síntesis y estudio de la actividad biológica del …esqueleto de péptidos y proteínas y...

Enrique Fraile Baños

Jesús Manuel Peregrina García y Alberto Avenoza Aznar

Facultad de Ciencia y Tecnología

Grado en Química

2015-2016

Título

Director/es

Facultad

Titulación

Departamento

TRABAJO FIN DE GRADO

Curso Académico

Síntesis y estudio de la actividad biológica del péptidoproadrenomedulina PAMP y de otros derivados

Autor/es

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2016

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Síntesis y estudio de la actividad biológica del péptido proadrenomedulinaPAMP y de otros derivados, trabajo fin de grado

de Enrique Fraile Baños, dirigido por Jesús Manuel Peregrina García y Alberto AvenozaAznar (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia

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Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática

TRABAJO FIN DE GRADO

Grado en Química

Síntesis y estudio de la actividad biológica del péptido

proadrenomedulina PAMP y de otros derivados

Alumno:

Enrique Fraile Baños

Tutores:

Jesús Manuel Peregrina García

Alberto Avenoza Aznar

Logroño, Febrero, 2016

ÍndiceAbreviaciones I

1. Resumen 1 2. Introducción 5 3. Antecedentes 11

3.1 Síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) 13 3.2 Formación del enlace O-glicosídico 16

4. Objetivos 17 5. Discusión de resultados 21

5.1 Síntesis de glicosilaminoácidos 23 5.2 Síntesis de los péptidos y glicopéptidos por SPPS 26 5.3 Ensayos biológicos 28

6. Conclusiones 31 7. Parte experimental 35

7.1 Síntesis de los diferentes compuestos (2-10) 38 7.2 Procedimiento experimental para la síntesis de 44 glicopéptidos por SPPS

7.2.1 Acoplamiento de los distintos aminoácidos 44 mediante el sintetizador automático

7.2.2 Acoplamiento manual de los aminoácidos 45 7.2.3 Obtención de los péptidos ya purificados 46 7.3 Ensayos biológicos de los distintos péptidos 47 Anexo: Espectros de RMN 49

IAbreviaciones

Abreviaciones Å ångström δ desplazamiento químico ʎ longitud de onda μL microlitro 1H, RMN Resonancia Magnética Nuclear de protón 13C, RMN Resonancia Magnética Nuclear de carbono-13 Aa aminoácido Ac acetilo Ac2O anhídrido acético AcOEt acetato de etilo Ala, A alanina APCI Atmosferic Pressure Chemical Ionization Arg, R arginina Asn, N asparagina Asp, D ácido aspártico Bn bencilo Boc terc-butoxicarbonilo tBu terc-butilo tBuOH terc-butanol COSY COrrelated SpectroscopY d doblete DCC N,N’-diciclohexilcarbodiimida DIEA diisopropiletilamina dd doblete de dobletes ESI ElectroSpray Ionization Et etilo Et3N trietilamina EtOH etanol Fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonilo g gramo GalNAc N-acetilgalactosamina Glu, E ácido glutámico Gly, G glicina h hora His, H histidina HPLC High Performance Liquid Chromatography HRMS espectrometría de masas de alta resolución HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation Hz herzio J constante de acoplamiento

II Abreviaciones

Leu, L leucina Lys, K lisina m multiplete M molaridad Me metilo MeOH metanol mg miligramo MHz megaherziomin minuto mL mililitro mm milímetro mmol milimol MS Mass Spectrometry nm nanómetro Phe, F fenilalanina ppm parte por millón Pro, P prolina R sustituyente alquilo o arilo, arginina RMN Resonancia Magnética Nuclear s singlete S* serina glicosilada Ser, S serina Trp, W triptófano t triplete, tiempo t.a. temperatura ambiente T* treonina glicosilada TBDPS terc-butildifenilsililo TFA ácido trifluoroacético THF tetrahidrofurano Thr, T treonina TIS triisopropilsilano TMS trimetilsililo, tetrametilsilano Val, V valina

1. Resumen

3Resumen/Abstract

PAMP es el acrónimo de un péptido de 20 aminoácidos de longitud, cuya estructura secundaria consiste en una hélice α para los residuos 2-20. La principal función de este péptido es su actuación como un factor angiogénico potente que soporta el crecimiento del tumor. En un estudio previo se demostró que los últimos 9 aminoácidos del péptido PAMP (12-20) tienen la misma actividad que el natural de 20 aminoácidos, por lo tanto, aquí es donde se va a centrar nuestro estudio, que consiste en la preparación del PAMP natural, el PAMP (12-20) y una serie de miméticos de éste último en el que se cambia la serina 19 por treonina y por sus derivados glicosilados. En primer lugar, se realizó la síntesis de los glicosilaminoácidos adecuadamente protegidos, consistentes en la unión entre un derivado de N-acetilgalactosamina y los aminoácidos serina o treonina mediante un enlace α-O-glicosídico a través de la metodología Koenigs-Knorr. Posteriormente, se realizó la síntesis de los distintos péptidos descritos anteriormente mediante la técnica de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS). Con ello se quiere probar el comportamiento que tiene cada una de las variaciones de un aminoácido en concreto (19) y si eso tiene alguna repercusión para un futuro estudio. Para ello se realizó un ensayo biológico muy preliminar en el CIBIR (Centro de Investigación Biomédica de La Rioja) de los distintos péptidos previamente sintetizados.

4 Resumen/Abstract

PAMP is the acronym of a peptide of 20 amino acids whose secondary structure is an alpha hélix for residues 2-20. This peptide acts as a powerful angiogenic factor which bears the tumor growth. A previous study showed that a short peptide comprising the last 9 amino acids had the same activity than the natural one of 20 amino acids. Therefore, our research was focused on this short peptide. We prepared the natural PAMP, PAMP (12-20) and a series of mimetic of the former where serine 19 was changed to threonine and their glycosylated derivates. First of all, we carried out the synthesis of two glycosyl amino acids suitably protected. We linked a protected N-acetylgalactosamine (GalNAc) to threonine or serine amino acids via a α-O-glicosidic bond, using the Koenigs-Knorr methodology. Subsequently, the preparation of the different peptides later described was carried out using the synthesis of peptides in solid phase (SPPS) methodology. With the aim to discover the behaviour of two variations of an specific amino acid (19) of the PAMP (12-20) peptide, a preliminar bioassay was carried out in the CIBIR (Biomedical Research Centre of La Rioja).

2. Introducción

7Introducción

Todas las glicoproteínas están constituidas por una cadena de aminoácidos (parte protéica) y residuos de carbohidratos. Estos últimos dotan de una mayor estabilidad a las macromoléculas; lo que quiere decir que las hacen menos vulnerables a la degradación química y enzimática.

