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1
Daniel Vergé 2009-2010
STRUCTURE DES PROTEINES I
2
Acidesnucléiques
carbamyl phos-phate, ribose
Polysac-charides
pyruvate,PEP et malate
Lipides
acides graset glycérol
PrécurseursH2ON2 CO2
osesacidesaminés
Protéines
nucléotides
acideα-cétonique
acétatemalonate
Organites
Cellules
Ensembles supramoléculaires
La diversité du monde vivant repose sur un faible nombre de molécules présentant une structure chimique simple.
- protéines: vingt acides aminés- acides nucléiques: huit nucléotides.
Ces molécules de base sont elles-mêmes formées à partir de précurseurs inorganiques communs (CO2, H2O et N2) qui constituent les "briques" de construction des macromolécules.
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3
O H O
Type de liaison ComposéDistance entre
atomes électronégatifs (Å)
N H NN H O
EauAlcoolsAcides carboxyliques
Amines
Urée, amides, peptides
2,82,72,6
3,1
2,9
D’après T. Creighton, Proteins (Freeman 1984) p. 137
Liaisons H: H + 2 atomes électronégatifs
Les interactions faibles intervenant dans la structure et la fonction des molécules biologiques
Interactions électrostatiques
E = q1q2/rD, DH20 = 78 (effet d’écran)
- Interaction entre 2 charges
- Interactions charge-dipôle, dipôle-dipôle
4
δ-
δ-
δ+
Le dipôle et les liaisons hydrogène de la molécule d’eau
Longueur de la liaison hydrogène : 0,177 nmLongueur de la liaison covalente O-H : 0,0965 nm Energie de la liaison hydrogène : 10 à 40 kJ.mole-1Energie de la liaison covalente O-H : 460 kJ.mole-1Temps de demi-vie de la liaison hydrogène : 10-10 à 10-9 sec
A l'état liquide, chaque molécule d'eau forme en moyenne 3,4 liaisons hydrogène avec les molécules voisines
Liaison O-H polarisée
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5
L’énergie de la liaison hydrogène est maximale si les 3 atomes (2O et H) sont colinéaires
Structure spatiale de la glace
6
Interactions hydrophobes
Eau
Molécule d’hexane occupant une cavité
Deux molécules d’hexane occupant une seule cavité
L’équilibre est déplacé à droite (ΔS > 0→ ΔG < 0)
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7
Interaction lipide-eauAcide gras
Tête hydrophile
Queue hydrophobe
Eau ‘ordonnée’‘Lehninger, Principles of Biochemistry
8
ΔS > 0, ΔG < 0
Lehninger, Principles of Biochemistry
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9
Composés amphiphiles
Ex: acide gras
micelle
Bicouche lipidique → membranes biologiques
10
Forces de van der WaalsProfil d’énergie de l’interaction de van der Waals en fonction de la distance r entre les centres des deux atomes. L’énergie est calculée en utilisant l’équation : E = B/r12 - A/r6
(potentiel de Lennard-Jones 6,12). A = 2,75 106 Å12 kcal/mol, B = 1425 Å6 kcal/mol pour l’interaction entre 2 carbones (M. Levitt, J. Mol. Biol.(1974) 82: 393-420).
