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Versión 1 21/12/2006 Página 1 de 39

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Indice

1. Identificación de microorganismos (IM)

2. Pruebas bioquímicas y enzimáticas (BE)

3. Antibiogramas manuales (AB)

4. Pruebas de sensibilidad complementaria (SC)



Identificación de microorganismos (IM)

1. Brucella spp

2. Campylobacter spp

3. Gardnerella vaginalis

4. Haemophillus spp

5. Levaduras

6. Moraxella catarrhalis

7. Neisseria meningitidis

8. Neisseria gonorrhoeae

9. Nocardia

10. Rhodococcus equi

11. Staphylococcus aureus

12. Streptococcus pneumoniae

13. Streptococcus pyogenes

14. Vibrio spp



1. Brucella spp 1. Aspecto de la colonia: pequeñas, convexas, translúcidas, levemente amarillentas y

opalescentes

2. Gram: cocobacilos Gram negativos

3. Catalasa (+)

4. Oxidasa (+)

5. Urea (+)

6. Aglutinación con antisueros específicos

2. Campylobacter spp 1. Gram: bacilos Gram negativos pequeños, curvos o como alas de gaviotas

2. Catalasa (+)

3. Oxidasa (+)

4. Hipurato (+) C. jejuni

5. Hipurato (-) Campylobacter sp

3. Gardnerella vaginalis 1. Aspecto de la colonia: colonias beta-hemolíticas en agar Gardnerella

2. Gram: bacilo Gram variable pleomórfico

3. Catalasa (-)

4. Oxidasa (-)

5. Hipurato (+)

6. Prueba de SPS (Polianetol Sulfonato de Sodio)

Las colonias beta-hemolíticas se aislan en agar Gardnerella sembrando la mitad de la

placa, trazando repetidas estrias sobre la superficie. Colocar un disco de SPS en el centro

de la zona inoculada. Se incuba en atmósfera de anaerobiosis durante 18-24 horas a 37ºC.

Halo de inhibición de SPS → Gardnerella vaginalis

4. Haemophillus spp

1. Gram: cocobacilos Gram negativos

2. Prueba de la urea, ornitina y porfirina

5. Levaduras

Test de filamentación



6. Moraxella catharralis 1. Gram: diplococos Gram negativos

2. Catalasa (+)

3. Oxidasa (+)

4. Tributirina (+)

5. Métodos de identificación alternativos a tributirina: API NH y/o API Neisseria 4H

7. N. meningitidis (Procesar los cultivos en campana de seguridad)

1. Gram: diplococos gramnegativos

2. Catalasa (+)

3. Oxidasa (+)

4. La identificación se confirma con: API NH, API Neisseria 4H

5. Aglutinación con partículas de látex para ver a que grupo pertenece

8. N. gonorrhoeae

1. Gram: diplococos gramnegativos

2. Catalasa (+)

3. Oxidasa (+)

4. La identificación se confirma con: API NH, API Neisseria 4H

9. Nocardia Tinción de Zielh-Neelsen: ácido alcohol resistencia parcial

Urea (+)

Reducción de nitratos (+)

10. Rhodococcus equi

1. Gram de colonia: bacilos G+ difterimorfos. A los 2 días de incubación de la placa, en el

gram se observan cocos G+

2. Tinción de Zielh-Neelsen: pueden tener una ácido alcohol resistencia parcial

3. Catalasa (+)

4. Nitratos (-)

5. Urea (+)

6. API coryne

11. S. aureus 1. Aspecto de la colonia: aspecto blanco o amarillento, son planas, cremosas, brillantes,



en ocasiones beta-hemolíticas

2. Gram: cocos grampositivos

3. Catalasa (+)

4. Coagulasa (+)

12. S. pneumoniae

1. Aspecto de la colonia: colonias alfa-hemolíticas en agar sangre (AS)

2. Gram: diplococos grampositivos, en forma redondeada o lanceolada

3. Catalasa (-)

4. Prueba de la optoquina: Las colonias alfa-hemolíticas se aislan en AS sembrando la

mitad de la placa, trazando repetidas estrias sobre la superficie. Colocar un disco de

optoquina de 400 mcg y 6 mm en el centro de la zona inoculada. Se incuba en

atmósfera de CO2 durante 18-24 horas a 35ºC

4.1.- Interpretación de la prueba de la optoquina.

Halo de inhibición de optoquina >14mm → SENSIBLE → NEUMOCOCO

Halo de inhibición de la optoquina ≤ 14mm → RESISTENTE → Otros estreptococos

5. Aglutinación con partículas de látex

13. S. pyogenes 1. Aspecto de la colonia: colonias beta-hemolíticas en agar sangre

2. Gram: diplococos grampositivos, en forma redondeada o lanceolada

3. Catalasa (-)

4. Prueba de la bacitracina. Las colonias betahemolíticas se aislan en AS sembrando la

mitad de la placa, trazando repetidas estrias sobre la superficie. Colocar un disco con

0,04 U de Bacitracina en el centro de la zona inoculada. Se incuba en atmósfera de CO2

durante 18-24 horas a 35ºC. La presencia de una zona de inhibición de cualquier

tamaño indica sensibilidad a la bacitracina

4.1. Sospecha de S. pyogenes→catalasa (-)→bacitracina (inhibición)

5. Aglutinación con partículas de latex: aglutinación positiva al grupo A

14. Vibrio spp 1. Gram: bacilos Gram negativos pequeños que pueden adoptar formas curvas

2. Catalasa (+)

3. Oxidasa (+)

4. Sensibilidad a 0/129 (+)



Pruebas bioquímicas y enzimáticas (BE)

