STEREOLOJİ NEDİR?

• Stereoloji, üç boyutlu örneklerin (biyolojik yapılar, metalurjik örnekler vb.) iki boyutlu kesitlerinden elde edilen verilere dayanarak, onların gerçekteki üç boyutlu özellikleri ile ilgili yorumlar yapılmasını sağlayan bilim dalının adıdır.

• Yapının her bir bileşeni, bu kesitlerde, sayısı, büyüklüğü ve kapladığı uzunluk, alan ve hacim oranıyla ilişkili bir biçimde izdüşümler (profiller) oluşturur. Bu izdüşümler de yapının içerdiği bileşenler hakkında bilgi almak üzere kullanılır. Fakat, yapının içinde bulunan bileşenlerin kesitlerde ortaya çıkan izdüşümleri, sadece ait oldukları yapıların, kesit düzlemi üzerindeki temsillerinden ibarettirler. Dolayısıyla, bu izdüşümlerden yola çıkarak doğrudan yorumlar yapmak, bunların ait oldukları bileşenlerin üç boyutlu özelliklerine ait gerçek verilerin elde olmamasından dolayı, oldukça yanıltıcı olabilmektedir (Şekil-1).

Şekil 1: İki boyutlu kesitlerle yapılan örneklemelerde ortaya çıkan boyut azalması. Herhangi bir yapı, iki boyutlu bir düzlemle kesişmesi durumunda, normalde üç boyutlu uzaydaki n boyutlu yapısına bağlı olarak, “n-1” boyutlu bir

kesişim (izdüşüm) verir. Dolayısıyla iki boyutlu kesitlerde, hacme sahip 3 boyutlu yapılar iki boyutlu alanlar; iki boyuta (en ve boy) sahip alanlar tek boyutlu çizgiler; ve tek boyutlu çizgiler ise boyutsuz (sıfır boyutlu) noktalar olarak

örneklenirler. Bu durum biyolojik dokulara uyarlanacak olursa: Bir hücre (3 boyutlu), kesitte bir alan; bir zar bir çizgi (çekirdek zarı gibi) ve (tam olmasa da ideal anlamında bir çizgi olan) bir fibril de bir nokta olarak ortaya çıkacaktır. Bu

prensibe göre boyutsuz (sıfır boyutlu) varlıklar, iki boyutlu kesitlerle örneklenemezler. Sayı kavramı da, boyutsal özelliklerden bağımsız (yani sıfır boyutlu) olduğundan, iki boyutlu kesitlerden faydalanılarak, doğrudan sayı

kavramına ulaşmak imkansızdır. Sayı ancak üç boyutlu bir örnekleme sondası ile örneklenebilir.

• Sözgelimi, bir yapı içerisinde bulunan "a" tipi bir taneciğin (örneğin beyinde bulunan nöronların) sayısını belirlemek istediğimizde, bunu doğrudan "a" taneciklerini içeren bir yapıdan alınmış iki boyutlu bir kesit üzerinde gerçekleştiremeyiz. Çünkü, taneciklerin kesitlerde ortaya çıkan izdüşümleri, onların büyüklükleri, kesit alma yönüne dik olan uzanımları, hacimleri vb. gibi faktörlerle yakından ilişkilidir. Büyük tanecikler, küçüklere göre daha büyük bir ihtimalle kesit düzlemi tarafından kesilme şansına sahipken, küçük "a" tanecikleri daha az izdüşüm verme şansına sahiptir (Şekil-2)