El enlace entre ambas partes se llama enlace glicosídico, y suele darse entre el oxígeno de una serina o treonina y un residuo carbohidrato.

Parte proteica Carbohidratos

Figura 2.1: Estructura en 3D de una glicoproteína CD66F.

La adrenomedulina (AM) fue aislada originalmente por Kitamura de un feocromocitoma humano, que es un tumor de la medula suprarrenal de la glándula adrenal.

El gen de la AM codifica una preprohormona de 185 aminoácidos, que después de desprenderse del péptido N-terminal de 21 residuos, genera un péptido de 164 aminoácidos conocido como pro-AM. Esta preprohormona se transforma posteriormente mediante un proceso enzimático en dos péptidos biológicamente activos: AM y PAMP1,2.

Ambos péptidos han sido detectados en una gran variedad de órganos y tipos de células y ejercen diferentes funciones dependiendo del sistema en el que estén localizados. El AM actúa como vasodilatador, neurotransmisor, broncodilatador3,4 y también es un factor de crecimiento o inhibición de la liberación autocrina.

1K. Kitamura, K. Kangawa, M. Kawamoto, Y. Ichiki, S. Nakamura, H. Matsuo, T. Eto, Biochem. Biophys. Res. Commun. 192 (1993) 553-560.2J. López, A. Martínez, Int. Rev. Cytol. 221 (2002) 1-92.3J.P. Hinson, S. Kapas, D.M. Smith, Endocr. Rev. 21 (2000) 138-167.4K. Kitamura, K. Kangawa, Y. Ishiyama, H. Washimine, Y. Ichiki, M. Kawamoto, N. Minamino, H. Matsuo, T. Eto, FEBS Lett. 351 (1994) 35-37.

8 Introducción

El AM también controla la secreción hormonal y la homeostasis renal. El PAMP es un vasodilatador e inhibe la neurotransmisión5 y el crecimiento de las células6 del neuroblastoma.

Este péptido se encuentra en el plasma, medula adrenal, aurícula derecha, riñón y cerebro y su actividad es hipotensora en ratas y gatos7. La concentración de PAMP se encuentra significativamente elevada en enfermedades severas, incluyendo la hipertensión8, fallo cardiaco congestivo9, insuficiencia renal crónica10 y carcinoma de próstata11.

La principal función de este péptido es su actuación como un factor angiogénico potente que soporta el crecimiento del tumor12,13,14.

Figura 2.2: Proceso de Angiogénesis.

5T. Shimosawa, Y. Ito, K. Ando, K. Kitamura, K. Kangawa, T. Fujita, J. Clin. Invest. 96 (1995) 1672-1676.6K. Ando, N. Omi, T. Shimosawa, T. Fujita, FEBS Lett. 413 (1997) 462-466.7M. Mahata, S.K. Mahata, R.J. Parmer, D.T. O’Connor, Hypertension 32 (1998) 907-916.8K. Kuwasako, K. Kitamura, K. Kangawa, Y. Ishiyama, J. Kato, T. Eto, Ann. Clin. Biochem. 36 (Pt 5) (1999) 622-628. 9T. Etoh, J. Kato, H. Washimine, T. Imamura, K. Kitamura, Y. Koiwasha, K. Kangawa, T. Eto, Horm. Metab. Res. 29 (1996) 46-47. 10T. Tokura, H. Kinoshita, S. Fujimoto, K. Kitamura, T. Eto, Nephron Clin. Pract. 95 (2003) 67-72.11A. Calvo, I. Abasolo, N. Jiménez, Z. Wang, L. Montuenga, Microsc. Res. Technol. 57 (2002) 98-104.12A. Martinez, M. Julian, C. Bregonzio, L. Notari, T. Moody, F. Cuttita, Endocrinology 145 (2004) 3858-3865.13A. Martínez, J.A. Bengoechea, F. Cuttitta, Endocrinology 147 (2006) 3457-3461. 14A. Martinez, E. Zudaire, S. Portal-Nunez, L. Guedez, S.K. Libutti, W.G. Stetler- Stevenson, F. Cuttitta, Cancer Res. 64 (2004) 6489-6494.

9Introducción

La angiogénesis es esencial para el crecimiento del tumor porque los tumores requieren de un adecuado suministro de sangre para poder cubrir sus necesidades metabólicas. A la vez que el tumor va creciendo, las células del tejido en el centro de la masa sufren hipoxia, lo que es un estímulo para la liberación de factores proangiogénicos. Esto promueve la formación de suficientes vasos sanguíneos para soportar el crecimiento adicional. Ya que el crecimiento progresivo del tumor depende del aporte sanguíneo, el tratamiento con fármacos que previenen la formación de vasos sanguíneos tumorales permite detener el desarrollo del cáncer por periodos prolongados15.

Figura 2.3: Estructura primaria de la preprohormona adrenomedulina.

* Se puede ver el PAMP en rojo y la AM en verde. Tambien han sido destacados algunos aspectos estructurales importantes: los aminoácidos en azul representan Gly, donde PAMP y AM son amidas una vez que la preprohormona es procesada. Los aminoácidos escindidos por las carboxipeptidasas están en amarillo. Nótese la presencia de un enlace disulfuro entre dos de las Cys en la secuencia AM.

15A. Martinez, Cancer Lett. 236 (2006) 157-163.

3. Antecedentes

13Antecedentes

En un estudio previo se demostró que la actividad de una versión reducida a los últimos 9 aminoácidos del PAMP es similar a la del natural de 20 aminoácidos (ARLDVASEFRKKWNKWALSR), por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue la síntesis y el estudio tanto del péptido de 20 aminoácidos como de 4 modificaciones del mismo (el reducido de 9 aminoácidos, el reducido pero cambiando la serina por treonina, el reducido pero cambiando la serina por serina-GalNAc (S*) y por último el reducido pero variando la serina por treonina-GalNAc (T*)). Para que esto funcione todos ellos deben tener una amida terminal. En este apartado se describen tanto la técnica de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) como la formación del enlace O-glicosídico. 3.1 Síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS). La síntesis peptídica en fase sólida (SPPS), cuyo pionero fue Merrifield, supuso un cambio muy importante en la síntesis química de péptidos. Hoy en día es el método más usado en la síntesis de péptidos y pequeñas proteínas en el laboratorio. Esta técnica permite sintetizar péptidos naturales difíciles de expresar en bacterias, modificar el esqueleto de péptidos y proteínas y sintetizar proteínas a partir de D-aminoácidos y otros aminoácidos no naturales. En esta síntesis, el péptido permanece unido covalentemente a la resina hasta que es desanclado por acción del ácido trifluoroacético (TFA). Por lo tanto, el péptido queda inmovilizado en la fase sólida y permanece retenido durante el proceso de filtrado, mientras que los subproductos son eliminados. La SPPS sigue una pauta general de ciclos repetitivos de acoplamiento-lavado-desprotección-lavado. El extremo libre amino terminal de un péptido unido a una fase sólida se acopla a un nuevo aminoácido con el grupo carboxilo libre y el amino protegido como carbamato. Posteriormente, este aminoácido es desprotegido dando lugar así a un nuevo extremo amino al cual se puede unir otro aminoácido. Esta técnica es tan usada y tan efectiva debido a que en los ciclos de lavado después de cada reacción en los que se eliminan los subproductos mientras que el péptido de interés permanece unido covalentemente a la resina insoluble. Además, se hacen de manera rápida y sin problemas, es decir, automáticamente.