Rayon de van der Waals
(Å)
C 1,7 0,77H 1,1 0,30 1,5 0,66N 1,5 0,7S 1,8 1,04P 1,9 1,1
½ liaison covalente
(Å)
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11
Acides Aminés
Classification:
- Hydrophobes- aliphatiques- aromatiques
- Hydrophiles- non chargés- chargés
- négativement- positivement
20 acides aminés constitutifs des protéines
Nomenclatures:
H2N CH C
C
OH
O
C
C
1
4
3
2
5
H2N CH C
C
OH
O
C
C
γ
β
α
δ
12
Acides aminés non polaires aliphatiques
Thio-éther
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13
e
Acides aminés aromatiques
noyau indolephénol
14
Acides aminés polaires non chargés
Alcool primaire Alcool secondaire Thiol
Amide
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15
Acides aminés chargésnégativement
Acides aminés chargéspositivement
guanidyle imidazole
16
Acide aminéAb/symbole
pKs
Index d’hydropathie Fréquence
Principales caractéristiques des acides aminés (1)
Lehninger, Principles of Biochemistry
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17
Acide aminéAb/symbole
pKs
Index d’hydropathie Fréquence
Principales caractéristiques des acides aminés (2)
Lehninger, Principles of Biochemistry
18
Acides aminés modifiés
(élastine)
(reductases)
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19
Acides aminés du métabolisme intermédiaire
20
Stéréochimie
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21
Relation entre les stéréoisomères de l’alanine et la configuration absolue du L- et D-glycéraldéhyde
22
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23
C
COO
H
C
CH3
OHH
NH3+
-
C
COO
H
C
CH3
HHO
NH3
-
+ C
COO
C
CH3
HHO
H
-
NH3+
C
COO
C
CH3
OHH
H
-
NH3+
Cas des acides aminés possédant 2 carbones asymétriques
L-thréonine L-allo-thréonine D-thréonine D -allo-thréonine
Racémisation
H2N C C
R
O-
OH
OH-
H2N C
R
O-C
O-
24
Propriétés ioniques
Forme non chargée zwitterion
charge +1 0 -1
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25
K1 = [H+] [AH+-]
[AH2+]
AH2+ AH+- A-
K1 K2
pH = pK1 + log [AH+-]
[AH2+]
K2 = [H+] [A-]
[AH+-]pH = pK2 + log
[A-]
[AH+-]
Point isoélectrique: pH pour lequel la charge globale est nulle:
[AH2+] = [A-] K1K2 =
[H+]2 [A-]
[AH2+]
pHi =(pK1 + pK2)
2[H+]2 = K1K2
26
Titrage: exemple de la Glycine
Point isoélectrique: pHi = (pK1 + pK2)/2
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27Point isoélectrique: pHi = (pK1 + pKR)/2
28Point isoélectrique: pHi = (pK2 + pKR)/2
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29
Propriétés chimiques
a. Groupements amines :
groupement α-amino-terminal et chaîne latérale de la lysine (ε-NH2)
R-NH2 + HX R-NH-R’ + R’X alkylation, acylation, arylation
R-NH2 + H+ R-NH3+ protonation
- Arylation: FDNB (Fluoro-DiNitroBenzène, réactif de Sanger)
Exemples:
R- NH2 + F
O2N
N O2
C très électrophile
O2N
N O2R- N H
HF
30
Chaînes latérales:
- Asn : glycosylation
- Ser, Thr, Tyr: phosphorylation
- Tyr: iodation
OH + ATP PO
O
O-
O-
+ ADP
OH + ICl OH
I
+ HCl
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31
Pont disulfure
Oxydation par l’acide
performique Réduction (DTT)
Alkylation (iodoacétate)
Carboxyméthyl-cystéine
Acide cystéique
Cystéines
32
Propriétés spectroscopiques des acides aminés
Spectre d’absorption ultra-violet des acides aminés aromatiques à pH 6
- Absorption visible-proche UV
- Activité optique : α (pouvoir rotatoire) → spectres de dispersion optique rotatoire (ORD) et dichroïsme circulaire (CD)
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33
Propriétés spectroscopiques des acides aminés aromatiques à pH neutres
OH O
H+
Application : titrage des tyrosines
λmax = 275 nm λmax = 294nm
- Fluorescence λém > λex
34
Séparation des acides aminés
Electrophorèse
Chromatographie en couche mince
papier
mélange
Flux du solvant
Composants séparés
Dépôt
Lysine
+ -
Aspartate
(migration àpH neutre)
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35
‘Finger-print’ d’un mélange de 9 acides aminés:Le mélange a été soumis à une électrophorèse à pH 6,5 dans la première dimension et à une chromatographie en couche mince (butanol-acide acétique-pyridine-eau) dans la deuxième dimension. Les taches correspondent aux acides aminés: 1, Arg; 2, Lys; 3, His; 4, Cys: 5, Glu; 6, Asp; 7, Pro; 8, Ile.