Şekil 2: Partikül büyüklüğü ve yöneliminin, örneklenme şansına etkisi. A’da, birbirine paralel ve eşit aralıklı kesitlere ayrılmış olan bir referans hacim içerisindeki iki partikülden büyük olanı, küçük olana göre daha fazla kesit tarafından örneklenme şansına sahiptir. Dolayısıyla, büyük partikül daha fazla kesitte izdüşümleri ile temsil edileceğinden, kesitlerde ortaya çıkan partikül izdüşümlerinin sayısının gerçek partikül sayısıyla doğrudan bir ilişkisinin olmadığı açıktır. B’de ise, kesit alma doğrultusuna göre partiküllerin yönelimlerinin, örneklenme ihtimali ile olan ilişkisi şematize edilmiştir. Uzun ekseni kesit alma doğrultusuna paralel olan, veya, kesit düzlemine dik olarak yerleşim gösteren partiküller, eğik veya kesit düzlemine paralel yerleşmiş olanlara göre daha fazla kesit tarafından isabet alma şansına sahip olacaklardır. Sonuçta, partiküllerin kesitlerde ortaya çıkan izdüşümlerinin sayısı (yani partiküllerin seri kesitler tarafından örneklenme ihtimali), partiküllerin boyutları ve yönelimlerinin de etkili olduğu bir parametredir ve bu parametreden yola çıkılarak partikül sayısına ulaşmak istendiğinde, izdüşüm sayısına etkide bulunan bu faktörleri ortadan kaldırabilecek bir örnekleme mantığı uygulanmalıdır. Bu da ancak, iki boyutlu kesitler bu tip yanıltıcı bilgiler içerdiğinden, üç boyutlu örnekleme stratejileri ile gerçekleştirilebilir.

• Şekil 3: İçerdiği partikülleri eş yönelimli olan (belli bir doğrultuda en-boy dağılımı gösteren) bir hacimden geçen eşit aralıklı kesitlerin doğrultusu ile, hacim içerisinde bulunan partiküllerin örneklenme şansı arasındaki ilişki. Partiküllerin uzun eksenlerine dik bir doğrultuda alınan kesitler, paralel doğrultuda alınanlara göre daha fazla miktarda partikülle kesişerek, daha fazla sayıda izdüşüm oluşturma şansına sahiptirler. A’da partikül yönelimine dik, B’de ise paralel alınan kesitler şematize edilmiştir.

• Görüldüğü gibi, eşit aralığa sahip kesitler, taneciklerin uzun eksenlerine dik bir doğrultuda alındığında daha fazla; paralel alındığında ise, aynı taneciklerden, daha az sayıda izdüşüm elde edilmektedir. Halbuki, sayı açısından bakıldığında, her bir tanecik "1" olarak sayımda gözükeceğinden, yönelimden bağımsız olarak, büyük olsun, küçük olsun tüm tanecikler eşit örneklenme şansına sahip olmalıdırlar.

• İki boyutlu kesit düzlemleri ile örneklenen “n” boyutlu bir yapı, kesitte “n-1” kadar boyuta sahip bir izdüşüm ile temsil edilecektir. Yani, belli bir hacme sahip (üç boyutlu) katı bir öğe, iki boyutlu bir yüzey; iki boyuta sahip bir yüzey (örneğin bir membran) tek boyutlu bir çizgi veya eğri; tek boyutlu (fibril gibi) bir çizgi veya eğri ise, sıfır boyutlu bir nokta olarak izdüşüm verir (Şekil-1). Tek başına bu bakış açısı bile, kesitlerden faydalanılarak yapılan morfometrik çalışmaların, uygun metotlar kullanılmadan ne kadar yanıltıcı olabileceğini göstermeye yeterlidir.

• Gerçekte "kesit" kavramı, herhangi bir katı yapı içerisinden geçen ve kalınlığı olmayan (t=0 olan) düzlemleri ifade eder. Buna iyi bir örnek olarak, bir maden örneğinin kesilmiş ve parlatılmış bir yüzeyi verilebilir.

• Stereolojide, böyle hata kaynaklarından etkilenmesi muhtemel olan yöntemler taraflı (biased) metodlar olarak nitelendirilmektedir. Dolayısıyla taraflı: "gerçek değerden sistematik sapma gösteren" manasındadır. Stereolojik metotlar ise, tarafsız (unbiased) metotlardır. Bunun anlamı; stereolojik metotlar kurallarına uygun bir biçimde uygulandığında, sistematik hatadan bağımsız sonuçlar elde edilmesini sağlar ve örnekleme sayısı arttırıldıkça gerçek değere daha fazla ihtimallikle yaklaşmak mümkün olur.

