stichting toegepast onderzoek …...de onzichtbare onderwaterwereld in kaart te brengen en te...
TRANSCRIPT
STICHTINGTOEGEPAST ONDERZOEK WATERBEHEER
STICHTINGTOEGEPAST ONDERZOEK WATERBEHEER
[email protected] www.stowa.nlTEL 033 460 32 00 FAX 033 460 32 01
Stationsplein 89POSTBUS 2180 3800 CD AMERSFOORT
[email protected] www.stowa.nlTEL 033 460 32 00
Stationsplein 89 3818 LE Amersfoort POSTBUS 2180 3800 CD AMERSFOORT
2018
14
VERKENNING VAN DE POTENTIE VAN METAGENOMICS VOOR MONITORING VAN WATERKWALITEIT
omslagmetagenomics.indd 1 04-04-18 14:13
Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit
2018
14
2 stowa 2018-14 | Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit
copyright | teksten uit dit rapport mogen worden overgenomen, mits met bronvermelding. de in
het rapport ontwikkelde, dan wel verzamelde kennis is om niet verkrijgbaar. de eventuele kosten
die stowa voor rapporten in rekening brengt, zijn uitsluitend kosten voor het vormgeven, verme-
nigvuldigen en verzenden.
disclaimer | dit rapport is gebaseerd op de meest recente inzichten in het vakgebied. desalniet-
temin moeten bij toepassing ervan de resultaten te allen tijde kritisch worden beschouwd.
de auteurs en stowa kunnen niet aansprakelijk worden gesteld voor eventuele schade die ontstaat
door toepassing van het gedachtegoed uit dit rapport.
UitgaVe
stichting toegepast onderzoek waterbeheer
postbus 2180
3800 cd amersfoort
aUteUrs | a.a. (aleida) de Vos van steenwijk, orvion (projectleider)
programmacoördinator | Bas van der wal, stowa
website | www.stowa.nl
VormgeVing | Vormgeving studio B, nieuwkoop
fotografie | Bastiaan schuit Fotografie, istock
drUk | dpp, Houten
stowa | 2018-14 | isbn | 978.90.5773.786.2
amersFoort, april 2018
colofon
3Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit | STOWA 2018-14
ten geleide
Inaansluitingopeeneerderonderzoeknaarhetvoorkomenvandegrotemodderkruiperen
de rode Amerikaans rivierkreeft in de Krimpenerwaard (Zuid-Holland) is een oriënterend
onderzoekgedaannaardemogelijkhedendieeenbredeeDNA-screeningbiedtomopsnelle
eneenvoudigewijzeeenbeeldtekrijgenvandebiodiversiteitendewaterkwaliteitindeze
polder.HetonderzoekwerduitgevoerddoorOrvioninsamenwerkingmetRAVON,hetHoog-
heemraadschapvanSchielandendeKrimpenerwaard,deNatuur-enVogelwerkgroepKrimpe-
nerwaard(NVWK),HetZuid-HollandsLandschap(ZHL)enOasenN.V.
Het onderzoek heeft bijgedragen aan de verdere ontwikkeling van de techniek en inzicht
gegevenindemogelijkhedendiedetechniekbiedtbijhetinbeeldbrengenvanorganismen
inoppervlaktewater.
Hetrapportistechnischvanaard.Hetrapportistoeleverendaanvervolgonderzoek.
bas Van der wal
Programmacoördinator
4 STOWA 2018-14 | Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit
5Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit | STOWA 2018-14
inhoUdsopgaVe
colofon
ten geleide
h1 introdUctie
h2 achtergrondinformatie dna analysetechnieken en edna methoden
2.1 dna-analysetechnieken
2.2 environmental dna (edna) methoden
h3 bemonstering
h4 ngs analyseresUltaten
4.1 Biodiversiteit
4.2 Vergelijking van monsters
4.3 Vergelijking filter monster met twn lijst
4.4 genetische eigenschappen
h5 discUssie
h6 conclUsies en aanbeVelingen
stowa in het kort
2
3
6
7
7
8
11
12
12
17
18
19
23
26
27
6 STOWA 2018-14 | Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit
DNAanalysetechniekenmakeneenbijnaonvoorstelbareontwikkelingdoorwelkenog lang
nietisafgelopen.Deeffectenhiervanzijnvoelbaarinveelsectoren,vandemedischeindustrie
totbiologischebodemsaneringen.Warenditenkelejarengeledennogdureencomplexetech-
nieken,inmiddelszijnzeinveelverschillendesectorengangbaarwaardoordeanalyseduuris
verkortendeprijssterkgereduceerd.DNAanalyseskomendaaromookvoorwaterkwaliteits-
monitoringinbeeld.
Hetdoelvanditprojectisomeeneersteverkenningtemakenvanhettypeinformatieover
waterkwaliteitdatmetbehulpvaneenbredeDNA-screeningwordtverkregen.eDNAwordtnu
vooralgebruiktvoormonitoringvanspecifiekesoorten(bijvoorbeelddeGroteModderkruiper)
ofspecifiekegroepen(bijvoorbeeldvissen).VoordezeeDNAbarcodingenmetabarcodingana-
lyseswordteenkleinstukjevanhetDNAvandesoortofgroepwaarmennaaropzoekiseerst
geamplificeerd(vermenigvuldigd)endangeanalyseerd.AlhetoverigeDNAdatinhetwater-
monsteraanwezigiswordtmetdezeanalysesalshetwareweggegooid.Datisjammeraange-
zienhierheelveelinformatieinschuiltoverdewaterkwaliteitendetoestandvanhetecosys-
teem.Inditprojectwordteendoorkijkgegevenvandekansendiedemetagenomicsmethode
biedtvoorhetmonitorenvanwaterkwaliteit.Ditzouenerzijdsmoetenleidentothetverkrij-
gen van meer hoogwaardige informatie over waterkwaliteit en anderzijds een efficiëntere
monitoringintijdenkosten.
Ditprojectistotstandgekomendoordatin2016voorheteerstindeKrimpenerwaardeDNA
onderzoekwerduitgevoerdnaarhetvoorkomenvandegrotemodderkruiper (GMK)enver-
spreidingvanderodeAmerikaanserivierkreeft (RARK)indeuitgestrekteslotenstelsels.Het
onderzoekwerduitgevoerddoorOrvioninsamenwerkingmetRAVON,Hoogheemraadschap
Schieland en Krimpenerwaard (HHSK), de Natuur- en Vogelwerkgroep Krimpenerwaard
(NVWK),HetZuid-HollandsLandschap(ZHL)enOasenN.V.Hetonderzoekisalskansaangegre-
penom,methulpvanSTOWA,teonderzoekenwelkekansenerliggenommeteenbredere
DNA-screeningmeerinformatieteverkrijgenoverdebiodiversiteitenwaterkwaliteit.Hiertoe
iseenKRWmeetpuntindeKrimpenerwaardbemonsterdengeanalyseerd.
Ditrapportisopgebouwduitdevolgendehoofdstukken:
•Inhoofdstuk2wordtachtergrondinformatiegegevenoverDNAanalysetechniekeneneDNA
methoden.
•Inhoofdstuk3staatomschrevenhoedebemonsteringisverlopenenhetwatermonsterin
hetlabisbehandeld.
