soutenance de thèse de benjamin boucherle le 9 décembre 2008
DESCRIPTION
Synthèse et évaluation de modulateurs de la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Soutenance de thèse de Benjamin Boucherle Le 9 décembre 2008 Directeur de thèse : Pr. Jean-Luc DECOUT Projet financé par l’association « Vaincre La Mucoviscidose ». Plan. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Synthèse et évaluation de modulateurs de la protéine CFTR(Cystic Fibrosis Transmembrane
conductance Regulator)
Soutenance de thèse de Benjamin Boucherle
Le 9 décembre 2008
Directeur de thèse : Pr. Jean-Luc DECOUT
Projet financé par l’association « Vaincre La Mucoviscidose »
Plan
• Contexte scientifique• Travaux antérieurs • La protéine CFTR• Modulation de la protéine CFTR
• Objectifs du travail• Résultats
• Poursuite de l’évaluation biologique des premiers composés actifs
• Recherche de nouveaux composés actifs • Recherche du pharmacophore• Pharmacomodulation
• Conclusions et perspectives
Plan
• Contexte scientifique• Travaux antérieurs • La protéine CFTR• Modulation de la protéine CFTR
• Objectifs du travail• Résultats
• Poursuite de l’évaluation biologique des premiers composés actifs
• Recherche de nouveaux composés actifs • Recherche du pharmacophore• Pharmacomodulation
• Conclusions et perspectives
Mise en évidence d’une nouvelle réaction
• entre :• Méthylglyoxal (MG) 1• α-aminoazahétérocycle 2
• Adduits de deux molécules de MG sur l’hétérocycle
Contexte Scientifique
Travaux antérieurs
Thèse C. Routaboul 2003
C. Routaboul et al. Chem. Comm. 2002
1
N
NH2O
1 2
+O
N
HNOH
OH
COO
N
HNOH
OH
COO
N
HNOH
OH
COO
N
HNOH
OH
COO
H2O
50°C
Mise en évidence d’une nouvelle réaction
• Accès à une nouvelle famille d’hétérocycles (Famille I)• Réaction stéréosélective et régiosélective • Obtention de deux mélanges racémiques majoritaire a et
minoritaire b
Contexte Scientifique
Travaux antérieurs
Dans la suite de la présentation, un seul énantiomère du mélange
racémique sera représenté1
N
NH2O
1 2
+O
N
HNOH
OH
COO
N
HNOH
OH
COO
N
HNOH
OH
COO
N
HNOH
OH
COO
H2O
50°C
Réactivité en milieu basique
• Adduits MG-2-aminopyridine 3• Formation :
• 2-aminopyridine de départ 5• Nouveau composé 4 (famille II) issu de trois réactions en une
seule étape :• Décarboxylation
• Déshydratation
• Oxydation
Contexte Scientifique
Travaux antérieurs
N
HNOH
OH
COO
N
NO
NaOH aq 1 M
3
N
NH2
5
+
4
50 °C
81 % 2
Activité biologique des nouveaux composés
• Parenté structurale entre • Le composé de la famille II 4 • Et un modulateur connu (MPB-07) de la protéine
CFTR
N
NO
4
Contexte Scientifique
Travaux antérieurs
Evaluation de l’effet des composés des familles I et II sur la protéine CFTR
N
HO
Cl
MPB-07
Cl
3
Plan
• Contexte scientifique• Travaux antérieurs • La protéine CFTR• Modulation de la protéine CFTR
• Objectifs du travail• Résultats
• Poursuite de l’évaluation biologique des premiers composés actifs
• Recherche de nouveaux composés actifs • Recherche du pharmacophore• Pharmacomodulation
• Conclusions et perspectives
Structure
• Super famille des transporteurs ABC (ATP Binding Cassettes) qui comprend également P-gP et MDR
• Canal Chlorure• 1480 acides aminés
• Répartis en deux séquences reliées par un domaine régulateur (R)
• comportant chacune :• 6 domaines transmembranaires