• Stereolojik metotların temelini “Sistematik Rasgele Örnekleme” (SRÖ) stratejisi oluşturmaktadır.

• Bu örnekleme biçiminin temel özelliği , çalışılacak olan yapıdan örnekler almanın gerekli olduğu durumlarda, yapının her noktasının eşit örneklenme şansına sahip olmasını sağlamasıdır.

• SRÖ, önceden belirlenmiş sabit bir örnekleme aralığı boyunca, ilk aralık içinden rasgele bir noktadan başlanmak suretiyle, ilgilenilen yapının tamamının örneklenmesini içerir. Önceden belirlenen örnekleme aralığı (örneğin, her onuncu kesiti veya parçayı seçmeye karar verildiğinde ilk on kesitlik seri), örneklemenin sistematik kısmını, ilk aralık içinde rasgele bir noktadan başlanması (örneğin, ilk on kesit içinden herhangi birinin başlangıç olarak seçilerek, bu kesitten sonra gelen her onuncu kesitin örnek olarak seçilmesi) ise, örneklemenin rasgelelik özelliğini sağlar

• İstatistiksel bakış açısıyla, bu tip bir örnekleme, ne kadar çok örnek üzerinde uygulanırsa, yapının her noktasına eşit örnekleme şansı tanıdığı için, homojen ve verimli bir örnekleme elde etme şansı da o kadar artar

Tanecik (partikül) Sayısı:

Biyolojik yapılardaki taneciklerin toplam sayılarının veya birim hacme düşen sayısal yoğunluklarının (NV) belirlenmesi, bir çok çalışma için vazgeçilmez bir parametredir.

• Tanecik sayımı yapmak için, ilgilenilen yapılardan kesitlerin alınması gerekir. Fakat bu kesitler, sadece görüntü olarak değerlendirildiklerinde, üç boyutlu bir ortamda dağılmış olarak bulunan sıfır boyutlu sayı kavramını örnekleyemeyen, iki boyutlu görüntülerdir. bir taneciğin bir kesit tarafından isabet alma şansı, o taneciğin çapına, yüksekliğine (hacmine) ve yönelimine (orientation) bağlıdır

• Holmes etkisinin fark edilmesinin ardından, araştırıcılar bir çok düzeltme faktörleri kullanarak, bu problemin üstesinden gelmeye çalışmışlardır. Bunlardan en ünlüsü ve belki de en çok kullanılanı, Abercrombie'nin düzeltme faktörüdür.

N: toplam tanecik sayısı; Ns: sayılan tanecikler; t: kesit kalınlığı; D: ortalama tanecik çapı.

• Öncelikle, Abercrombie’nin yöntemi taraflıdır (gerçek değerden sistematik sapma göstermektedir). Bizzat Abercrombie, bu metodun, hücre sayısını %5-10 oranında fazla hesaplamaya meyilli olduğunu belirtmektedir (Abercrombie, 1946). Ayrıca, tanecik yüksekliği olarak adlandırılan değerin belirlenmesinde de önemli zorluklar mevcuttur. Bu değerin ölçülmesi, pratik olarak imkansız olduğu gibi, bazı durumlarda, tanecik yüksekliği yerine “tanecik çapı” ölçülerek kullanılmaktadır ki, özellikle taneciklerin küre şeklinde olmadığı, basık, köşeli yapıda veya büzülmüş olduğu durumlarda, bu iki değer arasındaki farklılık oldukça önemli hale gelmektedir

Şekil 4: Fazla görünme (overprojection veya eski adıyla Holmes) etkisi.