•Inhoofdstuk4wordendeanalyseresultatengepresenteerdenverderuitgewerktbinnenver-
schillendethema’s.
•Inhoofdstuk5wordenderesultatensamengevatenwordteendoorkijkgegevennaarde
toepassingsmogelijkheden(enonmogelijkheden).
•Inhoofdstuk6wordeneenaantalaanbevelingengedaan.
h1 introdUctie
7Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit | STOWA 2018-14
2.1 dna-analysetechnieken
Hieronderwordteenkorteomschrijvinggegevenvandetechniekenzoalsdezezijngebruikt
binnenditproject.Hetvaltbuitendescopevanditprojectomaldebeschikbaretechniekenen
toepassingenteomschrijvenenvergelijken.
next generation sequencing (ngs)
Omdesamenstellingvanorganismenineenwatermonstermeetbaarenzichtbaartemakenis
binnenditprojectgebruikgemaaktvaneentechniekdieNextGenerationSequencing(NGS)
heet.Hiermeewordenorganismenineenmonstergekarakteriseerdopbasisvanhungene-
tischmateriaal(DNA-code).AangezienallelevendeorganismenuniekDNAbevatten,kanhun
DNA-codewordengebruiktomzevanelkaarteonderscheidenenteidentificeren.
Het DNA dat in de organismen van een watermonster aanwezig is wordt allereerst hieruit
geïsoleerdenopgezuiverd.VervolgenswordendeindividuelestukkenDNA(DNA-fragmenten)
middelsNGSafgelezen,waardoordeDNA-codevanelkfragmentdigitaalbeschikbaarkomt.
VanelkvandezeDNA-codeswordtbepaaldofhetovereenkomtmeteenorganismewaarvande
DNA-codereedsstaatgeregistreerdinpubliekedatabases.Wanneerdithetgevalis,endeze
goedovereenkomen,ishetgeïdentificeerd.
SomskomtdeverkregenDNA-codeovereenmetmeerderesoortenvandezelfdegroep,indat
gevalwordthetDNA-fragmenttoteenlagertaxonomischniveaugeïdentificeerd(bv.genus,
familie,orde,etc.).InditgevalishetDNAnietonderscheidendgenoegomtoteenhogerniveau
teidentificeren.
VanveelorganismenishetDNA(ofgenoom)nognietbekendofgeregistreerdindeonlinedata-
basesenishetdaarommogelijkdateenorganisme(nog)nietkanwordengeïdentificeerdop
basisvanhetDNA.Dedatabasewordtechtersteedssnellergevuldaangeziendekostenentech-
niekendieditmogelijkmakensteedsgoedkoperengangbaarderworden(ziefiguur2.1).
h2 achtergrondinformatie dna analysetechnieken en edna methoden
Tweegrafiekenwaarinwordtweergegeven(links)deafnameinkostenvoorsequencingen(rechts)detoenameinaantal
genomendatisgesequenced.
fig 2.1
8 stowa 2018-14 | Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit
VerschillendeNGS-techniekenzijnbeschikbaaren
worden nog doorontwikkeld, elk met hun eigen
voor- en nadelen. Binnen dit project is gebruik
gemaaktvannanoporesequencingmetdeMinION
vanOxfordNanoporeTechnologies(ONT).Dereden
voordezekeuzeisdatdetechnologietoegankelijk
is (geengrote investeringnodig inapparatuuren
laboratoriumruimte), dat de resultaten snel wor-
denverkregen(binnen2dagenishaalbaar)endat
de technologie mobiel is en daarmee niet meer
perségebondenaanspecialistischelaboratoria.
2.2 enVironmental dna (edna) methoden
EnvironmentalDNA(eDNA)iseenmethodeomdeaanwezigheidvansoortenaantetonen.
Nietdoorhetindividuzelfoptezoeken,maardesporenvanDNAteanalyserendieinhet
milieudoordesoortwordenachtergelaten.Waterorganismenendierendievaakinhetwater
zijntevinden,latencontinuDNAinhetwaterachterviabijvoorbeeldfeces,slijmenhuidcel-
len. Door watermonsters te analyseren op DNA specifiek van deze organismen wordt het
mogelijkomhunaanwezigheidaantetonen.EeneDNAaanpakiseenbewezenmethodeom
deonzichtbareonderwaterwereldinkaarttebrengenentemonitoren,hetgeeneenwaarde-
volletoevoegingisaandehuidigemethoden.
VerschillendemethodesbestaanomheteDNAvanorganismenteanalyseren,dezeworden
hieronderkortomschrevenenschematischweergegeveninfiguur2.3.
barcoding middels qpcr
eDNA wordt nu vooral gebruikt voor monitoring van specifieke soorten. Bijvoorbeeld van
zeldzamesoortenalsdegrotemodderkruiperofknoflookpad,ofvanexotenalsderodeAme-
rikaanserivierkreeftofmuskusrat.VooreDNAbarcodingwordteenonderscheidendstukje
vanhetDNA(barcode)vandesoortwaarmennaaropzoekisgeamplificeerd(vermenigvul-
digd)engeanalyseerd.HiervoorwordteentechniekgebruiktdieqPCR(quantitativePolyme-
raseChainReaction)heet.Dezetechniekiszeergevoeligendaarmeeuitermategeschiktom
diersoortenaantetonenwaarvanweinigeDNAaanwezigisinhetwater.EenqPCRreactieis
bovendiensnelengoedkoopuittevoeren.Hetnadeelisdatvoorelkesoorteenaparteanalyse
moetwordenuitgevoerd,daarmeeisdezetechnieknietgeschiktomeenbredescreeninguit
tevoerenenmoetvantevorenwordenbepaaldwelkesoortenmenwilmonitoren.
metabarcoding middels ngs amplicon sequencing
eDNAwordtookgebruiktomsoortenlijstentegenererenbinneneenspecifiekegroep,zoals
bijvoorbeeld van vissen of amfibieën. Voor deze eDNA metabarcoding analyses wordt een
onderscheidendstukjeDNA(barcode)vandegroepeerstgeamplificeerd(vermenigvuldigd).
Aldevermenigvuldigde stukjeswordenvervolgensafgelezenmeteenNGS-techniekomte
identificerenvanwelkesoortbinnendegroepheteDNAafkomstigis.Deuitdagingisomeen
stukDNAtevindendatzowelonderscheidendisvoordegroep(bv.datvissenonderscheidt
DeMinIONsequencer(ziegroenepijl)ingebruik
ophetkantoorvanOrvion.
fig 2.2
9Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit | STOWA 2018-14
vanalleanderesoorten),als(naamplificatie)voldoendeonderscheidendDNAoplevertzodat
deindividuelesoortenbinnendiegroepkunnenwordengeïdentificeerd.Dezeaanpakisook
bruikbaarvoorsoortenwaarweinigDNAvanaanwezigisomdatheteerstwordtvermenigvul-
digd.Metéénanalyseishetmogelijkomeensoortenlijsttegenereren.Dekostenpermonster
liggenhogerdanvoordeqPCR,echterwordtookmeerinformatieverkregen.Indepraktijk
blijktdatnietallesoortenindeanalyseswordenmeegenomenofvanelkaarzijnteonder-
scheiden.Voorelkegroep(bv.bacteriën,algen,vertebraten,vissen,amfibieën,etc.)wordteen
aparteanalyseuitgevoerd.Vooreencompleteanalysevanallesoortenbinnenallegroepenis
dezeaanpakkostbaarenomslachtig.