Séparation bi-dimensionnelle (finger-print)
36
Les molécules chargées positivement se lient aux billes chargées négativement
Exemple: résine échangeuse de cations
Les molécules chargées négativement ne sont pas retenues
Chromatographie d’échange d’ions
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37
Chromatographie d’échange d’ions (-SO3-)
38
High Performance Liquid Chromatography(HPLC)
Chromatographie de partage
Colonnes en acier
Billes de silice + chaînes hydrocarbonées
Haute pression
Phase réverseTampon d’élution de plus en plus hydrophobe
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39
PROTEINES
40
Introduction
Définition: polymère linéaire d’acides aminés
- 20 acides aminés- non ramifié- monodispersé- ordre des acides aminés imposé (séquence)
Diversité
- fibreuses- globulaires- membranaires- monomériques/oligomériques
collagène
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hémoglobineBPTI
nAChRPDH
Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor
Pyruvate déshydrogénase
Récepteur nicotinique de l’Acétylcholine
42
Données sur quelques protéines
MMNombre
de résidusNombre de
chaînes
Lehninger, Principles of Biochemistry
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43
Protéines conjuguées
classe Groupe prosthétique Exemple
Lehninger, Principles of Biochemistry
44
Rôles
- enzymes
- hormones
- anticorps
- transporteurs
- canaux
- protéines structurales: kératine, fibroïne, cytosquelette...
-....
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45
Peptides et protéines
Formation de la liaison peptidique
46
Structure d’un pentapeptide
Ser-Gly-Tyr-Ala-LeuSGYAL
Extrêmité N-terminale Extrêmité C-terminale
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47
Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2
Peptides contenant un acide aminé D
dermorphine
peptidoglycane
Modification post-traductionnelle par une racémase
48
Exemple d’un antibiotique peptidique cyclique
Gramicidine S
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49
Propriétés ioniques
Définitions:
- peptide- polypeptide- chaîne polypeptidique- protéine
50
Peptides à activité biologique:
- Hormones:
ocytocine vasopressine
Ex 2: thyrotropin releasing hormone (TRH)
Ex 1: post-hypophyse
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51
- Peptide de synthèse
- Hormone polypeptidique
Ex: insuline
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Purification des protéines
Avancement de la purification
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE)
Stryer
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53
Electrophorèse bidimensionnelle
Séparation des protéines de E. coli:1. Isofocalisation (horizontale)2. SDS-PAGE (verticale)
-
+
pHidécroissant
SDS-PAGE
Isofocalisation
MM
54
MMkDa
100
15
40
La même quantité totale de protéines (10 μg) est déposée dans chaque puits après chaque étape de purification
Electrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE)
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55
A chaque étape:
- Test d’activité (A mesurée en U/mL)
- Dosage de protéines ([P] mesurée en mg/mL)- Mesure du volume total V (en mL) - l’activité totale: AT = A x V- Calcul de la quantité totale de protéines P = [P] x V- L’activité spécifique est alors définie par : AS = AT/P = A/[P]
Paramètres de l’étape de purification:
- rendement de l’étape: rapport des activités totales R = ATf /ATi
- facteur de purification: rapport des activités spécifiques F = ASf /ASi
56
Tableau de purification
Etape PT (mg) AT (u) AS (u/mg)Volume (mL)
Extrait brutPrécipitation fractionnéeChromatographie d’échange d’ionsChromatographie d’exclusion moléculaireChromatographie d’affinité
Ensemble de la purification:
- rendement global: Rg = Π (Ri) = ATn /ATo
- facteur de purification global: Fg = Π (Fi) = ASn /ASo
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57
Précipitation Sel (sulfate d’ammonium)
pHi
pH
[sel]
pH
s sSolubilité
Dialyse
Sac de dialyse
Solution concentrée
tampon
avant après
Méthodes de fractionnement
58
Grosses molécules
Petites moléculesBille de polymère
Bille excluant les grosses molécules
Sens du flux
Chromatographie d’exclusion
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59
Chromatographie d’échange d’ions
Les molécules chargées positivement se lient aux billes chargées négativement
Exemple: résine échangeuse de cations
Les molécules chargées négativement ne sont pas retenues
CM -CH2-COO-
DEAE -CH2-CH2-NH+-(C2H5)2
60
HPLC
(1) thyroglobulin (669 kd)(2) catalase (232 kd)(3) bovine serum albumin (67 kd)(4) ovalbumin (43 kd)(5) ribonuclease (13.4 kd)
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61
Chromatographie d’affinité
62
Caractérisation de la protéine purifiée
Contenu en chaînes polypeptidiques:
- électrophorèse SDS-PAGE- analyse des N-ter
RNA pol
- nombre de chaînes
- masses moléculaires
- stoechiométrie
E. Coli167161
37
70
ββ’
σ
α
α2ββ’σω
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63
Détermination de la masse moléculaire
64
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65
Détermination de la masse moléculaire par spectrométrie de masse
Spectromètre
MALDI-TOF
Electrosprayionization(ESI)
capillaire échantillon
haute tension
vide
spectromètre
Matrix assisted laser desorption ionizationTime of flight
66
Anhydrase carbonique: ionisation par electrospray:A: Spectre de la protéine; les pics correspondent à des valeurs différentes de la charge z. B: Spectre de déconvolution donnant la masse de la protéine.