Uno de los objetivos para este tipo de síntesis es la de obtener un rendimiento lo más elevado posible en cada etapa. Para ello, cada aminoácido es añadido en exceso y el acoplamiento entre aminoácidos se optimiza gracias a una serie de reactivos determinados.

Los dos métodos de síntesis peptídica más habituales son los que utilizan como grupo protector el Fmoc y el t-Boc. En nuestro caso hemos utilizado el Fmoc, debido a que este grupo se libera en medio básico (generalmente con piperidina) que es lo que nos interesa para realizar una desprotección ortogonal.

14 Antecedentes

A continuación en la tabla 3.1 se muestra un cuadro con las diferencias entre el Fmoc y el t-Boc:

Boc Fmoc

Requiere de equipamiento especial

Sí No

Coste de los reactivos Bajo Alto

Solubilidad de los péptidos

Mayor Menor

Pureza de los péptidos hidrofóbicos

Elevada Puede ser menor

Problemas de agregación Poco frecuentes Más frecuentes

Tiempo de síntesis 20 min/aa 20-60 min/aa

Desproteción final HF TFA

Seguridad Potencialmente peligrosa Relativamente segura

Ortogonal No Sí

Tabla 3.1: Diferencias entre las metodologías Fmoc y el Boc.

También cabe destacar que no es necesario purificar cada péptido intermedio, por lo tanto esto conlleva a una reducción del tiempo y a la mejora del rendimiento global.

El primer acoplamiento consiste en la unión del aminoácido a la resina mediante un enlace tipo amida entre el grupo carboxilo del aminoácido y el amino de la resina.

Una vez que el primer aminoácido está unido a la resina, se elimina el grupo protector (Fmoc) del extremo amino antes de la unión del siguiente aminoácido para que a continuación se pueda producir el acoplamiento del siguiente aminoácido N-protegido, previa activación del grupo carboxilo del aminoácido entrante mediante agentes de acoplamiento; en nuestro caso, la Oxyma/DIC. Tanto la desprotección como el acoplamiento se repite todas las veces que sea necesario hasta conseguir la formación del péptido deseado.

15Antecedentes

Figura 3.1: Esquema de la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS). En la figura 3.1 se muestra un ejemplo general de SPPS en la que utilizan una resina de poliestireno, DIC como agente de acoplamiento y HF para liberar el péptido de la resina (“cleavage”). En nuestro caso se hace igual pero con la resina Rink Amide, Oxyma/DIC como agente de acoplamiento y TFA para el “cleavage”.

16 Antecedentes

3.2 Formación del enlace O-glicosídico En la mayoría de las glicoproteínas, los carbohidratos se encuentran unidos mediante enlaces O-glicosídicos a la cadena peptídica correspondiente. Al realizarse la unión entre el grupo hidroxilo del aminoácido (serina ó treonina) con el monosacárido (GalNAc) puede resultar la aparición de dos anómeros (α y β). El anómero α presenta el sustituyente, que en nuestro caso es el aminoácido, en posición axial. En cambio, el anómero β presenta el sustituyente en posición ecuatorial. Por tanto, es importante controlar esta reacción y encontrar unas condiciones que permitan la obtención mayoritaria de uno u otro anómero.

Figura 3.2: Anómeros α y β para un enlace O-glicosídico. Existen muchas metodologías para la formación del enlace O-glicosídico. A continuación se va a explicar la metodología de Koenigs-Knorr que es la empleada en el estudio, debido a que se obtiene de forma mayoritaria el anómero α, que es el deseado en este trabajo. Metodología Koenigs-Knorr: Es uno de los procedimientos más antiguos de glicosilación. Esta metodología está basada en el empleo de haluros de carbohidratos como grupos dadores, y como grupo aceptor el alcohol correspondiente.

Figura 3.3: Esquema de la metodología Koenigs-Knorr.

En nuestro caso, se ha utilizado cloro-azida ya que precisa de menos etapas para su obtención, por lo que el rendimiento será mayor que si se emplea la bromo-azida.

4. Objetivos

19Objetivos

Los objetivos de este trabajo son los siguientes:

1_ Para poder comparar resultados se pretende realizar la síntesis del propio PAMP a través de la técnica SPPS de manera automática.

ARLDVASEFRKKWNKWALSR-NH2 2_ Realizar la síntesis de los distintos aminoácidos glicosilados (S* y T*), adecuadamente protegidos, para después incorporarlos a la cadena peptídica.

Figura 4.2:Treonina GalNAc (T*). Figura 4.1: Serina GalNAc (S*).

3_ Realizar el acoplamiento de los distintos aminoácidos mediante la técnica SPPS excepto los aminoácidos glicosilados que se han realizado de forma manual para después incorporarlos al sintetizador automático para incorporar los aminoácidos restantes. Particularmente se llevará a cabo la síntesis de: - Una modificación del PAMP constituido por los últimos 9 aminoácidos:

KWNKWALSR-NH2

- Una modificación del anterior pero cambiando la serina (S) por treonina (T):

KWNKWALTR-NH2

- Una modificación del PAMP reducido pero cambiando la serina (S) por una

serina glicosilada (GalNAc-Ser, S*):

KWNKWALS*R-NH2

- Una modificación del PAMP reducido pero esta vez cambiando la serina (S) por una treonina glicosilada (GalNAc-Thr, T*):

- KWNKWALT*R-NH2

Posteriormente a su síntesis, es necesario llevar a cabo su purificacíon y caracterización.

4_Realizar unos ensayos biológicos sobre los distintos péptidos sintetizados para observar su actividad, en concreto, la velocidad de polimerización de la tubulina.

O

OAc

AcO

ONHAc

OAc

OH

O

HN

FmocO

OAc

AcO

ONHAc

OAc

OH

O

HN

Fmoc

5. Discusión de resultados

23Discusiónderesultados

5.1 Síntesis del glicosilaminoácido GalNAc-Thr. Partiendo del aminoácido treonina (compuesto 5), lo primero que se hace es proteger el grupo amina ya que es reactivo. Para ello se utiliza la N-Fmocsuccinimida (Fmoc-O-Suc) en medio básico y a temperatura ambiente. De esta forma obtenemos el compuesto 6 después de una serie de lavados para eliminar el exceso de los reactivos y subproductos de la reacción.