metagenomics middels ngs
HetisookmogelijkomalhetDNAinuiteenwatermonsterinéénkeer(direct)aftelezen,
zonderdatheteerstwordtvermenigvuldigd.Hiermeewordteenbredescreeninggemaakt
vanalhetlevenineenwatersysteem.NietalleenhetDNAvanhogeresoortenwordtmeegeno-
men, maar ook van organismen die onzichtbaar zijn zonder een microscoop (bacteriën,
macrofauna,algen,etc.).
schematische weergaVe Van de Verschillende technieken
Dezetechniekenwordeningezetvoormonitoringvanwaterorganismen.BarcodingmiddelsqPCRgeeftinzichtinéén
soort.Metmetabarcodingwordteensoortenlijstvaneenspecifieke(genetischverwante)groepgegenereerd.Metmeta-
genomicswordtinzichtverkregeninallesoortenineenmonster,achterafkunnenverschillendesoortenlijsten(ofande-
reeigenschappen)wordengegenereerd.
fig 2.3
stowa 2018-14 | Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit10
Hetvoordeelvandezeaanpakisdatvantevorengeenselectiegemaakthoefttewordenvande
organismendiemenwilmeten.Eenbredescreeningwordtgemaaktmetslechtséénanalyse.
Eenmogelijkeeffect(bias)alsgevolgvanvermenigvuldigingvanhetDNAwordthiermeevoor-
komen.Bovendiengaandegenetischeeigenschappen(zoalsantibioticaresistentie,metabolis-
me,etc.)dieookophetDNAgecodeerdzijnnietverlorenmetdezeaanpak,ietsdatdoorver-
menigvuldigingwelgebeurd.
EennadeelvandezeaanpakisdatDNAdatinzeerlageconcentratiesvoorkomtmogelijkniet
meerterugwordtgevonden.Degrotehoeveelhedendatadiewordengegenereerdbevatten
zeerveelnuttigeinformatie,echtervormthetverwerkenhiervaneenIT-uitdaging.
Binnenditprojectisvoordezemethodegekozenomeenverkenningtemakenvanhettype
informatiedathiermeewordtgegenereerdenwelkekansenerliggenvoorwaterkwaliteits-
monitoring.
11Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit | STOWA 2018-14
NaoverlegmetHHSKiseenKRWmonsternamelocatiegeselecteerdombinnenditproject
mee tenemen.Hetmonsternamepunt ligtdichtbijeengemaalwatalsmogelijkvoordeel
heeftdatheteDNAvanuiteengrotergebiedvandepolderdaarsamenkomt(ziefiguur3.1).
Bovendienblijkthet(opbasisvaneerdereKRW-metingen)eensoortenrijkelocatietezijn(zie
tabel3.1).
Delocatieisop1november2016bemonsterddoorOrvion,hierbijzijnnietdeofficiëleKRW
richtlijnengevolgd.Deelmonsterszijnvanhettrajectgenomenomde100mopverschillende
plekken(middenindeslootentussenhetriet)enverschillendedieptes.Vandezemonstersis
éénmengmonstergemaaktdatdirectinbehandelingisgenomeninhetlaboratoriumvan
Orvion.
Hetbemonsterdewaterisvervolgensophetlaboptweemanierenvoorbehandeld:
1200mlvanhetwaterisgefiltreerdovereen0,2μmmembraanfilteromdeaanwezigeorga-
nismenuithetwateropteconcentreren.Uitdeorganismendieophetfilterzijnachterge-
blevenisvervolgenshetDNAgeëxtraheerd(monstercodeS534D01 - filter).
2200mlvanhetwaterisafgedraaidineencentrifugeomdeaanwezigeorganismentecon-
centreren.Degevormdepelletmetcellen/organismenisgebruiktomeenDNA-extractieuit
tevoeren(monstercodeS534D03 - pellet).
h3 bemonstering
39_25DN3
39_25DN1
39_22BA3
39_25DN2
39_22BA1
39_22BA2
39_23DHS2
39_23DHS1
39_23DHS3
39_20KGZ539_20KGZ6
39_20KGZ4
KRWlocatiedieisbemonsterddoorOrvionop1november2016.fig 3.1
monsternamepunt X-coörd Y-coörd # macroFauna- soorten #macroFauna indiViduen
39_20kgZ4 105120 436908 101 1866
gegeVens Van de bemonsterde krw-locatie Zoals aangeleVerd door hhsk.tabel 3.1
12 STOWA 2018-14 | Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit
h4 ngs analyseresUltaten
DeDNA-extractenvandetweedeelmonsterszijngeanalyseerdmiddelsNGS(MinIONvanONT),
hiervoorisgeenamplificatiestapuitgevoerd,maarishettotaleDNAgeanalyseerd(ziepara-
graaf2.2).Indeoffertestaatgenoemddatdriemonsterszoudenwordengeanalyseerd,echteris
inafstemmingmetBasvanderWalbeslotendathetvanmeerwaardewasomextraeffortte
stoppenindeBio-ITenrapportagevandedata.Vandaardattweemonsterszijngeanalyseerd.
DeverkregendigitaleDNA-codesvanaldefragmentenzijnmetdoorOrvionontwikkeldeBio-
ITsoftwarevergelekenmetonlinepubliekedatabasesomtebepalenmetwelkedezehetbeste
overeenkomtof-komen.Deinstellingenindesoftwarebepalenaanwelkecriteriaeenmatch
moetvoldoenomtewordengeaccepteerd.
Vervolgenswordtdedataopgeschoond,dithoudtindatsoortendieminderdanvijfkeerzijn
geïdentificeerduitdedatawordengefilterdaangeziendezealsruiszijntebeschouwen.De
zoogdieren(Mammalia)zijninditgevalookuitdedatagefilterdaangeziendeidentificatieop
basisvanhettotaleDNAnognietbetrouwbaaris.Eenaantalvirussenenfagenzijnaangetoond
indedata,alzijndezenietmeerdanvierkeerteruggevondenendaaromuitdedatasetsgefil-
terd.Dealgemeneanalyseparameterswordenintabel4.1weergegeven.
Deverkregendatazijnopeenaantalmanierengeanalyseerdengeïnterpreteerd.Hetdoelisom
telatenzienopwelkemanierendezelfdedatasetkanwordenbenaderdengeanalyseerden
welkedatainhetDNAzitopgesloten
4.1 biodiVersiteit
Degeïdentificeerdesoorten(biodiversiteit)zijnzichtbaargemaaktineeninteractiefdiagram
(Krona)enineenExcelbestand.MetdeinteractieveKronadiagrammeniseenvisueeloverzicht
gegevenvandebiodiversiteit.Hiermeeisheteenvoudigomnaarspecifiekesoortentezoeken
ofdoordebiodiversiteitheente‘browsen’.Dooropeengroeptedubbelklikkenwordthierop
ingezoomd(meerdetail).Doorinhetmiddenteklikkenophetgewensteniveauwordterweer
uitgezoomd.
monster omscHrijVing (i) dna (ii) # dna- (iii) # Fragmenten (iV) # taXonomiscHe
concentratie Fragmenten geïdentiFiceerd eenHeden
(μg/ml) (reads) (reads) geïdentiFiceerd
s534d01 gefiltreerd 13,5 150.011 Voor: 5.929 155
na: 4.317
s534d03 gecentrifugeerd 32,8 248.717 Voor: 8.997 287
na: 6.924
algemene analysegegeVens Van de twee monsters.