1. Aglutinaciones

2. Catalasa

3. Coagulasa látex

4. Coagulasa tubo

5. Hipurato

6. Kliger

7. Indol

8. Movilidad

9. Nitratos

10. ONPG (O-Nitrofenil-Beta-galactopiranósido)

11. Ornitina

12. Oxidasa

13. Porfirina

14. Rosa de Bengala

15. Streptest

16. Test de filamentación

17. Tributirina

18. Urea



1. Aglutinaciones

1.1. Microorganismos: Salmonella, Shigella, E. coli O:157, Yersinia enterocolitica, Vibrio

colerae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Brucella abortus

Procedimiento

1. Colocar una gota de reactivo (antisuero) en un portaobjetos

2. Transferir un asa llena del organismo de prueba a la gota del antisuero y mezclar

3. Girar el portaobjetos durante 1 minuto

Interpretación del resultado

Resultado positivo: Aglutinación

1.2. Microorganismo: S.aureus meticilin-resistente

Nombre: Slidex MRSA Detection. Referencia: 73117

Procedimiento

Método de extracción de la PBP´2

1. Poner 4 gotas de Reactivo de Extracción 1 (R3) en un tubo de microcentrífuga

2. Coger 2 -3 asas cargadas con las colonias aisladas, resuspenderlas en el reactivo R3

3. Cerrar el tubo y ponerlo al baño-maría 95-100ºC 3 min

4. Retirar el tubo y dejar que se atempere

5. Añadir una gota del reactivo de Extracción 2 (R4) en el tubo

6. Homogenizar

7. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos

8. Utilizar el sobrenadante

Método de aglutinación en látex

1. Atemperar los reactivos

2. Resuspender los reactivos con látex

3. Añadir una gota de látex sensibilizado (R1) en un círculo, y depositar 50 µl de

sobrenadante

4. En otro círculo depositar Látex contro negativo (R2) y 50 µl de sobrenadante

5. Rotar durante 3 min y observar la aglutinación

Interpretación de resultados



POSITIVO Aglutinación NO Aglutinación

NEGATIVO NO Aglutinación NO Aglutinación

ININTERPRETABLE ------ Aglutinación

1.3. Microorganismo: Streptococcus pneumoniae

Nombre:Slidex pneumo-kit. Referencia: 58821

Procedimiento

1. Dejar los reactivos a temperatura ambiente antes de utilizar

2. Homogenizar los reactivos que contengan látex

3. Medios sólidos: En dos portas depositar 1 gota de suero fisiológico y poner en

suspensión algunas colonias para obtener una suspensión opalescente

Medios de hemocultivos Bact/Alert: en dos portas depositar una gota de

sobrenadante

4. Depositar en un porta una gota de látex anti- S. pneumoniae (R1) y sobre el otro 1

gota de látex control (R2)

5. Mezclar con bastoncillos

6. Rotar durante 2 min

7. Leer


Positivo: aglutinación con el reactivo R1 a los 2 min y ausencia de aglutinación en R2

Negativo: ausencia de aglutinación en reactivos R1 y R2

Ininterpretable: R2 presenta aglutinación

Látex Microorganismo R1 R2

Streptococcus pneumoniae + - Otros - - Ininterpretable - +

2. Catalasa Procedimiento



1. Colocar con un asa una pequeña cantidad de un cultivo puro sobre un portaobjetos

limpio y seco

2. Colocar inmediatamente una gota de solución de peróxido de hidrógeno (agua

oxigenada) sobre el cultivo

3. Observar


Resultado positivo: aparición de burbujas de gas

Resultado negativo: no aparición de burbujas (permanece inalterado)

3. Coagulasa sobre portaobjetos (Coagulasa látex) Nombre: Slidex Staph Plus. Referencia: 73115/73116

Procedimiento

1. Atemperar los reactivos

2. Homogenizar los reactivos con látex

3. Sobre una tarjeta depositar 1 gota de reactivo R1

4. Agregar con un asa 2 colonias a la tarjeta y extender sobre la superficie del círculo

5. Mezclar durante 10 seg

6. Rotar durante 20 seg


Positivo: presencia de aglutinación

Negativo: ausencia de aglutinación

4. Coagulasa tubo Nombre: BBL TM Coagulase Plasmas. Referencia: 240658

Preparación del reactivo

Rehidratar el reactivo con 3 ml de agua destilada estéril

Mezclar mediante rotación suave e inversión del frasco

Procedimiento

1. Agregar 0.5 ml del reactivo rehidratado a un tubo estéril con tapón de rosca

2. Emulsionar un asa llena de colonias sospechosas en el tubo anterior

3. Mezclar suavemente

4. Incubar 4 h 37ºC

Interpretación de resultados:

Cualquier grado de coagulación se considera positiva



5. Hipurato Nombre: Hippurate. Referencia: 231723

Procedimiento

1. Inocular en un tubo con 2 ml de solución salina estéril una suspensión concentrada del

microorganismo en estudio

2. Añadir un disco de hipurato


4. Añadir el reactivo de ninhidrina antes de leer los resultados

5. Leer


Resultado positivo: aparición de color púrpura tras unos minutos

Resultado negativo: color transparente/blanquecino

6. TSI Nombre: Triple sugar iron agar. Referencia: 21367

Procedimiento

Tomar con un asa colonia pura y se inocula este medio marcando una estría sobre la

superficie del agar inclinado y perforando la parte inferior de la columna de agar hasta el

fondo del tubo

Interpretacion de resultados 1. Formación de gas: se visualiza como burbujas o fractura de la columna de medio, provocadas por la presión del gas formado dentro del agar

2. Fermentación de azúcares

a. Glucosa: un microorganismo fermentador de glucosa virará la zona de la estría y el

fondo del tubo inoculado a amarillo; si permanece de color rojo no fermenta este

azúcar.

b. Lactosa: un microoganismo que no fermente la lactosa en este medio la zona

inclinada presentará un color rojo, si la fermenta esta zona virará a amarillo.