Ahora, el segundo objetivo es la protección del ácido en forma de éster terc-butílico. Se realiza en atmósfera inerte; para ello se mezcla el tricloroacetimidato de terc-butilo con ciclohexano por una parte, y por otra el compuesto 6 con AcOEt. Se añade gota a gota la disolución del acetimidato a la del compuesto 6 y así se obtiene el compuesto 7 (éster) despues de 12 h. Este compuesto se purifica mediante cromatografía de columna, obteniendo un rendimiento del 60%.

Una vez sintetizado uno de los compuestos para realizar la reacción de Koenigs-Knorr (compuesto 7) necesitamos el compuesto 4 el cual se sintetiza en los siguientes pasos:

1_Se parte de la galactosa per-acetilada comercial (compuesto 1) y se hace reaccionar con el ácido bromhídrico. Así se obtiene un intermedio (compuesto 2) que se va a utilizar en la siguiente etapa sin purificación previa.

O CCl3

NH

HO

CO2tBuFmocHN7

24 Discusiónderesultados

2_Se parte del (compuesto 2) y se hace reaccionar con NaH2PO4 y un exceso de Zn a temperatura ambiente. Así se obtiene con buen rendimiento el tri-O-acetilgalactal (compuesto 3). Este compuesto se purifica mediante cromatografía de columna. 3_El galactal obtenido en la reacción anterior (compuesto 3) se hace reaccionar con NaN3, FeCl3.6H2O y H2O2 a -20 ºC. Así se obtiene la cloro-azida (compuesto 4). Con un rendimiento del 50% después de purificación cromatográfica.

*En esta última reacción se obtiene de forma casi exclusiva (>95%) el anómero α.

Ya obtenidos los dos compuestos, se realiza la reacción de Koenigs-Knorr (un halosacárido es atacado por un nucleófilo). El grupo OH de la treonina (compuesto 7) actúa como nucleófilo atacando al C1 del monosacárido (compuesto 4). Las sales de plata se añaden para aumentar la electrofilia del C1 al facilitar la liberación del cloro como grupo saliente.


En la formación del enlace glicosídico entre el grupo hidroxilo del aminoácido y el monosacárido aparecen dos anómeros. Se quiere obtener el anómero α (compuesto 8α) pero el problema que tenemos es que también se obtiene el compuesto 8β con el aminoácido en posición ecuatorial. Al realizar el acoplamiento los anómeros se obtienen en una relación α:β de 7:3, siendo mayoritario el compuesto α que es el que nos interesa. La relación de anómeros se puede determinar realizando un RMN de 1H al crudo de reacción.

Figura 5.1: Productos α (axial) y β (ecuatorial). Se debe tener en cuenta lo siguiente:

- Los desplazamientos químicos de los protones ecuatoriales y axiales son diferentes (el protón H1 del anómero α se observa a campos más bajos que el β).

- Las constantes de acoplamiento de los protones H1,H2-diaxiales (anómero β) son mayores (J_6-7 Hz) que las constantes de acoplamiento axial-ecuatorial de dichos protones correspondiente al anómero α (J_2-4 Hz).

Posteriormente se debe separar el compuesto α y el compuesto β para quedarnos con el que nos interesa (compuesto α) y para ello se realiza una columna cromatográfica. Una vez obtenido el compuesto α debemos transformar la azida en amina para después acetilarla y para ello se realiza una reacción “one pot” a 0 ºC empleando Ac2O como agente acilante.


Para finalizar la síntesis y obtener el glicosil aminoácido adecuadamente protegido para utilizarlo en SPPS se debe eliminar el grupo protector terc-butilo para dejar el grupo ácido libre. *Del mismo modo se realizó la síntesis con el aminoácido serina. 5.2 Síntesis de los péptidos y glicopéptidos por SPPS. Se van a preparar 5 péptidos (el PAMP de 20 aminoácidos y otros cuatro péptidos como versiones reducidas del mismo):

- En primer lugar el PAMP de 20 aminoácidos (PAMP):

ARLDVASEFRKKWNKWALSR-NH2

- Una modificación del mismo constituido por los últimos 9 aminoácidos: KWNKWALSR-NH2

- Una modificación del anterior pero cambiando la serina (S) por treonina (T):

KWNKWALTR-NH2

- Una modificación del PAMP reducido pero cambiando la serina (S) por una

serina glicosilada con α –N-acetilgalactosamina (GalNAc-Ser, S*):

KWNKWALS*R-NH2

- Una modificación del PAMP reducido pero esta vez cambiando la serina (S) por una treonina glicosilada con α –N-acetilgalactosamina (GalNAc-Thr, T*):

KWNKWALT*R-NH2


La síntesis de los distintos péptidos explicados anteriormente se realiza mediante la técnica de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) explicada en el apartado de antecedentes, y asistida por microondas. Se seleccionó la utilización de la resina Rink Amide (figura 5.4) debido a que se obtiene después del “cleavage” el glicopéptido con el extremo C-terminal como amida primaria.

Figura 5.4: Estructura de la resina Rink Amide. En primer lugar, para los péptidos que no llevan el aminoácido glicosilado (los 3 primeros), se sintetizó mediante SPPS la secuencia completa, tanto la de 20 aminoácidos como la reducida de 9 aminoácidos (con serina) y la otra de 9 aminoácidos (con treonina). Para los siguientes dos (glicosilados) también se introdujo mediante la

técnica SPPS el primer aminoácido (Arg). A continuación, se llevó el acoplamiento de manera manual del glicosilaminoácido 10 (con treonina, T*) y el mismo compuesto pero con serina (S*) fuera del sintetizador automático de péptidos con el objetivo de aumentar su rendimiento. Al aminoácido incorporado a la resina en el sintetizador automático (Arg) se añadió el compuesto 10 con el grupo amino protegido en forma de Fmoc. Se añadió HBTU como agente de acoplamiento y diisopropiletilamina (DIEA) como base en DMF como disolvente. Posteriormente es necesario comprobar si se ha realizado correctamente el acoplamiento mediante el test de Kaiser explicado en la parte experimental.

Figura 5.5: Síntetizador automático de péptidos asistido por microondas Liberty Blue de CEM Corporation.