• Yukarıdakilerden başka, bu metot, kesitler arasında meydana gelebilecek kalınlık değişimlerinden de önemli oranda etkilenir. Bir dokudan alınan kesitlerin kalınlığının ise, ısı, nem, kesme açısı ve gömme ortamı gibi etkilere bağlı olarak farklılık gösterebileceği bilinen bir gerçektir

Disektör

• Disektör ilk kez 1984 yılında Sterio tarafından tarif edilmiştir (Sterio, disektör sözcüğünün bir anagramı olup; stereolojik metotlara çok büyük katkıları bulunan ve halen bu konuda çalışmalarını sürdürmekte olan ünlü bir "Viking" stereolojistin takma adıdır). Bu yöntem, tanecik sayımında kullanılan sanal 3 boyutlu bir stereolojik sonda olarak da tarif edilebilir. Disektörün temel mantığı, taneciklerin kesit alma doğrultusu boyunca ilk ortaya çıktıkları veya son görüldükleri kısımları, yani taneciklerin “uçlarını” bulmaktır. Her taneciğin şekli ve yöneliminden bağımsız olarak, bir yönde bir tek ucu olduğu düşünülürse, bu mantıkla iş gören bir metot, gerçek tanecik sayısına ulaşılmasını sağlar.

Fiziksel Disektör

• Disektörün ilk ortaya çıkan biçimidir (Sterio, 1984). Bu yöntemde, iki tane ardışık veya birbirlerinden belli bir uzaklıkla ayrılmış olan iki kesit alınır, birinde bulunup, diğerinde bulunmayan tanecikler sayılır. İki kesit arasındaki mesafe “disektör yüksekliği” adını alır ve yapılan sayım sonucunda, disektör yükseklikleri boyunca örneklenebilen disektör taneciklerinin, yani, tanecik uçlarının sayısı bulunur. Bu da, çalışılan taneciklerin sayısal yoğunluğunu (NV) verir.

• N, toplam tanecik sayısını; Q-, disektör taneciklerinin sayısını; h, kesitler arasındaki mesafeyi (yani disektör yüksekliğini); a(çer), sayımda kullanılan tarafsız sayım çerçevesinin alanını ve V(ref) ise, çalışılan yapının toplam

(veya referans) hacmini belirtmektedir.

• Eğer bu formülden V(ref) değeri çıkartılacak olursa, sonuçta elde edilecek olan değer, -toplam hacim hesaba katılmadığından- taneciklerin sayısal yoğunlukları olacaktır.

• Fakat bir çok durumda, sayısal yoğunluk değeri, toplam tanecik sayısı değişimiyle ilgili doğrudan bilgi vermediğinden, özellikle karşılaştırmalı çalışmalarda bu değerin kullanılması ve buna bağlı biyolojik yorumlar yapılması sakıncalı olabilmektedir

• Şekil 5 : Sayısal yoğunluk verilerinden yola çıkılarak biyolojik yorumlar yapmanın yanlışlığı.

• Disektör taneciği, disektör metodu ile yapılan sayım sırasında sayılabilen taneciklere verilen isimdir. Fiziksel disektörde, sayım için alınan kesit çiftlerinden birisi örnek kesit (referance section) ve diğeri gözlem kesiti (look-up section) olarak kullanılır. Bu kesitler incelenir ve örnek kesitte bulunup, gözlem kesitinde bulunmayan tanecikler, disektör taneciği olarak sayıma dahil edilir ve “Q-” simgesi ile gösterilirler. Bunlar, disektör yüksekliği içerisinde örneklenebilmiş olan tanecik uçlarıdır

Kesitlerden birisi örnek, diğeri gözlem kesiti olarak adlandırılarak, örnek kesitte bulunup, gözlem kesitinde bulunmayan partikül izdüşümleri, disektör partikülleri (Q-) olarak sayılır (A). Disektör örneklerinin sayısını artırmak üzere, kesitlerin rolleri değiştirilerek iki yönlü bir disektör sayımı da uygulanılabilir (B).

• Disektör metoduyla yapılan sayım sonucunda, toplam tanecik sayısının elde edilebilmesi için, referans veya toplam hacmin bilinmesi gerekir.

• Fakat, üzerinde çalışılan yapı, bir beyin çekirdeği, bir lenf follikülü veya bir tümör gibi, etrafındaki yapılardan izole edilmesi mümkün olamayacak bir organizasyon gösteriyorsa, bu durumda, hacim hesaplaması için Cavalieri prensibi kullanılabilir

• Bu prensibe göre, hacmi hesaplanmak istenen yapı, başından sonuna kadar seri kesitlere ayrılır. Her bir kesitte, yapıya ait olan izdüşümlerin alanı hesaplanır. Alan hesaplaması, pahalı olan görüntü analiz sistemleri kullanılarak yapılabileceği gibi, noktalı bir alan ölçüm cetveli kullanılarak da aynı güvenilirlikte sonuçlar elde edilebilir.

