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bdbiosciences.com23-11405-00 Rev. A4/2010

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Guía de utilización del KitBD Stem Cell Enumeration

para los citómetros de flujo BD FACSCanto II

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Historial

Revisión Fecha Cambio realizado

23-11405-00 Rev. A 4/2010 Versión inicial.

Contenido

Capítulo 1: Prefacio 1

Acerca de esta guía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

Convenciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

Asistencia técnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Capítulo 2: Introducción 7

Descripción general de la enumeración de células madre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

Carga de tubos en el citómetro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

Descarga de tubos del citómetro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

Flujo de trabajo diario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

Capítulo 3: Configuración del software 17

Flujo de trabajo para configurar el software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

Opciones de configuración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

Introducción de la información sobre el lote de microesferas de calibración . . . . 21

Introducción de los ID de los lotes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

Visualización de los objetivos de adquisición . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

Capítulo 4: Calibración del citómetro 27

Arranque del sistema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

Calibración del citómetro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

Calibración de la aplicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

Guía de utilización del Kit BD Stem Cell Enumeration para citómetros de flujo BD FACSCanto IIiv

Capítulo 5: Adquisición 35

Adquisición de controles de proceso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

Marcado y adquisición de muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

Nueva área de selección manual en un gráfico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

Capítulo 6: Directrices sobre áreas de selección y ejemplos 43

Directrices sobre áreas de selección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

Descripción general de los ejemplos de definición de área de selección . . . . . . . . 46

Muestra de leucoféresis (fresca) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

Muestra de leucoféresis (descongelada) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

Muestra de médula ósea (fresca) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

Muestra de médula ósea (descongelada) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

Muestra de sangre de cordón (fresca) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

Muestra de sangre de cordón (descongelada) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

Capítulo 7: Revisión de informes 87

Revisión del Cytometer Setup Report (Informe de calibración del citómetro) . . . 88

Revisión del Application Setup Report (Informe de calibración de la aplicación) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

Revisión del Lab Report (Informe de laboratorio) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

Capítulo 8: Solución de problemas 95

Datos de contacto e información sobre solución de problemas . . . . . . . . . . . . . . 96

Fallo de solapamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

La lista de trabajo no se procesará . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

No se produce ningún resultado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

Se producen resultados incompletos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99

La ubicación del área de selección es dudosa, pero se informa de todos los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

Número insuficiente de eventos recopilados, pero se informa de todos los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

Advertencias generales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

Anticoagulante de heparina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

1Prefacio

Este capítulo abarca los siguientes temas:

Acerca de esta guía (página 2)

Convenciones (página 3)

Asistencia técnica (página 5)

Guía de utilización del Kit BD Stem Cell Enumeration para citómetros de flujo BD FACSCanto II2

Acerca de esta guía

Acerca de este tema Esta guía ofrece instrucciones para la adquisición y el análisis de muestras marcadas con el kit BD™ Stem Cell Enumeration en un citómetro de flujo BD FACSCanto™ II, utilizando un software clínico BD FACSCanto™ con el módulo BD Stem Cell Enumeration, v1.0.

Antes de empezar En esta guía, se asume que ha leído las Instrucciones de uso de BD FACSCanto II y el Manual de referencia del software clínico BD FACSCanto y que se ha familiarizado con la calibración del citómetro.


Convenciones

Acerca de este tema Las siguientes tablas indican las convenciones utilizadas en esta guía.

Símbolos de seguridad Estos símbolos de seguridad se muestran en esta guía y en las etiquetas de seguridad para alertarle de posibles peligros.

Símbolo Significado

Alerta de precaución

Identifica una práctica peligrosa o insegura que podría provocar pérdidas de datos, daños materiales, lesiones leves o graves o incluso la muerte

Peligro biológico


Convenciones tipográficas y de teclado Convención Uso

Notas Una nota describe funciones o instrucciones importantes.

Negrita El formato de negrita se utiliza para indicar opciones del software, como diálogos, campos y botones.

Cursiva El formato de cursiva se utiliza para destacar títulos de libros.

También se utiliza al describir software, para indicar un texto específico escrito en una ventana o cuadro de diálogo.

> La flecha se utiliza para indicar rutas de selección de menús. Por ejemplo, “Select File > Print” significa que seleccione la opción Print (Imprimir) del menú File (Archivo).

Ctrl+X Cuando se utiliza con nombres de teclas, el signo más (+) significa que hay que pulsar dos teclas de forma simultánea. Por ejemplo, Ctrl+P significa que hay que mantener pulsada la tecla Control mientras se pulsa la letra p.


Asistencia técnica

Acerca de este tema Este tema ofrece información sobre cómo obtener asistencia técnica.

Dónde encontrar información de ayuda

Para resolver cuestiones técnicas u obtener ayuda para la solución de un problema:

Consulte Solución de problemas (página 95).

Consulte la sección del Manual de referencia del citómetro BD FACSCanto II, el Manual de referencia del software clínico BD FACSCanto, o las Instrucciones de uso de BD FACSCanto II específicas de la operación que esté realizando.

Consulte la ayuda en línea en el software clínico BD FACSCanto.

Para obtener más asistencia

Si necesita asistencia técnica adicional, póngase en contacto con el representante local del servicio técnico o con su proveedor de BD Biosciences. Visite nuestro sitio Web (bdbiosciences.com) para obtener información de contacto actualizada.

Cuando se ponga en contacto con BD Biosciences

Cuando se ponga en contacto con BD Biosciences, tenga disponible la siguiente información:

Nombre del producto, número de pieza y número de serie.

Cualquier mensaje de error.

Detalles sobre el funcionamiento reciente del sistema.

http://www.bdbiosciences.com

¿Necesita obtener información de forma más rápida?

Encontrará información sobre este producto también en el sistema de Ayuda del software.

Puede mantener abierta la ventana Help (Ayuda) mientras utiliza el software o imprime la información directamente de la pantalla.

No se necesita acceso a Internet para utilizar el sistema de Help (Ayuda).

2Introducción


Descripción general de la enumeración de células madre (página 8)

Carga de tubos en el citómetro (página 10)

Descarga de tubos del citómetro (página 11)

Flujo de trabajo diario (página 12)


Descripción general de la enumeración de células madre

Acerca de este tema Este tema ofrece una descripción general de la enumeración de células madre.

Descripción general Cada vez se utiliza más el transplante de células progenitoras hematopoyéticas en el tratamiento de afecciones sanguíneas, tumores malignos y anomalías genéticas.1-3 El antígeno CD34 se encuentra presente en las células precursoras hematopoyéticas inmaduras y en las células hematopoyéticas de formación de colonias en la médula ósea y la sangre, incluidas las células progenitoras unipotentes y pluripotentes.4 Se pueden utilizar anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo dirigidos contra la molécula CD34 para identificar las células CD34+ mediante citometría de flujo.

El BD Stem Cell Enumeration junto con la citometría de flujo proporcionan una enumeración simultánea de poblaciones de células madre hematopoyéticas viables doble positivas CD45+/CD34+ dentro de la población de células CD34+ (células/µL), así como el porcentaje de leucocitos viables totales que son CD34+ (%CD34).

Las muestras marcadas con el kit BD Stem Cell Enumeration se adquieren en un citómetro de flujo BD FACSCanto II y se analizan con el software clínico BD FACSCanto con el módulo BD Stem Cell Enumeration v1.0. El software utiliza un algoritmo automático de definición de área de selección para identificar y aislar las células madre. Los métodos de análisis y adquisición del software se basan en el método presentado en las directrices aprobadas H42-A2 del Clinical and Laboratory Standards Institute.5


Referencias

Nº Cita

1 Shpall EJ, Jones RB, Bearman SI, et al. Transplantation of enriched CD34-positive autologous marrow into breast cancer patients following high-dose chemotherapy: influence of CD34-positive peripheral-blood progenitors and growth factors on engraftment. J Clin Oncol. 1994;12:28-36.

2 Langenmayer I, Weaver C, Buckner CD, et al. Engraftment of patients with lymphoid malignancies transplanted with autologous bone marrow, peripheral blood stem cells or both. Bone Marrow Transplant. 1995;15:241-246.

3 Zander AR, Lyding J, Bielack S. Transplantation with blood stem cells. Blood Cells. 1991;17:301-309.

4 Greaves MF, Titley I, Colman SM, et al. CD34 cluster workshop report. In: Schlossman SF, Boumsell L, Gilks W, et al, eds. Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. New York, NY: Oxford University Press; 1995;1:840-846.