3. Sulfuro de hidrógeno: aparece un precipitado negro que ennegrece el tubo y puede dificultar la visualización de la fermentación de azúcares

7. Indol

Procedimiento Se realiza al adicionar el reactivo de indol a la urea tras haber leído esta prueba




Resultado positivo: aparición de un halo rojo en la superficie del líquido

Resultado negativo: no se producen cambios

8. Movilidad Nombre: Urea motiliti indole. Referencia: 21372

Procedimiento

1. Se toma con un asa el microorganismo a estudiar

2. Se inocula punzando una vez el centro de la columna del medio de movilidad


Interpretación de resultados Resultado positivo: un crecimiento difuso que se extiende desde la línea de inoculación

9. Nitratos Nombre: Nitrate reduction. Referencia: 4372191

Procedimiento



2. Añadir una tableta de NITRATOS


4. Añadir los reactivos de NIT1 y NIT2.


Resultado positivo: aparición de color rojo

Resultado negativo: color transparente/blanquecino

10. ONPG (O-Nitrofenil-Beta-galactopiranósido) Nombre: ONPG. Referencia: 231248

Procedimiento



2. Añadir un disco de ONPG



Resultado positivo: aparición de color amarillo

Resultado negativo: no se modifica el color



11. Ornitina Nombre: Ornithine carboxylase. Referencia: 56757011

Procedimiento



2. Añadir una tableta de ORNITINA



Resultado positivo: aparición de color morado

Resultado negativo: color transparente/azul claro

12. Oxidasa Nombre: Bactident oxidase. Referencia: 1.133.00.0001

Procedimiento

1. Tomar un asa de colonia del microorganismo a estudiar y depositarla sobre el papel de

filtro que se encuentra en el extremo de la tira comercial empleada para esta prueba

2. Frotar el asa con la colonia sobre este papel de filtro


Reacción positiva: Vira a color púrpura en 10 seg

Limitaciones

No leer tras 30 seg, pues son falsos positivos. También se observan falsos positivos en

colonias muy mucosas 13. Porfirina

Nombre: Porphyrin. Referencia: 56757321

Procedimiento



2. Añadir una tableta de PORFIRINA



Adicionar el reactivo de INDOL

Positivo: aparición de color rosa pálido tras unos minutos

Negativo: color transparente/blanquecino



14. Rosa de Bengala Nombre: Brucelloslide test. Referencia: 72691

Procedimiento 1. Atemperar sueros y reactivos

2. En un círculo de la tarjeta depositar 30 µl de antígeno homogeneizado y 30 µl de suero

3. Mezclar en un agitador

4. Proceder de igual forma con el congtrol positivo

5. Agitar lentamente la tarjeta durante 4 min exactos

Interpretación de resultados Reacción positiva: Se observa aglutinacíon, aunque sea mínima

Reaccion negativa: Ausencia de aglutinación

15. Streptest Nombre: Prolex TM Streptococcal Grouping Latex kit for identification of Groups A, B, C, D,

F or G Streptoccoci. Referencia: 5028300PL050

Procedimiento

1. En un tubo depositar 1 gota del reactivo 1 (Reagent Extraction)

2. Añadir al tubo la colonia problema

3. Añadir al tubo anterior una gota de reactivo 2 (Reagent Extraction)

4. Esperar 5 minutos

5. En una cartulina depositar sobre cada círculo una gota con partículas de látex

correspondientes a cada grupo de estreptococo

6. Añadir al tubo problema 5 gotas de reactivo 3 ( Reagent Extraction)

7. Mezclar una gota de colonia sospechosa con cada una de las partículas de látex de la

cartulina correspondientes diferentes grupos de estreptococos


Resultado positivo: Aparición de aglutinación en algún grupo de estreptococo

16. Test de filamentación

Procedimiento 1. Poner en un tubo con suero 0,5 ml de humano un inóculo pequeño de colonias de

levadura

2. Se incuba 2-3 h (>3 h cualquier levadura filamenta) a 37ºC

Interpretación de resultados Se deposita una gota de este tubo en un portaobjetos, colocamos un cubreobjetos y se

observa al microscopio 40x la presencia de tubos germinativos.



Tubo germinativo (+): apéndice la mitad de ancho y de 3-4 veces el largo de la célula

del cual emerge → Candida albicans

Tubo germinativo (-) → Candida sp. Se realizará una galeria de identificación, API

levaduras y/o una siembra en agar cromogénico para su identificación final

17. Tributirina

Nombre: Tributyrin. Referencia: 56748821

Procedimiento

1. En un tubo estéril con 2 ml de suero fisiológico se realiza una suspensión 5 McFarland

de las colonias a estudiar

2. Introducir en dicho tubo una tableta de tributirina

3. Incubar 24 h 37ºC en aerobiosis

Interpretación de resultados Tributirina (+): color amarillo limón → Moraxella catharralis

Tributirina (-): color anaranjado → Neisseria sp u otros microorganismos

18. Urea

Nombre: Urea/Indole. Referencia: 56757611

Procedimiento



2. Añadir una tableta de urea



Positivo: aparición de color rosa

Negativo: color transparente/amarillo pálido



Antibiogramas manuales (AB) Documento científico

Métodos de difusión

1. Método del antibiograma disco-placa

1.1. Fundamento

1.2. Indicaciones y limitaciones

2. Método del E-test

2.1. Fundamento


Documento técnico

1. Propósito y alcance

2. Principio del método.

3. Materiales necesarios: 4. Conservación

5. Procedimiento

6. Incubación

7. Lectura e interpretación de los resultados

8. Antimicrobianos seleccionados

9. Bacterias decrecimiento difícil

Anexos 1. Haemophillus influenzae/parainfluenzae

2. Neisseria gonorrhoeae

3. Neisseria meningitidis

4. Moraxella catarrhalis

5. Streptococcus pneumoniae

6. Staphylococcus spp

7. Streptococcus spp

8. Corinebacterium spp

9. Bacilos Gram Negativos no fermentadores

10. Bacilos Gram Negativos fermentadores



11. Campylobacter spp

El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos es una de las

funciones más importantes de los laboratorios de microbiología clínica. Su realización se