• Alan içine düşen toplam nokta sayısı, her bir noktanın temsil ettiği alan ile çarpıldığında, ilgili bölgenin alanı elde edilir.

Burada P, nokta sayısını; a(p) ise tek bir noktanın kesit üzerinde temsil ettiği alanı ifade eder.

Tarafsız Sayım Çerçevesi

• Tanecik sayımı yapmak için tanecik izdüşümlerinden yararlanılan durumlarda, kesitlerde ortaya çıkan tanecik izdüşümlerinin belli bir alanla sınırlandırılarak sayılmaları gerekmektedir. Bu durumda, izdüşümlerin hangi kurallara göre sınırlandırılması gerektiği konusu ortaya çıkar.

• Şekil 7: Tarafsız sayım çerçevesinden önce yaygın olarak kullanılmakta olan iki sayım çerçevesi tipi. Bu tiplerin farklı çeşitlemeleri mevcut olmakla beraber, burada sadece sayımda kullandıkları temel mantığı karşılaştırmak amacıyla bu iki temel tip şematize edilmiştir.

• Sayım çerçevelerinden kaynaklanan bu tip sayım hatalarının sebebi, “kenar etkisi” denen bir etki ile açıklanmaktadır. Kısa olarak kenar etkisi, herhangi bir sayım çerçevesi kullanıldığında, çerçevenin içine düşen taneciklerin sayılmasında bir sorun olmadığı halde, çerçeve kenarlarıyla kesişen taneciklerin hangi kurallara göre değerlendirilmeleri gerektiği sorununa vurgu yapmaktadır.

• Tarafsız sayım çerçevesi, en genel olarak kullanılan şekliyle, bir kalın ve düz, bir de ince ve kesikli iki tip çizgi ile sembolize edilen dört kenara sahip basit bir dikdörtgen veya karedir. Görünüşte pek fazla bir değişikliği olmamasına rağmen, sayım kuralları açısından diğer sayım çerçevelerinden farklıdır. Temel olarak, ince ve kesikli çizgiler “dahil” kenarlar, kalın ve devamlı çizgiler de “hariç”veya “yasak” kenarlardır. Yani kesikli çizgilere rastlayan izdüşümler sayılırken, devamlı çizgilere isabet eden izdüşümler sayım dışı bırakılır

Optik Disektör ve 3 Boyutta Tanecik Sayımı

• Optik disektör sayım metodunun esası, kalın bir doku kesiti içerisinde, sanal optik kesitlerle ilerleyerek tanecik sayımı yapmaktır

• Optik disektör sondasının üç boyutlu şematik çizimi. Optik disektör, fiziksel olarak karşılaştırılan iki kesit çifti yerine, kalın bir kesit hacmi içerisinde, bir dizi sanal optik kesitle ilerleyerek, karşılaşılan partikülleri sayma esasına dayanır. Teorik olarak, kalınlık içindeki her sanal kesit, bir sonrakine göre örnek (referans) kesit, bundan bir sonraki kesit ise öncekine göre gözlem (look-up) kesitidir. Dolayısıyla birinde bulunup diğerinde bulunmayan partiküller, disektör partikülü olarak sayılırlar. Fakat pratik uygulamada, sayısal açıklığı yüksek bir mercek (Daha ince optik kesitler alabilmek için gereklidir.) kullanılarak, kesit kalınlığı ve disektör sondasının yüksekliği boyunca tarama yapılarak, karşılaşılan partiküller sayılır

• Şekilde, (+) işaretli partiküller sayılabilirken, (-) işaretli olanlar sayım dışı bırakılmaktadırlar (Burada üst yüz “hariç”, alt yüz ise “dahil” olarak kabul edilmektedir)

• Optik disektör yönteminin uygulanması kısaca şu şekildedir: Doku üzerinde tespit edilen herhangi bir örnekleme alanında, şeffaf olan kalın bir kesit içerisinde optik olarak ilerlemek, bu yöntemin özünü oluşturur. Söz konusu olan örnekleme alanına gelindiğinde, öncelikle kesitin üst yüzeyine odaklama yapılarak, ilk net görüntünün elde edildiği düzey, kesitin üst yüzeyi olarak belirlenir.

