Improved Solid-Phase Extraction Method for SystematicToxicological Analysis

in Biological Fluids

PRINSIP KERJA

Penetapan kadar senyawa asam, netral dan basa yang diekstraksi dari cairan biologis

dengan SPE kolom C8-kation exchange dan dideteksi dengan menggunakan GC-NPD

TINJAUAN SIFAT FISIKO KIMIA SENYAWA TARGET

Senyawa target : Senyawa asam, netral dan basa.

Senyawa pengotor : - Dalam darah : protein, metabolit dan sel darah

- Dalam urin : metabolit

Medium : cairan biologis (darah dan urin)

Tinjauan Sifat Fisiko Kimia

Senyawa Asam, contohnya phenobarbital, fenitoin dan internal standar (alobarbital)

- Phenobarbital

- pKa : 7,4

- Kelarutan : Larut dalam 1000 bagian air; 8 bagian etanol; 40 bagian

kloroform; 13 bagian eter; 700 bagian benzena

- Jarak Lebur : 174-178 °C

- Fenitoin

- pKa : 8,3

- Kelarutan : Praktis tidak larut dalam air; larut dalam 60 bagian

etanol; 500 bagian kloroform; 30 bagian aseton; 600

bagian eter

- Jarak Lebur : 295-298 °C

- Alobarbital

- pKa : 7,8

- Kelarutan : Larut dalam 700 bagian air; 15 bagian etanol; 20 bagian

eter; larut dalam larutan basa

- Jarak Lebur : 173 °C

Senyawa Basa, contohnya morfin, MDMA, kokain, diazepam, lidokain dan internal

standar (nalorphine, trihexylamine dan prazepam)

- Morfin

- pKa : 8 dan 9,9

- Kelarutan : 1 bagian larut dalam 17,5 bagian air, dalam 100 bagian

etanol, sangat mudah larut dalam campuran kloroform-

isopropanol dan praktis tidak larut dalam eter

- Jarak Lebur : 254-256°C

- MDMA

- pKa : Pada pH 9 dalam benzene (9,41), hexane (8,69), etil

asetat (8,84)

- Kelarutan : larut dalam etil asetat, benzen, dan heksan

- Jarak Lebur : 100-110 °C

- Kokain

- pKa : 8,6

- Kelarutan : Larut dalam 600 bagian air; 6,5 bagian etanol; 0,7 bagian

kloroform; 3,5 bagian eter; larut dalam etil asetat dan

aseton

- Jarak Lebur : 98 °C

- Diazepam

- pKa : 3,3

- Kelarutan : Sedikit larut dalam air; larut dalam 25 bagian etanol; 2

bagian kloroform; 39 bagian eter

- Jarak Lebur : 131-135 °C

- Lidokain

- pKa : 7,9

- Kelarutan : Tidak larut dalam air; larut dalam etanol, kloroform,

benzena dan eter

- Jarak Lebur : 68-69 °C

- Nalorphine

- pKa : 7,8

- Kelarutan : Agak sukarlarut dalam air dan eter; larut dalam etanol,

aseton dan kloroform

- Jarak Lebur : 208 °C

- Trihexylamine

- pKa : -

- Kelarutan : -

- Jarak Lebur : <75 °C

- Prazepam

- pKa : 2,7

- Kelarutan : Larut dalam etanol dan kloroform

- Jarak Lebur : 145-146°C

SKEMA KERJA

pH diatur agar berada dalam rentang 4-

4,5, divortex kemudian dipanaskan pada

suhu 60-65ºC selama 2 jam

pH diatur agar berada dalam rentang 4-

4,5, divortex kemudian dipanaskan pada

suhu 60-65ºC selama 2 jam

+ 0,1 ml Internal Standar

Sampel BiologisSampel Biologis

AsamAsam BasaBasa

Pretreatment Sampel

Sifat Analit

Khusus sampel urin, terlebih

dahulu dihidrolisis dengan

penambahan enzim β-

glucuronidase

Khusus sampel urin, terlebih

dahulu dihidrolisis dengan

penambahan enzim β-

glucuronidase

Disonifikasi selama 10 menitDisonifikasi selama 10 menit

Seluruh jenis sampel dilarutkan dalam 1

ml aquadest

Seluruh jenis sampel dilarutkan dalam 1

ml aquadest

pH diatur agar berada dalam rentang 8-

8,5 dengan penambahan dapar fosfat pH

8

pH diatur agar berada dalam rentang 8-

8,5 dengan penambahan dapar fosfat pH

8

+ 0,1 ml Internal Standar

Dilarutkan dalam 1 ml dapar

fosfat pH 6

Dilarutkan dalam 1 ml dapar

fosfat pH 6

Disonifikasi selama 10

menit

Disonifikasi selama 10

menit

pH diatur agar berada dalam

rentang 6-6,5 dengan

penambahan 1M KOH atau 1M

HCl

pH diatur agar berada dalam

rentang 6-6,5 dengan

penambahan 1M KOH atau 1M

HCl

Disonifikasi kembali selama 10 menitDisonifikasi kembali selama 10 menit

Disentrifugasi selama 10 menit pada

kecepatan 2500 rpm

Disentrifugasi selama 10 menit pada

kecepatan 2500 rpm

SPE (Solid Phase Extraction)SPE (Solid Phase Extraction)