5 Enumeration of Immunologically Defined Cell Populations by Flow Cytometry; Approved Guideline-Second Edition. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2007. CLSI document H42-A2.


Carga de tubos en el citómetro

Acerca de este tema Este tema describe cómo cargar tubos en el citómetro de flujo BD FACSCanto II.

Carga de un tubo Para cargar un tubo en el SIT:

1. Empuje el brazo aspirador hacia la izquierda cuando así se lo indiquen.

2. Coloque el tubo en el SIT, asegúrese de que el tubo está recto y empuje con firmeza hacia arriba hasta que el tubo toque el tope y esté completamente asentado.

3. Centre el brazo aspirador debajo del tubo.

Hay tres pasadores de sensor en el brazo aspirador. La parte inferior del tubo debería quedar centrada, por encima de los pasadores.

Temas relacionados Descarga de tubos del citómetro (página 11)

Adquisición de controles de proceso (página 36)

Marcado y adquisición de muestras (página 38)

Precaución: Peligro biológico. Lleve siempre guantes al cargar manualmente las muestras en el citómetro. Se realiza un lavado de la parte exterior del tubo de inyección de muestras (SIT) entre muestras que podrían contener residuos de peligro biológico.


Descarga de tubos del citómetro

Acerca de este tema Este tema describe cómo descargar tubos del citómetro de flujo BD FACSCanto II.

Descarga de un tubo Para descargar un tubo del SIT:

1. Espere a que baje el brazo aspirador.

2. Cuando se lo indiquen, sujete el tubo de muestras mientras empuja el brazo aspirador hacia la izquierda.

3. Extraiga el tubo del SIT.

4. Suelte el brazo aspirador.

La limpieza del SIT se produce cuando el brazo aspirador se coloca en el centro.

Temas relacionados Carga de tubos en el citómetro (página 10)



Precaución: Peligro biológico. Lleve siempre guantes al cargar manualmente las muestras en el citómetro. Se realiza un lavado de la parte exterior del tubo de inyección de muestras (SIT) entre muestras que podrían contener residuos de peligro biológico.

Precaución: Para evitar un reflujo dentro del tubo, siga exactamente la secuencia de extracción del tubo.

Precaución: Peligro biológico Si no sostiene el tubo al desplazar el brazo aspirador, el tubo podría caerse del SIT y ocasionarle una exposición a una muestra que suponga un riesgo biológico potencial.


Flujo de trabajo diario

Acerca de este tema Este tema le ayuda a organizar el flujo de trabajo diario al procesar muestras para el análisis y la adquisición de células madre.

Al procesar otros tipos de paneles

Si va a adquirir otros tipos de paneles a lo largo del día, optimice los parámetros después de optimizar la aplicación BD Stem Cell Enumeration. Consulte Calibración de la aplicación (página 32). No vuelva a procesar la Standard Setup (Calibración estándar) antes de adquirir las muestras de células madre. Si lo hace, aparece un mensaje de error al hacer clic en Run (Procesar), en el que se indica que los parámetros del citómetro del panel BD Stem Cell + 7AAD no se han optimizado. La lista de trabajo se detendrá y no podrá proseguir hasta que vuelva a procesar la Standard Setup (Calibración estándar) seguida de la Application Setup (Calibración de la aplicación).

Flujo de trabajo Los láseres del citómetro deben encenderse al menos 30 minutos antes de realizar la calibración. Para aumentar la eficiencia y dejar que se calienten los láseres, recomendamos realizar las tareas en el orden indicado a continuación.

Precaución: La Application Setup (Calibración de la aplicación) debe realizarse después de la Standard Setup (Calibración estándar). El software no le permitirá procesar muestras si el archivo BD Stem Cell.opt es posterior al archivo SetupResults.dat.

Nº Tarea Consulte

1 Encienda el citómetro. Arranque del sistema (página 28)

2 Inicie el sistema de fluidos. Arranque del sistema (página 28)

3 Marque los controles de proceso y de optimización.

Prospecto del kit BD Stem Cell Enumeration


4 Prepare las microesferas de calibración de 7 colores BD FACS.

Nota: Compruebe que los láseres del citómetro se han calentado durante 30 minutos antes de preparar las microesferas de calibración.

Prospecto del kit de microesferas de calibración de 7 colores BD FACS

5 Ajuste lo siguiente:

Opciones de impresión y exportación

Tiempo de la cuenta atrás

Ignore Loader (Ignorar cargador) (cargar los tubos manualmente)

Opciones de configuración (página 19)

6 Introduzca la información sobre el lote de microesferas de calibración.

Introducción de la información sobre el lote de microesferas de calibración (página 21)

7 Verifique que el ID de lote y los valores de microesferas/bolas introducidos en el software coinciden con los valores impresos en la bolsa de las microesferas BD Trucount™.

Introducción de los ID de los lotes (página 23)

8 Procese la Standard Setup (Calibración estándar) y compruebe que se ha realizado correctamente.

Calibración del citómetro (página 29)

Calibración de la aplicación (página 32)

9 Procese la Application Setup (Calibración de la aplicación) con el panel BD Stem Cell y compruebe que se ha realizado correctamente.

Nota: Si necesita optimizar otros paneles, hágalo después de finalizar la Application Setup (Calibración de la aplicación), pero antes de salir de la calibración.


Revisión del Application Setup Report (Informe de calibración de la aplicación) (página 91)

Nº Tarea Consulte


10 Establezca una nueva Worklist (Lista de trabajo) para los controles, procese los controles de BD Stem Cell y observe los gráficos.


11 Compruebe que los valores de control se encuentran dentro de los rangos mostrados en la hoja de valores de análisis de los controles BD Stem Cell Controls Assay Values.

Nota: Si se vuelve a procesar la Standard Setup (Calibración estándar) tras la Application Setup (Calibración de la aplicación), tendrá que repetir la Standard Setup (Calibración estándar) y, a continuación, la Application Setup (Calibración de la aplicación).

Prospecto del kit de controles BD Stem Cell Controls kit

Al procesar otros tipos de paneles (página 12)


12 Marque las muestras de los pacientes.

Precaución: No marque las muestras hasta que los

controles se hayan procesado correctamente y los resultados se encuentren dentro del rango establecido para los lotes de control de procesos que está utilizando.

Prospecto del kit BD Stem Cell Enumeration

13 Adquiera las muestras marcadas. Marcado y adquisición de muestras (página 38)

14 Revise los Lab Reports (Informes de laboratorio).

Revisión del Lab Report (Informe de laboratorio) (página 93)

Nº Tarea Consulte


15 Observe todos los gráficos y vuelva a definir el área de selección si fuera necesario.

Nueva área de selección manual en un gráfico (página 41)

16 Resuelva cualquier problema que surja. Solución de problemas (página 95)

17 Una vez que hayan terminado de adquirir las muestras de células madre, desactive la opción Ignore Loader (Ignorar cargador) para que otros usuarios puedan utilizar el BD FACS™ Cargador.


Nº Tarea Consulte

3Configuración del software


Flujo de trabajo para configurar el software (página 18)




Visualización de los objetivos de adquisición (página 24)


Flujo de trabajo para configurar el software

Acerca de este tema Este tema ofrece una descripción general de las tareas que han de realizarse a la hora de configurar el software. Antes de utilizar el software para analizar muestras de células madre, ajuste las opciones e introduzca la información predeterminada.

Flujo de trabajo La configuración del software incluye las siguientes tareas.

Tarea Descripción

1 Opciones de configuración (página 19).

2Introducción de la información sobre el lote de microesferas de calibración (página 21).

3 Introducción de los ID de los lotes (página 23).

4Visualización de los objetivos de adquisición (página 24).


Opciones de configuración

Acerca de este tema Este tema describe cómo establecer las opciones del software que agilizan la adquisición y el análisis. Con las opciones puede determinar si desea o no:

Imprimir los informes de laboratorio y de calibración y el número de copias

Detener la vista de Lab Report (Informe de laboratorio) y durante cuánto tiempo

Exportar archivos PDF

Cargar manualmente los tubos en el citómetro

Procedimiento Para ajustar las opciones:

1. Seleccione Tools (Herramientas) > Options (Opciones).

2. Haga clic en cada icono y elija las opciones seleccionado el botón o activando la casilla de verificación.

Icono de la opción Parámetros

Nota: Debe seleccionarse o conectarse una impresora.


