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Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 1
Jan-Philipp Stier
Marc Matuszewska
Wendelin Wolf
Lars Lüdicke
Thomas Horn
Molekulare BiotechnologieRuprecht-Karls-Universität Heidelberg
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Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 2
GliederungI. Begriff und Geschichte der PCR
II. Ablauf der PCR allgemein
III. Mathematische Beschreibung der PCR
IV. mathematische Problemstellungen der
PCR
V. Quantitative PCR
VI. RT-PCR
VII. Real Time PCR
VIII. Beispiele
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Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 3
I. Begriff und Geschichte
PCR (Polymerase Chain Reaction)„Polymerase-Kettenreaktion“ zur
Vervielfältigung von Nukleinsäuren
Erfinder: Kary Mullis (1985)
PCR eröffnet in fast allen Bereichen der
Naturwissenschaft zahlreiche neue
Möglichkeiten
Nobelpreis für Mullis 1993
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Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 4
II. Ablauf der PCR allgemein I
Benötigte Reagenzien (Master Mix)Nukleotide (dNTP): dATP, dGTP, dTTP, dCTP
Taq DNA-Polymerase: Enzym repliziert DNA
Enzym-Cofaktor: Mg2+
Enzym, welches Kontaminationen abbaut
Puffer: Erhaltung pH-Wert, Salzkonzentration
spezifische Primer (20-30 Basen: sense-,
antisense)
zu amplifizierende DNA
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Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 5
II. Ablauf der PCR allgemein IIPCR ist 3-Schritt-Prozess (Zyklus)
1. Denaturierung (T>90°C): ein dsDNA Molekül in zwei ssDNA Moleküle
2. Annealing (Anlagerung: 40°C<T<65°C): Bindung spezifischer Primer an Zielsequenz
3. Extension (Verlängerung: T≈72°C): Synthese (5‘-3‘) zwei ssDNA zu zwei dsDNA
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6
zu vermehrenderDNA-Abschnitt
5’3’5’
3’
5’
3’5’
3’
Denaturierung (T>90°C)
5’
5’ 5’
3’5’
3’
3’
3’
Annealing (40 – 65 °C)
3’
5’3’
5’ 5’
3’5’
3’
DNA-Synthese (72 °C)
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Schutzhaube
Heizblöcke
Steuerungseinheit
PCR-Gerät
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8
III. Mathematische Beschreibung der PCR IZyklus 1 Zyklus 2 Zyklus 3 Zyklus 4
1Denaturierung
2Annealing
3Extension
N = N0 * 2n
N = Zahl der amplifizierten Moleküle
N0 = Zahl der Startmoleküle
n = Zahl der Zyklen n
N
N0
N
N0
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Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 9
III. Mathematische Beschreibung der PCR II
Plateau-Phase
Limitierung von Reaktionskomponenten Thermische Inaktivierung der DNA Polymerase Reassoziation der PCR-Produkte konkurriert mit Primeranlagerung
theoretisch:
20 Zyklen: 1,048,576
30 Zyklen: 1,073,741,824
n
N
N0
N
N0
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III. Mathematische Beschreibung der PCR IIIEffizienz E der PCR:
Anteil der Matrizen (Templates), die in jedem Schritt umgesetzt wird ≠ 100%
E meist um die 85%
geringe Veränderungen E große Veränderungen N
Beispiel: E=0.85; n=30 => N=10.4*107N0
E=0.80; n=30 => N= 4.6*107N0
E = Amplifikationseffizienz
N = N0 * (1+E)n
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IV. Mathematische Problemstellungen IPrimer Schmelztemperatur
Einfaches Modell
Primer kürzer als 14 Nukleotide:
TM=2*(A+T)+4*(G+C)
Primer länger als 14 Nukleotide:
TM=64.9+(G+C-16.4)/(A+T+C+G)
entscheidend ist der GC Gehalt (3 H-
Bindungen), beeinflusst TM maßgeblich
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Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 12
IV. Mathematische Problemstellungen IIKompliziertes Modell
R… molare Gaskonstante R=1.987(cal/°C*mol)
… dimensionslose molare Primerkonzentration
T0=-273.15°C
t… Temperaturkurrektor t=-21,6°C
S… Entropie des Primers in cal/(K*mol)
H… Enthalpie des Primers in kcal/mol
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Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 13
IV. Mathematische Problemstellungen IIIBerechnung Enthalpie, Entropie:
H(p)=i=1n-1H(pi,pi+1); S äquivalent
Beispiel:
p=GGAT
H(GGAT)=H(GG)
+H(GA)+H(AT)
(pi;pi+1) H(pi;pi+1) S(pi;pi+1)
AA oder TT 9.1 24.0
AT 8.6. 23.9
TA 6.0 16.9
CA oder TG 5.8 12.9
GT oder AC 6.5 17.3
CT oder AG 7.8 20.8
GA oder TC 5.6 13.5
CG 11.9 27.8
GC 11.1 26.7
GG o. CC 11.0 26.6
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V. Quantitative PCR I
Frage: Wie groß ist N0?