(MSD) composant le canal ionique• 1 domaine de fixation aux
nucléotides (NBD)
Contexte Scientifique
La protéine CFTR
4
Localisation, Fonctions et Régulation
• Localisée sur la face apicale des épithéliums polarisés
• Fonctions• Canal Chlorure
• Grâce à l’énergie provenant de l’hydrolyse de l’ATP sur les NBD
• Régulation d’autres canaux ioniques
• Régulation en fonction du taux de phosphorylation du domaine R dépendant de la concentration en AMPc
Contexte Scientifique
La protéine CFTR
5
Pathologies impliquant la protéine CFTR
• Diarrhées sécrétoires (Choléra)• Suractivation de la protéine CFTR
• Mucoviscidose (Cystic Fibrosis) • Inhibition ou abolition de la fonction canal Cl-
Contexte Scientifique
La protéine CFTR
6
La mucoviscidose
• Maladie génétique autosomique récessive• La plus fréquente dans les populations d’origine
caucasienne• Mutations du gène codant pour la protéine CFTR (plus
de 1500 mutations décrites)• Symptômes
• Nombreux et variables, principalement pulmonaires et digestifs• Peu ou pas reliés au génotype
• Traitements actuels uniquement symptomatiques et préventifs
Contexte Scientifique
La protéine CFTR
Nécessité d’un traitement curatif7
Les différentes classes de mucoviscidose
• Six classes• Principale mutation :
• ΔF508 ou delF508• Synthèse d’une
protéine non adressée à la membrane
• Classe II
Contexte Scientifique
La protéine CFTR
8
Perspectives thérapeutiques de la mucoviscidose
• Thérapie génique• Restauration du transport ionique par activation
de transporteurs autres que CFTR• Thérapie protéique
• « Through-reading » : classe I• Correcteurs : classe II• Activateurs de CFTR : classes II (en association avec
un correcteur) III, IV et V
Contexte Scientifique
La protéine CFTR
9
Plan
• Contexte scientifique• Travaux antérieurs • La protéine CFTR• Modulation de la protéine CFTR
• Objectifs du travail• Résultats
• Poursuite de l’évaluation biologique des premiers composés actifs
• Recherche de nouveaux composés actifs • Recherche du pharmacophore• Pharmacomodulation
• Conclusions et perspectives
Modulation de la protéine CFTR
• Type de modulation :• Action sur le système de régulation de CFTR
(Kinases, AMPc)• Action directe sur la protéine
• Activateurs/Potentiateurs : traitement potentiel de la mucoviscidose• Activateurs : actifs sans préactivation de CFTR par le
système AMPc• Potentiateurs : nécessitent une préactivation pour être
actifs (Phosphorylation du domaine R)
• Inhibiteurs (outils pharmacologiques)
Contexte Scientifique
Les modulateurs de CFTR
10
Les activateurs / potentiateurs de CFTR
• Très nombreux, de classes chimiques très variées
• La plupart sont moyennement actifs (activation à des concentrations autour du µM) et non sélectifs
• Un essai clinique en cours :• VX-770• Phase II • Sur patients portant la mutation G551D (Classe III)
Contexte Scientifique
Les modulateurs de CFTR
L’activation de CFTR est une perspective thérapeutique prometteuse
11
Les inhibiteurs de CFTR
• Très nombreux, de classes chimiques très variées
• La plupart sont moyennement actifs (inhibition à des concentrations autour du µM) et non sélectifs
• Le plus intéressant en tant qu’outil pour l’étude de CFTR est CFTRinh-172 • Sélectif et assez actif