GC-NPD

SPE Senyawa Asam

- 1 mL 0.1M bufer fosfat (pH 6)/metanol

(80:20), lalu dikeringkan dengan vakum

selama 5 menit, laju alir 1.5 mL/min

- 1 mL 1M asam asetat, lalu dikeringkan

dengan vakum selama 2 menit, laju alir 1.5

mL/min

- 1 mL n-hexana, lalu dikeringkan dengan

vakum selama 2 menit, laju alir 1.5 mL/min

Pengkondisian Kolom

- 2 ml metanol

- 2 ml buffer fosfat pH 6

Pemasukan Sampel

Dibiarkan selama 2 menit agar

sampel meresap ke dalam kolom

Pencucian

Pengelusian Analit

kolom dielusi dengan menggunakan 4

ml metilenklorida

Eluat diuapkan pada suhu kamar dengan

bantuan gas nitrogen

SPE Senyawa Basa

2 ml air, laju alir 2 mL/min

2 ml buffer asetat pH 4, laju alir 1 mL/min

Pengkondisian KolomPengkondisian Kolom

2 ml metanol

2 ml air

Pemasukan SampelPemasukan Sampel

Dibiarkan selama 2 menit agar

sampel meresap ke dalam kolom

PencucianPencucian

Pengelusian Analit Tahap 1Pengelusian Analit Tahap 1

kolom dielusi dengan menggunakan 2 ml

asetonitril, eluat ditampung, kolom dibiarkan

mengering dengan vakum selama 2 menit

Eluat

(Benzodiazepin)

Eluat

(Benzodiazepin)

Pengelusian Analit Tahap 2Pengelusian Analit Tahap 2

kolom dielusi kembali dengan menggunakan

4 ml kloroform yang dijenuhkan dengan

ammonia: isopropanol (80:20) (2%)

Eluat (Senyawa Basa Lainnya)Eluat (Senyawa Basa Lainnya)

Ditambahkan dengan 0,1 ml methanol yang diasamkan

(0,1 ml HCl dalam 100 ml methanol) kemudian diuapkan

pada suhu kamar dengan bantuan gas nitrogen

Ditambahkan dengan 0,1 ml methanol yang diasamkan

(0,1 ml HCl dalam 100 ml methanol) kemudian diuapkan

pada suhu kamar dengan bantuan gas nitrogen

PEMBAHASAN

Senyawa Asam

Preperlakuan sampel

Darah atau urin (2.5 mL) dilarutkan dengan 1 mL bufer fosfat (pH 6), dan

ditambahkan 0,1 mL larutan internal standar (alobarbital). Penambahan bufer fosfat

dtujukan untuk mengatur pH sampel menjadi asam. Dengan demikian senyawa yang

bersifat asam akan berubah menjadi bentuk bebasnya dan nantinya dapat tertambat

dalam fase diam C8 yang bersifat non polar. Sedangkan alobarbital dipilih sebagai

internal standar karena alobarbital jarang digunakan dalam pengobatan ataupun

disalahgunakan. Selain itu alobarbital memiliki sifat fisikokimia dan karakter retensi

yang mirip dekat dengan sebagian besar analit asam. Sampel kemudian disonik selama

10 min, lalu pH diatur hingga 6-6.5 dengan KOH 1 M atau HCl 1 M. Sampel kemudian

disonik kembali selama 10 min, dilakukan pengaturan pH kembali jika perluhingga 6-

6.5. Sampel lalu disentrifugasi selama 10 min (250 rpm). Sonifikasi bertujuan untuk

mencampur sampel dengan dapar dan internal standar yang telah ditambahkan

sebelumnya. Selain itu sonifikasi bertujuan untuk melepaskan obat dari ikatan protein

pada plasma. Pengaturan pH yang berulangkali bertujuan agar pH sampel tetap sama,

terutam pada darah dimana sering terjadi fluktuasi.Lapisan supernatan kemudian

diambil.

Proses SPE

Pengkondisian Kolom

Ditambahkan 2 mL metanol, dikuti 2 mL bufer fosfat pH 6. Kolom dijaga agar

tidak sampai kering. Penambahan metanol bertujuan untuk mengaktifkan kolom,

sedangkan penambahan bufer fosfat pH 6 bertujuan agar kondisi kolom sama dengan

kondisi sampel sehingga analit tetap berada dalam bentuk bebasnya.

