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Structure et morphologie de l’amylose synthétisée in vitro par l’amylosaccharase
Gabrielle Potocki-Veronese, Cécile Albenne, Pierre Monsan, Magali Remaud-SimeonINSA Toulouse –Ingénierie Enzymatique Moléculaire
U.M.R. CNRS 5504, U.M.R. INRA 792
Jean-Luc Putaux, Danielle Dupeyre
CERMAV Grenoble, Structure et Propriétés des Glycomatériaux
Alain Buleon
INRA Nantes, Unité de Physicochimie des Macromolécules
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Amylose
Amidon amylose
amylopectine
Métabolisme de l’amidon : biosynthèse de l’amylose
GBSSI
Amidon phosphorylase
ADP-Glc + α-1,4-Glcn ADP + α-1,4-Glcn+1
Glc-1-P + α-1,4-Glcn Pi + α-1,4-Glcn+1
OH
H
H
O
CH2OH
HO OHH
OH
H
H
O
CH2OH
HO OHH
OH
H
H
O
CH2OH
HO OHH
OH
H
H
α(1-4)
Mw ~10 6 -107OH
H
H
O
CH2OH
HO OHH
OH
H
H
O
CH2OH
HO OHH
OH
H
H
O
CH2OH
HO OHH
OH
H
H
α(1-4)
Mw ~10 6 -107
OH
H
H
OHO OHH
OH
H
H
O
CH2OH
HO OHH
OH
H
H
O
CH2OH
HO OHH
OH
H
H
CH 2
H
2CHOH
HH
H
H
HO
OH
O
Ø
cluster
D ~1 6P 5 ( nm)
α(1-6)
α(1-4)
Mw ~10 -10
OH
H
H
OHO OHH
OH
H
H
O
CH2OHCH2OH
HO OHH
OH
H
H
O
CH2OHCH2OH
HO OHH
OH
H
H
CH 2
H
2CHOH
HH
H
H
HO
OH
OH
2CHOHCHOH
HH
H
H
HOHO
OHOH
O
Ø
cluster
D ~1 6P 5 ( nm)D ~1 6P 5 ( nm)P 5 ( nm)
α(1-6)
α(1-4)
Mw ~107 -108
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Structure de l’amylose
(Imberty et al., Starch/Staerke, 1991)
- Amylose et amylodextrines recristallisent sous forme d’agrégats ou de gelsen fonction du DP et de la concentration- Le type cristallin résultant (A ou B comme dans l’amidon natif) dépend de la température, du précipitant et du DP - Refroidissement de solutions aqueuses d’amylose ou amylodextrines : type B
(Imberty et al., J. Mol. Biol., 1988)
0 5 10 15 20 25 30
I
Angle de diffraction
Type B
Type A
Diffraction des rayons X
Modèles 3-D
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Amylosaccharase : du saccharose à l’amylose
Saccharose
Amylosaccharase
fraction insoluble amylose
fraction soluble
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L’amylosaccharase pour la synthèse d’amylose in vitro
Amylosaccharase
Saccharose : agro-ressource abondante et peu coûteuse
Expression recombinante chez E.coli800 mg/litre de culture
Synthèse d’amylose sans amorce
Enzyme pure (chromato. affinité TAG)
GBSSI, Amidon phophorylase
GBSSI : ADP-Glc Amidon phosphorylase : Glc-1-P
GBSSI recombinante inactive
GBSSI : amylopectine du grainAmidon phosphorylase : α-glucanes
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L’amylosaccharase pour la synthèse in vitro d’amylose
Objectifs
- Synthèse d’ α-glucanes de structure et propriétés contrôlées
- Systèmes bio-mimétiques de la biosynthèse de l’amidon
contrôle de la synthèse d’amylose
- Éléments structuraux impliqués dans la spécificité pour le saccharose
et la transglucosylation
- Mécanisme catalytique de polymérisation
- Structure du polymère
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Du saccharose à l’amylose
F G-Ftrehalulose
F
G-Fturanose
Isomerisation
G-enzymesaccharose
GF + enzymeF
G2
G3maltotriose
G
G2maltose
PolymerisationExtrémité non-réductriceMécanisme non-processif
Gn
Gn+1
Amyloseinsoluble
Maltooligosaccharides solubles
G
HydrolyseH2O
glucose
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Caractérisation structurale de l’amylose
EnzymologieContrôle de la synthèse
MicroscopieMorphologie
Approche pluridisciplinaire
Diffraction des rayons XCristallinité
Analyse Enthalpique DifférentielleThermostabilité
Biochimie analytiqueTaille, rendements, cinétiques
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Conditions réactionnelles
Concentrations initiales en saccharose100 mM (réaction A100)300 mM (réaction A300)600 mM (réaction A600)
Température 30°C
Incubation 16-28 h consommation totale du saccharose