• Ardından, ön çalışmada tespit edilmiş olan disektör mesafesi kadar (genellikle 10-15m m) ilerlenilerek, bu ilerleme esnasında karşılaşılan tanecikler sayılır. Disektör yüksekliği, kesitin alt yüzüne ulaşmadan, bu kez de (alt yüzeydeki artefaktlardan etkilenmemek amacıyla) bir alt güvenlik kuşağı bırakılacak biçimde belirlenmiş olmalıdır

• Dolayısıyla, bu şekilde gerçekleştirilen bir sayım, o disektör hacmi içerisinde bulunan tanecik sayısını verecektir. Sonuçta, toplam disektör taneciği sayısı, toplam disektör hacmine bölündüğünde, birim hacimde bulunan tanecik sayısı (sayısal yoğunluk; NV) elde edilir.

•  Bu mesafelere alt (G1) ve üst (G2) güvenlik kuşakları denir. Disektör sondasının yüksekliği (h), sayım çerçevesinin alanı (A) ile çarpıldığında, disektör hacmi elde edilir. Disektör sondası ile örneklenen kalınlık parçası ise, disektör sondası yüksekliğinin (h), kesit kalınlığına (t) bölünmesi ile elde edilir. Pratikte de kesit kalınlığı olarak ortalama kesit kalınlığı değeri kullanılır 

Kesit Kalınlığının Ölçülmesi 

• Stereolojik metotların uygulanmasında, kesit kalınlığını (ışık mikroskobunda) ölçmek için genellikle, odaklama değişimi sırasında mikroskop tablasının dikey eksende (z ekseninde) kat ettiği mesafe hesaplanır. Bu mesafe değişimi de genellikle, ya mikroskobun mikro veya makro vidasının üzerinde bulunan derecelendirmeler kullanılarak veya, mikroskop tablasına takılan ve tablanın dikey eksendeki hareketlerine duyarlı bir araç (mikrokator) yardımıyla gerçekleştirilir. 

• Mikroskop görüntüsü, kesitin üst yüzeyine yaklaştırıldığında, ilk net görüntünün elde edildiği yer kesitin üst yüzü; son karşılaşılan net görüntü ise, kesitin alt yüzüdür. Bu ikisi arasında optik olarak ilerlerken mikroskop tablasına yaptırılan aşağı veya yukarı hareketler, kesit kalınlığını verecektir. 

Parçalama (Fraksiyonlama) 

• Stereolojide parçalama yöntemi, şu anda belki de stereolojinin en çok kullanılan tanecik sayma (veya alan, hacim, uzunluk vb. hesaplama) yöntemidir. Dokuda meydana gelen hiçbir şekil değişiminden etkilenmemesi, kesit kalınlığı, büzüşme-şişme miktarı gibi değerlere ihtiyaç göstermemesi ve oldukça etkin bir yöntem olması açısından, en çok tercih edilen metotların başında gelir. 

• Parçalama yönteminin esası, herhangi bir yapıdan, tek tip (uniform) sistematik rasgele örnekleme ile seçilen nispeten küçük bir doku parçasında tanecik sayımı yapmaktır. Gereken tek şart, sayım için örneklenen doku miktarının, orijinal yapının kaçta kaçına karşılık geldiğinin, yani ana yapıya olan oranının bilinmesidir. Bu küçük doku bölümünden elde edilen tanecik sayısı değeri ise, 

Fiziksel Parçalama 

• Fiziksel parçalama, tanecikleri sayılacak olan yapının, belli adımlarla daha küçük fiziksel parçalara ayrılarak örneklenmesi ve en son örnekleme neticesinde elde kalan oranı belli parçalardan, toplam tanecik sayısını elde etmek şeklinde özetlenebilir. 