Spectre d’une protéine
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67
MALDI-TOF Mass Spectrum of Insulin and β -lactoglobulin. A mixture of 5 pmol each of insulin (I) and β-lactoglobulin (L) was ionized by MALDI, which produces predominately singly charged molecular ions from peptides and proteins (I + H+ for insulin and L + H+ for lactoglobulin). However, molecules withmultiple charges as well as small quantities of a singly charged dimer of insulin, (2 I + H)+, also are produced. [After J. T. Watson, Introduction to Mass Spectrometry, 3d ed. (Lippincott-Raven, 1997), p. 282.]
Détermination de la masse moléculaire par spectrométrie de masse
68
Détermination du point isoélectrique
Mélange d’ampholytes
Etablissement d’un gradient de pH
Migration jusqu’au point isoélectrique
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69
Point isoélectrique de quelques protéines
Protéine pHi
70
Détermination de la structure primaire
Chaîne polypeptidique isolée
1. Composition en acides aminés
Hydrolyse acide totaleHCl 6N, 110°C, atmosphère inerte
Acides aminés posant problème:Trp, Cys, Asn, Gln
Séparation avant ou après dérivation- chromatographie d’échange d’ions- HPLC
Analyse
Formule brute
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71
Composition en acide aminés de 2 protéines
Nombre de résidus par molécule de protéine
aa Cytochrome c Chymoptrypsinogène
72
Séquençage
N-terminal:
- Détermination du résidu N-terminal: FDNB, Chlorure de Dansyl- Séquençage récurrent: méthode d’Edman
SéparationIdentification du PTH-aaRecyclage du peptide
Peptide raccourciPhénylthiocarbamyl
(PTC)-peptide
Anilinothiazolinone Phénylthiohydantoïne(PTH)-aa
peptideTMA
Lehninger, Principles of Biochemistry
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73
74
C-terminal:
- Détermination du résidu C-terminal: Hydrazinolyse NH2-NH2- Séquençage récurrent: Carboxypeptidases
Non spécifique LevureCarboxypeptidase Y
Non spécifique Feuilles de citronnier Carboxypeptidase C
R, K (sauf P en n-1)Pancréas de porc Carboxypeptidase B
Non spécifique (sauf R,K, et P en position n ou n-1)
Pancréas de bœufCarboxypeptidase A
SpécificitéSourceNom
Ex: aldolase, carboxypeptidase A: -Phe-Ile-Leu-Ser-His-Ala-Tyr-COOH
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75
Coupure des chaînes polypeptidiques:
C-terminal de E, DStaphylococcus
aureusEndopeptidase
V8
Entre 2 résidus hydrophobesMuqueuse
gastrique bovinePepsine
N-terminal de I, M, F, W, Y, V, sauf si P précède
Bacillusthermoproteolyticus
Thermolysine
C-terminal de A, G, S, V, sauf si P suitPancréas de boeufElastase
C-terminal de F, Y, W, sauf si P suitPancréas de boeufChymotrypsine
C-terminal de R, K, sauf si P suitPancréas de boeufTrypsine
SpécificitéSourceEnzyme
-chimique:
Bromure de cyanogène BrCN
-enzymatiques:
Endoprotéases
-CO-NH-CH-COOH
CH2-CH2-OH
homosérine
H2O
76
Séparation des peptides
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77
Caractérisation des ponts disulfure
- Dosage des thiols libres:DTNB, NEM
N-éthylmaléimide (NEM)340 nm
Acide dithionitrobenzoïque (DTNB)412 nm
- Position des thiols libres:Marquage 14C-iodoacétate radioactifHydrolyse ménagée (endopeptidase)Séparation des peptides (HPLC ou cartepeptidique)Repérage des pics ou taches radioactives Analyse
autoradiographie
78
- Méthode générale: Comparaison des ‘finger prints’ des protéines native et réduite(carte peptidique ou HPLC)
- Position des ponts disulfure:
- Exemple de la méthode de la ‘Double diagonale’