IC50 (CHO-wt) = 1 µM• Mais peu soluble dans l’eau et inactif sur
tissus
Contexte Scientifique
Les modulateurs de CFTR
Nécessité de développer d’autres inhibiteurs de CFTR
N
S
CF3
S
O
HO
O
Ma et al. J Clin. Invest. 2002
12
Les modulateurs développés au laboratoire
• Collaboration avec l’équipe :• Physiopathologie et Pharmacologie des Canaux
ionique (UMR 6187), Pr F. Becq
• Evaluation par le test d’efflux d’ions iodures radioactifs• Mesure de la vitesse de sortie des ions iodures en
présence des composés à tester
• Mise en évidence d’un potentiateur• GPact-11a : EC50 (CHO-wt) = 2,1 µM• Composé de la famille I• Adduit MG-9-propyladénine
Contexte Scientifique
Les modulateurs de CFTR
N
NN
N
HN
COOOH
OH
13
Les modulateurs développés au laboratoire
• Mise en évidence de plusieurs inhibiteurs dont :• Le composé 4 de la famille II :
IC50 (CHO-wt) = 5,1 nM
• GPinh-5a : IC50 (CHO-wt) = 71 pM
• Composé de la famille I• Adduit MG-2’-désoxyadénosine
Contexte Scientifique
Les modulateurs de CFTR
N
NO
4
N
NN
N
HN
O
OH
HO
COOOH
OH
14
Plan
• Contexte scientifique• Travaux antérieurs • La protéine CFTR• Modulation de la protéine CFTR
• Objectifs du travail• Résultats
• Poursuite de l’évaluation biologique des premiers composés actifs
• Recherche de nouveaux composés actifs • Recherche du pharmacophore• Pharmacomodulation
• Conclusions et perspectives
Objectifs
• Poursuite des études biologiques sur les composés actifs
• Identification du pharmacophore
• Pharmacomodulation des composés actifs
N
NO
N
NN
N
HN
O
OH
HO
OH
OH
O O
Objectifs
N
O
N
NN
N
HN
O
OH
HO
COOOH
OH
N
NN
N
HN
COOOH
OH
15
Plan
• Contexte scientifique• Travaux antérieurs • La protéine CFTR• Modulation de la protéine CFTR
• Objectifs du travail• Résultats
• Poursuite de l’évaluation biologique des premiers composés actifs
• Recherche de nouveaux composés actifs • Recherche du pharmacophore• Pharmacomodulation
• Conclusions et perspectives
Poursuite de l’évaluation biologique
• Validation du potentiel thérapeutique des modulateurs ou de leur intérêt en tant qu’outils
• Nécessité d’obtention de quantités importantes• Synthèses à plus grande échelle • Optimisation des purifications
• Changement de phases de chromatographie
RésultatsEvaluations Biologiques
16
Toxicité
• Cellulaire (Test au MTT)• Pas de toxicité des
molécules testées
• Génétique (Test d’Ames)• Pas de toxicité des
molécules testées sauf 4 composé de la famille II
• Induction d’enzymes hépatiques (Cyt P450)
• Pas d’induction par les molécules testées
RésultatsEvaluations Biologiques
17
N
NN
N
HN
O
OH
HO
COOOH
OH
N
NN
N
HN
COOOH
OH
N
NO
GPact-11a
4
GPinh-5a
N
HNOH
OH
COO
N
NN
N
HN
O
OH
HO
COOOH
OH
HN
N
N O
COOOH
OH
N
NN
N
HN
COOOH
OH
N
NO
GPinh-15ab
GPinh-5a
GPinh-8ab
GPact-11a
4
Sélectivité
• Autre transporteur ABC : MRP1• Pas d’effet des molécules
testées• Canaux non-chlorures :
les canaux cardiaques potassiques (Herg), sodiques et calciques• Pas d’effet des molécules
testées• D’autres canaux
chlorures : les canaux calcium- et volume-activés• Pas d’effet de GPinh-5a
18
RésultatsEvaluations Biologiques
N
HNOH
OH
COO
N
NN
N
HN
O
OH
HO
COOOH
OH
HN
N
N O
COOOH
OH
N
NN
N
HN
COOOH
OH
N
NO
GPinh-15ab
GPinh-5a
GPinh-8ab
GPact-11a
4
N
NN
N
HN
O
OH
HO
COOOH
OH
GPinh-5a
N
NN
N
HN
O
OH
HO
COOOH
OH
N
NN
N
HN
COOOH
OH
N
NO
GPinh-5a
GPact-11a4