• Çalışılan yapıdan çeşitli aşamalarda alınan örneklemelerde uyulması gereken tek şart, sistematik ve rasgele olarak örnek seçimidir; yani ilk m tane örneği içeren aralık içinden rasgele bir başlangıç örneği seçilerek, daha sonra bu seçilen örneği takip eden her m’inci örnek alınmalıdır. Burada m, önceden karar verilen örnekleme aralığıdır (sözgelimi, her 20 kesitten birinin seçilmesine karar verilmişse m, 20 dir). 

• Her bir örneklemede, örnek olarak seçilen parça veya kesitlerin, örneğin alındığı yapı veya örneklerin ne kadarlık bir oranına karşılık geldiği bilinmelidir. Bu değer, parçalama katsayısı olarak adlandırılır ve “f” ile gösterilir  

• Burada f1, f2, f3... ve fn değerleri parçalama oranlarını belirtmektedir. Sözgelimi, ilk örneklemede, dilimlenen bir yapının her 5 diliminden biri alınmışsa, f1=1/5 olacaktır. Tüm basamaklarda bu şekilde kaydedilen parçalama oranlarının tersi ile toplam disektör taneciği sayısının (S Q-) çarpımı da, toplam tanecik sayısı hesabını verecektir. 

Optik Parçalama 

• Optik parçalama yöntemi, uygulama kolaylığı sebebiyle, en çok tercih edilen tanecik örnekleme yöntemidir. Sadece tanecik sayımında değil, tanecik çapı, yüzey alanı ve hacim hesaplamaları gibi uygulamalarda da sıklıkla kullanılmaktadır. 

• Yöntemin uygulanmaya başlanmasından bu yana, oldukça ilginç sonuçlar elde edilmiştir. Sözgelimi, insan beyin hücrelerinin toplam sayısının hesaplanmasında en büyük problemlerden birini oluşturan beyincik granüler hücrelerinin sayısı, optik disektör ve Cavalieri kombinasyonunun kullanılması ile ortaya konmuştur 

• Optik disektörün uygulanmaya başlamasından sonra, optik parçalama yöntemi de kendiliğinden ortaya çıkmıştır. Optik parçalama kısaca, basamaklı örneklemelerden elde edilen ve tüm yapıya olan oranı (parçalama oranı) bilinen örnekler üzerinde, optik disektörler ile tanecikleri örneklemektir.  

KAYNAK • 1. Abercrombie, M., (1946), Estimation of nuclear populations from microtome sections. Anatomical Record, 94, 239-247.

2. Andersen, B.B., Korbo, L., Pakkenberg, B.(1992) A quantitative study of the human cerebellum with unbiased stereological techniques. J. Comparative Neurology, 326:549-560.

3. Braendgaard, H., Evans, S.M., Howard, C.V., Gundersen, H.J.G., (1990). The total number of neurons in the human neocortex unbiasedly estimated using optical disectors. J. Microscopy, 157: 285-304

4. Clarke, P.G.H., (1992). How inaccurate is the Abercrombie correction factor for cell counts?. TINS, 15(6): 211-2125. Cruz-Orive, L.M.(1997) Stereology of single objects. J. Microscopy, 186(2), 93-107

6. Cruz-Orive, L.M., Weibel, E.R.(1990) Recent stereological methods for cell biology: a brief survey. Lung. Cell. Mol. Physiol., 2, L148-L1567. Gallagher, M., Landfield, P.W., McEwen, B., Meaney, M.J., Rapp, P.R., Sapolsky, R., West, M.J. (1996). Hippocampal neurodegeneration in ageing. Science, 274, 4-5.

8. Gundersen, H.J.G (1986) Stereology of arbitrary particles. J. Microscopy, 143(1), 3-459. Gundersen, H.J.G. (1977) Notes on the estimation of the numerical density of arbitrary particles: The edge effect. J. Microscopy, 111: 219-223 

10. Gundersen, H.J.G. (1992). Stereology: The fast lane between neuroanatomy and brain function or still only a tightrope? Acta Neurologica Scandinavica, 137, 8-13.11. Gundersen, H.J.G., Bagger, P., Bendtsen, T.F., Evans, S.M., Korbo, L., Marcussen, N., Moller, A., Nielsen, K., Nyengaard, J.R., Pakkenberg, B., Sorensen, F.B., 

Vesterby, A., West, M.J. (1988a). The new stereological tools: Disector, Fractionator, nucleator, and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS, 96, 857-881.