Blocage des thiols libres (iodoacétate)Hydrolyse ménagée (endopeptidase)Séparation des peptides (électrophorèse 1ère dimension)Rupture des ponts (acide periodique):R-S-S-R’ R-SO3
- + R’-SO3-
R-S-CH2-COOH R-SO2-CH2-COOHSéparation des peptides (électrophorèse 2ème dimension)Identification des Cys impliquées
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79
Résultat
38 acides aminés2R, 1K: 4 peptides après trypsine2M: 3 peptides après BrCN
N-ter: E
N-ter (commence par E)
C-ter (ne finit ni par K ni par R)
se superpose à
permettant de les orienteret
N C
séquence
FDNB, hydrolyse,séparation
Réduction des ponts au besoin
Trypsine
BrCN
80
Autres méthodes de séquençage
Spectrométrie de masse
SM1 SM2 DétecteurCollision
Electrosprayionization
Séparation Clivage
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81
Séquençage d’un peptide doublement chargé (m/z = 676,42 Da) par spectrométrie de masse (ESI MS/MS). Les différences de masse entre les ions des séries y et b permettent d’identifier les acides aminés
82
protéine
ADN (gène)D’après la séquence du gène
Applications:- recherche de séquences homologues
Protéines EF-Tu
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83Famille des protéines GroEL
- Evolution
84
Synthèse peptidique en phase solide
Principe
bloqué activé bloqué
HN CH C
R1
O
X + H2N CH C
R2
Z
O
Y
HN CH C
R1
O
X HN CH C
R2
Z
O
+ protection des groupements réactifs des chaînes latérales
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85
Blocage de la fonction amine
(fluoromethoxy carbonyl)
Ou tBoc : ter-butyloxycarbonyl , (CH3)3C-O-CO-
Lehninger, Principles of Biochemistry
86
Etape 1:Attachement du résidu C-terminal à un groupe réactif de la résine
Acide aminé protégé
Résine de polystyrène insoluble
Lehninger, Principles of Biochemistry
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87
Etapes 2-4: Addition d’un résidu d’acide aminé
Activation par le DCC de l’acide aminé 2 protégé
Déprotection de la fonction amine par une base organique faible
Formation de la liaison peptidique
Répétition du cycle si nécessaire
Dicyclohexyl-urée
Lehninger, Principles of Biochemistry
88
Etape 5: Libération du peptide final
Déprotection de la fonction amine (voir réaction 2) et clivage par HF de la liaison à la résine
Lehninger, Principles of Biochemistry
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89
Effet du rendement unitaire sur le rendement global
Nombre de résidus dans le peptide
Rendement global (%) suivant le rendement unitaire:
90
Niveaux d’organisation des protéines
Lehninger, Principles of Biochemistry
primaire secondaire tertiaire quaternaire
Résidusd’acides aminés
Hélice α Chaîne polypeptidique Assemblage de sous-unités
(ex de l’hémoglobine)
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91
Structure Secondaire
L’unité peptidique
Dimensions de la liaison peptidique (en Å)
92
Liaison peptidique
résidu
Plans peptidiques et angles de rotation φ (N-Cα) et ψ (Cα-C) autour du carbone α d’un résidu d’acide aminé
Résonance électronique de la liaison peptidique
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93
Position de référence φ = 0, ψ = 0:
Les deux plans peptidiques adjacents sont coplanaires. Cette structure n’est pas permise à cause de la gêne stérique entre l’oxygène de l’α-carbonyle (résidu i) et l’hydrogène de l’α-amine (résidu i+1).
Lehninger, Biochemistry
94
Diagramme de Ramachandran pour l’alanine:
Les régions permises sont hachurées, celles qui ne le sont que partiellement sont claires. Les tirets indiquent une zone permise au prix d’une légère torsion des angles de liaison.