(I)deconcentratievanhetgeëxtraheerdeDNA,(II)HetaantalDNA-fragmentendatdoordeMinIONisgedecodeerd(III)
HetaantalDNA-fragmentendatovereenkomtmetDNAindereferentiedatabases(voorennahetopschonenvande
data)(IV)aantaltaxonomischeeenhedendiezijngeïdentificeerdnahetopschonenvandedata.
tabel 4.1
13Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit | STOWA 2018-14
DeExceldocumentenbevattendesoortenlijstwaaropdeKrona’szijngebaseerd.Hierinisper
soort/groepaangegevenhoeveelDNA-fragmentenzijngeïdentificeerdenwelkpercentagevan
hetgeheelditbetreft.InExcelisheteenvoudigomdedatatebewerken(sorteren,filterenen
kopiëren).
Devolgendezesfileszijndigitaalbeschikbaargesteldmetditrapportofzijnoptevragenvia
Orvion:
•Exceldocumentmetdatavanhetgefiltreerdemonster:
20171219_M14-S534D01-filter_P0180.xlsx
•Kronadiagramvandebacteriëninhetgefiltreerdemonster:
20171219_M14-S0534D01-bacterien-filter_P0180.html
•Kronadiagramvandeeukaryoten(zonderzoogdieren)inhetgefiltreerdemonster:
20171219_M14-S0534D01-eukaryoten-filter_P0180.html
•Exceldocumentmetdatavanhetgecentrifugeerde monster:
20171219_M15-S537D03-pellet_P0180.xlsx
•Kronadiagramvandebacteriëninhetgefiltreerdemonster:
20171219_M15-S0534D03-bacterien-pellet_P0180.html
•Kronadiagramvandeeukaryoten(zonderzoogdieren)inhetgefiltreerdemonster:
20171219_M15-S0534D03-eukaryoten-pellet_P0180.html
Debiodiversiteitresultatenzijnhierondervoordetweemonstersnaderuitgewerkt.
gefilterde watermonster (filter)
DeverkregendatazijnopgesplitstinBacteriënenEukaryoten.Intabel4.2iseenoverzichtgege-
venvandetop3aangetoondegeneravanbeidegroepen.Infiguur4.1iseenscreenshotweerge-
gevenvandebiodiversiteitKronafilesvandebeidegroepen.
# dna- %-age Van omscHrijVing
Fragmenten totaal
prokaryoten
Limnohabitans sp. 448 7,56 Veel aangetroffen bacterieel genus in
zoetwater (meren, sloten, etc.), zeer
diverse ecofysiologie. Facultatief aeroob.
Flavobacterium sp. 235 3,96 Breed aangetroffen in milieu (water en
bodem). aeroob, chemoheterotroof.
Polynucleobacter sp. 129 2,18 Veel aangetroffen bacterieel genus in
zoetwater (meren, sloten, etc.),
eukaryoten
Thalassiosira sp. 40 0,67 diatomeeën/kiezelwieren
Sterkiella sp. 12 0,20 ciliaten
Spirogyra sp. 11 0,19 groene algen
top 3 Van aangetroffen bacteriën en eUkaryoten in het gefiltreerde watermonster
(filter) die tot genUsniVeaU Zijn geïdentificeerd.
tabel 4.2
14 stowa 2018-14 | Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit
screenshots Van de krona’s Voor het gefiltreerde watermonster (filter).
AfbeeldingAvandebacteriënenafbeeldingBvandeEukaryoten.DeinteractieveKrona’szijnmetditrapport
meegestuurd.
fig 4.1
gecentrifugeerde watermonster (pellet)
DeverkregendatasetvandepelletisgefilterdomonderscheidtemakentussenProkaryoten
(ArchaeaenBacteriën)enEukaryoten.Intabel4.3iseenoverzichtgegevenvandetop3aange-
toondegeneravanbeidegroepen.
a
b
15Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit | STOWA 2018-14
discussie van de biodiversiteitresultaten
CentrifugerenresulteertineenhogereconcentratieDNA,aantalDNA-fragmentenenaantal
taxonomischeeenhedenen lijktdaarmeeeenbetereprocedurevoordit typeanalyses.Dit
heeftechternauwelijksverschilgemaaktindedominantaangetroffensoortentussendetwee
monsters.Welblijktdateenaantalsoortensignificantmeerzijnaangetroffeninhetgecentri-
fugeerdemonsterdaninhetgefiltreerdemonster,ditwordtnadertoegelichtinparagraaf4.2.
OpvallendisdatveelvanheteukaryootDNAnietkanwordengeïdentificeerd(meerdan30%).
Ditkomtwaarschijnlijkdoordatnogmaarweiniggenomenvanhogereorganismeninderefe-
rentiedatabaseszijnopgenomenendoordathogereorganismenveelmeerDNAmetzichmee-
dragendanprokaryoten.VeelvanditDNAisnietuniekenonderscheidendvooreensoort
waardoor identificatie niet mogelijk is. Zo zijn bijvoorbeeld een aantal soorten geïdentifi-
ceerdwaarvanwezekerkunnenzijndatdezenietinhetwateraanwezigzijn,zoalsDNAvan
deorang-oetangofvandeTibetaanseantilope.
Ookzijneenaantalvissoortengeïdentificeerd(bijvoorbeelddekarperendriedoornigestekel-
baars),maarsteedsmetslechtséénDNA-fragmentwaardoordeidentificatienietbetrouw-
baargenoegisommeetenemeninderesultaten.OokisbijvoorbeeldéénDNA-fragmentvan
eenkikkersoortteruggevonden-Nanoranaparkeri-ditiséénvandeeersteamfibieënwaarvan
hetgenoomisgesequenced.HetstukjeDNAdatinonzedatasetisgevondeniswaarschijnlijk
generiekvooramfibieën/kikkers,wantdezespecifiekekikkersoortkomtnietinWest-Europa
voor.
Vooralkleinemicro-organismenwordenindedatasetsteruggevonden,dithoudtindesoor-
tendieinhetgeheelwordenbemonsterd(bacteriën,macrofauna,etc.)ennietlossecellenin
lageconcentratiesvanhogereorganismen(eDNA).Vandemicro-organismenisdeidentifica-
tieookbeteraangezienmeerDNAinhetmonsteraanwezigisendereferentiedatabasesbeter
zijngevuld.
# dna- %-age Van omscHrijVing
Fragmenten totaal
bacteriën
Flavobacterium sp. 744 8,29 Veel aangetroffen bacterieel genus in
zoetwater (meren, sloten, etc.), zeer
diverse ecofysiologie. Facultatief aeroob.
Limnohabitans sp. 519 5,78 Breed aangetroffen in milieu (water en
bodem). aeroob, chemoheterotroof.