Para finalizar se introdujo el compuesto obtenido en el acoplamiento manual en el sintetizador automático para proceder al acoplamiento de los aminoácidos restantes (Arg-Trp-Asn-Lys-Trp-Ala-Leu-). Una vez obtenidos los distintos péptidos y glicopéptidos se desprotegieron los grupos hidroxilo del carbohidrato mediante una disolución de hidracina y metanol. Se liberó la resina y se desprotegieron las cadenas laterales utilizando TFA,TIS y H2O (proporciones explicadas en la parte experimental) obteniendo así el glicopéptido final (“Cleavage”). Una vez obtenido el glicopéptido final se lava con éter frío y se centrifuga y posteriormente se purifica mediante HPLC. 5.3 Ensayos biológicos El transporte de carga intracelular depende de los microtúbulos (proteínas como la tubulina) y otras proteínas motoras como la kinesina y la dienina. Ya se ha demostrado que el PAMP de 20 aminoácidos aumenta la velocidad de la kinesina. Para cambiar la actividad de la kinesina se requiere una amida terminal; también se ha demostrado que del péptido PAMP de 20, los últimos 9 (PAMP12-20 ) aminoácidos presentan similar actividad. Por otra parte, fragmentos de péptidos pequeños como PAMP18-20 son capaces de retrasar la polimerización de la tubulina. Por lo tanto, es aquí donde se va a centrar nuestro ensayo. Se pesaron distintas cantidades de los 5 péptidos sintetizados en el laboratorio y también el PAMP de 20 aminoácidos comercial disponible en el CIBIR, adquirido a la empresa Phoenix. Se disolvieron en la cantidad de H2O correspondiente para hacer una concentración de 100 µM. Se hicieron disoluciones para tener en cada ensayo una concentración de 10 µM. Por último, se pusieron las distintas muestras en sus respectivos pocillos y se utiliza un espectrofotómetro para medir su absorbancia. Como se puede observar en la figura 5.6, en base a la línea de control, tanto la treonina (T) como la treonina GalNAc (T*) presentan una absortividad mayor con respecto a las otras modificaciones del PAMP de 20. Esto quiere decir que tiene una mayor actividad, por lo tanto estos datos preliminares obtenidos son importantes para un posterior análisis más exhaustivo acerca de estas dos variaciones.


Figura 5.6: Gráfica de la absortividad frente al tiempo de los distintos péptidos.

6. Conclusiones

33Conclusiones

Basándome en los objetivos descritos anteriormente las conclusiones del trabajo son las siguientes:

- La síntesis del PAMP de 20 aminoácidos mediante la técnica SPPS automáticamente se realizó con éxito.

Ala-Arg-Leu-Asp-Val-Ala-Ser-Glu-Phe-Arg-Lys-Lys-Trp-Asn-Lys-Trp-Ala-Leu-Ser-Arg-NH2

- La síntesis de los aminoácidos tanto de serina GalNAc (S*) como de

treonina GalNAc (T*) se realizó con éxito. Su posterior acoplamiento de forma manual a la cadena peptídica de unas modificaciones reducidas del PAMP de 20 aminoácidos sintetizadas de manera automática mediante la técnica SPPS y su purificación y caracterización se realizó con éxito.

Figura 6.1: Glicosilaminoácidos protegidos. Derivados reducidos: Lys-Trp-Asn-Lys-Trp-Ala-Leu-Ser-Arg-NH2

Lys-Trp-Asn-Lys-Trp-Ala-Leu-Thr-Arg-NH2

Lys-Trp-Asn-Lys-Trp-Ala-Leu-Ser (α-GalNAc)-Arg-NH2

Lys-Trp-Asn-Lys-Trp-Ala-Leu-Thr (α-GalNAc)-Arg-NH2

- El ensayo biológico muy preliminar que se realizó del PAMP de 20 aminoácidos y sus 4 modificaciones dieron unos resultados interesantes; por lo que, se hará un posterior análisis más exhaustivo.

O

OAc

AcO

ONHAc

OAc

OH

O

HNFmoc

R

R= Me: Thr*

R= H: Ser*

7. Parte experimental

37Parteexperimental

Los espectros de Resonancia Magnética Nuclear de

1H y

13C se realizaron en los

espectrómetros Bruker Avance-400 y Bruker ARX-300. Los desplazamientos químicos se expresaron en ppm en la escala δ y las constantes de acoplamiento (J) en Hz. Se utilizaron como disolventes deuterados cloroformo, con TMS como referencia interna y agua deuterada, con referencia interna del propio disolvente.

Los análisis de electrospray-espectrometría de masas (ESI-MS) se realizaron en un equipo microTOF-Q-BRUKER con fuente MultiMode, ionización ESI+APCI y se registraron en modo de ión positivo.

La cromatografía de capa fina se llevó a cabo en placas de silicagel (Polychrom SI F254) sobre soporte de poliéster y para su visualización se utilizó luz ultravioleta, disolución reveladora de H2SO4 al 5% en etanol y revelador de ácido fosfomolíbdico en etanol.

La cromatografía de columna se realizó utilizando silicagel de 0.04-0.06 mm (230-240 mesh).

La síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) se realizó en un sintetizador automático asistido por microondas Discover Liberty Blue de CEM Corporation.

38 Parteexperimental

7.1 Síntesis de los diferentes compuestos (2-10)

α-D-tetra-O-acetil-1-bromogalactopiranosa (2)

Se parte de la galactosa peracetilada (compuesto 1, 20.0 g), la cual se disuelve primeramente en CH2Cl2 (100 mL) en un matraz de 0.5 L. Se añade lentamente HBr (30 mL cc) y se deja bajo agitación durante 3-4 h a temperatura ambiente. Transcurridas esas horas, se neutraliza la mezcla con una disolución saturada de NaHCO3 (≈100 mL) y se extrae en dos porciones de CH2Cl ó éter (2 x 100 mL). Una vez extraída toda la fase orgánica se seca con Na2SO4 anhidro (3 cucharadas), se filtra y se pone en el rotavapor para eliminar el disolvente, así obtenemos el compuesto 2, el cual tiene un aspecto aceitoso (21.5 g, 51.4 mmol).

3,4,6-Tri-O-acetil-D-galactal (3)

Se disuelve el compuesto 2 (21.5 g, 51.4 mmol) en acetona (300 mL, 1 eq). Se añade exceso de Zn (40 g, 611.6 mmol, 13 eq), NaH2PO4 (2 g, 16.67 mmol, 0.3 eq) y por último se añade una disolución saturada de NaH2PO4 (20 mL, 0.4 mL/mmol). Se deja reaccionar durante una noche entera bajo agitación y a temperatura ambiente. Al día siguiente se pincha y si todo ha ido bien se añade AcOEt y se filtra en diatomeas. La disolución obtenida se pone en el rotavapor para eliminar la acetona, luego se redisuelve en diclorometano (DCM) y se realiza una extracción con NaCl saturado, se seca con Na2SO4 anhidro, se filtra y se evapora. El producto obtenido se purifica mediante una columna cromatográfica con eluyente Hex:AcOEt (6:4). Así se obtiene el compuesto 3 con un aspecto aceitoso (14.0 g, 51.4 mmol).