3. Haga clic en OK (Aceptar) para guardar las selecciones y cerrar la ventana Options (Opciones).

Temas relacionados Introducción de la información sobre el lote de microesferas de calibración (página 21)


Precaución: Debido a los requisitos de temperatura de este ensayo, BD FACS Cargador no puede utilizarse para adquirir muestras.

Nota: Una vez que hayan terminado de adquirir todas las muestras de células madre, desactive esta opción para que otros operadores puedan utilizar el Cargador.

Icono de la opción Parámetros


Introducción de la información sobre el lote de microesferas de calibración

Acerca de este tema Este tema describe cómo introducir la información de lote las microesferas de calibración de 7 colores BD FACS™. La información del lote determina los valores objetivos del detector y los factores de superposición de espectros del citómetro.

Antes de empezar Localice la tarjeta de valores de calibración que se incluye con el nuevo lote de microesferas de calibración de 7 colores BD FACS.

Procedimiento Para introducir la información sobre el lote de las nuevas microesferas:

1. Seleccione Cytometer (Citómetro) > Setup (Calibración) > Standard Setup (Calibración estándar).

Aparece la ventana Bead Lot Information (Información de lote de microesferas). Si el lote de las microesferas ha caducado, aparece un mensaje de error.


2. Introduzca la información del nuevo lote manualmente o escaneando los códigos de barras. Consulte las Instrucciones de uso del BD FACSCanto II para obtener más información.

– Manualmente:

a. Haga clic en el botón New Lot ID (Nuevo ID de lote), introduzca la información del lote y haga clic en OK (Aceptar) para guardar los cambios.

b. Con la tarjeta de valores de calibración del nuevo lote de microesferas, introduzca los valores objetivo en la pestaña Targets (Objetivos) y los valores de superposición de espectros en la pestaña Spectral Overlap Factors (Factores de superposición de espectros).

– Escaneando los códigos de barras:

Haga clic en el botón Scan Barcodes (Escanear los códigos de barras), siga las indicaciones y haga clic en OK (Aceptar) para guardar los cambios.

3. En la ventana Bead Lot Information (Información de lote de microesferas), verifique que se ha seleccionado el ID del nuevo lote.

4. Haga clic en Finish (Finalizar).

5. En el cuadro de diálogo Save Setup Bead Lot Info (Guardar la información de lote de microesferas de calibración), haga clic en Yes (Sí) para guardar la información que acaba de introducir.

Temas relacionados Opciones de configuración (página 19)



Introducción de los ID de los lotes

Acerca de este tema Este tema describe cómo introducir los ID de los lotes de las microesferas de recuentos absolutos BD Trucount y del kit BD Stem Cell Enumeration.

Antes de empezar Tenga a mano la bolsa de las microesferas de recuentos absolutos BD Trucount y la caja del kit BD Stem Cell Enumeration para introducir los ID de los lotes.

Procedimiento Para introducir los ID de los lotes:

1. Seleccione Tools (Herramientas) > Lot IDs (ID de lotes).

Aparecerá el cuadro de diálogo Lot IDs (ID de lotes).

2. Haga clic en la pestaña BD Stem Cell e introduzca el ID del lote del kit BD Stem Cell Enumeration.

3. Haga clic en la pestaña Microesferas de recuentos absolutos, introduzca el ID de lote de la bolsa de microesferas BD Trucount e introduzca el valor de microesferas por bola.

Pestañas

Precaución Compruebe que los valores que introduce coinciden con los valores impresos en la bolsa de BD Trucount. Si se utiliza un recuento de microesferas incorrecto se obtendrán recuentos absolutos imprecisos.


4. Haga clic en OK (Aceptar) para guardar la información.

Temas relacionados Opciones de configuración (página 19)


Visualización de los objetivos de adquisición

Acerca de este tema Este tema describe cómo visualizar los objetivos de adquisición establecidos para los paneles BD Stem Cell + 7AAD y BD Stem Cell. El responsable del laboratorio establece los objetivos de CD45, CD34 y de tiempo. El objetivo de las microesferas BD Trucount no lo puede ajustar el usuario.

Procedimiento Para ver los objetivos de adquisición:

1. Seleccione Reagents (Reactivos) > BD Stem Cell + 7AAD (o BD Stem Cell) > Acquisition Targets (Objetivos de adquisición).

Aparecerá el cuadro de diálogo Reagents (Reactivos).

Pestañas


Los objetivos de adquisición predeterminados se definen con los siguientes criterios:

– El mínimo de CD45 viables se establece en 75.000, según la recomendación de las directrices aprobadas H42-A2 del Clinical and Laboratory Standards Institute.1

– El mínimo de CD34 viables se establece en 125 para garantizar que se adquieren al menos 100 células CD34 tras el análisis final.

– El tiempo máximo se establece en 900 segundos, para asegurarse de que se alcanzan los valores objetivo de adquisición sin eliminar la muestra.

– El recuento de microesferas BD Trucount se establece en 1.000 para garantizar que se adquieren suficientes microesferas para calcular con precisión los recuentos absolutos.

2. Haga clic en OK (Aceptar) para cerrar el cuadro de diálogo.

1. Enumeration of Immunologically Defined Cell Populations by Flow Cytometry;Approved Guideline-Second Edition. Wayne, PA: Clinical and Laboratory StandardsInstitute; 2007. CLSI document H42-A2.

4Calibración del citómetro


Arranque del sistema (página 28)




Arranque del sistema

Acerca de este tema Este tema describe cómo arrancar el ordenador, el software y el citómetro. Deje que los láseres del citómetro se calienten durante 30 minutos antes de realizar la calibración.

Procedimiento Para arrancar el sistema:

1. Encienda la alimentación del ordenador y el citómetro de flujo BD FACSCanto II.

2. Inicie el software clínico BD FACSCanto e inicie sesión.

3. Inicie el sistema de fluidos.

4. Deje que el citómetro se caliente durante 30 minutos antes de realizar la calibración.

Temas relacionados Flujo de trabajo para configurar el software (página 18)



Calibración del citómetro

Acerca de este tema Este tema describe cómo calibrar el citómetro.

Antes de empezar Prepare microesferas de calibración de 7 colores BD FACS según las instrucciones del prospecto de los reactivos.

Lea las instrucciones en Carga de tubos en el citómetro (página 10) y Descarga de tubos del citómetro (página 11).

Calibración del citómetro Para calibrar el citómetro:

1. Compruebe que el citómetro está listo.

2. Seleccione Cytometer (Citómetro) > Setup (Calibración) > Standard Setup (Calibración estándar).

Se abre la ventana Setup Lot Information (Información de lote de calibración) .

3. Seleccione el número de lote de las microesferas de calibración de 7 colores BD FACS que esté utilizando en el menú Lot ID (ID de lote).

Si tiene que introducir información del nuevo lote, consulte Introducción de la información sobre el lote de microesferas de calibración (página 21).

4. Compruebe que las microesferas no han caducado. (El software indicará si las microesferas han caducado).

5. Compruebe que los valores en las pestañas Targets (Objetivos) y Spectral Overlap Factors (Factores de superposición de espectros) coinciden con los de las microesferas de calibración de 7 colores BD FACS que esté utilizando.

6. Haga clic en Next (Siguiente), compruebe que se encuentra seleccionado Run setup in manual mode (Procesar calibración en modo manual) y, a continuación, vuelva a hacer clic en Next (Siguiente).


7. Cargue el tubo de microesferas en el citómetro cuando se le indique y haga clic en OK (Aceptar).

El software adquiere los datos para calibrar el citómetro.

8. Cuando se le solicite, retire el tubo.

Comprobación de la calibración

1. Compruebe que la calibración se ha realizado correctamente.

Si la calibración no se ha realizado correctamente, consulte las Instrucciones de uso de BD FACSCanto II para obtener información sobre la solución de problemas.

2. (Opcional) Para ver el informe, haga clic en View Setup Report (Ver informe de calibración).

Para obtener una descripción de los elementos en el informe, consulte Revisión del Cytometer Setup Report (Informe de calibración del citómetro) (página 88).


