flere av disse forskjellige metodene for å

få en best mulig beskrivelse.

• Myoglobin compound II som eksempel:

– Krystallografi

– Resonance Raman

– EPR

– Lysaborbsjon

– Mössbauer

– DFT

Myoglobin compound II

strukturkjemiske metoder 1 - universitetet i oslo...raman, uv/synlig, mcd, dft, modellering, samt...

Documents