Los datos espectroscópicos obtenidos coinciden con los descritos en la literatura16.

16 C.Plattner,.; M. Höfner, ; N. Sewald, Org. Lett. 13 (2011) 545-547.

39Parteexperimental

α-D-3,4,6-Tri-O-acetil-2-azido-1-cloro-2-desoxigalactopiranosa (4)

Se disuelve el compuesto 3 (14.0 g, 51.4 mmol, 1 eq) en CH3CN (350 mL), posteriormente se añade FeCl3.6H2O (11.10 g, 41.12 mmol, 0.8 eq), NaN3 (3.68 g, 56.54 mmol, 1.1 eq) y H2O2 (6.52 mL, 56.54 mmol, 1.1 eq). Se deja la mezcla bajo agitación a -20ºC durante 6-7 h mediante el empelo del dedo frío. Una vez finalizada la reacción el compuesto obtenido se purifica mediante una columna cromatográfica en eluyente Hex:AcOEt (6:4). Así obtenemos el compuesto 4 con un aspecto aceitoso y de color amarillo (4.9 g, 13.4 mmol, 50%).

Fmoc-L-Thr-OH (6)

En un matraz esférico de 1L se disuelve L-treonina comercial (5) (10.0g, 95.15 mmol) en una mezcla de CH3CN:H2O (300 mL 2:1) y se añade NaHCO3 (24.0 g, 285.68 mmol, 3 eq). Una vez disuelto, se añade Fmoc-O-Suc (48.14 g, 142.71 mmol, 1.5 eq). Se deja reaccionar durante 2 días a temperatura ambiente. Transcurridos los dos días se evapora el CH3CN y la fase acuosa se extrae con Et2O. Posteriormente se añade H2SO4 hasta pH ácido, observándose un precipitado blanco. Se añade agua y se extrae con AcOEt (3 x 50 mL). La fase orgánica se seca con Na2SO4 anhidro, se filtra y se evapora en el rotavapor. Así se obtiene el compuesto 6 con un aspecto espumoso blanco (17.3 g, 19.3 mmol, 60%).


Fmoc-L-Thr-OtBu (7)

Se añade en un matraz el compuesto 6 (3.8 g, 11.12 mmol, 1 eq) y se disuelve en AcOEt (57 mL); en otro matraz se añade tricloroacetimidato de terc-butilo (4 mL, 22.24 mmol) disuelto en ciclohexano ( 21.8 mL). Se pone bajo agitación el compuesto 6 ya disuelto y se añade gota a gota con un dispensador la disolución del acetimidato y se deja reaccionar durante 12 h. Al finalizar la reacción se evapora en el rotavapor y se redisuelve en DCM para precipitar el producto de partida, posteriormente lo ponemos en N2 líquido para ayudar a que precipite y después se filtra para eliminar el precipitado. Para finalizar se evapora todo en el rotavapor y se realiza una columna cromatográfica Hex:AcOEt (7:3). Así se obtiene el compuesto 7 con un aspecto espumoso blanco (2.96 g, 7.44 mmol, 60%).

Fmoc-L-Thr(α-O-D-Tri-O-acetil-2-azido-2-desoxigalactopiranosil)-OtBu (8α)

En primer lugar se activa el tamiz molecular de 4 Å durante 4 h a 600 ºC. A continuación, se añade en un schlenk. Esta reacción se realiza bajo atmósfera inerte por lo que se utilizaran disolventes secos. En el schlenk se introduce el compuesto 7 (2.96 g, 7.44 mmol) y el Ag2CO3 (3.07 g, 11.17 mmol, 1.5 eq) en una mezcla de disolventes tolueno/DCM (24 mL/37 mL) bajo agitación a 0ºC durante 30 min. Posteriormente se añade gota a gota el AgClO4 (0.386 g, 1.86 mmol, 0.25 eq) previamente disuelto en tolueno (10 mL). A continuación se añade el compuesto 4 (4.9 g, 13.4 mmol, 1.8 eq) disuelta en una mezcla de disolventes tolueno/DCM (37 mL/ 37 mL). La reacción se deja durante 8h a temperatura ambiente y protegida con papel de plata porque es fotosensible. Una vez finalizada la reacción, se filtra en diatomeas y el crudo de reacción se purifica mediante una columna cromatográfica de eluyentes tolueno:acetona (9:1). Así se obtiene el compuesto 8α que tiene un aspecto espumoso blanco (2.3 g, 3.3 mmol, 39%). Sus propiedas físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los descritos en la bibliografía17.

17R. U: Lemieux, ; R. M. Ratcliffe,. J. Can . Chem. 57 (1979) 1244-1251.

41Parteexperimental

Fmoc-L-Thr(α-O-D-Tri-O-acetil-N-acetilgalactosaminil)-OtBu (9)

Se disuelve el compuesto 8α (2.3 g, 3.3 mmol, 1 eq) en THF (30 mL), AC2O (20 mL) y HAcO (10 mL) en un baño de hielo. A continuación, se añade Zn (2.81g, 42.92 mmol, 13 eq) previamente activado y una disolución de CuSO4 saturada (4.95 mL, 1.5 mL/meq) y la mezcla se agita durante 2h. Posteriormente, se filtra en diatomeas, la fase obtenida se lava con NaHCO3 saturado, se seca con NaSO4 anhidro, se filtra y se evapora en el rotavapor. Así se obtiene el compuesto 9 (0.600 g, 0.890 mmol, 39%).

Fmoc-L-Thr(α-O-D-Tri-O-acetil-N-acetilgalactosaminil)-OH (10)

Se disuelve el compuesto 9 (0.600 g, 0.890 mmol) en CH2Cl2 (15 mL) y se añade TFA (15 mL). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 2h. A continuación, se evapora en el rotavapor para eliminar el TFA y obteniendo así el compuesto 10 (0.490 g, 0.608 mmol, 95%) con un aspecto espumoso de color blanco.

Los datos espectroscópicos coindicen con los descritos en la literatura 18.

18 a) H. Cai.; Z. H. Huang. ; L. Shi .; P. Zou, ; Y. F. Zhao ; H. Kunz ; Y. M.Li ; Eur. J. Org. Chem. (2011) 3685-3689. b) B. Liebe, ; H. Kunz, Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 36 (1997) 618-621.