3. Haga clic en el botón Close Preview (Cerrar vista previa) para cerrar el informe y volver al asistente.

4. Haga clic en Next (Siguiente).

5. En el cuadro de diálogo Save Setup Results (Guardar resultados de la calibración), haga clic en Yes (Sí) para continuar.

6. Haga clic en Next (Siguiente) para continuar con la calibración de la aplicación.

Aparece la vista Setup Optimization (Optimización de la calibración).

Siguientes pasos Prosiga con Calibración de la aplicación (página 32).




Botón Close Preview


Calibración de la aplicación

Acerca de este tema Este tema describe cómo calibrar la aplicación BD Stem Cell Enumeration. Los valores de compensación para el ensayo se calculan con una muestra de optimización.

Al procesar otros tipos de paneles

Si va a adquirir otros tipos de paneles a lo largo del día, optimice los parámetros después de optimizar la aplicación BD Stem Cell Enumeration (consulte paso 10 en la página 34). No vuelva a procesar la Standard Setup (Calibración estándar) antes de adquirir las muestras de células madre. Si lo hace, aparece un mensaje de error al hacer clic en Run (Procesar), en el que se indica que los parámetros del citómetro del panel BD Stem Cell + 7AAD no se han optimizado. La lista de trabajo se detendrá y no podrá proseguir hasta que vuelva a procesar la Standard Setup (Calibración estándar) seguida de la Application Setup (Calibración de la aplicación).

Antes de empezar Marque el control alto o bajo de células madre de BD Stem Cell con reactivo BD Stem Cell y 7-AAD para utilizarlo como tubo de optimización.

Siga las instrucciones de marcado y consulte la tabla de Resumen de marcado del prospecto del kit BD Stem Cell Enumeration.


Calibre el citómetro. Consulte la Calibración del citómetro (página 29).

Precaución: La Application Setup (Calibración de la aplicación) debe realizarse después de la Standard Setup (Calibración estándar). El software no le permitirá procesar muestras si el archivo BD Stem Cell.opt es posterior al archivo SetupResults.dat.


Procedimiento Para calibrar la aplicación:

1. Seleccione BD Stem Cell en el menú Panel Types (Tipos de panel) en el asistente Setup Optimization (Optimización de calibración).

2. Haga clic en Next (Siguiente).

Aparece la vista BD Stem Cell Enumeration Setup (Calibración).

3. Haga clic en Start (Iniciar).

4. Cargue el control marcado con el tubo 7-AAD (optimización) en el citómetro cuando se le indique y haga clic en OK (Aceptar).

El software comienza a adquirir datos y, a continuación, calcula el solapamiento de 7-AAD en el canal PE.

5. Compruebe el mensaje de estado bajo la casilla de verificación Calculating Spillover (Cálculo de solapamiento).

– Si se determina que el solapamiento es correcto, vaya al paso 6.

– Si se determina que es incorrecto, haga clic en Cancel (Cancelar) y repita el paso 1 hasta el paso 5. Además, consulte Solución de problemas (página 95).


6. Haga clic en View Report (Ver informe).

a. Confirme que el Overall Result (Resultado general) es PASS (Apto).

b. Observe el valor de superposición de espectros PE–%7-AAD.

Un valor de −0,5% a 10,5% indica una optimización correcta de la calibración.

Para obtener una descripción de los elementos en el informe, consulte Revisión del Application Setup Report (Informe de calibración de la aplicación) (página 91).

7. Para cerrar el informe y volver al asistente, haga clic en el botón Close Preview (Cerrar vista previa).

8. Haga clic en Save (Guardar).

9. Cuando se le solicite, descargue el tubo.

10. (Opcional) Haga clic en Next (Siguiente) si va a optimizar otros paneles.

11. Haga clic en Finish (Finalizar).

Los resultados de la calibración optimizada se guardarán en el archivo BD Stem Cell.opt, en la carpeta C:\Archivos de programa\Archivos comunes\BD\Setup Results.

Temas relacionados Revisión del Application Setup Report (Informe de calibración de la aplicación) (página 91)

5Adquisición






Adquisición de controles de proceso

Acerca de este tema Este tema describe cómo adquirir controles de proceso de marcado en el citómetro.

Precaución:

Antes de empezar Marque el control alto y el control bajo de células madre de BD Stem Cell con el kit BD Stem Cell Enumeration, pero no añada 7-AAD. Siga las instrucciones del prospecto de los reactivos.


Calibre la aplicación. Consulte Calibración de la aplicación (página 32).

Procedimiento Para adquirir controles de proceso:

1. Introduzca la información de control alto y bajo en la Worklist (Lista de trabajo).

Nota: El ID y el Case Number (Número de caso) deben ser exclusivos.

a. Indique Control en la columna Name (Nombre) para los controles alto y bajo.

Nota: Si no indica Control en la columna Name (Nombre), el panel BD Stem Cell se desactivará.

b. Escriba el número de ID del lote en la columna ID.

El Name (Nombre) y el ID se convierten en el nombre del archivo.

c. Indique el tipo de control (High (Alto) o Low (Bajo)) en la columna Case Number (Número de caso).

Precaución: Debido a los requisitos de temperatura de este ensayo, el cargador no puede utilizarse para adquirir muestras.


d. Seleccione BD Stem Cell en el menú Panel.

Nota: Si elige el panel BD Stem Cell + 7AAD para procesar el control, aparecerá un mensaje de error.

2. Haga clic en Run (Procesar) ( ) para adquirir los controles High (Alto) y Low (Bajo).

3. Una vez finalizada la adquisición, inspeccione todos los gráficos y verifique que las áreas de selección incluyen las poblaciones adecuadas. Realice los ajustes necesarios.

Nota: Debido a que los controles de proceso se procesaron con el panel BD Stem Cell (sin 7-AAD), los dos gráficos de viabilidad (7 y 8) no aparecen en el informe de laboratorio.

4. Compruebe que los resultados se encuentran dentro del intervalo establecido para los lotes de controles de proceso que está utilizando.

Consulte las hojas de análisis de los controles para conocer los intervalos de valores.

Siguiente paso Prosiga con Marcado y adquisición de muestras (página 38).






Marcado y adquisición de muestras

Acerca de este tema Este tema describe cómo adquirir muestras marcadas en el citómetro.

Precaución:

Antes de empezar Lea las instrucciones en Carga de tubos en el citómetro y Descarga de tubos del citómetro (página 11).

Adquiera los controles de proceso. Consulte Adquisición de controles de proceso (página 36).

Consulte la Directrices sobre áreas de selección (página 44) y la Descripción general de los ejemplos de definición de área de selección (página 46) para el tipo de muestra que esté adquiriendo.

Procedimiento Para marcar y adquirir muestras:

1. Siga las instrucciones del prospecto del kit BD Stem Cell Enumeration para diluir las muestras cuanto sea necesario y márquelas.

2. Seleccione el panel BD Stem Cell + 7AAD del menú Panel en la Worklist (Lista de trabajo).

No utilice el panel BD Stem Cell (sin 7-AAD) para muestras de pacientes. Este panel sólo es para procesar controles.

3. Añada las muestras a la Worklist (Lista de trabajo).

Utilice nombres exclusivos en la columna Sample ID (ID de muestra).

Precaución: No marque las muestras hasta que los controles se hayan procesado correctamente.

Precaución: Debido a los requisitos de temperatura de este ensayo, el cargador no puede utilizarse para adquirir muestras.


4. Si la muestra requiere dilución, añada el factor de dilución a la columna Dilution (Dilución) de esa muestra. Añada la información específica de la muestra que sea necesaria.

Para muestras sin diluir, utilice el valor predeterminado de 1.

5. Haga clic en Run (Procesar) ( ).

6. Cuando se lo indiquen, elija guardar los cambios a la Worklist (Lista de trabajo).

7. Agite suavemente y al completo las muestras marcadas, a baja velocidad, para volver a suspender las células y las microesferas.

8. Cuando se solicite, instale el tubo que contiene la primera muestra de la lista de trabajo en el citómetro y haga clic en OK (Aceptar).

Aparece la pestaña Acquisition (Adquisición) y los eventos se representan en los gráficos.

9. Una vez que se alcanzan los objetivos de adquisición, aparece el Lab Report (Informe de laboratorio).

10. Imprima todos los informes de laboratorio.

Consulte Opciones de configuración (página 19) para definir las opciones de impresión.