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Rendements finaux
24 g/l
3 g/l
050
100150200250300350400
S P S P S P
rési
dus
gluc
osyl
es in
corp
orés
(mM
)
amylose insolubleisomères du saccharoseDP>25 DP4-DP25DP2-DP3glucose
A100 A600A300
3 g/l
24 g/l
54 g/l
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Analyse de la fraction insoluble
4 20 30 40 50 60 70 80 90 100 112-0,005
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100 GABY 040510 #29 [modified by dionex] D24h concentré ECD_1µC
min
HPAEC
DP4
DP90
Mécanisme de polymérisation non-processif : forte polydispersité
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Chromatographie d’exclusion de taille
A100 A300 A600DP 58 45 35
Polydispersité 3.0 2.6 2.3
Faibles concentrations en saccharose longues chaînes diluéesHautes concentrations en saccharose courtes chaînes concentrées
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Morphologie : MET
Réseaux
Unités élémentaires 10-15 nm
Agrégats
A100 A300 A600
X 200 000 X 5 000 X 5 000
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Morphologie : MEB
Particules ovoïdes
Agrégats de particules 1-2 µm
A300 A600
Particules isolées 4-5 µm
X 3 000
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Morphologie : microscopie optique
Croix de MalteOrganisation sphérulitique
A300 A600
Biréfringence intense et homogène1 orientation par particule
X 500
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Diffraction des rayons X
% crystallinité
5 10 15 20 25 302 thetas
DiffractedIntensity
5 10 15 20 25 305 10 15 20 25 305 10 15 20 25 302 thetas
DiffractedIntensity
Taille latérale(nm)
94
83
45 8.9
16.0
11.8
A600
A300
A100
DP
35
45
58
Type B
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Analyse Enthalpique Différentielle
Tm↑ DP↑
Traitement thermique 5 min 90°C
0 80 120 160 200
T (¡C)
A100
A300
A600
Endothermic Flux
40
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Traitement thermique
Crystallinité augmente de 30 %
5 min 90°C
5 10 15 20 25 302 Thetas
A600-TT
A600-NTT
A100-TT
A100-NTT
DiffractedIntensity
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Pourquoi des structures si différentes ?
Cinétiques de précipitation et de polymérisation
- turbidimétrie des milieux de synthèse
- capacité de liaison à l’iode
- cinétique d’apparition des produits
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Turbidité
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
0 10 20 30
Reaction time (h)
Turb
idity
(OD
600
nm
)
A100A300A600
2 mécanismes de précipitation :-A100 : précipitation progressive des plus longues chaînes diluées-A300, A600 : précipitation soudaine des petites chaînes concentrées
CTL A100 A300 A600
[chaînes DP>3]19 g/l
8 g/l
36 g/l
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Polymérisation et précipitation
Temps de réaction
[saccharose] 100 mM
[saccharose] 600 mMMaltooligosaccharides
x2
1 h0.4 h
Interactions inter-chaînesprécipitation
17 hDP 58
DP 39DP 35
10 hDP 60
réseaux
agrégats
λmax
DP 642 h
λmax
précipitation
λmax
DP 642 h
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Conclusion
Synthèse in vitro d’amylose
Concentration en saccharoseTaille, morphologie, cristallinité
Polydispersité élevée / DP 35-58 ≠ amylose naturelleIngénierie de l’amylosaccharase
- enzyme thermostable- ‘super-polymerase’
2 morphologies réseaux (longues chaînes diluées)agrégats ovoïdes (courtes chaînes concentrées)
Forte cristallinité de type B amylose résistante
Design d’amylose : thermostabilité, solubilité, résistance à l’hydrolyse enzymatique contrôlées
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Merci !
INSA ToulouseIngénierie Enzymatique Moléculaire
Pierre Monsan Magali Remaud-Siméon
Cécile Albenne
INRA Nantes
Alain BuleonBruno Pontoire
Joëlle Davy
CERMAV Grenoble
Jean-Luc PutauxDanielle Dupeyre