Creighton, Proteins
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95
(deg
rés)
(degrés)Lehninger, Biochemistry
Diagramme de Ramachandran de la pyruvate kinase:
Les valeurs de φ et ψ pour tous les acides aminés de l’enzyme, à l’exception de la glycine, ont été reportés sur le diagramme
96
Définition:structure localestructure périodique
Structure secondaire:
Structure secondaire Angle de liaison (degrés) Résidus par tour
Distance entre résidus (en
projection, nm) φ ψ ω
Hélice α droite -57 -47 180 3,6 0,15 Hélice 310 -49 -26 180 3,0 0,20 Feuillet β antiparallèle -139 +135 -178 2,0 0,34 Feuillet β parallèle -119 +113 180 2,0 0,32 Polyproline I -83 +158 0 3,33 0,19 Polyproline II -78 +149 180 3,0 0,31 Polyglycine II -80 +150 180 3,0 0,31
Paramètres des principales structures secondaires
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97
Diagramme de Ramachandran de diverses structures secondaires
Lehninger, Biochemistry
Hélice αdroite
(degrés)
(deg
rés)
Hélice αgauche
Feuillet βcourbé
Triple hélicede collagène
Feuillet βparallèle
Feuillet βantiparallèle
Hélice αdroite
98
L’hélice α
L’hélice α droite: les plans peptidiques sont parallèles à l’axe de l’hélice, l’angle dièdre entre 2 plans successifs est de 100°.
Les liaisons hydrogène sont parallèles à l’axe de l’hélice
N-ter
C-ter
Lehninger, Biochemistry (2e édition)
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99
Représentation en roue(vue de dessus)
Durliat, Biochimie structurale
dipôle
Lehninger, Biochemistry
100
Les feuillets β
Etablissement des liaisons H entre brins dans les feuillets βparallèles et antiparallèles.
Représentation du feuillet plissé.
Durliat, Biochimie structurale
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101
Représentation schématique de trois chaînes (brins) formant un feuillet β. Les chaînes latérales sont situées alternativement au-dessus et au-dessous du plan du feuillet.
102
Tournant β
Isomères de Proline
Lehninger, Biochemistry
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103
Probabilités relatives qu’un résidu se trouve dans un type de structure secondaire
Prédiction de structures secondaires
104
Méthodes d’étude des structures secondaires
Dispersion optique rotatoire et dichroïsme circulaire
Spectres de dispersion optique rotatoire (à gauche) et de dichroïsme circulaire (àdroite) d’une chaîne de poly-lysine dans les conformations en héliceα (α) en feuillet β (β) et en ‘pelote statistique’ (désordonnée) (r).
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105
Méthodes d’étude des structures tridimensionnelles
Détermination de la structure de la myoglobinea: le diagramme de diffraction est obtenu à partir d’un cristal de la protéineb: calcul de la carte de densité électronique (ici l’hème)c: localisation des atomesd: structure tridimensionnelle Lehninger, Biochemistry
Diffraction des rayons X par les cristaux
106
Résonance Magnétique Nucléaire
Spectre unidimensionnel d’une globine
Déplacement chimique
Spectre bidimensionnel NOE de la globine
Les pics en dehors de la diagonale indiquent des 1H en interaction. Les 2 exemples en A correspondent aux interactions représentées en B.
BA
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107
Structure de la chaîne polypeptidique de la globineétablie par RMN
Lehninger, Biochemistry
108
Protéines fibreuses
Surenroulement d’hélices
Formation d’une structure ‘coiled-coil’:A: hélice α droiteB: torsion de l’hélice α droiteC: surenroulement de 2 hélices α
Vue axiale montrant la position des chaînes latérales dans les deux hélices: les résidus a et d en interaction sont hydrophobes, les résidus en périphérie peuvent être chargés ou polaires
Périodicité 7 résidus
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109
cellules
filament intermédiaire
protofibrille
protofilament
coiled-coil
hélice α
hélice α
coiled-coil
protofilament
protofibrille
Structure d’un cheveu
(kératine)
110
Collagène
Modèles d’une chaîne isolée de la triple hélice de collagène
(séquence Gly-Pro-Hyp)
Triple hélice de collagène(hélice droite)
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111
Section transversale: les carbones α des résidus Gly sont situés à l’intérieur de la triple hélice, les noyaux pyrrolidones vers l’extérieur. Les liaisons H entre les hélices sont indiquées en pointillé.