11. Revise todos los gráficos para verificar que todas las áreas de selección incluyen las poblaciones adecuadas. Consulte Nueva área de selección manual en un gráfico (página 41) si es necesario volver a definir las áreas de selección.

12. Una vez que hayan terminado de adquirir las muestras de células madre, desactive la opción Ignore Loader (Ignorar cargador) para que otros usuarios puedan utilizar el Cargador.

Consulte Opciones de configuración (página 19).


Nueva área de selección manual en un gráfico

Acerca de este tema Puede modificar las áreas de selección deteniendo la Worklist (Lista de trabajo) en el Lab Report (Informe de laboratorio) o bien puede acabar de procesar la lista y, a continuación, modificar las áreas de selección durante el análisis.

Procedimiento Para modificar las áreas de selección deteniendo la Worklist (Lista de trabajo) en el Lab Report (Informe de laboratorio):

1. Haga clic en Pause (Pausa) durante la cuenta atrás entre las muestras.

2. Haga clic en cualquier gráfico para ajustar el área de selección.

El gráfico seleccionado aparecerá en una vista ampliada.

3. Ajuste las áreas de selección cuanto sea necesario.

Lea las instrucciones en la Directrices sobre áreas de selección y ejemplos (página 43).

Para que las áreas de selección vuelvan a sus posiciones originales, haga clic en Autogate (Área de selección automática).

4. Haga clic en Continue (Continuar) para cerrar el gráfico

5. Haga clic en Run (Procesar) para continuar con la adquisición.

Temas relacionados Marcado y adquisición de muestras (página 38)

Directrices sobre áreas de selección y ejemplos (página 43)

6Directrices sobre áreas de selección y

ejemplos


Directrices sobre áreas de selección (página 44)

Descripción general de los ejemplos de definición de área de selección (página 46)

Muestra de leucoféresis (fresca) (página 47)

Muestra de leucoféresis (descongelada) (página 52)

Muestra de médula ósea (fresca) (página 62)

Muestra de médula ósea (descongelada) (página 67)

Muestra de sangre de cordón (fresca) (página 76)

Muestra de sangre de cordón (descongelada) (página 81)


Directrices sobre áreas de selección

Acerca de este tema Este tema muestra un ejemplo de cómo el Software clínico BD FACSCanto procesa una muestra marcada con el kit BD Stem Cell Enumeration y analizada en un citómetro de flujo BD FACSCanto II. Las áreas de selección mostradas son áreas de selección automáticas definidas por el software. No fue necesario ajustar de forma manual el área de selección. La muestra marcada en este ejemplo es sangre fresca periférica movilizada.

Cómo utilizar esta información

Utilice esta información para revisar los gráficos de datos, comprobar la ubicación y los límites de cada área de selección y ajustar dichas áreas cuanto sea necesario.

Ajuste las áreas de selección únicamente si es necesario.

Términos clave Los términos clave en la tabla de pautas sobre áreas de selección corresponden a la siguiente información:

Nº de paso. El orden en el que el algoritmo de definición de área de selección procesa los datos.

Nº de gráfico. El orden en el que el gráfico aparece en el Lab Report (Informe de laboratorio).

Tipo de gráfico. Las etiquetas de los ejes del gráfico.

Acción del software. Cómo procesa los datos el algoritmo de definición de área de selección.

Nombre de área de selección. El nombre del área de selección tal y como aparece en el Lab Report (Informe de laboratorio).

Acción del usuario. Qué se debe buscar en el gráfico y cómo ajustar manualmente el área de selección (si fuera necesario).


Ejemplo de Lab Report (Informe de laboratorio)

Los gráficos se muestra en el Lab Report (Informe de laboratorio) en el siguiente orden.

SpecimenALP16-BD1

�� 7�1��8�� 7��6��8��PAL

0��7��8��

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�� *,�!�: �"��

32 4 5

6 7 8

1

Nº de gráfico Área(s) de selección

Nº de gráfico Área(s) de selección

CD45Pos, Lymphs (Linfocitos) Microesferas

CD34Pos Debris (Detritos)

CD45Pos, CD45Dim Viable

Viable CD34 Viable

1 5

2 6

3 7

4 8


Descripción general de los ejemplos de definición de área de selección

Acerca de este tema Este tema presenta ejemplos de definición de áreas de selección para datos adquiridos a partir de diferentes tipos de muestras:

Muestra de leucoféresis (fresca) (página 47)

Muestra de leucoféresis (descongelada) (página 52)

Muestra de médula ósea (fresca) (página 62)

Muestra de médula ósea (descongelada) (página 67)

Muestra de sangre de cordón (fresca) (página 76)

Muestra de sangre de cordón (descongelada) (página 81)


Muestra de leucoféresis (fresca)

Acerca de este tema Este tema muestra un ejemplo de cómo el Software clínico BD FACSCanto procesa una muestra de leucoféresis fresca teñida con el kit BD Stem Cell Enumeration y analizada en un citómetro de flujo BD FACSCanto II. Las áreas de selección mostradas son áreas de selección automáticas definidas por el software. No fue necesario ajustar de forma manual el área de selección. Para obtener más información, consulte Directrices sobre áreas de selección (página 44).



Paso 1, gráfico 6

Debris (Detritos)


Paso 2, gráfico 8

Paso 3, gráfico 7

Viable

Viable


Paso 4, gráfico 1

Paso 5, gráfico 2

CD45Pos

Lymphs (Linfocitos)

CD34Pos


Paso 6, gráfico 3

Paso 7, gráfico 4

CD45PosCD45Dim

Viable CD34


Paso 8, gráfico 5

Micro-esferas


Muestra de leucoféresis (descongelada)

Acerca de este tema Este tema muestra un ejemplo de cómo el Software clínico BD FACSCanto procesa una muestra de leucoféresis descongelada teñida con el kit BD Stem Cell Enumeration y analizada en un citómetro de flujo BD FACSCanto II (los gráficos llevan la etiqueta Auto gating (Definición automática de áreas de selección)). Un segundo conjunto de gráficos (con la etiqueta Manual gating (Definición manual de áreas de selección)) muestra un ejemplo de cómo ajustar manualmente cada área de selección. Para obtener más información, consulte Directrices sobre áreas de selección (página 44).


Utilice esta información para revisar los gráficos de datos, comprobar la ubicación y los límites de cada área de selección y ajustar dichas áreas cuanto sea necesario. Consulte Lab Report (Informe de laboratorio) de la definición automática del área de selección (página 60) y Lab Report (Informe de laboratorio) de la definición manual del área de selección (página 61) para ver los Lab Reports (Informes de laboratorio) de esta muestra.


Paso 1, gráfico 6

Definición automática de área de selección Definición manual de área de selección

Aumente el área de selección de Debris (Detritos)No incluya los eventos de microesferas. Los siguientes gráficos mostrarán menos detritos y lapoblaciones de interés serán más visibles.

El área de selección de Debris (Detritos) es demasiado pequeña.

Debris (Detritos) Debris (Detritos)


Paso 2, gráfico 8

Paso 3, gráfico 7

Definición automática de área de selección

No es necesario ajustar de forma manual el área de selección.

Viable



Viable


Paso 4, gráfico 1


Ajuste manualmente el área de selección Lymphs (Linfocitos) para que sólo incluya los linfocitos.

El área de selección Lymphs (Linfocitos) muestra demasiados eventos que no son de linfocitos.

CD45Pos CD45Pos

Lymphs (Linfocitos)

Lymphs (Linfocitos)


Paso 5, gráfico 2Definición automática de área de selección


CD34Pos


Paso 6, gráfico 3


Ajuste manualmente el área de selección CD45Dim para que incluya todos los eventos CD45Dim.

El área de selección CD45Dim no incluye la población CD45Dim en su totalidad.

CD45Pos CD45PosCD45DimCD45Dim


Paso 7, gráfico 4


Ajuste el área de selección Viable CD34 para que incluya el extremo izquierdo y el tercio superior de los linfocitos viables. Las células con un FSC bajo y un SSC más alto no son viables, tal y como se define por dispersión.

El área de selección Viable CD34 depende de la definición correcta del área de selección de los linfocitos viables en el gráfico 1. Ajuste siempre el área de selección Viable CD34 si el área de selección de linfocitos se ajustó anteriormente.

Viable CD34Viable CD34

Observe que los dos gráficos son muy diferentes. Los cambios realizados en las áreas de selección anteriores afectan al modo en el que aparecen las poblaciones en los gráficos posteriores.