Methode 1: Titrationsanalyse
Verwendung externen Standards mit bekanntem N0
Anfertigung Verdünnungsreihe von Standard und Probe
Amplifikation in n Zyklen Berechnung N0 Probe über Steigung
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Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 15
Auswertung:der Unterschied von N0 ist proportional zu den Steigungen der Geraden
man sucht Wert auf x-Achse (linearer Teil)
Abtragung der dazu gehörigen y-Werte
Differenz dieser Werte gleich der Differenz von N0 von Probe und Standard
so etwa 2- bis 10-fache Konzentrationsunterschiede
bestimmbar
V. Quantitative PCR II
Probe
Standard
Lo
g N
Log N0
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einfaches Beispiel:N0S=100 (log N0S=2), n=20, E=0.85 => NS=100*(1+0.85)20
NS=2.21*107 => log NS=7.344
NP bei N0=100 => log NP=7.568
log N0S + 0.224 ergibt log N0P
log N0P=2.224
N0P=168
V. Quantitative PCR III
Probe
StandardLo
g N
Log N0 2
7.568
7.344
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Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 17
Methode 2: lineare Analyse N = N0 * (1+E)n
(nach: Y = a * X + b)
Log N = [Log (1+E)]*n + Log N0
n0
Log N 0
Lo
g N Log (1+E)
V. Quantitative PCR III
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VI. Reverse Transcriptase oder RT-PCR
Ausgangsmaterial: m-RNA ds-cDNA
Enzym: Reverse Transcriptase Retroviren
Tth-Polymerase Reverse TranscriptaseMangan-Ionen
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3’5’ mRNA3’ 5’Primer 1
Primer 25’ 3’
5’3’einzelsträngigecDNA
doppelsträngige3’5’5’ cDNA3’
Reverse Transkription
Amplifikation
3’5’
5’3’
Primer 25’ 3’
Primer 13’ 5’
Synthese des komplementärencDNA Stranges
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VII. Real Time PCR
Im Prinzip wie eine Standard PCR, jedoch mit Farbstoff der in die DNA interkaliert
In diesem Zustand Detektion möglich
früher: Ethidiumbromid und Detektion mit Videokamera
heute: Fluoreszierende Farbstoffe und digitale Aufnahme
Echtzeitmessung mit jedem Zyklus
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Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 21
Zyklenzahl
Flu
ore
sze
nz
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Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn 22
VIII. Messung von Metallothionein-I mRNAAuswertung
Auftragen der Werte in ein Diagramm: x-Achse = log(Std.DNA)
y-Achse = log(Verhältnis) Geradengleichung: Schnittpunkt mit der x-Achse ist Äquivalenzpunkt (log1=0)
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VIII. Gen-Expression durch RT-PCRCT-Wert
-Patientenabhängig
-Errechnet sich aus den Zyklen, die benötigt werden, um einen spezifischen Schwellenwert zu überschreiten ( Fluoreszenz)
1. Normierung des CT-Wertes des Target-Gens
2. Eichung des CT(Target)-Wertes zu Bezugsexpressionsgröße
2 -∆∆CT relative
Expression in Bezug auf Calibrator-Gen (100%)
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