desarrolla mediante las pruebas de sensibilidad o antibiograma, cuyo principal objetivo es

evaluar en el laboratorio la respuesta de un microorganismo a uno o varios antimicrobianos,

traduciendo, en una primera aproximación, su resultado como factor predictivo de la eficacia

clínica. El antibiograma define la actividad in vitro de un antibiótico frente a un microorganismo

determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una bacteria o población

bacteriana. Los métodos de difusión son muy utilizados y aceptados para el estudio de la

sensibilidad

Métodos de difusión

1. Método del antibiograma disco-placa

1.1.- Fundamento

El antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores es

uno de los métodos que CSLI recomienda para la determinación de la sensibilidad bacteriana a

los antimicrobianos. El antibiograma disco-placa consiste en depositar, en la superficie de agar

de una placa de petri previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel secante

impregnados con los diferentes antibióticos. Tan pronto el disco impregnado de antibiótico se

pone en contacto con la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibiótico

difunde al agar. El antibiótico difunde radialmente a través del espesor del agar a partir del

disco formándose un gradiente de concentración. Transcurridas 18-24 horas de incubación los

discos aparecen rodeados por una zona de inhibición. La concentración de antibiótico en la

interfase entre bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas se conoce como concentración

crítica y se aproxima a la concentración mínima inhibitoria (CMI) obtenida por métodos de

dilución. Sin embargo, los métodos disco-placa no permiten una lectura directa del valor de la

CMI. Unos diámetros de inhibición, expresados en mm, estandarizados para cada

antimicrobiano nos indicarán la sensibilidad del microorganismo .


El método de disco-placa es fácil de realizar, rápido y barato. Es una metodología

aplicable a una amplia variedad de bacterias, fundamentalmente bacterias aerobias no

exigentes de crecimiento rápido como Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp.,

Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Acinetobacter spp., Staphylococcus spp.



y Enterococcus spp, además, con ligeras modificaciones, puede ser aplicado a Haemophilus

spp., Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae y Streptococcus spp.

2. Método del E-test 2.1. Fundamento

En el método E-test (AB Biodisk, Suecia) podemos, mediante lectura directa, determinar

la concentración inhibitoria mínima (CMI). Consiste en una tira de plástico no poroso de 6 cm

de largo por 5 mm de ancho que incorpora un gradiente predefinido de antimicrobiano

equivalente a 15 diluciones. El protocolo para preparar el inóculo es el mismo que para la

difusión en disco. Siguiendo el método de difusión, una vez inoculado la placa de agar con el

microorganismo, se coloca la tira de E-test sobre su superficie, produciéndose de forma

inmediata una difusión del antibiótico desde el soporte hasta el agar, creándose de este modo

a lo largo de la tira un gradiente exponencial de las concentraciones del antimicrobiano. Tras la

incubación de las placas, se puede observar una zona de inhibición elipsoidal y simétrica.

Después de la incubación la CMI será el valor obtenido en el punto en el que el extremo de

inhibición intersecciona con la tira.


En contra de lo que ocurre en la difusión en disco donde la orientación del disco no

importa, si colocamos la tira al revés no se observa elipse de inhibición ya que el gradiente de

concentraciones se situa solo sobre una de las caras de la tira. El E-test se ha utilizado para

determinar la CMI de diversos antibióticos en una amplia gamma de bacterias, incluyendo

Helicobacter pylori, Corynebacterium spp., estreptococos nutricionalmente deficientes,

enterococos con resistencia elevada a aminoglicósidos.

En algunos casos como vancomicina y S. pneumoniae, la CMI es más alta utilizando el

E-test que la obtenida por los métodos de microdilución, produciendo resultados que se

encuentran en el rango superior de aislamientos susceptibles y con resultados de control de

calidad por encima de los límites aceptables.

El E-test se considera como un método alternativo para el estudio cuantitativo de la

sensibilidad antimicrobiana del que cabe destacar su sencillez y buena correlación con la

técnica estándar de dilución en agar para el estudio de la CMI.



1. Propósito y alcance

El objetivo de este documento es describir el método empleado para determinar la sensibilidad

antibiótica de los microorganismos que se detallarán posteriormente. Utilizamos el método de difusión en

agar, con discos y tiras de E-test.

2. Principio del método.

Un inóculo estandarizado de un microorganismo se extiende sobre la superficie de

placas de agar Müeller-Hinton u otro agar, y en ella se colocan discos impregnados de

antibióticos o tiras de E-test.

1. Discos de papel de filtro impregnados con antibióticos:

Se colocan sobre el agar y después de una adecuada incubación medimos el diámetro

de la zona de inhibición alrededor de cada disco. El tamaño de la zona de inhibición es

inversamente proporcional a la concentración mínima inhibitoria (CMI) del microorganismo. Nos

basamos en las recomendaciones de la CLSI para informar como sensible, intermedio o

resistente.

2. Determinación de la CMI mediante tiras reactivas de E-test:

Se colocan sobre el agar y después de una adecuada incubación de las placas se

puede observar una zona de inhibición elipsoidal y simétrica. La CMI será el valor obtenido en

el punto en el que el extremo de inhibición intersecciona con la tira.

3. Materiales necesarios: 3.1. Placas de agar Müeller-Hinton, agar sangre, agar chocolate…

3.2. NaCl 0.85% estéril.

3.3. Discos antimicrobianos o tiras de E-test; usar discos que contengan la concentración

de antibiótico especificada en el documento de la CLSI. Almacenar los discos para

cortos periodos de tiempo a 2-8ºC; y para largos periodos de tiempo a -20ºC. Las tiras

de E-test se mantienen a -20ºC. Tras sacar los discos o tiras de E-test esperar a que

alcancen la Tª ambiente antes de usarlos. No usar después de la fecha de caducidad.