Triple hélice de collagène
112
Localisation des ponts entre les molécules de tropocollagène adjacentes dans la fibre de collagène. La région N-terminales d’une molécule est reliée à la partie C-terminale d’une autre molécule de la rangée voisine
Stries espacées de 64 nm
Structure des fibrilles de collagène
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113
Fibroïne de la soie
Chaîne latérale d’Ala Chaîne latérale de Gly
114
Différents modes de représentation des protéines: myoglobine
Protéines globulaires
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115
A: Unité βαβ: l’hélice est presque toujours au-dessus du plan du feuillet formé par les deux brins parallèles
B: Feuillet β formant un motif en clégrecque
C: Feuillet β antiparallèle en méandre
D: Faisceau d’hélices antiparallèles
Creighton, Proteins
A
B
C
très rare
jamais observé
D
Structures supersecondaires
116
Ex: Motif de liaison du calcium
Motifs
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117
Motifs de liaison à l’ADN
Motif hélice-tournant-héliceL’hélice C-terminale s’insère dans le grand sillon de l’ADN (B)
Leucine-zipper:Deux hélices dimérisent via leur région ‘Leucine-zipper’. Les hélices se fixent symmétriquement dans le grand sillon de l’ADN.
118
Faisceau (botte) tétrahélicoïdal
Exemple de l’hémérythrine. La protéine possède deux atomes de fer.
DomainesMotifs de repliement (plis tertiaires, domaines)
Faisceau d’hélices antiparallèles; Les résidus en interaction sont hydrophobes, les résidus à l’extérieur hydrophiles
Tout α
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119
Sandwich β:
Immunoglobuline, domaine VL
Tout β
120
Tonneau β alterné
Retinol binding protein (RBP)
Feuillets β antiparallèles
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121
Retinol binding protein (RBP)
122
Tonneau β en clé grecque
Chymoptrypsine
2 domaines β antiparallèles
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123
Motif ‘jelly-roll’
124
Turbine β
Feuillet β antiparallèle
Galactose oxydase
Turbine à 7 pales
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125
Hélice β à trois feuillets‘single –stranded right-handed β helix’
Pectate lyase de Erwinia chrysanthemi
126
Domaine de liaison des dinucléotides dans les déshydrogénases, composé de deux unités de liaison de nucléotide β-α-β-α-β. Les nucléotides se lient du côté des extrémités C-terminales des brins β.
Module Rossmann
adénine
nicotinamide
Domaines α/β
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127
α/β Feuillet parallèle
Domaine 1 de la lactate déshydrogénase
‘3 couches’
128
α/β Feuillet parallèle
Triose phosphate isomérase
‘4 couches’
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129
Topologie des connections β:
Diagramme topologique des feuillets β: a) 4 brins: feuillet βantiparallèle (fait partie d’un domaine de l’aspartate transcarbamylase); b) 5 brins: feuillet β parallèle (flavodoxine); c) 8 brins: tonneau antiparallèle (plastocyanine).
130
Domaines α + β
Inhibiteur pancréatique de la trypsine
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131
Exemple d’une protéine multi-domaines: la pyruvate kinase
132
Classification
SCOP(Structural Classification Of Proteins)http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop
Tout α α/β
- PDB
- Motif
- Superfamille
- Famille
- Protéine
- Espèce
Lehninger, Principles of Biochemistry
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133
Tout β
Lehninger, Principles of Biochemistry
134
α + β
Lehninger, Principles of Biochemistry
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135
Classification CATH
Orengo, C.A. et Thornton, J.M. Ann. Rev. Biochem. 74 (2005) 867-900
http://www.cathdb.info/latest/index.html
136
Protéines modulaires
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137
Quelques exemples de protéines modulaires
138
Cbl, ubiquitine ligase et protéine multi-adaptatrice (RTK)
Dikic & Giordano Curr. Opin. Cell Biol. (2003) 15:128-135
Exemple de protéine modulaire: Cbl
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139
Symétrie cyclique
Ordre 2 Ordre 3
Structure quaternaire: différents types de symétrie
Lehninger, Principles of Biochemistry
140
Symétrie dihédrale
Lehninger, Principles of Biochemistry
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141
Différents types d’interactions
142
L’hémoglobine
Transition R-T
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143
Arrangement des quatre sous-unités α2β2 dans l’hémoglobine
α1
β2β1
α2
144
0000
5100
1108000
α1β1 (α2β2)α1β2 (α2β1)α1α2 β1β2
Oxy-Hb
0121
4400
986900
α1β1 (α2β2)α1β2 (α2β1)α1α2 β1β2
Désoxy-Hb
Ponts salins
Liaisons HContacts de Van der Waals
NbreSous-unités
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145
Glutamine synthetase
D6 (2 hexamères C6)
ADP
146
C6R6
Aspartate transcarbamylase
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147
Assemblage d’un filament d’actine
Symétrie hélicoïdale
148
Interfaces entre sous-unités dans le filament d’actine
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149
Symétrie icosaèdrique
Ordre 5
Ordre 3
Ordre 2
150
Capsides virales
Poliovirus
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151
RNA
Protéine
Virus de la mosaïque du tabac
152
Méthodes d’étude de la structure quaternaire
- Electrophorèse en conditions non-dénaturantes/dénaturantes (+/- réducteur)
- Méthodes hydrodynamiques: chromatographie d’exclusion, sédimentation: détermination de la masse moléculaire)
- Pontages avec réactifs bi-fonctionnels + SDS-PAGE
- Microscopie électronique
- Cristallographie
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153
Principes de structuration des protéines globulaires:
- Les résidus hydrophobes ont tendance à être enfouis à l’intérieur de la structure. S’ils sont exposés au milieu extérieur, ils interagissent entre eux le plus possible et la région hydrophobe exposée est entourée d’une couche de molécule d’eau ‘ordonnée’ (couche de solvatation).