Influence de la stéréochimie• Principaux inhibiteurs
Composés de la famille I
IC50 sur cellules CHO-wt déterminées par le test d’efflux d’ions iodures
Mélange a:b(proportions déterminées par
spectrométrie de RMN)
Mélange majoritaire a
Mélange minoritaire b
GPinh-17 4,4 µM (75:25) 1,8 µM 4,9 µM
GPinh-18 5,7 µM (60:40) 4,2 µM 2,7 µM
GPinh-5 Non Déterminée 71 pM 194 pM
GPinh-15 2,2 nM (60:40) 2,1 nM 1,6 nM
GPinh-8 2,5 nM (60:40) 3,0 nM Non Déterminée
19
RésultatsEvaluations Biologiques
N
HNOH
OH
COO
HO
GPinh-17
N
NNH
N
HN
COOOH
OH
GPinh-18
N
HNOH
OH
COO
GPinh-8
HN
N
N O
COOOH
OH
GPinh-15
N
NN
N
HN
O
OH
HO
COOOH
OH
GPinh-5
C. Routaboul et al. JPET 2007
Evaluation sur différentes mutations de CFTR
Composés (proportions a:b déterminées par RMN)
Mutations de CFTR (et type cellulaire)
Expression endogène Expression hétérologue
wt (Calu 3)
ΔF508 (CF15)
wt (CHO)
G551D (CHO)
G1349D (Cos7)
Inhibiteurs IC50 (déterminées par le test d’efflux des ions iodures)
Glibenclamide 11,7 µM 11,8 µM 14,7 µM 7,9 µM 9,0 µM
CFTRinh-172 ND ND 1,2 µM ND ND
GPinh-5a 93,3 pM 67,3 pM 71,0 pM 43,1 nM 72,3 pM
GPinh-8ab (60:40) 15,7 nM 8,7 nM 2,5 nM 190 nM 79,4 nM
GPinh-15ab (60:40) 2,3 nM 6,3 nM 3,4 nM 154 nM 7,0 nM
GPinh-17ab (75:25) 11,2 µM 7,0 µM 4,4 µM 35,5 µM 9,0 µM
GPinh-18ab (60:40) 11,9 µM 6,0 µM 5,7 µM 110 µM 2,9 µM
Potentiateur EC50 (déterminées par le test d’efflux des ions iodures)
GPact-11a ND ND 2,1 µM inactif inactif
20
RésultatsEvaluations Biologiques
C. Routaboul et al. JPET 2007
Evaluation sur différentes mutations de CFTR
Composés (proportions a:b déterminées par RMN)
Mutations de CFTR (et type cellulaire)
Expression endogène Expression hétérologue
wt (Calu 3)
ΔF508 (CF15)
wt (CHO)
G551D (CHO)
G1349D (Cos7)
Inhibiteurs IC50 (déterminées par le test d’efflux des ions iodures)
Glibenclamide 11,7 µM 11,8 µM 14,7 µM 7,9 µM 9,0 µM
CFTRinh-172 ND ND 1,2 µM ND ND
GPinh-5a 93,3 pM 67,3 pM 71,0 pM 43,1 nM 72,3 pM
GPinh-8ab (60:40) 15,7 nM 8,7 nM 2,5 nM 190 nM 79,4 nM
GPinh-15ab (60:40) 2,3 nM 6,3 nM 3,4 nM 154 nM 7,0 nM
GPinh-17ab (75:25) 11,2 µM 7,0 µM 4,4 µM 35,5 µM 9,0 µM
GPinh-18ab (60:40) 11,9 µM 6,0 µM 5,7 µM 110 µM 2,9 µM
Potentiateur EC50 (déterminées par le test d’efflux des ions iodures)
GPact-11a ND ND 2,1 µM inactif inactif
20
RésultatsEvaluations Biologiques
C. Routaboul et al. JPET 2007
Evaluation sur différentes mutations de CFTR
Composés (proportions a:b déterminées par RMN)
Mutations de CFTR (et type cellulaire)
Expression endogène Expression hétérologue
wt (Calu 3)
ΔF508 (CF15)
wt (CHO)
G551D (CHO)
G1349D (Cos7)
Inhibiteurs IC50 (déterminées par le test d’efflux des ions iodures)
Glibenclamide 11,7 µM 11,8 µM 14,7 µM 7,9 µM 9,0 µM
CFTRinh-172 ND ND 1,2 µM ND ND
GPinh-5a 93,3 pM 67,3 pM 71,0 pM 43,1 nM 72,3 pM
GPinh-8ab (60:40) 15,7 nM 8,7 nM 2,5 nM 190 nM 79,4 nM
GPinh-15ab (60:40) 2,3 nM 6,3 nM 3,4 nM 154 nM 7,0 nM
GPinh-17ab (75:25) 11,2 µM 7,0 µM 4,4 µM 35,5 µM 9,0 µM
GPinh-18ab (60:40) 11,9 µM 6,0 µM 5,7 µM 110 µM 2,9 µM
Potentiateur EC50 (déterminées par le test d’efflux des ions iodures)
GPact-11a ND ND 2,1 µM inactif inactif
20
RésultatsEvaluations Biologiques
C. Routaboul et al. JPET 2007
Evaluation sur différentes mutations de CFTR
Composés (proportions a:b déterminées par RMN)