10. Torundas estériles de algodón.

11. Pipetas Pasteur estériles.

12. Turbidez estándar de 0.5 McFarland.

13. Pinzas.

14. Regla, para medir la zona de inhibición.



15. Fuente de luz movible.

16. Superficie negra no reflectante.

17. Vórtex.

18. Aparato dispensador de multidiscos.

4. Conservación

4.1 Discos

Se deben guardar a 4ºC y dejarlos a temperatura ambiente 1 hora antes de utilizarlos.

Los discos se congelarán si son antimicrobianos beta-lactámicos y ha de transcurrir más de

una semana hasta su utilización. Por regla general, se recomienda reemplazar los discos

de beta-lactámicos que están refrigerados con aquellos que se encuentran congelados. El

deterioro de los discos ocurre si son sometidos a humedad o a frecuentes fluctuaciones de

temperatura. En el caso de utilizar dispensador, éste debe tener una tapa muy ajustada y

un desecante, que será substituido cuando por exceso de humedad cambie de color el

indicador. El dispensador debe mantenerse refrigerado cuando no se vaya a utilizar.

4.2. E-test

Deben almacenarse a -20ºC. En todo momento las tiras de E-test deben estar

protegidas de la humedad. Antes de utilizar se deben atemperar a temperatura ambiente

durante por lo menos 30 minutos.

5. Procedimiento

Sacar las placas y los discos o tiras de E-test a Tª ambiente antes de su uso y dejar que se

atemperen (Evitar exponerlos a temperaturas elevadas durante largo tiempo)

5.1. Preparación del inóculo:

Usando un asa o una torunda se cogen varias colonias de un cultivo fresco y se hace

una suspensión en suero salino estéril.

Ajustar la turbidez de la suspensión a una turbidez estándar de 0.5 McFarland (que se

corresponde con 1.5x108 UFC/ml).

Vórtex 15-20 segundos para que se mezcle.

5.2. Inoculación de placas

Antes de que transcurran 15 minutos de haber ajustado el inóculo a 0.5 McFarland,

introducir una torunda de algodón dentro de la suspensión y al retirarla rotar contra la pared

superior del tubo por encima del nivel del líquido para eliminar el exceso de inóculo.



Inocular las placas, sin dejar ninguna zona libre, deslizando el escobillón por la

superficie del agar 3 veces, rotando la placa 60º para asegurar una siembra uniforme.

Evitar dar contra los lados de la placa petri y crear aerosoles.

Dejar secar la placa ya inoculada de 3-5 minutos, pero no más de 15, antes de poner

los discos.

5.3. Dispensación de antibióticos

5.3.1 Discos

Aplicar los discos o tiras de E-test en la superficie del agar usando un dispensador o unas pinzas estériles.

Presionar suavemente con las pinzas para asegurar un completo contacto del disco o tira con el agar.

No recolocar un disco una vez que ha contactado con la superficie del agar porque la

difusión del antibiótico comienza instantáneamente.

Incubar las placas dentro de los 15 minutos desde la aplicación de los discos.

Apilar las placas invertidas en grupos de cinco.

5.3.2. Tiras de E-test

Nos debemos asegurar que la escala de CMI está orientada hacia arriba y que la

concentración máxima está cercana al extremo de la placa de petri..

Asegurarse que la tira contacta completamente con la superficie del agar. Si es

necesario, eliminar las gotas de aire que puedan encontrarse por debajo de la tira

presionándola ligeramente con las pinzas. Es importante no mover las tiras una vez que

han sido colocadas en la superficie del agar ya que el antibiótico empieza

a difundir rápidamente. En placa de petri de 100 mm depositar solo una tira por placa y

poner la tira en el centro de la placa.

6. Incubación Incubar 16-18 h 37ºC.

7. Lectura e interpretación de los resultados

7.1.-Discos

Después de 18 horas de incubación leer el diámetro de las zonas de completa inhibición

con una regla. Si el microorganismo es un estafilococo o un enterococo debemos esperar

24 horas para asegurar la sensibilidad a la oxacilina y vancomicina. Las zonas de los

medios transparentes se miden sobre el reverso de la placa y los medios que contienen

sangre sobre la superficie del agar. En las pruebas de sensibilidad a meticilina en



estafilococos el halo alrededor de la oxacilina debe observarse utilizando luz transmitida

para visualizar las colonias diminutas.

Comparando los diámetros del halo de inhibición con las CMIs, y estableciendo las

correspondientes rectas de regresión, se han fijado unos criterios para clasificar las cepas

estudiadas. De esta forma se han fijado tres categorías: sensible (S), intermedia (I) y

resistentes (R). Las interpretaciones seguirán las normas establecidas por el CSLI.

El término sensible indica que la infección ocasionada por la cepa para la que se ha

determinado la CMI o su correspondiente halo de inhibición puede tratarse de forma

adecuada empleando las dosis habituales de antimicrobiano, en función del tipo de

infección y de la especie considerada.

El término intermedio indica que el halo de inhbición traducido en valores de CMI se

aproxima a las concentraciones de antimicrobiano alcanzables en sangre o tejidos y que

puede esperarse eficacia clínica en aquellas localizaciones en las que se alcanzan altas

cocentraciones de antimicrobiano (p. ej. orina) o cuando se emplean dosis más elevadas de

lo habitual. CSLI también incluye en esta categoría aquellos casos de antimicrobianos con

márgenes de toxicidad estrechos en los que pequeños errores técnicos podrían suponer

cambios de interpretación en la categoría clínica.

El término resistente se refiere a aquellos microorganismos que no se inhiben por las

concentraciones habitualmente alcanzadas en sangre/tejidos del correspondiente

antimicrobiano, o a aquellos microorganismos en los que existen mecanismos de

resistencias específicos para el agente estudiado en los que no ha habido una adecuada

respuesta clínica cuando se ha usado como tratamiento el correspondiente antimicrobiano.