ARLDVASEFRKKWNKWALSR-NH2 (11) HRMS (ESI+) (m/z) C 112 H 182 N 36 O 27 615.8488 4+ (z) KWNKWALSR-NH2 (12)

Figura 7.1: Estructura del péptido 12. HRMS (ESI+) (m/z) C 56 H 88 N 18 O 11 594.3434 2+ (z) 1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm): 0.88-0.95 (m, 7H, Leuγ, Leuδ), 1.31 (d, J = 7.2 Hz, 3H, Alaβ), 1.35-1.50 (m, 6H, Arg γ, Leuβ, Lys1γ1, Lys2 γ1), 1.53-1.77 (m, 9H, Lys1γ2, Lys2γ2, Lys1β1, Lys2β1, Lys2β2, Lys1δ, Lys2δ), 1.83-1.90 (m, 3H, Lys1β2, Argβ), 2.47-2.57 (m, 2H, Asnβ), 2.72-2.76 (m, 2H, Lys2ε), 2.97 (t, J = 7.7 Hz, 2H, Lys1ε), 3.12 (t, J = 6.9 Hz, 1H, Arg δ), 3.16-3.38 (m, 4H, Trp1β, Trp2β), 3.80 (t, J = 6.7 Hz, 1H, Leuα), 3.83-3.92 (m, 4H, Serβ), 4.00 (t, J = 6.6 Hz, 1H, Argα), 4.20 (q, J = 7.1 Hz, 1H, Alaα), 4.27-4.32 (M, 2H, Lys1α, Lys2α), 4.42 (t, J = 5.6 Hz, 1H, Serα), 4.51 (t, J = 6.7 Hz, 1H, Asnα), 4.61-4.68 (m, 2H, Trp1α, Trp2α), 7.10-7.26 (m, 6H, Trp1(5,6,2), Trp2(5,6,2)), 7.45 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp1(7)), 7.49 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp2(7)), 7.58 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp1(4)), 7.63 (d, J = 7.9 Hz, 1H, Trp2(4))

KWNKWALTR-NH2 (13)

Figura 7.2: Estructura del péptido 13.

HRMS (ESI+) (m/z) C 57 H 90 N 18 O 11 601.3513 2+ (z) 1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm): 0.89-0.96 (m, 7H, Leuγ, Leuδ), 1.22 (d, J = 6.4 Hz, 3H, Thrγ), 1.32 (d, J = 7.2 Hz, 3H, Alaβ), 1.36-1.50 (m, 6H, Arg γ, Leuβ, Lys1γ1, Lys2 γ1), 1.53-1.77 (m, 9H, Lys1γ2, Lys2γ2, Lys1β1, Lys2β1, Lys2β2, Lys1δ, Lys2δ), 1.80-1.91 (m, 3H, Lys1β2, Argβ), 2.45-2.55 (m, 2H, Asnβ), 2.72-2.76 (m, 2H, Lys2ε), 2.98 (t, J = 7.7 Hz, 2H, Lys1ε), 3.12 (t, J = 7.0 Hz, 1H, Arg δ), 3.16-3.38 (m, 4H, Trp1β, Trp2β), 3.80 (t, J = 6.7 Hz, 1H, Leuα), 4.01 (t, J = 6.6 Hz, 1H, Argα), 4.19-4.35 (m, 5H, Thrβ, Thrα, Alaα, Lys1α, Lys2α ), 4.51 (t, J = 6.7 Hz, 1H, Asnα), 4.62-4.68 (m, 2H, Trp1α, Trp2α), 7.10-7.26 (m, 6H, Trp1(5,6,2), Trp2(5,6,2)), 7.45 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp1(7)), 7.50 (d, J = 8.2 Hz, 1H, Trp2(7)), 7.58 (d, J = 7.9 Hz, 1H, Trp1(4)), 7.63 (d, J = 7.9 Hz, 1H, Trp2(4))

43Parteexperimental

KWNKWALS*R-NH2 (14)

Figura 7.3: Estructura del péptido 14.

HRMS (ESI+) (m/z) C 64 H 101 N 19 O 16 695.8831 2+ (z) 1H RMN (300 MHz, D2O) δ (ppm): 0.89-0.96 (m, 7H, Leuγ, Leuδ), 1.3 (d, J = 7.2 Hz, 3H, Alaβ), 1.34-1.49 (m, 6H, Arg γ, Leuβ, Lys1γ1, Lys2 γ1), 1.56-1.91 (m, 12H, Lys1γ2, Lys2γ2, Lys1β1, Lys2β1, Lys2β2, Lys1δ, Lys2δ, Lys1β2, Argβ), 2.01 (s, 3H, Ac) 2.49-2.51 (m, 2H, Asnβ), 2.67-2.80 (m, 2H, Lys2ε), 2.89-3.04 (m, 2H, Lys1ε), 3.17 (t, J = 6.7 Hz, 1H, Arg δ), 3.23-3.39 (m, 4H, Trp1β, Trp2β), 3.69-4.02 (m, 3H, Leuα, Gal6,Gal3, Gal4, Argα, Gal5), 4.10-4.13 (dd, J = 10.1, 3.6 Hz, 1H, Gal2), 4.13-4.40 (m, 6H, Alaα, Lys1α, Lys2α, Serβ, Serα), 4.50 (t, J = 6.7 Hz, 1H, Asnα), 4.58-4.68 (m, 2H, Trp1α, Trp2α), 4.86 (d, J = 3.4 Hz, 1H, Gal1), 7.10-7.27 (m, 6H, Trp1(5,6,2), Trp2(5,6,2)), 7.45 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp1(7)), 7.50 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp2(7)), 7.58 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp1(4)), 7.63 (d, J = 7.6 Hz, 1H, Trp2(4))

KWNKWALT*R-NH2 (15)

Figura 7.4: Estructura del péptido 15. HRMS (ESI+) (m/z) C 65 H 103 N 19 O 16 702.8910 2+ (z) 1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm): 0.91-0.98 (m, 7H, Leuγ, Leuδ), 1.28 (d, J = 6.3 Hz, 3H, Thrγ), 1.32 (d, J = 7.2 Hz, 3H, Alaβ), 1.36-1.50 (m, 6H, Arg γ, Leuβ, Lys1γ1, Lys2 γ1), 1.53-1.91 (m, 12H, Lys1γ2, Lys2γ2, Lys1β1, Lys2β1, Lys2β2, Lys1δ, Lys2δ, Lys1β2, Argβ), 2.04 (s, 3H, Ac) 2.47-2.57 (m, 2H, Asnβ), 2.72-2.76 (m, 2H, Lys2ε), 2.98 (t, J = 7.6 Hz, 2H, Lys1ε), 3.19 (t, J = 6.7 Hz, 1H, Arg δ), 3.22-3.39 (m, 4H, Trp1β, Trp2β), 3.65-3.79 (m, 3H, Leuα, Gal6), 3.86-3.89 (m, 2H, Gal3, Gal4) 3.97-4.02 (m, 2H, Argα, Gal5), 4.11 (dd, J = 10.1, 3.6 Hz, 1H, Gal2), 4.22-4.32 (m, 3H, Alaα, Lys1α, Lys2α ), 4.44-4.57 (m,3H, Thrβ, Thrα, Asnα), 4.64-4.68 (m, 2H, Trp1α, Trp2α), 4.89 (d, J = 3.8 Hz, 1H, Gal1), 7.11-7.27 (m, 6H, Trp1(5,6,2), Trp2(5,6,2)), 7.46 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Trp1(7)), 7.51 (d, J = 8.2 Hz, 1H, Trp2(7)), 7.59 (d, J = 7.9 Hz, 1H, Trp1(4)), 7.63 (d, J = 7.9 Hz, 1H, Trp2(4))