Polynucleobacter sp. 132 1,47 Veel aangetroffen bacterieel genus in
zoetwater (meren, sloten, etc.),
eukaryoten
Thalassiosira sp. 40 0,67 diatomeeën/kiezelwieren
Sterkiella sp. 12 0,20 ciliaten
Spirogyra sp. 11 0,19 groene algen
top 3 Van aangetroffen bacteriën en eUkaryoten in het gecentrifUgeerde watermonster (pellet)
die tot genUsniVeaU Zijn geïdentificeerd.
tabel 4.3
16 STOWA 2018-14 | Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit
screenshots Van de krona’s Voor het gecentrifUgeerde watermonster (pellet).
AfbeeldingAvandebacteriënenafbeeldingBvandeEukaryoten.DeinteractieveKrona’szijnmetditrapport
meegestuurd.
fig 4.2
a
b
17Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit | STOWA 2018-14
screenshot Van een krona waarin de genera worden afgebeeld die alleen in het filtermonster
Zijn aangetroffen (a) en die genera die alleen in het pelletmonster Zijn aangetroffen (b).
fig 4.3
4.2 Vergelijking Van monsters
Doordatalledatadigitaalwordengegenereerdishetmogelijkommetalgoritmesdemon-
stersmetelkaartevergelijken.Bijvoorbeeld,welkesoorten/genera/familieszijninbeidemon-
stersaangetoondenwelkezijnenkelindeéén,maarnietindeanderaangetoond?Terillustra-
tiestaatinfiguur4.3weergegevenwelkegeneraalleeninhetfilterofjuistalleenindepellet
zijnaangetoond.
a
b
18 STOWA 2018-14 | Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit
Zoalsverwachtzijnmeersoortenalleenindepelletaangetoonddandiealleeninhetfilter
zijnaangetoond.Aangezienuitdepelletongeveer2,5keermeerDNAisgeëxtraheerddanuit
hetfilterisdeverwachtingdatsoortendieindepelletmetweinigDNA-fragmentenzijnaan-
getoondnietinhetfilterzijnteruggevondendoordatdezeonderdedetectielimietblijven.Dit
isvoordemeestegeneraookhetgeval,zezijnopbasisvangemiddeld11,8DNA-fragmenten
(0,13%vantotaal)geïdentificeerdendaarmeenietdominantaanwezig.Erzijntweegroepen
dieechteropvallen,Rhodobacterspp.(106DNA-fragmentenoftewel1,18%)endegroepvande
Sphingomonadaceae (118 DNA-fragmenten oftewel 1,31%) bestaande uit Sphingopyxis spp.,
Novosphingobiumspp.enSphingomonasspp.
VanShingopyxisalaskensis isbekenddatheteenultramicrobacteriumismeteenzeerklein
volumevan0,1μm3welkedooreen0,2μmfilterheenkangaanendusnietindeanalysevan
het filterwordtmeegenomen.Door te centrifugerenwordtdezeechterwelmeegenomen.
Mogelijkisditookhetgevalvoordeoverigesoorten,alzijndeze(voorzoverbekend)nietaan-
gemerktalsultramicrobacteria.
Dezevergelijkinglaatziendatheteenvoudigisomsignificanteverschillentussenmonsters
inzichtelijktemakenmetdezemethode.Ditgeldtookvoorhetvergelijkenvanvelemonsters
omopdezemaniersignificanteverschillenenovereenkomstenaantetonen,bijvoorbeeldin
detijd,inlocatiesofwatercondities.
4.3 Vergelijking filter monster met twn lijst
DeTaxaWaterbeheerNederlandbestaatuiteenaantallijsten(TWN-lijst),waarinalleorganis-
menzijnopgenomendievoorhetwaterbeheerrelevant(kunnen)zijn.Ditkunnenduszowel
aquatischealssemi-aquatischealsookniet-aquatischeorganismenzijn.
DedatadiezijnverkregenvoorhetfiltermonsterzijnmetdeTWNlijstvergelekenomtebepa-
lenwelkesoortendieindeTWN-lijstzijnopgenomeninhetwatermiddelsNGSterugzijn
gevonden.DeTWN-lijstisbegin2017gedownloadviahttp://sofus.ecosys.nl/Taxus/Downloads/Taxa-
lists/TWNList.XLS.VoordevergelijkingisgebruikgemaaktvandeEukaryotendieinhetwater
zijnaangetroffen,deBacteriënzijnbuitenbeschouwinggelaten.Erisnietgecontroleerdop
eventueleverschilleninnaamgevingofandereafwijkingentussendetweedatasets,hetkan
daaromzijndatbepaaldeovereenkomstennietzijnmeegenomen.DetaxadiemetdeMinION
zijngeïdentificeerddieookindeTWN-lijstvoorkomenstaanweergegevenintabel4.4.
MindersoortenopindeTWN-lijstzijnopbasisvanhetDNAgeïdentificeerddande101soor-
tendiemetdereguliereKRW-monitoringzijnbepaald(zietabel1).Zoalseerderalomschre-
venheeftditvooraltemakenmethetfeitdatnogmaarweiniggenomenvanEukaryoteninde
referentiedatabaseszijnopgenomen.Bovendienisnietbekendhoegrootheteffectvande
bemonsteringisgeweest(dezeisnietvolgensKRW-richtlijnenuitgevoerd)ofhetfeitdatdeze
opeenandermoment(jaarenseizoen)isgenomen.
ZoalsverwachtzijnopbasisvanhetDNAwelveelbacteriëngeïdentificeerd,dezestaanechter
nauwelijks(oftotzeerlagetaxonomischeeenheid)indeTWN-lijstopgenomen.
19Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit | STOWA 2018-14
MindersoortenopindeTWN-lijstzijnopbasisvanhetDNAgeïdentificeerddande101soor-
tendiemetdereguliereKRW-monitoringzijnbepaald(zietabel3.1).Zoalseerderalomschre-
venheeftditvooraltemakenmethetfeitdatnogmaarweiniggenomenvanEukaryoteninde
referentiedatabaseszijnopgenomen.Bovendienisnietbekendhoegrootheteffectvande
bemonsteringisgeweest(dezeisnietvolgensKRW-richtlijnenuitgevoerd)ofhetfeitdatdeze
opeenandermoment(jaarenseizoen)isgenomen.
ZoalsverwachtzijnopbasisvanhetDNAwelveelbacteriëngeïdentificeerd,dezestaanechter
nauwelijks(oftotzeerlagetaxonomischeeenheid)indeTWN-lijstopgenomen.
4.4 genetische eigenschappen
DoordathettotaleDNAvandealleorganismenindeanalysewordtmeegenomen,engeen
gebruikwordtgemaaktvanamplificatiestappen,wordthetmogelijkomnietalleendebiodi-
versiteittemeten,maarookdeaanwezigegenetischeeigenschappen.Ditwilzeggendatniet
alleenwordtbepaaldwieerzijn,maarookwatzekunnendoen.
Dedatasetvandepelletis,terillustratie,gescreendopdeaanwezigheidvanantibioticaresis-
tentiegenen(ARG).Dedatazijnnietverdergevalideerdenkandaaromnietalsdiagnosewor-
denbeschouwd,hetisbedoeldomteillustrerenwelketypeinformatieindedatazitopgeslo-
ten.OmspecifiekdedatasettescreenenopdeaanwezigheidvanARGisgebruikgemaaktvan
deCARDreferentiedatabase(TheComprehensiveAntibioticResistanceDatabase-https://card.
mcmaster.ca/).Deaangetroffengenendiemeerdantweekeerzijnaangetroffenstaanomschre-
venintabel3.1.