Mutations de CFTR (et type cellulaire)
Expression endogène Expression hétérologue
wt (Calu 3)
ΔF508 (CF15)
wt (CHO)
G551D (CHO)
G1349D (Cos7)
Inhibiteurs IC50 (déterminées par le test d’efflux des ions iodures)
Glibenclamide 11,7 µM 11,8 µM 14,7 µM 7,9 µM 9,0 µM
CFTRinh-172 ND ND 1,2 µM ND ND
GPinh-5a 93,3 pM 67,3 pM 71,0 pM 43,1 nM 72,3 pM
GPinh-8ab (60:40) 15,7 nM 8,7 nM 2,5 nM 190 nM 79,4 nM
GPinh-15ab (60:40) 2,3 nM 6,3 nM 3,4 nM 154 nM 7,0 nM
GPinh-17ab (75:25) 11,2 µM 7,0 µM 4,4 µM 35,5 µM 9,0 µM
GPinh-18ab (60:40) 11,9 µM 6,0 µM 5,7 µM 110 µM 2,9 µM
Potentiateur EC50 (déterminées par le test d’efflux des ions iodures)
GPact-11a ND ND 2,1 µM inactif inactif
20
RésultatsEvaluations Biologiques
C. Routaboul et al. JPET 2007
Evaluation sur différentes mutations de CFTR
Composés (proportions a:b déterminées par RMN)
Mutations de CFTR (et type cellulaire)
Expression endogène Expression hétérologue
wt (Calu 3)
ΔF508 (CF15)
wt (CHO)
G551D (CHO)
G1349D (Cos7)
Inhibiteurs IC50 (déterminées par le test d’efflux des ions iodures)
Glibenclamide 11,7 µM 11,8 µM 14,7 µM 7,9 µM 9,0 µM
CFTRinh-172 ND ND 1,2 µM ND ND
GPinh-5a 93,3 pM 67,3 pM 71,0 pM 43,1 nM 72,3 pM
GPinh-8ab (60:40) 15,7 nM 8,7 nM 2,5 nM 190 nM 79,4 nM
GPinh-15ab (60:40) 2,3 nM 6,3 nM 3,4 nM 154 nM 7,0 nM
GPinh-17ab (75:25) 11,2 µM 7,0 µM 4,4 µM 35,5 µM 9,0 µM
GPinh-18ab (60:40) 11,9 µM 6,0 µM 5,7 µM 110 µM 2,9 µM
Potentiateur EC50 (déterminées par le test d’efflux des ions iodures)
GPact-11a ND ND 2,1 µM inactif inactif
20
RésultatsEvaluations Biologiques
C. Routaboul et al. JPET 2007
Test en chambre de Ussing
• Test tissulaire• Mesure de l’intensité du courant
transépithélial• Sur intestin de souris• Inhibiteur GPinh-5a
• Inhibe dès 20 pM• Nécessite une préincubation
• Activateur GPact-11a• EC50 de 135 µM après stimulation par la
forskoline• EC50 de 256 µM sans stimulation par la
forskoline
GPact-11a n’est pas seulement un potentiateur mais également un activateur
Ctrl
CRA-6 20
pM
CRA-6 50
pM
CRA-6 10
0pM
0
25
50
75
100
**
******%
d'a
ctiv
atio
n ré
sidu
elle
par
Fsk
1µ
M
Ctrl
CRA-6 20
pM
CRA-6 50
pM
CRA-6 10
0pM
0
25
50
75
100
**
******%
d'a
ctiv
atio
n ré
sidu
elle
par
Fsk
1µ
M
-6 -5 -4 -3 -20
10
20
30 EC50=134.9+/-1.3µM(+ 1µM Fsk ; n=6)
EC50=256.1+/-1.2µM(n=5)
Log [GPact-11a] M
Is
c (
µA
/cm
²)
-6 -5 -4 -3 -20
10
20
30 EC50=134.9+/-1.3µM(+ 1µM Fsk ; n=6)
EC50=256.1+/-1.2µM(n=5)
Log [GPact-11a] M
Is
c (
µA
/cm
²)
21
RésultatsEvaluations Biologiques
Test in vivo
• Sur la salivation de souris (collecte de la salive produite)
• Après stimulation et en présence des modulateurs
• Inhibiteur GPinh-5a • Inhibe dès 20 pM• Nécessite une préincubation
• Activateur GPact-11a• EC50 de 7,2 µM après
stimulation• Inactif sur souris KO (CFTR
-/-)5 10 15 20 25 30
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Iso 10µM WT (n=19)
Iso 10µM + CRA 11 30µM WT n=7
Iso 10µM KO (n=6)
Iso 10µM + CRA 11 30µM KO n=2
Time (min)
Ave
rage
of s
aliv
ary
(µg.
min
-1.g
-1)
CFTR-wt Iso 10 µM
CFTR-wt Iso 10 µM
+ GPact-11a 30 µMCFTR-/- Iso 10 µM
CFTR-/- Iso 10 µM
+ GPact-11a 30 µM
5 10 15 20 25 300
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Iso 10µM WT (n=19)
Iso 10µM + CRA 11 30µM WT n=7
Iso 10µM KO (n=6)
Iso 10µM + CRA 11 30µM KO n=2
Time (min)
Ave
rage
of s
aliv
ary
(µg.