- Les résidus hydrophiles interagissent facilement avec l’eau à la surface de la protéine. S’ils sont enfouis, ils établissent entre eux des liaisons H.
- Dans la structure, les atomes sont en contact de van der Waals.
154
Dénaturation
% d
énat
uré
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155
Dénaturation-renaturation
Expérience d’Anfinsen (ribonucléase)
Etat natifcatalytiquement actif
Etat natif, ponts correctement reformés, actif
Etat dénaturé, ponts S-S réduits, inactif
+ urée et mercaptoéthanol dialyse
156
Chemins du repliement
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157
entropie
En
erg
ie
Structure native
Structure dépliée
Po
urc
enta
ge
de
rési
du
s d
ans
la
con
form
atio
n n
ativ
e
158
Structure d’un ‘molten globule’ (A) et d’une structure native (B)(Cytochrome b562)
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159
Protéine prion
PrPC PrPSc
160
Protéines membranaires
Lehninger, Principles of Biochemistry
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161
Protéine périphérique
Changement de pH, de force ionique, agent chélatant, ...
DétergentPhospholipase C
Protéine intégrale
GPI-linkedprotein
Protéine-glycane
Lehninger, Principles of Biochemistry
Caractérisation du type de protéine membranaire
162
Différents types de protéines transmembranaires
Lehninger, Principles of Biochemistry
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163
Diagrammes d’hydropathie:
164
Glycophorine
Modèles d’insertion des protéines dans la membrane
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165
bactériorhodopsine
166
Structure de la rhodopsine
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167
Structure de la Rhodopsine:
Détails
Palczewski et al. Science (2000) 289 :739-745
168
Structure schématique de la rhodopsine
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169
Structures comparées de récepteurs couplés aux Protéines G
Hanson M.A., Stevens R.C. (2009) Structure 17:8-14
170
Répartition des résidus chargés (bleu), Tyr (orange) et Trp(rouge) par rapport à la bicouche lipidique
Lehninger, Principles of Biochemistry
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171
FepA: 22 brins transmembranaires (capture de fer)OmpLA: dimère, 12 brins (phospholipase)Maltoporine: trimère, 16 brins (transporteur de maltose)TolC: trimère, tonneau à 12 brins, 4 de chaque sous-unité (transporteur)α-Hémolysine: tonneau à 14 brins, 2 brins en épingle à cheveu par sous-unité (toxine)
Protéines membranaires en tonneau β
Lehninger, Principles of Biochemistry
172
Structure proposée pour le transporteur de glucose GLUT1.
(a) Les hélices transmembranaires sont représentées par des séries de lignes obliques de 3 ou 4 résidus, chaque ligne correspondant à un tour d’hélice. 9 des 12 hélices contiennent au moins 3 résidus polaires ou chargés.(b) Représentation en roue d’une hélice montrant la répartition des résidus et la structure amphipatique. (c) Association de plusieurs hélices (ici 4) avec les faces polaires orientées vers l’intérieur, formant un canal bordé par des résidus chargés ou polaires. Lehninger, Principles of Biochemistry