Pemasukkan Sampel

Sampel yang telah diberi praperlakuan kemudian dimasukkan. Sampel dibiarkan

meresap pada kolom selama kurang lebih 2 menit. Hal ini bertujuan agar analit dapat

tertambat dengan sempurna pada kolom.

Pencucian

Kolom dicuci berturut-turut dengan:

1. 1 mL 0.1M bufer fosfat (pH 6)/metanol (80:20), lalu dikeringkan dengan vakum

selama 5 menit, laju alir 1.5 mL/min.Campuran ini ditujukan untuk mengganggu

ikatan ionik dan hidrofobik lemah antara pengotor dan penjerap. Campuran ini

mampu mengeleminasi pengotor yang bersifat basa lemah dan kuat, sedangkan

senyawa yang bersifat asam akan tetap tertambat pada penjerap. Hal ini

dimungkinkan karena pH campuran bersifat asam sehingga senyawa yang

bersifat basa akan berubah menjadi bentuk ionnya dan telepas dari penjerap

yang bersifat non polar.

2. 1 mL 1M asam asetat, lalu dikeringkan dengan vakum selama 2 menit, laju alir

1.5 mL/min. Pencucian dengan asam asetat ditujukan untuk menghilangkan

pengotor lain sementara analit tetap dalam bentuk bebas dan tertambat pada

kolom.

3. 1 mL n-hexana, lalu dikeringkan dengan vakum selama 2 menit, laju alir 1.5

mL/min.Penggunaan n-hexana ini ditujukan untuk mengeleminasi pengotor

seperti lemak. Selain itu n-hexana ini ditujukan untuk mengusir air. Adanya air

akan menyebabkan proses pengeringan sampel nantinya akan menjadi lebih

sulit.

Pengelusian analit

Vakum dimatikan lalu kemudian dimasukkan 4 mL metilenklorida untuk

mengelusi analit. Metilenklorida ditampung tanpa menggunakan vakum. Metilenklorida

digunakan sebagai pengelusi karena sifatnya yang non polar, sehingga analit yang

bersifat non polar akan terlarut ke dalamnya. Selain itu, metilenklorida memiliki titik

didih yang rendah (40oC), sehingga mudah dihilangkan. Proses pengelusian ini tidak

menggunakan vakum dan hanya memanfaatkan gravitasi. Hal ini bertujuan agar pelarut

dapat mengalami kontak dengan lebih sempurna dengan analit.

Senyawa Basa

Sampel pretreatment untuk senyawa basa

Darah (2,5 ml) dilarutkan dengan 1 ml air dan 0,1 ml internal standar

(nalorphine 100 mg/l) dan trihexylamine dan prazepam 10

mg/l).Sampel disonik selama 10 menit pada temperatur ruang, pH

diadjust sampai 8-8,5 dengan buffer fosfat pH 8. Penambahan air

serta sonifikasi ini berguna untuk memecah ikatan protein pada

sampel. Internal standar yang digunakan lebih dari 1 jenis, hal ini

diakibatkan karena analit yang diekstraksi memiliki berbagai struktur

kimia yang berbeda, yaitu golongan opiat, golongan amfetamin,

golongan kokain dan golongan benzodiazeopin. Nalorphine dipih

sebagai internal standar karena memiliki profil ekstraksi dan

kromatografi yang mirip dengan morfin. Namun pada senyawa lain

hal ini tidak terpenuhi, karena itu digunakan trihexylamine (THA)

untuk internal standar golongan amfetamin dan kokain. Alasan lain

penggunaan dua internal standar ini adalah waktu retensinya. THA

terelusi diawal sedangkan nalorphine terelusi mendekati akhir dari

kromatogram sehingga memberikan rentang yang luas. Untuk

golongan benzodiazepine digunakan prazepam yang memiliki

karakter fisikokimia dan kromatografi yang sama dengan

benzodiazepine. Selain itu prazepam tidak digunakan dalam drug of

abuse maupun obat yang diresepkan. Penggunaan buffer pH 8

digunakan untuk mengkondisikan analit yang bersifat basa berada

dalam bentuk ion sehingga dapat tertambat dalam kolom SPE yang

penukar ion yang bersifat polar.