# Fragmenten %-age Van totaal naam taXontYpe (uit twn) taXon niVeau
109 1,8 Thalassiosirales diatomeeën ordo
137 2,3 Bacillariophyta diatomeeën divisio
14 0,24 Thalassiosira pseudonana diatomeeën species
11 0,19 Spirogyra maxima Fytoplankton species
40 0,67 Thalassiosira diatomeeën genus
9 0,15 Daphniidae Zoöplankton Familia
55 0,93 Thalassiosiraceae diatomeeën Familia
8 0,13 Thalassiosira weissflogii diatomeeën species
7 0,12 Cryptophyta Fytoplankton phylum
14 0,24 Anomopoda Zoöplankton cladocera
6 0,10 Tintinnida Zoöplankton ordo
5 0,08 Brachionus calyciflorus Zoöplankton species
taxa die Zowel in het filter als in de twn-lijst Voorkomen.
Hetaantalfragmentenenpercentagevanhettotaalstaanookgenoemd.Hettaxontypeentaxonniveauisuitde
TWN-lijstovergenomen.
tabel 4.4
20 STOWA 2018-14 | Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit
gen naam Biedt resistentie tegen omscHrijVing (engels) # Fragmente
mexk tetracycline, erythromycine, inner membrane resistance-nodulation-cell 6
triclosan division (rnd) transporter in the mexjk
multidrug efflux protein
ceoB aminoglycoside, ceoaB is an rnd efflux system that 3
fluoroquinolone confers multidrug
resistance in Burkholderia cenocepacia
nova novobiocin a type iii aBc transporter, identified 3
on the novobiocin biosynthetic gene
cluster, involved in the transport and
resistance of novobiocin.
mexn thiamphenicol, mexn is the inner membrane transporter of 3
chloramphenicol the mexmn-oprm multidrug efflux complex
antibiotica resistentiegenen die meer dan twee keer in de dataset Zijn aangetroffen
op basis Van een screening met de card referentiedatabase.
tabel 4.5
BinneneenanderprojectvanOrvionisvaneenRWZIhetinfluent(ruwrioolwater)enhet
effluent(nazuivering)gescreendopdeaanwezigheidvanARG.Dezetweemonstersbevatten
significantmeerARGdanditslootwatermonster(ziefiguur4.4).Inhetinfluentzijntoen63
verschillendeARGaangetoondeninheteffluentnog30ARG.Inditslootwatermonsterzijn
vierARGaangetoond,inhoeverredezeARGvannaturevoorkomen(ARGisdeelseennatuur-
lijkafweermechanismeinbacteriën)ofdoorexternefactorenaanwezigzijnzounaderonder-
zochtmoetenwordenomtebepaleninhoeverreantibioticaresistentieviahetoppervlaktewa-
terwordtverspreid.
Enkeleanderevoorbeeldenvangenetischeeigenschappenvanhetecosysteemdiemetdeze
datakunnenwordenverkregenzijn:
•pathogeniciteits- en/of toxiciteitsgenen (bijvoorbeeld van blauwalgen, ziektemakers voor
mens,dieren/ofplant),
•specifieke metaboleprocessen (bijvoorbeeldnitrificatie (omzettingvanammoniumnaar
nitraat),denitrificatie(omzettingvannitraatnaarstikstofgas),methaanproductie,afbraak
vanspecifiekestoffen),
•matevanaerobie/anaerobie(aeroob,microaerofiel,nitraatreducerend,sulfaatreducerend,
etc.).
TotnutoewordtvooralhetDNAvanwatermonstersgeanalyseerd.Hetisechterookmogelijk
omhetRNAopdezelfdewijzemetNGSteanalyseren.RNAiseenvormvanDNAdatalleen
wordtgeproduceerdwanneereengenactiefis,hetRNAvormthetsjabloonvoorhetcorres-
ponderendeeiwit/enzym.RNAisdaaromeenmaatvooractiviteitaangezieneencelinprinci-
pealleenRNAzalproducerenwanneerhetcorresponderendeenzymnodigis.DoorRNAte
metenwordtdaarominformatieverkregenoverwieineenmonsteractiefzijnenwatzeaan
hetdoenzijn.Ditbiedtextramogelijkhedenomvaneenwatersysteemtebepalenwatdeactu-
elestatusis.
21Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit | STOWA 2018-14
referentiedatabase naturalis
MethetprojectDNAWaterscanontwikkelenNaturalisenKWReengenetischemethodevoor
dedetectieenmonitoringvanaquatischemacrofaunaindicatorsoorten,die(mede-)bepalend
zijnvoordeecologischewaterkwaliteit,volksgezondheid(muggen)ofschade(exoten).
Naturalisenpartnershebbendegenetischecodevanverscheidenesoortengesequenceden
eenreferentiedatabaseopgesteld.Aangeziendedatabase (nog)nietpubliekbeschikbaaris,
heeftNaturalisdedatasetvanhetfiltermonstervanOrviontegenhuneigendatabaseaange-
houdenmethuneigenBio-ITsoftware.Hetdoelwasomtebepalenofdoorgebruiktemaken
vaneenanderereferentiedatabasemeerdataoverhetwatermonsterbeschikbaarkomt,met
namevandemacrofauna.
1 de Vos van steenwijk, a., godschalk, F.d., van Bemmel, m., van loosdrecht, m. next-generation dna-monitoringstechnieken voor het nieuwe zuiveren H2o-online. H2o-online / 9 januari 2017
antibiotica resistentiegenen (arg).
Dieinhetinfluent(blauw)eninheteffluent(groen)zijnaangetoond.ZiehetbijbehorendeartikelinH2Ovoormeer
informatie1.
fig 4.4
22 STOWA 2018-14 | Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit
Hetblijktechterdat,omwillevaneenaantalfactoren,dedatanietdirectbruikbaarisbinnen
ditproject.Ditonderanderedoordatniethethelegenoomvandemacrofaunasoorten is
gesequencd,maareenbarcode(hetCOI-gen)vandesoorten.BovendienmaaktOrviongebruikt
vaneenanderesequencingtechnologie(MinIONvanONT)danNaturalis(Illumina)watande-
redataverwerkingenBio-ITtoolsvereist.Kortom,deinformatieverkregendoortevergelijken
metdereferentiedatabasevanNaturaliskon(nog)nietbinnenditprojectwordenmeegeno-
men.
23Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit | STOWA 2018-14
Devolgendepuntenwordenindithoofdstuknadertoegelichtenbediscussieerd:
•Monitoringprokaryoten
•Monitoringhogereorganismen
•Behoudenbeheervandata
•Monsterconserveringen-opslag
•Ontwikkelingenintechnologieendatabases
•Onmogelijkhedenvandemethode
kansen voor monitoring prokaryoten
BacteriënenArchaea(deProkaryoten)zijnzeerdiversenaangepastaanhunomgeving.Deze
groeporganismenreageertsnelopveranderendecondities,veelalsnellerdanmeercomplexe
organismen.Desamenstellingvanprokaryotengeeftdaarominformatieoverdetoestandvan
hetwater,alsgevolgvanbijvoorbeeldorganischestofgehalte,zuurstofconcentratie,stikstof
(ammonium,nitriet,nitraat)enmogelijkookvanspecifiekeverontreinigingen.