12. Gundersen, H.J.G., Bendtsen, T.F., Korbo, L., Marcussen, N., Moller, A., Nielsen, K., Nyengaard, J.R., Pakkenberg, B., Sorensen, F.B., Vesterby, A., West, M.J. (1988b). Some new, simple, and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS, 96, 379-394.

13. Gundersen, H.J.G., Jensen, E.B. (1987). The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J. Microscopy, 147(3):229-263.14. Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: Three dimensional measurement in microscopy, Bios Scientific Publishers, U.K.

15. Korbo, L., Pakkenberg, B., Ladefoged, O., Gundersen, H.J.G., Arien-Soborg, P., Pakkenberg, H.(1990) An efficient method for estimating the total number of neurons in rat brain cortex. J. Neuroscience Methods, 31, 93-100

16. Korkmaz, A. Tümkaya, L., (1997) Estimation of section thickness and optical disector height with a simple calibration method. J. Microscopy,187(2): 104-10917. Mayhew, T.M., (1991). Review article: The new stereological methods for interpreting functional morphology from slices of cells and organs. Experimental Psysiology, 

76: 639-66518. Mayhew, T.M., (1992).A Review of recent advances in stereology for quantifying neural structure. J. Neurocytology, 21, 313-328

19. Mayhew, T.M., (1996) Invited Review: Adaptive remodelling of intestinal epithelium assessed using stereology: correlation of single cell and whole organ data with nutrient transport. Histol Histopathol, 11, 729-741

20. Mayhew, T.M., Gundersen, H.J.G. (1996). If you assume, you can make an ass out of u and me: A decade of the disector for stereological counting of particles in 3D space. J. Anatomy, 188:1-15.

21. Oorschot, D.E. (1994). Are you using neuronal densities, synaptic densities or neurochemical densities as your definitive data? There is a better way to go. Progress in Neurobiology, 44, 233-274.

22. Pakkenberg, B., Gundersen, H.J.G. (1988) Total number of neurons and glial cells in human brain nuclei estimated by the disector and the fractionator. J. Microscopy 150(1):1-20. 

23. Pakkenberg, B., Gundersen, H.J.G. (1997). Neocortical neuron number in humans: Effect of sex and age. J. Comparative Neurology, 384, 312-32024. Pakkenberg, H., Andersen, B.B., Burns, R.S., Pakkenberg, B.(1995). A stereological study of substantia nigra in young and old rhesus monkeys. Brain Research, 693, 

201-20625. Rasmussen, T., Schliemann, T., Sorensen, J.C., Zimmer, J., West, M.J. (1996). Memory impaired aged rats: No loss of principal hippocampal and subicular neurons. 

Neurobiology of Ageing, 17(1), 143-147.26. Sterio, D.C.(1984). The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J. Microscopy, 134(2), 127-136

27. West, M.J. (1993). New stereological methods for counting neurons. Neurobiology of Ageing, 14, 275-285.28. West, M.J. (1994).Advances in the study of age-related neuron loss. Seminars in Neuroscience, 6, 403-411

29. West, M.J., Æstergaard, K., Andreassen, O.A., Finsen, B., (1996). Estimation of the number of somatostatin neurons in the striatum: An in situ hybrizidation study using the optical fractionator method. J. Comparative Neurology 370, 11-22

30. West, M.J., Gundersen, H.J.G., (1990). Unbiased stereological estimation of the number of neurons in the human hippocampus. J. Compararative Neurology, 296, 1-22.

31. West, M.J., Slomianka, L.,Gundersen, H.J.G. (1991). Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record, 231, 482-497.

32. Willams, W. R., Rakic, P., (1988). Three-Dimensional counting: An accurate and direct method to estimate numbers of the cells in sectioned material. J. Comparative Neurology 278, 344-352