7.2. E-test:

Leer la CMI en el punto de intersección entre el extremo de inhibición de la elipse y la

tira de E-test. Cuando el crecimiento tiene lugar a lo largo de toda la tira y no se observa

formación de la elipse de inhibición, la CMI se informará como superior al valor máximo de

la escala de lectura y, por el contrario, cuando la elipse de inhibición se encuentre por

debajo de la tira debe ser informado como inferior al valor mínimo de la escala de lectura.

Con ciertas combinaciones de bacterias-antibióticos, el extremo de la elipse de inhibición

puede ser difuso. Debemos mencionar una serie de consideraciones sobre la lectura de los

resultados, a saber:



7.2.1. Cuando la CMI coincide entre dos marcas de la tira se informará el resultado

correspondiente al valor superior.

7.2.2. Si se observan intersecciones diferentes del crecimiento bacteriano en ambas

partes de la tira, debemos informar el valor de CMI más alto si la diferencia entre los dos

valores no es superior a la mitad de un paso de dilución doble. Por ejemplo, si la CMI en un

lado de la tira es 8 y en el otro es 12, deberemos informar 12. Sin embargo, si en un lado es

8 y en otro lado 16 debemos repetir la determinación.

7.2.3. Para S. maltophilia o Enterococcus spp., pueden aparecer colonias pequeñas en

la zona de inhibición, por lo que se debe considerar como resistente.

7.2.1. Cuando se lea la intersección de la elipse con las tiras de sulfamidas, trimetoprim o cotrimoxazol, deberemos leer la intersección en la zona de crecimiento denso y no considerar la existencia de crecimiento en la zona poco densa.

7.2.2.Si se observan colonias grandes en la zona de inhibición puede representar un cultivo mixto o variantes resistentes. Debemos repetir el test a partir de colonias del cultivo primario. Si volvemos a observar el mismo patrón, se tienen que subcultivar las colonias que crecen en la zona de inhibición, identificarlas y volver a realizar el E-test. Si obtenemos el mismo resultado y el cultivo es puro, debemos informar como resistente.

7.2.2.Utilizando los puntos de corte actuales para S. pneumoniae y penicilina una cepa

que es resistente por el método de dilución en agar (CMI >2 µg/ml) puede ser categorizada

como intermedia (CMI = 0,25 a 1,0 µg/ml) por E-test. En estos casos cuando encontramos

una cepa con CMI de 1 µg/ml por el método E-test, se recomenda confirmar la CMI por un

método alternativo. Se ha observado una relación directamente proporcional entre los

valores de E-test y los valores de referencia de la CSLI obtenidos por dilución en agar, los

puntos de corte de la CMIs serán apropiados para categorizar la bacteria estudiada como

sensible, intermedia o resistente.

8. Antimicrobianos seleccionados

Es evidente la imposibilidad de ensayar un gran número de antimicrobianos frente a un

microorganismo determinado. Los antibióticos seleccionados para cada grupo de

microorganismos se detallan en los anexos de este documento.

9. Bacterias de crecimiento difícil Son bacterias que requieren para su crecimiento sustancias nutritivas suplementarias y

otros medios equivalentes que están debidamente estandarizados para las pruebas de

sensibilidad, ya sea por dilución o difusión.

9.1. Haemophilus: Agar HTM

9.2. Neisseria gonorrhoeae/meningitidis: Agar Müeller-Hinton con 5% sangre



9.3. Streptococcus spp: Agar Müeller-Hinton con 5% sangre

9.4. Corynebacterium spp: Agar Müeller-Hinton con 5% sangre

ANTIBIOGRAMA DIFUSIÓN DISCO-PLACA. (Agar HTM)

MICROORGANISMOS: Haemophilus influenzae/ parainfluenzae.

Nº DE MUESTRA:

TEST DE β-LACTAMASA:

Difusión en disco:

Antibiótico Carga (mcg) Resultado

Ampicilina (AM) .....................................10 ..................................

Amoxi/clavulánico (AMC) ................... 20/10 ................................

Cefuroxima (CXM).................................30 ..................................

Cefotaxima (CTX)..................................30 ..................................

Claritromicina (CLR)..............................15 ..................................

Ciprofloxacino (CIP) ...............................5 ...................................

Septrim (SXT)................................. 1.25/23.75 ............................

Rifampicina (Ri)..................................... .5 ...................................

Tetraciclina (Te) ....................................30 ..................................



ANTIBIOGRAMA DIFUSIÓN DISCO-PLACA (Agar Müeller-Hinton con 5% sangre)

MICROORGANISMO: Neisseria gonorrhoeae.

Nº DE MUESTRA:


Difusión en disco:


Ampicilina (AM) 10 Ceftriaxona (CRO)................................ 30 ..................................

Ciprofloxacino (CIP)................................5 ...................................

Espectinomicina ...................................100 .................................

Tetraciclina (TE) ....................................30 ..................................

Difusión en E-test:

Antibiótico Resultado

Penicilina (PG) .................................................

Cefotaxima (CT) ...............................................

ANTIBIOGRAMA DIFUSIÓN DISCO-PLACA (MH con Sangre)

MICROORGANISMO: Neisseria meningitidis.

Nº DE MUESTRA:


Difusión en disco:




Ampicilina (AM) 10 Ceftriaxona (CRO).................................30 ..................................


Septrim (SXT)................................. 1.25/23.75 ............................

Rifampicina (Ri)......................................5 ...................................



Penicilina (PG) .................................................

Cefotaxima (CT) ...............................................

ANTIBIOGRAMA DIFUSIÓN DISCO-PLACA. (Agar Sangre)

MICROORGANISMO: Moraxella catarrhalis.

Nº DE MUESTRA:


Difusión en disco:


Ampicilina (AM) .....................................10 ..................................

Amoxi/clavulánico (AMC) 20/10 Cefuroxima (CXM).................................30 ..................................

Cefotaxima (CTX)..................................30 ..................................

Claritromicina (CLR)..............................15 ..................................

Ciprofloxacino (CIP) ...............................5 ...................................

Septrim (SXT)................................. 1.25/23.75 ............................

Rifampicina (Ri)..................................... .5 ...................................