Voorheenwashetnietmogelijkomdeprokaryotenindetailincomplexeecosystementeana-
lyseren aangezien de technieken hiervoor niet beschikbaar waren of te kostbaar waren.
Ondertussen is dit wel mogelijk en kan deze groep organismen een belangrijke bron van
informatievormen.Dereferentiekadersontbrekenechternogomopbasisvandebacteriële
biodiversiteitenaanwezigeeigenschappeneenuitspraaktedoenoverdewaterkwaliteit.
Eenaantalthema’swaarvoorditwelmogelijkiswordenhieronderkortomschreven.
Fecale indicatoren:Specifiekebacteriënkomenalleenvoorindefecesvanwarmbloedigedie-
ren.Dezewordendaaromgebruiktalsindicatorvoorfecalebesmettingvanwater.Denormis
nogaltijdomEscherichiacolientotaalcoliformenoptekweken.Anderefecaleindicatororga-
nismenzijnechterbekenddiemeerwaardevolleinformatiekunnengevendoordatzespeci-
fiekzijnvoorbepaaldediersoorten.Doordezeaantetonenwordtdaaromnietalleeninfor-
matieverkregenoverhetoptredenvanfecalebesmettingen,maarookwaardebesmetting
vandaankomt.Isdebesmettingbijvoorbeeldafkomstigvandemens(RWZIofriooloverstort),
vankoeien,varkensofvogels?Dithelptinhetnemenvanpreventievemaatregelenomtoe-
komstigebesmettingentevoorkomenendewaterkwaliteitteverbeteren.DeDNA-datasetvan
eenmonsterkanopaldezefecalesoortenwordengescreend.Overigensisinditprojectver-
kregendatasetsgeenDNAvanfecaleindicatororganismenbovendedetectielimietterugge-
vonden.
Blauwalgen (cyanobacteriën) en pathogenen:Dedatakunnenwordengescreendopsoorten
waarvan bekend is dat ze gezondheidsrisico’s met zich meebrengen. Te denken valt aan
blauwalgenenziektemakers(voormens,planten/ofdier).Doordatdegenetischeeigenschap-
penmeewordengenomenzouspecifiekgescreendkunnenwordenopdeaanwezigheidvan
toxiciteitsgenenofpathogeniciteitsgenen.Cyanobacteriëndieindedatasetszijnaangetrof-
fenzijn:
•Calothrixsp.
•Nostocsp.
•Cyanobiumsp.
h5 discUssie
24 STOWA 2018-14 | Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit
Antibioticaresistentiegenen: Zoals beschreven (zie paragraaf 4.4) kan het DNA ook worden
gescreendopdeaanwezigheidvanantibioticaresistentiegenen(ARG).Dedatakunnenwor-
dengebruiktomhetontstaanendeverspreidingvanantibioticaresistentieinhetmilieute
monitoren.
Virussen: HetismogelijkommetDNA-techniekenookvirussenenfagen(virussenspecifiek
voorbacteriën) tekarakteriseren.Bijbemonsteringenanalysevanditmonster ishierniet
specifiekrekeningmeegehouden,tochzijneenaantalvirussenenfageninlageaantallen
(1of2fragmenten)aangetoond.HetbetreffenDNA-virussenaangeziendeanalyseisuitge-
voerdopDNAennietopRNA.Eenaantalvoorbeeldenvanaangetroffenvirussen/fagenstaan
hierondergenoemd:
•ParameciumbursariaChlorellavirus:infecteertgroenealgen
•Chrysochromulinaericinavirus:infecteertgroenealgen
•MycobacteriumphageTonenili:infecteertMycobacteriën
monitoring van hogere organismen
Zoalsreedseerdergenoemdisgeblekendatdezeaanpaknietdirectbruikbaarisvoorhetana-
lyserenenmonitorenvanhogereorganismen.Vandesoortendiekleingenoegzijnominzijn
geheelindebemonsteringmeetewordengenomeniswelvoldoendeDNAbeschikbaar,echter
zijndereferentiedatabasesnognietvoldoendegevuldomdezenauwkeurigteidentificeren.
Nadrukmoetliggenophetvullenvandedatabasesmetcompletegenomenvan,voorwater-
kwaliteit,significanteorganismen.
VandesoortenwaarvanenkelheteDNAwordenbemonsterd(zoalsvissen,amfibieën,zoog-
dieren)isgeblekendatmetdezemethodeonvoldoendedatawordtgeproduceerd.Bovendien
geldtookvoordezesoortendatdereferentiedatabasesnogonvoldoendecompleetzijn.Een
combinatievantechniekenzouhierinuitkomstbieden,zokanvaneenmonsterzowelhet
totaleDNA(dezemethode)alshetgeamplificeerdeDNAvoorspecifiekehogereorganismen
(ampliconsequencing,zieparagraaf2.2)wordengeanalyseerdindienaanvullendeinformatie
nodig/wenselijkis.
behoud en beheer van data
ZoalsinhetvoorgaandehoofdstukisgedemonstreerdkunnendeDNA-datadiepermonster
worden gegenereerd op verschillende manieren worden geanalyseerd en geïnterpreteerd
afhankelijkvanhetdoelendevraagstellingen.Dedigitaledatablijvenbehoudenenkunnen
ookjarenlateropnieuwwordengeanalyseerdopbasisvandenieuwsteinzichten.Zoishet
dusmogelijkom‘terugindetijd’,opbasisvannieuweinzichten,monstersteanalyseren.
HetDNAdatpermonsterwordtverkregenblijftvelejarenstabielwanneerhetbij-80°Cwordt
opgeslagen.Indienbijvoorbeeldeennieuwe,verbeterdetechnologiewordtontwikkeldishet
mogelijkomookhetDNAterugindetijdteanalyseren.
Het opslaan en beheren van de data vormt een belangrijk aandachtspunt. Ook is het van
belangdatdedatavooreindgebruikers,maarookvoorhetpubliekenanderebelanghebben-
den,wordenontslotenenvisueelwordengemaakt.
25Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit | STOWA 2018-14
monsterconservering en -opslag
OmdatDNA-analysesnietafhankelijkzijnvanlevende,ofzelfsintacte,organismenworden
deteanalyserenwatermonstersinhetvelddirectgeconserveerd.Opdezemanierblijvende
monstersrepresentatiefvoorhetbemonsterdesysteemzonderdatergegevensverlorengaan.
Demonstershoevennaconserveringniettewordengekoeldofdirectinbehandelinggeno-
menteworden,maarkunneneenaantalweken/maandenwordenopgeslagen.Ditbetekent
datdelogistiekeenvoudigisenmonsterskunnenwordenopgespaardindiendatwenselijk/
nodigis.
ontwikkelingen in technologie
Sequencing-techniekenzijnalvergaandgeautomatiseerd(bijvoorbeelddoorrobotisering)en
deverwachtingisdatditalleenmaarverderzalwordengeautomatiseerd.Ditbetekentdat
hetmogelijkisomveelmonstersinparallelinbehandelingtenemen(high-throughput)ende
doorlooptijdsterkwordtverkort.Bovendienwordtdeafhankelijkheidvanbeschikbareen/of
gespecialiseerde manuren veel kleiner. Voor relatief eenvoudige analyses en interpretaties
zijndoorlooptijdenvanminderdaneenweekhaalbaar.