min
-1.g
-1)
CFTR-wt Iso 10 µM
CFTR-wt Iso 10 µM
+ GPact-11a 30 µMCFTR-/- Iso 10 µM
CFTR-/- Iso 10 µM
+ GPact-11a 30 µM
22
RésultatsEvaluations Biologiques
Plan
• Contexte scientifique• Travaux antérieurs • La protéine CFTR• Modulation de la protéine CFTR
• Objectifs du travail• Résultats
• Poursuite de l’évaluation biologique des premiers composés actifs
• Recherche de nouveaux composés actifs • Recherche du pharmacophore• Pharmacomodulation
• Conclusions et perspectives
Simplifications structurales
• Petites molécules contenant le pharmacophore• Modifications de la famille I
• Modification des groupements méthyles• Famille II• Décarboxylation
NO
Résultats
Recherche du pharmacophore
HN
N
COOOH
OHHN
N
R COOOH
OH
R
N
N
OHN
N
HOH
OH
23
Sélection de molécules
• Comprenant le pharmacophore supposé
NOH
O
Cl
Résultats
Recherche du pharmacophore
NHOH
O
Cl
H2N
OH
O
Cl
H2N
OH
O
Cl
NOH
O
Cl
N POH
O
O NH
O
O
N O
O
NH3
COO
N
OH
Br
OH
O
N
Br
OH
O
N
Br OH
O
N
Br
N
NN
N
O
O
OH
HONH2
OH
NH3
COOH3NSO3
24
Activités
• Aucun potentiateur • 5 composés inhibiteurs• 2 atomes de carbone
entre les hétéroatomes• Conforte la structure du
pharmacophore proposé
NOH
O
Cl
IC50 (CHO-wt) = 1 mM
NOH
O
Cl
IC50 (CHO-wt) = 96 µM
N O
O
IC50 (CHO-wt) = 220 µM
OH
O
N
Br
IC50 (CHO-wt) = 25 µM
N
NN
N
O
O
OH
HONH2
OH
IC50 (CHO-wt) = 4 µM
Résultats
Recherche du pharmacophore
25
Modification des groupements méthyles
• Changement de l’α–oxoaldéhyde : éthylglyoxal (EG)
• Résultats antérieurs :• Réaction entre : l’éthylglyoxal et la
2-aminopyridine• Formation d’adduits voisins de ceux
du MG
• Extension de la réaction aux adduits EG-1-aminoisoquinoléine N
HNOH
OH
COO
N
NH2 O
O
21 %
Résultats
Recherche du pharmacophore
O
O
O
SeO2
N
HNOH
OH
COO
N
NH2
23 %
26
Influence de l’α-oxoaldéhyde (MG Vs EG)
• Remplacement des groupements méthyles par éthyles compatible avec l’activité (encombrement)• Adduit EG-2-aminopyridine : IC50 (CHO-wt) = 18 µM
• Influence de la lipophilie ?
N
HNOH
OH
COO
N
HNOH
OH
COO
N
HNOH
OH
COO
N
HNOH
OH
COO
Pas d'activité Pas d'activitéInhibiteurInhibiteur
Résultats
Recherche du pharmacophore
<<<
27
Nouveaux composés de la famille II
• Extension de la réaction à 3 nouveaux adduits :• Adduits MG-1-
aminoisoquinoléine• Adduits MG-benzamidine• Adduits EG- 2-
aminopyridine
• Produits attendus non obtenus à partir des adduits MG-dérivés de l’adénine (GPact-11a et GPinh-5a notamment)
N
NO
81 %
N
NO
10 %
N
NO
55 %
Résultats
Recherche du pharmacophore
N
HN
ROH
OH
COO
RN
NO
R
R
NaOH aq
N
NOH
39 %
28
Famille II
• Voie d’accès à des pyrimidines substituées
• 2 composés inhibiteurs• Confirmation du
pharmacophore
N
NO
IC50 (CHO-wt) = 17 nM
N
NO
IC50 (CHO-wt) = 5 nM
Résultats
Recherche du pharmacophore
29
N
NOH
NH2
NH1)
2) NaOH
O O
48 % (2 étapes)
Accès à un nouveau type de composés : Famille III
• Essai de modification des adduits de la famille I en milieu basique • Différent de NaOH : tBuOK
• Mise en évidence d’une nouvelle famille de composés• Résultant d’une
décarboxylation des adduits de la famille I
• Evaluation sur CFTR en cours
N
NH
COOOH
OH
N
NOH
OHtBuOK
N
NOH
OH
7 %
Résultats
Recherche du pharmacophore
N
NN
N
NOH
OH
37 %
N
NN
N
NOH
OH
14 %
S N
NOH
OH
17 %N
NN
N
HN
COOOH
OH
N
NN
N
NOH
OH
Famille I