7.2 Procedimiento experimental de acoplamiento de los diferentes glicopéptidos por SPPS

7.2.1 Acoplamiento de los distintos aminoácidos por el sintetizador automático:

Se preparan las disoluciones necesarias dependiendo de los aminoácidos que se van a utilizar, todos ellos disueltos en DMF.

Los aminoácidos deben tener una concentración de 0.2 M. Para cada acoplamiento se usan 2.5 mL por lo tanto 0.2 x 2.5=0.5 mmoles de cada aminoácido para cada acoplamiento (5 eq).

Se utiliza un ligero exceso de DMF para cada aminoácido.

Tabla 7.1: Datos de las distintas cantidades de aminoácido.

También hace falta preparar las disoluciones del activador, de la resina, de la oxyma y la desprotección.

Tabla 7.2: Datos del activador, resina, oxyma y la desprotección.

Aminoácido mL g

Ala 3 0.19

Arg 18 2.34

Asn 3 0.36

Leu 3 0.22

Lys 6 0.57

Thr 3 0.24

Thp 6 0.64

Desprotección 12 mL de Piperidina en 60 ml de DMF

Act (Dic) 0.5M 1 mL x 0.5M =0.5 mmoles (5 eq)

Oxyma 1M 0.5 mL x 1M = 0.5 mmoles (5 eq)

Resina (Rink amide)

0.128 g para tener 0.1 mmoles

45Parteexperimental

*Se utiliza una temperatura de 90 ºC tanto para el acoplamiento como en la desprotección y cada acoplamiento de los aminoácidos tarda 4 min y la respectiva desprotección 1.5 min.

Una vez preparadas todas las disoluciones e introducidas en sus respectivos recipientes del sintetizador, introducimos la resina (Rink Amide) en una jeringa en la que se introduce la sonda del sintetizador. Posteriormente, se programan los aminoácidos que se van a acoplar y su orden. El propio sintetizador realiza tanto el acoplamiento como la desprotección como los diferentes lavados necesarios.

7.2.2 Acoplamiento manual del aminoáciodo:

Ya sintetizada mediante la técnica SPPS la Arg (R), se acopla de manera manual el glicosilaminoácido correspondiente (S* ó T*). Se utiliza el “building block” (compuesto 10), también se ha realizado con el compuesto de serina (S*).En primer lugar se añade HBTU (51 mg, 0.9 eq) que actúa como agente de acoplamiento, el aminoácido 1.5 eq (Thr= 101 mg, Ser= 98.5 mg) y la resina disueltos en 1 mL de DMF. Posteriormente, se añade 0.5 mL de DIEA (0.5 M en NMP) que actúa como base. Finalmente, se añade la mezcla sobre la secuencia sintetizada en el sintetizador automático (Arg) y se pone a reacción toda la noche recubierto de papel de plata ya que la HBTU es fotosensible.

Una vez finalizada la reacción se comprueba si el acoplamiento ha sido correcto mediante el test de Kaiser.

Test de Kaiser (Figura 7.5): Procedimiento que se basa en el cambio de coloración de la resina. Para ello se toma una alícuota de la resina que se lava con MeOH, se añade a un bote clip pequeño y se le adiciona 15 gotas de PhOH, 15 gotas de ninhidrina y 15 gotas de KCN. Luego se calienta con el secador y se observa el color de la resina. Si se observa de color azul, la ninhidrina ha reaccionado con los grupos aminos libres y por tanto, la reacción de acoplamiento no se ha completado; sin embargo si la resina no cambia de color indica que ya no hay grupos aminos libres por lo que el acoplamiento ha finalizado.

Posteriormente se introduce la secuencia en el sintetizador automático para terminar de acoplar los aminoácidos correspondientes (Arg-Trp-Asn-Lys-Trp-Ala-Leu-).


Figura 7.5: Equema global del test káiser.

7.2.3 Obtención del péptido ya purificado.

Una vez obtenidos los diferentes péptidos se liberan de la resina y se desprotegen las cadenas laterales utilizando 4 mL de una disolución formada por (3.8 mL de TFA, 100 µl de tis(triisopropilsilano), 100 µl de agua). Este proceso se denomina “Cleavage”.

Posteriormente se centrifuga utilizando éter frío y se purifica mediante HPLC.

47Parteexperimental

7.3 Ensayos biológicos de los distintos péptidos. Se preparan las distintas disoluciones de los péptidos en H2O para tener una concentración de 100 µM. Para ello pesamos 1 mg del péptido y se disuelve en la cantidad de H2O correspondiente:

Péptido Peso molecular (g/mol) Volúmen (mL) PAMP 20 2460.87 4.063

PAMP 12-20 S 1618.95 6.176 PAMP 12-20 T 1632.97 6.123 PAMP 12-20 S* 1822.03 5.488 PAMP 12-20 T* 1836.03 5.446

Tabla 7.3: Datos de PM y volumen de los distintos péptidos

Una vez se tienen preparadas las diferentes disoluciones se diluyen con una disolución tampón hasta alcanzar una concentración de 10 µM y se añaden en las cubetas que contienen el preparado de tubulina, el cual se ha adquirido comercialmente. Finalmente, se introducen las muestras en el espectrofotómetro y se mide la absorbancia.

Anexo: Espectros de RMN

51Anexos

Caracterización del compuesto PAMP de 20 aminoácidos. 1H RMN 400 MHz en D20 Caracterización del compuesto PAMP de 9 aminoácidos con serina. 1H RMN 400 MHz en D20

52 Anexos

Caracterización del compuesto PAMP de 9 aminoácidos con treonina. 1H RMN 400 MHz en D20

Caracterización del compuesto PAMP de 9 aminoácidos con treonina-GalNAc (T*). 1H RMN 400 MHz en D20

53Anexos

Caracterización del compuesto PAMP de 9 aminoácidos con serina-GalNAc (S*). 1H RMN 400 MHz en D20

síntesis y estudio de la actividad biológica del …esqueleto de péptidos y proteínas y...

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