Micro-esferas


Lab Report (Informe de laboratorio) de la definición automática del área de selección

SpecimenALP004-BD1

BD Stem Cell + 7AAD7/1/2008 5:37:59 PM7/16/2008 2:47:53 PM1200752000OKPAL

16072008.csv

Panel:Acquired:Analyzed:TruC Lot ID:Bead/Pellet:Status:Operator:Reviewer:Results:

Director: BD

Dilution Factor: 11 Column #2: Column #3: BD FACSCanto II V96322014 BD FACSCanto v.2.4.3155.23769

BD Stem Cell + 7AAD Total Events: 295630

ALP004-BD1005.001.fcs Kit Lot ID: IUO24371

CD34+ Viable Abs Cnt (cells/μl) 4787.34CD45+ Viable Abs Cnt (cells/μl) 83522.63

CD34+ Viable Events 4322CD45+ Viable Events 75404Bead Events 5164

Viable CD34+ % Viable CD45+ 5.73CD34 Viability (%) 48.72Viable CD34+ CV (%) 1.52

QC MessagesInspect all dot plots.

Comments


Lab Report (Informe de laboratorio) de la definición manual del área de selección

SpecimenALP004-BD1

BD Stem Cell + 7AAD7/1/2008 5:37:59 PM7/16/2008 2:53:35 PM1200752000OKPAL

16072008.csv

Panel:Acquired:Analyzed:TruC Lot ID:Bead/Pellet:Status:Operator:Reviewer:Results:

Director: BD

Dilution Factor: 11 Column #2: Column #3: BD FACSCanto II V96322014 BD FACSCanto v.2.4.3155.23769

BD Stem Cell + 7AAD Total Events: 295630

ALP004-BD1005.001.fcs Kit Lot ID: IUO24371

CD34+ Viable Abs Cnt (cells/μl) 4039.67CD45+ Viable Abs Cnt (cells/μl) 59838.46

CD34+ Viable Events 3647CD45+ Viable Events 54022Bead Events 5164

Viable CD34+ % Viable CD45+ 6.75CD34 Viability (%) 41.90Viable CD34+ CV (%) 1.66

QC MessagesManual Gate is in effect.Inspect all dot plots.

Comments


Muestra de médula ósea (fresca)

Acerca de este tema Este tema muestra un ejemplo de cómo el Software clínico BD FACSCanto procesa una muestra de médula ósea fresca teñida con el kit BD Stem Cell Enumeration y analizada en un citómetro de flujo BD FACSCanto II. Las áreas de selección mostradas son áreas de selección automáticas definidas por el software. No fue necesario ajustar de forma manual el área de selección. Para obtener más información, consulte Directrices sobre áreas de selección (página 44).



Paso 1, gráfico 6

Debris (Detritos)


Paso 2, gráfico 8

Paso 3, gráfico 7

Viable

Viable


Paso 4, gráfico 1

Paso 5, gráfico 2

Lymphs (Linfocitos)

CD45Pos

CD34Pos


Paso 6, gráfico 3

Paso 7, gráfico 4

CD45PosCD45Dim

Viable CD34


Paso 8, gráfico 5

Micro-esferas


Muestra de médula ósea (descongelada)

Acerca de este tema Este tema muestra un ejemplo de cómo el Software clínico BD FACSCanto procesa una muestra de médula ósea descongelada teñida con el kit BD Stem Cell Enumeration y analizada en un citómetro de flujo BD FACSCanto II (los gráficos llevan la etiqueta Auto gating (Definición automática de áreas de selección)). Un segundo conjunto de gráficos (con la etiqueta Manual gating (Definición manual de áreas de selección)) muestra un ejemplo de cómo ajustar manualmente cada área de selección. Para obtener más información, consulte Directrices sobre áreas de selección (página 44).




Paso 1, gráfico 6


Aumente el área de selección de Debris (Detritos). Los siguientes gráficos mostrarán menos detritos y las poblaciones de interés serán más visibles.

El área de selección de Debris (Detritos) es demasiado pequeña.

Debris (Detritos)Debris (Detritos)


Paso 2, gráfico 8

Ajuste manualmente el área de selección Viable para que sólo incluya los linfocitos y los monocitos.

El área de selección Viable es demasiado ancha.


Viable Viable




Viable




CD45Pos

Lymphs (Linfocitos)




CD34Pos


Paso 6, gráfico 3

Ajuste manualmente el área de selección CD45Dim, de modo que incluya el grupo de células, pero no los linfocitos más brillantes.

El extremo derecho del área de selección CD45Dim no incluye todas las células en el grupo.


CD45Pos CD45PosCD45DimCD45Dim



Viable CD34


Paso 8, gráfico 5

Micro-esferas




Muestra de sangre de cordón (fresca)

Acerca de este tema Este tema muestra un ejemplo de cómo el Software clínico BD FACSCanto procesa una muestra de sangre de cordón fresca teñida con el kit BD Stem Cell Enumeration y analizada en un citómetro de flujo BD FACSCanto II. Las áreas de selección mostradas son áreas de selección automáticas definidas por el software. No fue necesario ajustar de forma manual el área de selección. Para obtener más información, consulte Directrices sobre áreas de selección (página 44).



Paso 1, gráfico 6

Debris (Detritos)


Paso 2, gráfico 8

Paso 3, gráfico 7

Viable

Viable


Paso 4, gráfico 1

Paso 5, gráfico 2

CD45Pos

Lymphs (Linfocitos)

CD34Pos


Paso 6, gráfico 3

Paso 7, gráfico 4

CD45Pos

CD45Dim

Viable CD34


Paso 8, gráfico 5

Micro-esferas


Muestra de sangre de cordón (descongelada)

Acerca de este tema Este tema muestra un ejemplo de cómo el Software clínico BD FACSCanto procesa una muestra de sangre de cordón descongelada teñida con el kit BD Stem Cell Enumeration y analizada en un citómetro de flujo BD FACSCanto II. Las áreas de selección mostradas son áreas de selección automáticas definidas por el software. No fue necesario ajustar de forma manual el área de selección. Para obtener más información, consulte Directrices sobre áreas de selección (página 44).



Paso 1, gráfico 6

Debris (Detritos)


Paso 2, gráfico 8

Paso 3, gráfico 7

Viable

Viable


Paso 4, gráfico 1

Paso 5, gráfico 2

CD45Pos

Lymphs (Linfocitos)

CD34Pos


Paso 6, gráfico 3

Paso 7, gráfico 4

CD45Pos CD45Dim

Viable CD34


Paso 8, gráfico 5

Micro-esferas

7Revisión de informes


Revisión del Cytometer Setup Report (Informe de calibración del citómetro) (página 88)

Revisión del Application Setup Report (Informe de calibración de la aplicación) (página 91)

Revisión del Lab Report (Informe de laboratorio) (página 93)


Revisión del Cytometer Setup Report (Informe de calibración del citómetro)Acerca de este tema Este tema describe la información que se encuentra en el

Cytometer Setup Report (Informe de calibración del citómetro).

Cytometer Setup Report El Cytometer Setup Report (Informe de calibración del citómetro) se genera tras procesar la calibración del citómetro.

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a b c d e f g


Contenido del informe La siguiente tabla describe la información que aparece en el Cytometer Setup Report (Informe de calibración del citómetro). Los números se corresponden con los que aparecen en el informe de ejemplo.

Nº Nombre Función

1 Encabezado del informe

Contiene el nombre del citómetro y el número de serie, la versión de software, la fecha y la hora de la calibración, la institución, el director, el operador y el resultado general (PASS (Apta) o FAIL (No apta)).

2 Microesferas de calibración

Enumera el producto de microesferas utilizado, el número de catálogo, el ID de lote y la fecha de caducidad.

3 Detectors (Detectores)

Proporciona la siguiente información:

Laser (Láser) (a). Indica qué láser ha activado la partícula teñida para que emita la luz recogida por ese detector.

FL Target (Objetivo de fluorescencia) (b). El valor objetivo de fluorescencia en formato de registro. El software ajusta la tensión para que la microesfera de calibración se encuentre en el valor objetivo. Para obtener más información sobre el FL Target, consulte el prospecto de las microesferas.

Voltage (Tensión) (c). Indica la tensión necesaria para ajustar las microesferas en los valores objetivo de fluorescencia (b).