Gambar 1. Kromatogram GC-NPD dari fraksi senyawa basa yang diperoleh dari

sampel urin pengguna opiat, kokain dan amfetamin IS2=nalorphine, IS3=THA

Gambar 2. Kromatogram GC-NPD dari fraksi senyawa glongan benzodiazepin yang

diperoleh dari sampel empedu

Sampel disonik kembali selama 10 menit, pH dicek kembali. Hal

ini dilakukan karena setelah sonifikasi tersebut dapat terjadi fluktuasi

pH akibat berat jenis sampel yang tinggi. Sampel lalu disentrifugasi

2500 rpm selama 10 menit, hal ini dilakukan untuk memisahkan

pengotor berupa protein dari matriks sampel berdasarkan perbedaan

berat jenis. Pengotor tersebut akan ada di fase bawah sedangkan

analit ada pada supernatan. Supernatan digunakan kembali untuk

ekstraksi lebih lanjut.

Untuk sampel urin, 2 ml larutan glukoronidase (5000 unit/ml)

ditambahkan dalam 2,5 ml sampel dan pH diadjust hingga 4-4,5.

Sampel lalu divortex, dan diinkubasi pada waterbath pada suhu 60-

650 C. Penambahan glukoronidase berguna untuk menghilangkan

ikatan glukoronida, yang biasanya merupakan hasil metabolisme

pada senyawa morfin, kodein dan benzodiazepine, pengaturan pH

hingga 4 bertujuan untuk membantu proses hidrolisis glukoronid

tersebut. Setelah 2 jam, pH diatur hingga 8-8,5 dengan buffer pH 8.

Prosedur selanjutnya sama dengan sampel darah.

SPE untuk senyawa basa (termasuk benzodiazepine)

Pengkondisian Kolom

Pertama, kolom diprekondisikan dengan menggunakan 2 ml metanol dan 2 ml

air berturut-turut. Hal ini dilakukan untuk pengaktifan kolom sebelum digunakan untuk

mengekstraksi.Vakum tidak dihidupkan untuk mencegah kolom kering.

Pemasukan Sampel

Sampel yang telah dikondisikan dimasukkan ke dalam kolom. Paling tidak

dibutuhkan 2 menit untuk melewatkan sampel ke dalam kolom agar terserap sempurna

dalam kolom.

Pencucian

Dua ml air (2 ml/menit) dan 2 ml buffer asetat pH 4 dialirkan ke kolom dengan

laju alir 1 ml/menit berturut-turut. Penambahan air digunakan untuk mengelusi senyawa

yang bersifat polar dari dalam kolom, sementara analit yang terikat dalam kolom tidak

ikut terelusi karena air tidak dapat mengganggu ikatan ion antara analit dengan kolom.

Penambahan buffer fosfat selanjutnya akan mengubah analit golongan benzodiazepine

dalam bentuk bebasnya sementara analit golongan lain tetap berada dalam bentuk

ionnya. Benzodiazepine memiliki rentang pKa yang luas dari 1,2-12 serta memiliki dua

nilai pKa (bromazepam, lorazepam, flurazepam, nitrazepam) sehingga dapat berada

dalam bentuk bebas pada pH 4.

Pengelusian

1. Kolom lalu dialiri dengan 2 ml asetonitril dan dielusi tanpa menggunakan

vakum. Asetonitril lalu diuapkan dengan bantuan nitrogen dan direkonstitusi

dalam 100 µl metanol (fraksi C, yang mengandung senyawa benzodiazepin).

Karena benzodiazepine telah berada dalam bentuk bebas, senyawa tersebut dapat

terelusi pada pelarut organic seperti asetonitril yang bersifat semipolar.

Sedangkan analit lain yang berbentuk ion tidak ikut terelusi.

2. Kolom lalu dikeringkan dengan vakum selama 2 menit untuk menghilangkan

sisa asetonitril dalam kolom.

3. Kolom dialiri dengan 4 ml kloroform yang dijenuhkan dengan ammonia:

isopropanol (80:20) (2%) tanpa menggunakan vakum, eluat yang diperoleh

ditampung. Dengan menggunakan pelarut kloroform yang dijenuhkan dengan

ammonia yang bersifat basa, dapat mengganggu ikatan antara analit dengan

kolom. Ammonia yang bersifat basa akan memecah ikatan antara analit yang

bersifat ion dengan kolom, sehingga analit akan terpisah dari kolom dan berada

dalambentuk bebas akibat peningkatan pH. Analit yang sudah dalam bentuk

bebasnya ini kemudian akan terelusi oleh campuran pelarut kloroform dan

isopropanol yang bersifat semipolar.

4. Terakhir, 0,1 ml metanol yang diasamkan (0,1 ml HCl dalam 100 ml metanol)

ditambahkan ke dalam fraksi, lalu diuapkan dengan bantuan nitrogen pada suhu

kamar dan direkonstitusi dalam 100 µl metanol (step 7). Penambahan metanol

yang diasamkan dengan HCl ini bertujuan untuk membuat senyawa golongan

amfetamin yaitu MDMA, MDA dan MDEA berada dalam bentuk garamnya,

karena senyawa tersebut dalam bentuk bebasnya mudah menguap.