Structure­function prediction of Glycosylphosphatidylinositol (GPI)­anchored fungal

Aspartic peptidases

María Victoria Revuelta*, Facundo Orts*, Arjen ten Have** Instituto de Investigaciones Biológicas (IIB­CONICET), Mar del Plata, Buenos Aires, CP 7600, Argentina.mrevuelta@mdp.edu.ar, facundoorts@gmail.com, atenhave@mdp.edu.ar

Introducción* Aspartil Proteasas (APs) son peptidasas que poseen dos lóbulos homólogos * El sitio activo esta formado por dos Aspartatos y una Tirosina en el motivo D[TS]G­Y­D[TS]G. * Forman una familia de proteínas con muy baja conservación de secuencia pero con la estructura conservada. * APs están involucradas en digestión (pepsina), Alzheimer (BACE), Malaria (Memapsinas) y SIDA (HIV, Candida spp.) * Las yapsins son APs de ascomicetes involucradas en la maduración de péptidos (feromonas (Saccharomyces cerevisiae), otras hidrolasas (Candida albicans)) * Las yapsins permanecen ancladas a la membrana y muestran una alta especificidad de sustrato. * En un análisis en el hongo planta­patógeno Botrytis cinerea se han identificado y clasificado 14 APs (Tabla 1).

ResultadosFigura 1: Análisis filogenéticos de 265 secuencias de hongos. A: Análisis realizado en base a las secuencias completas (enzima madura, sin secuencia que corresponde al motivo GPI). B: Análisis realizado removiendo de las secuencias el “polyproline loop” (G298­N303). C: Análisis realizado removiendo el “SS1­loop” (D48­F58). D: Análisis realizado removiendo cuatro "flaps" sobre el subsitio catalítico (D48­C59, Y84­S89, S244­F251, A281­K293). Sobre los modelos de SAP1 (1QZW, C. albicans) se muestran, en rojo, los residuos D[TS]G­Y­D[TS]G conservados, y en verde las secuencias removidas para el análisis.

B) C) D)

Figura 2:Análisis por Evolutionary Trace Conservación de secuencia, mostrado en el modelo de SAP1. A: representa el grado de conservación de residuos para todas las secuencias en el análisis filogenético. B: se analizan solo las secuencias de la rama “yapsin­like”. C: análisis de la rama de las “yapsins”.

Figura 3:Análisis de co­adaptación de residuos por COMULATORA: Heatmap obtenido del software. B: Representación de la interrelación de los residuos sobre el modelo SAP1. En azul: D[TS]G­Y­D[TS]G. C: Diagrama de flujo para la interpretación del heatmap sobre el modelo.

27 144

212

235

237

253

255

281

383

492

27144212235237253255281383492

D37 → E133 → L157 → S219 - F237, T256D86 I169 N219 L296

A)

B)C)

A) B)

C)

Discusión

­ La remoción del Polyproline loop, involucrado en la especificidad de sustrato, resulta en un salto de la rama de 2qzw hasta la rama de las Yapsins.­ El SS1­loop, específico de las yapsins, también afecta a la función, ya que un grupo de parálogos de Yarrowia lipolytica agruparon con las yapsins luego de la eliminación de las sub­secuencias SS1.­ La remoción de las sub­secuencias de los cuatro "flaps" sobre el subsitio catalítico genera que AP6, que pertenece a la vía de secreción, agrupe con las yapsins directamente. Esto sugiere una importancia de estos "flaps" en la función.­ Entonces, identificamos seis "loops" que se hallan sobre el (sub)sitio de las APs y que afectan la ramificación del árbol filogenético, lo cual sugiere que están involucradas en la especificidad por el sustrato.­ El análisis de coevolución indica una gran interrelación entre los residuos que rodean el sitio catalítico. Además parece que existe una red de residuos que muestran co­adaptación.

BcAP1 BcAP2 BcAP3 BcAP4 BcAP5 BcAP6 BcAP7 BcAP8 BcAP9 BcAP10 BcAP11 BcAP12 BcAP13 BcAP14Localización Citosol Vacuola GPI-Membrana GPI-Membrana Secretada ER/Golgi Secretada Secretada Secretada Secretada GPI-Membrana Pared celular GPI-Membrana ER/Golgi

Yapsin like? No No Sí Sí No Sí No No No No Sí Sí No NoTabla 1

Important Unimportant

A)