GPact-11a
Famille III
30
Formation des composés de la famille III
• Stéréochimie des composés• Deux isomères observés par spectrométrie de
RMN • Deux diastéréoisomères • Ou deux mélanges racémiques
• Le même mélange d’isomères est obtenu • A partir du mélange racémique majoritaire a de la
famille I • A partir des deux mélanges racémiques a et b
Résultats
Recherche du pharmacophore
31
Proposition de mécanisme
• Déprotonation• Elimination du
carboxylate • Arrachement
concerté du proton en α
• Reprotonation
N
N
O
OH
H
HN
N
OH
OH
OO
tBuOK
H
- CO2N
N
O
O
OO
H
H
Résultats
Recherche du pharmacophore
H
N
N
OH
OH
H
N
N
O
O
OO
H
H
32
Proposition de mécanisme
N
N
H
OH
OH
H
N
N
H
OH
OH
H
+
HN
N
OH
OH
OO
H
HN
N
OH
OH
OO
H
+
N
N
H
OH
OH
H
N
N
H
OH
OH
H
+HN
N
OH
OH
OO
H
HN
N
OH
OH
OO
H
+
HN
N
OH
OH
OO
H
HN
N
OH
OH
OO
H
+
• Deux mélanges racémiques• A partir du mélange racémique majoritaire a de la
famille I • A partir des deux mélanges racémiques a et b
Résultats
Recherche du pharmacophore
33
Plan
• Contexte scientifique• Travaux antérieurs • La protéine CFTR• Modulation de la protéine CFTR
• Objectifs du travail• Résultats
• Poursuite de l’évaluation biologique des premiers composés actifs
• Recherche de nouveaux composés actifs • Recherche du pharmacophore• Pharmacomodulation
• Conclusions et perspectives
Structure des « chefs de file » et voies de synthèse
• Le meilleur inhibiteur et le potentiateur diffèrent uniquement par le groupement en position 9
• Modifications de l’adénine en position 7 ou 9 et/ou 8 et/ou 2
Résultats
Pharmacomodulation
N
NN
N
HN
COOOH
OH
GPact-11a
N
NN
N
HN
O
OH
HO
COOOH
OH
GPinh-5a
N
NN
NH
NH2
N
NN
N
NH2
R2
1
2
34
567
8
9 N
NN
N
HN
R2
OH
OH
COO
R1 R1
O
O
34
Modulations réalisées
N
NNH
N
NH2
N
HNOH
OH
COO
N
N
N
R1
HCH3CH2CH3CH2CH2CH3CH(CH3)2CH2CH=CH2CH=CHCH3CH2C CHCH2CH2CH2OHCH2CH2CH2CH3CH2PhCH2CH2CH2PhRibose2'-désoxyribose
R1 =
N
HNOH
OH
COO
N
N
N
R2
R2 = CH3CH2CH2CH3CH2CH=CH2
N
HNOH
OH
COO
N
N
N
R5
R6
R5 =
R6 =
CH2CH2CH3
OCH3Cl
N
HNOH
OH
COO
N
N
N
R4
R3
R3 =
R4 = SCH2CH3OCH2CH3SH
2'-désoxyriboseH
SCH2CH3SHBr
CH2CH2CH3
OCH3SCH3OH
Résultats
Pharmacomodulation
35
Dérivés de la 2’-désoxyadénosine
• Lors de la réaction avec le MG• Formation des adduits attendus• Et d’adduits ne portant plus le 2’-désoxyribose
• Difficultés de purification• Accès à des dérivés de l’adénine modifiée en
position 8
N
NN
N
NH2
Y
O
HO
HO
R
N
NN
N
HN
Y
O
HO
HO
RO O
OH
OH
COO
Résultats
Pharmacomodulation
N
NN
NH
HN
Y
R
OH
OH
COO
36
Activité des adduits MG-dérivés de l’adénine
• En position 9
R = Evaluation par le test d’efflux d’ions iodures
(CHO-wt)
Activité EC50 IC50
CH-(CH3)2 0 x x
CH2-CH=CH2 + 3 µM x
CH=CH2-CH3 0 x x
CH2-C≡CH 0 x x
CH2-CH2-CH2-OH 0 x x
N
NN
N
HN
R
OH
OH
COO
R = Evaluation par le test d’efflux d’ions iodures (CHO-wt)
Activité EC50 IC50
H - x 4,2 µM
CH3 0 x x
CH2-CH3 0 x x
CH2-CH2-CH3 + 2 µM x
CH2-CH2-CH2-CH3 0 x x
CH2-Ph 0 x x
CH2-CH2-CH2-Ph 0 x x
2’-désoxyribose - x 71 pM
ribose - x Pas de 100 % inhibition
Résultats
Pharmacomodulation
37
Activité des adduits MG-dérivés de l’adénine
• En position 8 et/ou 9
R1 = R2 =
Evaluation par le test d’efflux d’ions iodures (CHO-wt)
Activité EC50 IC50
dRib
SH ?
CH3-CH2-S 0 x x
CH3-CH2-O 0 x x
H
Br ?
SH + 23 µM
CH3-CH2-S ?