Tetraciclina (Te) ....................................30 ..................................




MICROORGANISMO: Streptococcus pneumoniae

Nº DE MUESTRA: Difusión en disco:


Penicilina (PG).................................... 10 UI ................................

Ampicilina (AM) .....................................10 ..................................

Oxacilina (OX) No Informar ..................1 ...................................

Cefotaxima (CTX) ................................. 30 ..................................

Eritromicina (E).................................... .. 15 .................................

Clindamicina (CC) ................................. 2 ...................................

Levofloxacino (LVX) ...............................5 ...................................

Septrim (SXT)................................. 1.25/23.75 ............................

Rifampicina (RD) ....................................5 ...................................

Tetraciclina (TE) ....................................30 ..................................

Vancomicina (VA) ..................................30 ..................................



Penicilina (PG) .................................................

Cefotaxima (CT) ...............................................



ANTIBIOGRAMA DIFUSIÓN DISCO-PLACA (Agar MH)

MICROORGANISMO: Staphylococcus spp. Nº DE MUESTRA:

Difusión en disco:


Penicilina (PG).................................... 10 UI ................................

Ampicilina (AM) .....................................10 ..................................

Oxacilina (OX) .....................................1 ...................................

Cefalotina (CF) ......................................30 ..................................

Cefotaxima (CTX) ..................................30 ..................................

Imipenem (IMP) .....................................10 ..................................

Eritromicina (E)......................................15 ..................................

Clindamicina (CC) ..................................2 ...................................


Septrim (SXT)................................. 1.25/23.75 ............................

Rifampicina (Ri)......................................5 ...................................

Tetraciclina (TE) ....................................30 ..................................

Vancomicina (VA) ..................................30 ..................................

Antibióticos urinarios:

Fosfomicina (FF) ..................................200 .................................

Nitrofurantoína (Fd) ..............................300 .................................




.

MICROORGANISMO: Streptococcus spp.

Nº DE MUESTRA:


Ampicilina (AM)......................................10 ..................................

Eritromicina (E) ......................................15 ..................................

Clindamicina (CD)...................................2 ...................................

Vancomicina (VA) ..................................30 ..................................


Tetraciclina (TE) ..................................30 ..................................

Rifampicina (RD) ....................................2 ...................................

Antibióticos de información opcional:

Linezolid ( )...........................................30 ..................................

Imipenem (IMP) .....................................10 ..................................


Penicilina (PG) .................................................

Cefotaxima (CT) ...............................................


Fosfomicina (FF) ..................................200 .................................





.

MICROORGANISMO: Corynebacterium spp. AISLAMIENTO:

Nº DE MUESTRA: Antibiótico Carga (mcg) Resultado

Penicilina (PG) ................................... 10 UI ................................

Ampicilina (AM)......................................10 ..................................

Cefalotina (CF) ......................................30 ..................................

Cefotaxima (CTX) ..................................30 ..................................

Eritromicina (E) ......................................15 ..................................

Clindamicina (CD)...................................2 ...................................

Vancomicina (VA) ..................................30 ..................................

Gentamicina (GM) .................................10 ..................................


Tetraciclina (TE) ..................................30 ..................................

Rifampicina (RD) ....................................2 ...................................

Septrim (SXT)................................. 1.25/23.75 ............................

Antibióticos de información opcional:

Linezolid ( )...........................................30 ..................................

Imipenem (IMP) .....................................10 ..................................


Fosfomicina (FF) ..................................200 .................................




ANTIBIOGRAMA DIFUSIÓN DISCO-PLACA DE

BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES. (Agar MH)

MICROORGANISMO:

AISLAMIENTO:

Nº DE MUESTRA:


Piperacilina (Pi).....................................100 .................................

Piperacilina/tazobactam (PTc) .............100 .................................

Cefotaxima (CTX) ..................................30 ..................................

Ceftazidima (CAZ).................................30 ..................................

Aztreonam (AZM) .................................30 ..................................

Imipenem (IMP) .....................................10 ..................................

Meropenem(MEM) ................................10 ..................................

Gentamicina (GM) .................................10 ..................................

Amikacina (AK)......................................30 ..................................

Tobramicina (TO) ..................................10 ..................................


Septrim (SXT)................................. 1.25/23.75 ............................

* En Acinetobacter spp. añadir a los anteriores:

Colistina (CL).........................................10 ..................................

Ampicilin/Sulbactam (SAM)................ 10/10 ................................


Fosfomicina (FF) ..................................200 .................................




ANTIBIOGRAMA DIFUSIÓN DISCO-PLACA DE

BACILOS GRAM NEGATIVOS FERMENTADORES. (Agar MH)

MICROORGANISMO:

AISLAMIENTO:

Nº DE MUESTRA:


Ampicilina (Am)......................................10 ..................................

Piperacilina (Pi).....................................100 .................................

Amoxi/Clavulánico (AMC) .................. 20/10 ................................

Cefalotina (CF) ......................................30 ..................................

Cefuroxima (CFX) .................................30 ..................................

Cefoxitina (FOX)....................................30 ..................................

Cefotaxima (CTX) ..................................30 ..................................

Ceftazidima (CAZ).................................30 ..................................

Aztreonam (AZM) .................................30 ..................................

Imipenem (IMP) .....................................10 ..................................

Gentamicina (GM) .................................10 ..................................

Amikacina (AK)......................................30 ..................................

Tobramicina (TO) ..................................10 ..................................


Septrim (SXT)................................. 1.25/23.75 ............................


Fosfomicina (FF) ..................................200 .................................





MICROORGANISMO: Campylobacter

Nº DE MUESTRA:

Difusión en disco:


Eritromicina (E)......................................15 ..................................


Azitromicina (AZM)................................15 ..................................

Moxifloxacino (MO) ................................5 ...................................