ΔVoltage (d) indica el cambio en voltios desde la última calibración. La diferencia entre los dos valores debe ser inferior a 50 voltios. Con una diferencia inferior a 50 será apta (g). Con una diferencia de 50 o superior a 50, no será apta.

Sensitivity (Sensibilidad) (e). Medida de la capacidad del citómetro para resolver células débilmente teñidas. La medición incluye contribuciones de eficiencia de recopilación de fotones, señal de fondo y brillo intrínseco de cada fluoróforo.

Spec (Especificación) (f). Un valor de sensibilidad superior al de Spec significa que el detector cumple la especificación de sensibilidad (g).

P/F (g). Indica si la Sensitivity (Sensibilidad) (e) o ΔVoltage (Tensión D) (d) es apta o no apta. Un fallo de cualquiera de las categorías producirá un resultado general Fail (No apto) (g) para ese detector.


Información sobre la resolución de problemas

Para obtener ayuda con los valores que se encuentran fuera del rango en el Cytometer Setup Report (Informe de calibración del citómetro), consulte el Manual de referencia del software BD FACSCanto o bien el prospecto de las microesferas de calibración de 7 colores BD FACS.

Temas relacionados Calibración del citómetro (página 29)

4 Compensation (Compensación)

Muestra los valores de superposición de espectros calculados durante la calibración a los voltajes actuales. Los valores ≤100% serán aptos. Los valores >100% no serán aptos.

5 Lasers (Láseres) Ofrece información sobre cada láser y si cumple o no las especificaciones de potencia (en milivatios) determinadas por BD Biosciences. También se indica la corriente del láser (medida en amperios).

6 Fluidics (Sistema de fluidos)

Muestra si la presión del líquido de revestimiento cumple o no las especificaciones determinadas por BD Biosciences. También muestra la tensión de la presión para velocidades de flujo baja, media o alta, lo que resulta de utilidad al solucionar problemas.

7 Comments (Comentarios)

Proporciona un área para indicar información adicional.

8 Revisor Proporciona un espacio para que el revisor firme el informe.

Nº Nombre Función


Revisión del Application Setup Report (Informe de calibración de la aplicación)

Acerca de este tema El Application Setup Report (Informe de calibración de la aplicación) muestra los parámetros del citómetro específicos del ensayo. El software utiliza estos parámetros si opta por no optimizar con los controles de procesos.

Application Setup Report El Application Setup Report (Informe de calibración de la aplicación) se genera tras procesar la calibración del citómetro. A continuación se muestra un informe de calibración.

Application Setup ReportBD Stem Cell

Cytometer:Serial Number:Software:Date:

BD FACSCanto IIV96300098BD FACSCanto v2.4.3155.237697/16/2007 04:37:00 AM

Institution:Director:Operator: USERS

Cytometer SetupCytometer Setup Report: 7/16/2007 04:37:00 AM, Overall Result: PASSBead Product: BD FACS 7-Color Setup Beads, Catalog Number: 335775Lot Information: Lot ID 76697, Exp.: 2007-09-30

DetectorsDetector Laser VoltageFSC Blue 317SSC Blue 407FITC Blue 357PE Blue 3967AAD Blue 438Trucount beads Red 516

CompensationFluorophores (%spectral overlap)

Detector FITC PE 7AAD Trucount beadsFITC 100.00 0.48 0.00 0.01PE 24.67 100.00 5.50 0.017AAD 2.40 10.81 100.00 0.51Trucount beads 0.00 0.09 10.09 100.00

Threshold (Operator: And)

FITC 400

Comments

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c


Contenido del informe La siguiente tabla describe la información que aparece en el Application Setup Report (Informe de calibración de la aplicación). Los números se corresponden con los que aparecen en el informe de ejemplo.

Temas relacionados Calibración de la aplicación (página 32)

Nº Nombre Función


Contiene el nombre del citómetro y el número de serie, la versión de software, la fecha y la hora del procesamiento, la institución, el director y el operador.

2 Resultados de la calibración

Indica la fecha y la hora en la que se ha realizado la calibración y el resultado (PASS (Apta) o FAIL (No apta)).

3 Microesferas de calibración

Enumera el producto de microesferas utilizado, el número de catálogo, el ID de lote y la fecha de caducidad.

4 Detectors (Detectores)

Proporciona la siguiente información:

Laser (Láser) (a). Indica qué láser ha activado la partícula teñida para que emita la luz recogida por ese detector.

Voltage (Tensión) (b). Indica la tensión necesaria para ajustar las microesferas en los valores objetivo de fluorescencia.

5 Compensation (Compensación)

Muestra los valores de superposición de espectros calculados durante la calibración a los voltajes actuales. Los valores ≤100% serán aptos. Los valores >100% no serán aptos.

PE–%7AAD value (Valor PE–%7AAD) (c). Un valor de −0,5% a 10,5% indica una optimización correcta de la calibración.

6 Threshold (Umbral)

Indica el parámetro o los parámetros y el valor o los valores utilizados como umbral durante la optimización. También muestra el operador lógico activo para el umbral o los umbrales. Los diferentes operadores lógicos son:

OR (únicamente un umbral)

AND (todos los umbrales seleccionados)



8 Revisor Proporciona un espacio para que el revisor firme el informe.


Revisión del Lab Report (Informe de laboratorio)

Acerca de este tema El Lab Report (Informe de laboratorio) incluye gráficos de muestras, datos analizados y mensajes de control de calidad.

Lab Report Tras cada muestra se genera un Lab Report (Informe de laboratorio).

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Comments

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Contenido del informe La siguiente tabla describe la información que aparece en el BD Stem Cell Lab Report. Los números se corresponden con los que aparecen en el informe de ejemplo.

Temas relacionados Solución de problemas (página 95)

Nº Nombre Función


Contiene información sobre el laboratorio, los reactivos, en ensayo y la muestra, así como las fechas y horas de la adquisición y el análisis.

2 Títulos de columnas

Muestra los valores introducidos en las columnas específicas de los paneles de la Worklist (Lista de trabajo).

3 Información del software y del citómetro

Indica el nombre del citómetro y el número de serie, así como el nombre del software y el número de versión.

4 Gráficos Muestra los gráficos de los datos analizados, así como el número total de eventos recopilados.

Nota: Los dos gráficos de viabilidad se omiten del informe cuando se procesan controles de proceso.

5 Nombre del archivo de muestra y número de lote del kit

Indica el nombre del archivo de muestra y el número de lote del kit BD Stem Cell Enumeration.

6 Resultados Proporciona los resultados del análisis de cada tubo. El responsable del laboratorio puede elegir qué resultados desea mostrar y cambiar los rangos de alarma (consulte el Manual de referencia del software BD FACSCanto II o las Instrucciones de uso de BD FACSCanto II).

7 Mensajes de control de calidad

Esta sección muestra:

Los valores de control de calidad seleccionados por el responsable del laboratorio

Un mensaje que indica si se ha producido un fallo

Un mensaje si uno o más resultados se encuentran fuera del rango de alarma



8Solución de problemas


Datos de contacto e información sobre solución de problemas (página 96)

Fallo de solapamiento (página 96)

La lista de trabajo no se procesará (página 97)

No se produce ningún resultado (página 97)

Se producen resultados incompletos (página 99)

La ubicación del área de selección es dudosa, pero se informa de todos los resultados (página 100)

Número insuficiente de eventos recopilados, pero se informa de todos los resultados (página 102)

Advertencias generales (página 103)

Anticoagulante de heparina (página 105)


Datos de contacto e información sobre solución de problemasAcerca de este tema Este tema ofrece sugerencias para ayudarle a solucionar

problemas que puedan surgir e incluye información de contacto si se necesita asistencia adicional.

Cómo obtener asistencia Utilice la siguiente información para ponerse en contacto con el servicio de asistencia.

Para obtener asistencia en EE.UU., llame al (877) 232-8995.

Para obtener asistencia en Canadá, llame al (888) 259-0187.

Para obtener asistencia fuera de EE.UU. y Canadá, póngase en contacto con su representante o distribuidor local de BD.

Consulte nuestro sitio Web (bdbiosciences.com), para obtener información de contacto actualizada.

Fallo de solapamiento

Mensaje de control de calidad Posible causa Solución recomendada

Spillover failure. (Fallo de solapamiento.)