Eenandereontwikkelingisdatdetechnologieindetoekomstookinhetveldkanworden
toegepast.Voorspecifieketoepassingenbiedtditkansenaangezienergeenafhankelijkheid
meer isvangespecialiseerde laboratoriaen/ofspecialistischewerknemers.Dedataworden
digitaal verkregen en kunnen eenvoudig via internet worden verstuurd naar een centraal
puntvoorverdereverwerkingenanalyse.Deverwachtingisdatditbinnenvijfjaargangbaar
wordtvoorNGSenqPCRtechnieken.
Detechnologieontwikkeltzichsnel.Ditheeftalsnadeeldathetvoorschrijvenvanstandaard-
proceduresmoeilijkis,echterhetvoordeelisdatdekostenafnemenendekwaliteittoeneemt.
wat zijn de openstaande uitdagingen?
Opditmomentishetnognietmogelijkommetdezetechniekeninformatietegenererenover
bijvoorbeeldhetstadiumvanontwikkelingvandeaanwezigehogereorganismen.Zijnditbij-
voorbeeldadulten,juvenielenoflarven?Ookaspectenalsgezondheidengeslachtzijnnog
nietuitdedatatedestilleren(ditisoverigensonmogelijkindienalleennaarbarcodeswordt
gekeken).
Metdezetechnologieisnoggeenabsolutekwantificatie (aantallen/ml)mogelijk,maarwel
eenrelatievekwantificatie(%-agevantotaalDNAsequenties).Ditisveelalvoldoendevoorhet
vergelijkenvanmonstersengeeftinzichtinverschuivingenindetijd.Indienabsolutekwanti-
ficatievanbepaaldesoorten/eigenschappennodigiszijnanderetechniekenbeschikbaar(bij-
voorbeeldqPCR,zieparagraaf2.2)waarmeedezekunnenwordengekwantificeerd.Voorsoor-
tenwaarvanenkelheteDNAwordtgeanalyseerd(endusniethetorganismeinhetgeheel)is
absolutekwantificatienognietmogelijk
26 STOWA 2018-14 | Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit
MetdezeverkenningisaangetoonddatmeteenbredeDNA-screening(metagenomics)van
eenwatermonsterveeldatawordtverkregenoverhetwatersysteem.155(filter)en287(pellet)
taxonomischeeenhedenzijngeïdentificeerd.Dezezijnzichtbaargemaaktindebijgevoegde
digitalebestandeninExceleninKronadiagrammen.Maarookdeeigenschappenvandesoor-
tenkomenmetdezemethodebeschikbaarhetgeenmeerinformatiegenereertoverhetwater-
systeem.
Opbasisvanderesultatenwordendevolgendeaanbevelingengedaan:
•Hetiswaardevolommiddelsmetagenomicswaterkwaliteittemonitoren.Opkortetermijn
kanditalvoormicro-organismenenhuneigenschappen.
•Oplangeretermijniseenbredescreeningvoorhogereorganismen(m.nmacrofauna)ook
haalbaar. Voorwaarde daarvoor is dat complete genomen worden gesequenced van deze
organismenenopenbaarwordengemaakt.
•Indienmogelijkpre-amplificatie vanhetDNAvermijdenaangezienopdezemanierveel
dataverlorengaat.Pre-amplificatieismetnamevalidewanneerhetDNAnietinvoldoende
concentratiesvoorkomt,bijvoorbeeldvooreDNAwaarbijalleensporen(enniethetorganis-
mezelf)wordenbemonsterd.
•Hetisnumetnamevanbelangomdatategenereren,referentiekadersoptebouwenen
ervaringoptedoenmetdezemethodieken
h6 conclUsies en aanbeVelingen
27Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit | STOWA 2018-14
STOWAishetkenniscentrumvanderegionalewaterbeheerders(veelaldewaterschappen)in
Nederland.STOWAontwikkelt,vergaart,verspreidtenimplementeerttoegepastekennisdie
dewaterbeheerdersnodighebbenomdeopgavenwaarzijinhunwerkvoorstaan,goeduitte
voeren.Dezekenniskanliggenoptoegepasttechnisch,natuurwetenschappelijk,bestuurlijk-
juridischofsociaalwetenschappelijkgebied.
STOWAwerktinhogematevraaggestuurd.Weinventariserennauwgezetwelkekennisvragen
waterschappenhebbenenzettendievragenuitbijdejuistekennisleveranciers.Hetinitiatief
daarvoorligtveelalbijdekennisvragendewaterbeheerders,maarsomsookbijdekennisinstel-
lingenenhetbedrijfsleven.Dittweerichtingsverkeerstimuleertvernieuwingeninnovatie.
Vraaggestuurdwerkenbetekentookdatwezelfvoortdurendopzoekzijnnaarde‘kennisvra-
genvanmorgen’-devragendiewegraagopdeagendazettennogvoordatiemandzegesteld
heeft-omoptimaalvoorbereidtezijnopdetoekomst.
STOWAontzorgtdewaterbeheerders.Wijnemendeaanbestedingenbegeleidingvandegeza-
menlijkekennisprojectenopons.Wijzorgenervoordatwaterbeheerdersverbondenblijven
metdezeprojectenenerook‘eigenaar’vanzijn.Ditomtewaarborgendatdejuistekennis-
vragenwordenbeantwoord.Deprojectenwordenbegeleiddoorcommissieswaarregionale
waterbeheerderszelfdeelvanuitmaken.Degroteonderzoekslijnenwordenperwerkvelduit-
gezetenverantwoorddoorspecialeprogrammacommissies.Ookhierinhebbenderegionale
waterbeheerderszitting.
STOWA verbindt niet alleen kennisvragen en kennisleveranciers, maar ook de regionale
waterbeheerdersonderling.DoordesamenwerkingvandewaterbeheerdersbinnenSTOWA
zijnzijsamenverantwoordelijkvoordeprogrammering,zettenzijgezamenlijkdekoersuit,
wordenmeerderewaterschappenbijéénenhetzelfdeonderzoekbetrokkenenkomende
resultatensnellertengoedevanallewaterschappen.
de grondbeginselen Van stowa Zijn Verwoord in onZe missie:
Het samenmet regionalewaterbeheerdersdefiniëren vanhunkennisbehoeften ophetgebied vanhet
waterbeheerenhetvoorenmetdezebeheerders(laten)ontwikkelen,bijeenbrengen,beschikbaarmaken,
delen,verankerenenimplementerenvandebenodigdekennis.
stowa in het kort
28 STOWA 2018-14 | Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit
STICHTINGTOEGEPAST ONDERZOEK WATERBEHEER
STICHTINGTOEGEPAST ONDERZOEK WATERBEHEER
[email protected] www.stowa.nlTEL 033 460 32 00 FAX 033 460 32 01
Stationsplein 89POSTBUS 2180 3800 CD AMERSFOORT
[email protected] www.stowa.nlTEL 033 460 32 00
Stationsplein 89 3818 LE Amersfoort POSTBUS 2180 3800 CD AMERSFOORT
2018
14
VERKENNING VAN DE POTENTIE VAN METAGENOMICS VOOR MONITORING VAN WATERKWALITEIT
omslagmetagenomics.indd 1 04-04-18 14:13