CH2-CH2-CH3
OH 0 x x
CH3-S 0 x x
CH3-O 0 x x
N
NN
N
HN
R1
OH
OH
COO
R2
N
NNH
N
HN
HS
COOOH
OH
N
NNH
HN
HN
S
COOOH
OH
Résultats
Pharmacomodulation
38
Plan
• Contexte scientifique• Travaux antérieurs • La protéine CFTR• Modulation de la protéine CFTR
• Objectifs du travail• Résultats
• Poursuite de l’évaluation biologique des premiers composés actifs
• Recherche de nouveaux composés actifs • Recherche du pharmacophore• Pharmacomodulation
• Conclusions et perspectives
Conclusions sur le pharmacophore
• Sélection de petites molécules contenant le pharmacophore :• Mise en évidence de nouveaux inhibiteurs de la
protéine CFTR• Structure nécessaire mais pas suffisante pour
observer une activité• Peu d’informations sur les groupements voisins
nécessaires à l’activité
• Modification de la famille I• Accès à d’autres composés de la famille II• Accès à une nouvelle famille
NO
Conclusions et Perspectives
N
N
O
R
R
Famille II
N
N
HOH
OH
Famille III 39
Conclusions sur la pharmacomodulation
• Mise en évidence de deux nouveaux potentiateurs
• Peu de variations sur la position 9 permettent de conserver une activité
• En attente de résultats complémentaires pour les positions 2 et 8
Conclusions et Perspectives
N
NNH
N
HN
HS
COOOH
OH
N
NN
N
HN
COOOH
OH
40
Mode d’action ?
• Hypothèses :• Liaison directe à la protéine• Site d’action identique pour inhibiteurs et
activateurs• Site localisé à proximité de la Glycine 551
Conclusions et Perspectives
41
P
Cl-
MSD
NBD1 NBD2
R
Milieu extracellulaire
Milieu intracellulaire
P
PP
Conclusions et Perspectives
Mode d’action ?
42
NBD1
R
NBD2
Cl-
MSD
N N
N
NHN
OOC
HOHO
P
PP
P
Conclusions et Perspectives
Mode d’action ?
43
NBD2NBD1
R
Cl-
NBD2
MSD
P
PP
P
Conclusions et Perspectives
Mode d’action ?
NN
N
NHN
O
OH
OH
OOC
HO
HO
44
Perspectives (1)
• Poursuite de l’évaluation des composés actifs• Association de GPact-11a et d’un correcteur : effet
sur delF508 ?• Compétition avec l’ATP• Mutagenèse dirigée
• Modélisation in silico• Etude par docking : identification d’un site de liaison• Couples d’acides aminés portant des charges
opposées se situant à proximité dans les modèles 3D de la protéine CFTR
Conclusions et Perspectives
45
Perspectives (2)
• Recherche de potentiateurs• Combinaison des modifications favorables en
positions 9 et 8
• Poursuite des variations structurales• Adduits de l’EG sur 9-propyladénine• Essais avec d’autres α-oxoaldéhydes
N
NN
N
HN
COOOH
OH
N
NNH
N
HN
HS
COOOH
OH
N
NN
N
HN
COOOH
OH
HS
Conclusions et Perspectives
46
GPact-11aNouveau potentiateur
mis en évidenceComposé à synthétiser
Perspectives (3)
• Poursuite de la simplification structurale
• Obtention d’un seul énantiomère
• 7-méthylguanosine • chef de file ?
Conclusions et Perspectives
N
HNR
R
COO
N
X
+ H2NR
R
COOH
GP
NH
HNR
R
COO
N
X
+ H2NR
R
COOH
R2
R2
R2
R2
N N
X
+
GP
H2NR
COOHHN
COO
R
R1
R1
R1
R1
R1
R1
R2R2
47
N
NN
N
O
O
OH
HONH2
OH
Remerciements
• Vaincre la Mucoviscidose
• Jean-Luc Décout, Marie-Carmen Molina, Antoine Fortuné, Equipe CBO
• Equipe PPCI : Frédéric Becq, Caroline Norez, Johanna Bertrand, Patricia Melin
• Ensemble du DPM
Mécanisme Famille I
N
N
HO
OH
H
N
N
H2O
HO
OH
HH3O+
O
HO
OH
N
N
HO
HO
OH
H
O
OH
OH
N
N
OH
OH
OH
O
OH
N
NH
H
N
HN
OH
COO
OH
2
- H2O
- H2O1
H
Mécanisme Famille II
N
NO
O
O
- CO2
N
NO
N
NOH
COO
N
NO
oxydation
NaOHaq
- H2O
N
NO
N
NOH
COO
OH
- [H++2e-]
Mécanisme Famille III
N
N
O
OH
H
HN
N
OH
OH
OO
tBuOK
H
- CO2N
N
O
O
OO
H
H
H
N
N
OH
OH
H