PRUEBAS DE SENSIBILIDAD COMPLEMENTARIA (SC)

1.- Test de la beta-lactamasa 2.- Beta-Lactamasas de Espectro Ampliado (BLEAs) 3.- Resistencia a macrólidos y lincosamidas



Test de la beta-lactamasa 1. Propósito y alcance

En este documento se describe el método empleado para detectar la resistencia a

penicilina, amoxicilina y ampicilina en microoganismos como H. influenzae, M. catarrhalis , N.

gonorrhoeae, Bacteroides, Staphylococcus y Enterococcus.

2. Fundamento

Uno de los procedimientos más frecuentemente utilizado para detectar la producción

bacteriana del enzima beta-lactamasa es el método de la cefalosporina cromogénica. Se basa

en la detección visual de los productos finales de la hidrólisis de la beta-lactamasa, lo cual se

demuestra con una reacción colorimétrica.

Método de la cefalosporina cromogénica: Normalmente se usan discos de papel de filtro impregnados con “nitrocefin”, una

cefalosporina cromogénica. La beta-lactamasa hidroliza la unión amida en el anillo de los

antibióticos betalactámicos y produce un cambio de color en cuestión de segundos en

algunos microorganismos.

Una reacción positiva aparece si el disco cambia de amarillo a rojo en la zona donde la

bacteria ha sido depositada.

3. Materiales 1. Discos de Cefinasa (almacenar a 2-8ºC)

2. Agua destilada

3. Portaobjetos o placas petri vacías

4. Pipetas Pasteur

5. Asas estériles

4. Procedimiento: 4.1. Colocar el/los discos en un portaobjetos o en una placa petri.

4.2. Humedecer cada disco con una gota de agua destilada estéril.

4.3. Usando un asa estéril o similar, coger varias colonias bien aisladas y de igual

morfología de una placa de agar y colocarlas sobre la superficie del disco de Cefinasa.



4.4. Observar el cambio de color. Normalmente un resultado positivo aparece entre los 15

segundos y 5 minutos. Si no cambia de color en los primeros 5 minutos se considera el

test negativo.

Positivo: amarillo cambia a rojo.

Negativo: no cambia de color.

5. Informe de resultados Test de beta-lactamasa positiva: informar resistencia a amoxicilina, ampicilina y penicilina.

Test de la beta-lactamasa negativa: informar sensibilidad a amoxicilina, ampicilina y penicilina.

Beta-Lactamasas de Espectro Ampliado (BLEAs)

1. Propósito y alcance En este documento se describe uno de los procedimientos manuales empleados en la

detección de beta-lactamasas de espectro ampliado (BLEAs): técnica de la doble difusión con

discos o técnica de la sinergia del doble disco.

2. Fundamento Las beta-lactamasas de espectro extendido (BLEE) son un grupo de enzimas de

codificación plasmídica derivadas de las beta-lactamasas clásicas que presentan:

1. Resistencia a amino y ureidopenicilinas (similar a las betalactamasas clásicas).

2. Resistencia a cefalosporinas de tercera generación, excepto cefamicinas (cefoxitina).

3. Resistencia a monobactámicos (aztreonam),

4. No afectan a carbapenemes (imipenem, meropenem...)

5. La acción hidrolítica de estas enzimas se ve contrarrestada por los inhibidores de las

beta-lactamasas (ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam).

Los microorganismos donde más frecuentemente aparece este tipo de resistencia

enzimática son Klebsiella pneumoniae y E. coli, aunque también se han identificado en otras

especies de BGN como Proteus, Serratia o Salmonella spp.

3. Materiales

1. Discos de antibióticos: amoxicilina/clavulánico, cefotaxima, cefuroxima, aztreonam y

ceftazidima.

2. Solución salina estéril.



3. Placas de Müeller-Hinton.

4. Tubos estériles.

5. Asas estériles.

6. Torundas de algodón

4. Procedimiento Realizamos una suspensión bacteriana ajustada a una concentración 0.5 MacFarland e

inoculamos una placa de agar Mueller-Hinton mediante el método de difusión en disco.

Colocamos discos con carga estándar (30 mcg) de cefotaxima, ceftazidima, aztreonan y

cefuroxima dispuestos a una distancia de 25-30 mm del disco de amoxicilina/ácido clavulánico

(20/10); es decir, el disco de amoxicilina/clavulánico se pone en el centro y el resto alrededor a

la distancia ya mencionada.

Incubamos 24 horas a 37ºC.

5. Lectura de resultados Se considera que existe sinergia, y por tanto, presencia de una BLEE, cuando se

observa una ampliación del halo de inhibición en alguna cefalosporina o en el aztreonam

(efecto similar a un embudo).



Resistencia a macrólidos y lincosamidas

1. Propósito y alcance En este documento se describe un método manual empleado para la detección

resistencia a macrólidos-lincosamidas de los estafilococos y enterococos.

2. Fundamento:

Se realiza para detectar la resistencia a macrólidos-lincosamidas de los estafilococos y

enterococos que puede ser de 3 tipos:

Constitutiva

Inducible

Fenotipo M.

3. Materiales

1. Discos de antibióticos: eritromicina y clindamicina

2. Solución salina estéril.

3. Placas de Müeller-Hinton.

4. Tubos estériles.

5. Asas estériles.

6. Torundas de algodón

4. Procedimiento Realizamos una suspensión 0.5 MacFarland y sembramos una placa de agar Muller-

Hinton.

Colocamos los discos de eritromicica (15 mcgr.) y de clindamicina (2 mcgr ) a una

distancia de 2.5-3 cm.

Incubamos a 35-37ºC en atmósfera 37ºC.

5. Resultados:

a. Resistencia constitutiva (la más frecuente):

i. Eritromicina = resistente

ii. Clindamicina = resistente.

b. Resistencia inducible:




ii. Clindamicina = sensible, pero con achatamiento en el borde próximo a la

acción de la eritromicina.

c. Resistencia fenotipo M:


ii. Clindamicina = sensible, sin achatamiento en el borde cercano a la

acción de la eritromicina.

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