No ha añadido el 7-AAD al tubo.

No utilizado controles BD Stem Cell para realizar la calibración.

No ha añadido el reactivo CD45/CD34 al tubo.

Vuelva a realizar el marcado y procese los tubos de calibración y optimización. Compruebe el sistema de fluidos del citómetro.

http://www.bdbiosciences.com


La lista de trabajo no se procesará

No se produce ningún resultado


Worklist will not run. (La lista de trabajo no se procesará).

Se ha procesado la Standard Setup (Calibración estándar) después de la Application Setup (Calibración de aplicación).

1. Vuelva a realizar el marcado de los tubos de calibración y optimización.

2. Vuelva a procesar la Standard Setup (Calibración estándar), seguida de la Application Setup (Calibración de la aplicación).


Lymph gate failure. (Fallo del área de selección de los linfocitos).

Número insuficiente de linfocitos en la muestra.a

Vuelva a definir el área de selección manualmente.

Población de linfocitos sin resolver.


CD45 gate failure. (Fallo en el área de selección CD45).

Número insuficiente de células CD-45 en la muestra.a


CD34Pos gate failure. (Fallo en el área de selección CD34Pos).

Número insuficiente de células CD34Pos en la muestra.a


Viable CD34 gate failure. (Fallo en el área de selección CD34 viable).

Número insuficiente de células CD34 viables en la muestra.a



CD34 gate failure. (Fallo en el área de selección CD34).

Número insuficiente de células CD34 en la muestra.a


Viability gate failure. (Fallo en el área de selección de viabilidad).

Número insuficiente de células viables en la muestra porque todas las células están muertas.

Repita el marcado y, a continuación, adquiera la muestra recién marcada.

Número insuficiente de células viables en la muestra porque se añadió 7-AAD al control de proceso.

1. Repita el marcado según el prospecto del kit BD Stem Cell Enumeration. (No añada 7-AAD a los controles de proceso).

2. Adquiera controles de proceso recién marcados.

a. Compruebe los objetivos de adquisición de los valores establecidos. Consulte Visualización de los objetivos de adquisición (página 24).



Se producen resultados incompletos


No beads detected. (No se han detectado microesferas).

No se ha utilizado un tubo BD Trucount.

El tubo no tenía bola.

Repita el marcado con un tubo BD Trucount y adquiera la muestra recién teñida.

Less than 1,000 beads collected.a (Se han recopilado menos de 1.000 microesferas).



Concentration of white blood cells is too high. (La concentración de leucocitos es demasiado alta).

La concentración de leucocitos es >45.000 células/µL.

Diluya la muestra y vuelva a marcar y a adquirir la muestra recién marcada.

a. Compruebe los objetivos de adquisición de los valores establecidos. Consulte Visualización delos objetivos de adquisición (página 24).


La ubicación del área de selección es dudosa, pero se informa de todos los resultados


Viability gate suspect. (Duda de viabilidad en el área de selección).

Ubicación del área de selección poco habitual.


Beads gate suspect. (Duda en el área de selección de microesferas).




El tubo no tenía bola.


CD34Pos gate suspect. (Duda en el área de selección CD34Pos).




CD45 gate suspect. (Duda en el área de selección CD45).



CD45Dim gate suspect. (Duda en el área de selección CD45Dim).



Lymphs gate suspect. (Duda en el área de selección de linfocitos).

Ubicación del área de selección poco habitual. (En este ejemplo, el área de selección incluye monocitos).

1. Vuelva a definir el área de selección manualmente.

2. Ajuste manualmente el área de selección de CD34.



Número insuficiente de eventos recopilados, pero se informa de todos los resultados


Less than 100 Viable CD34 events collected.a (Menos de 100 eventos de CD34 viables recopilados).

Recuento de CD34 bajo. La adquisición superó el tiempo de espera tras 15 minutos.

1. Revise los gráficos y los resultados de los informes.

2. Vuelva a marcar la muestra, aumente el tiempo de detención, adquiera la muestra recién teñida.

Less than user-requesteda Viable CD34 events collected. (Se han recopilado menos eventos CD34 viables de los solicitados por el usuario).

Recuento de CD34 bajo. La adquisición superó el tiempo de espera tras 15 minutos.

3. Revise los gráficos y los resultados de los informes.

4. Vuelva a marcar la muestra, aumente el tiempo de detención, adquiera la muestra recién teñida.

Insufficient Viable CD45 events collected. (Eventos CD45 viables recopilados insuficientes).

Número insuficiente de células viables en la muestra. La adquisición superó el tiempo de espera tras 15 minutos.

Revise los gráficos y los resultados de los informes.

Número insuficiente de eventos CD45 viables en la muestra. La adquisición superó el tiempo de espera tras 15 minutos.


Compruebe que la antigüedad de la muestra es de <24 horas.

La muestra se ha diluido demasiado.

Utilice un factor de dilución menor.


Advertencias generales

Less than user-requested Viable CD45 events collected. (Se han recopilado menos eventos CD45 viables de los solicitados por el usuario).

Número insuficiente de eventos CD45 viables en la muestra. La adquisición superó el tiempo de espera tras 15 minutos.


La muestra se ha diluido demasiado.

Utilice un factor de dilución menor.

a. Compruebe los objetivos de adquisición de los valores establecidos. Consulte Visualización delos objetivos de adquisición (página 24).



Cytometer settings were generated from a failed setup result. (Los parámetros del citómetro se generaron a partir de un resultado de calibración incorrecta).

Fallo de calibración del citómetro

1. Vuelva a procesar la calibración del citómetro y compruebe que se completa con éxito.

2. Vuelva a procesar las muestras.

Setup optimization failed. (Fallo de optimización de calibración).

No se ha añadido 7-AAD al tubo.

Añada 7-AAD al tubo de optimización y vuelva a procesar la calibración.

No se ha añadido el reactivo BD Stem Cell reagent al tubo.

Vuelva a marcar la muestra y adquiera la muestra recién teñida.

Se ha utilizado una muestra de control incorrecta.

Vuelva a marcar y a adquirir los controles.


One or more results are outside the alarm range. (Uno o más resultados se encuentran fuera del rango de alarma).

La concentración de leucocitos es >45.000 células/µL.

Diluya la muestra y vuelva a marcar y a adquirir la muestra recién teñida.

Stem cell controls are out of range. (Los controles de células madre se encuentran fuera del rango).

Fallo de calibración del citómetro.

Vuelva a procesar la calibración del citómetro y compruebe que es correcta (Pass) y, a continuación, vuelva a marcar y a procesar los controles.

Error de pipeteado. Vuelva a marcar y a procesar los controles.

Los controles no se han vuelto a suspender correctamente antes del pipeteado.

Abra un nuevo tubo de controles BD Stem Cell controls, vuelva a marcar y a procesarlos.

Research Use Only - Not for use in diagnostic or therapeutic procedures (Sólo para investigación - No es apto para uso en procedimientos diagnósticos o terapéuticos).

Se ha utilizado un BD FACSCanto cytometer y/o Cargador para adquirir muestras.

Cargue los tubos manualmente y adquiera las muestras con un BD FACSCanto II flow cytometer.

Manual gate is in effect (Se está utilizando un área de selección manual).

Las áreas de selección se han vuelto a definir manualmente.

NA. Para volver a aplicar el algoritmo de área de selección, haga clic en Autogate (Área de selección automática).

Inspect all dot plots. (Inspeccionar todos los gráficos de puntos).

Deben revisarse los gráficos de puntos para verificar que las áreas de selección se han definido correctamente y las poblaciones de células aparecen tal y como se esperaba.

NA.



Anticoagulante de heparina

Observación Posible causa Solución recomendada

Franja de plaquetas.

Se ha recopilado una muestra en anticoagulante de heparina.

1. En el gráfico 1, desplace el límite izquierdo del área de selección de CD45Pos a la derecha para excluir las plaquetas.

2. Al ajustar el área de selección de los linfocitos en el gráfico1, la franja de plaquetas en el gráfico 2 se ha eliminado parcialmente.

Gráfico 1 antes de volver a definir el área de selección

Gráfico 1 tras volver a definir el área de selección

CD45Pos CD45Pos

LinfocitosLinfocitos

Franja de plaquetas

Gráfico 2 antes de volver a definir el área de selección

Gráfico 2 tras volver a definir el área de selección

CD34+ CD34+

stemcelll

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