skm marker neg. kon. herz tor herz nor lpl 310 603 872 pdk-4 abb. 9: agarose gelelektrophorese....
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Skm
Skm
Mar
ker
Mar
ker
Neg
. Kon
.
Neg
. K
on.
Her
z to
r
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Her
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Her
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r
Her
z n o
r
LPL
310
603
872
PDK-4
Abb. 9: Agarose Gelelektrophorese. PDK-4 und LPL cDNA-Fragmente nach PCR-Amplifikation. Aus der Auswahl der Primer ergibt sich für PDK-4 eine Fragmentgröße von 482 bp und für LPL von 498 bp. In der PCR wurde cDNA aus Skelettmuskelgewebe (Skm) normothermer Hamster und Herzmuskelgewebe von torpiden und normothermen Hamstern (Herz tor, Herz nor) eingesetzt.
normotherm torpid
Rat
io P
DK
-4 /
Act
in m
RN
A
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Abb. 11: Densitometrische Auswertung der Autoradiographien aus Abb. 10. Die dargestellten Mittelwerte ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den PDK-4 und den jeweiligen Actin Signalstärken (SEM). RNA aus normothermen Gewebe (N): 0,45 0,06 (n = 7). RNA aus torpidem Gewebe (T): 0,57 0,13 (n = 5). T-Test für nicht verbundenen Stichproben: p= 0,38.
a
b
c
Abb. 10: a,b: Autoradiographien eines Northernblots mit 20 µg Herz-RNA nach Hybridisierung mit PDK-4 und Actin cDNA-Sonden. N: RNA aus Herzmuskelgewebe normothermer Hamster. T: RNA aus Herzmuskelgewebe torpider Hamster. c: Photo des denaturierenden Northerngels vor dem Transfer der RNA auf die Nylonmembran.
PDK-4
Actin
Probe # 1
T
2
N
3
N
4
N
5
N
12
N
11
T
10
T
9
N
8
N
7
T
6
T
28S rRNA
18S rRNA
N/T
Langtag Kurztag
Rat
io P
DK
-4 m
RN
A /
28S
rRN
A
0.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.02.22.42.62.83.0
Abb. 13: Densitometrische Auswertung der Autoradiographien aus Abb. 12. Die dargestellten Mittelwerte ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den PDK-4 und den jeweiligen 28S rRNA Signalstärken (SEM). Herz-RNA von Langtag-Hamstern: 1,6 0,44 (n = 11). Herz-RNA von torpiden und normothermen Kurztag-Hamstern: 1,98 0,79 (n = 11). T-Test für nicht verbundene Stichproben: p= 0,89.
Abb. 12: Obere Abbildung: Autoradiographie eines Northernblots mit 20 µg Herz-RNA pro Bahn von Langtag- und Kurztag-akklimatisierten Hamstern nach Hybridisierung mit der PDK-4 Sonde. Untere Abbildung: Photo des dazugehörigen Northerngels vor dem Transfer der RNA auf die Nylonmembran.
Proben# 1 2 3 4 5 76 4
N
5
N
6
T
7
T
8
N
10
T
9
N
8 9 10 11 1
T
3
N
2
N
11
TN/TLangtag Kurztag
PDK-4
28S rRNA 18S rRNA
Abb. 14 : Für die Klonierung differentieller Sequenzen ausgeschnittene Banden. N-DP2: Zweites Differenzprodukt der Analyse mit normotherm-cDNA als Tester. T-DP2: Zweites Differenzprodukt der Analyse mit torpid-cDNA als Tester.
300
400
500
200
Marker
T3
T2
T1
T4
T-DP2
N2
N3
N1
N-DP2
AMP DP 1 DP2
dens
itom
etris
che
Inte
nsitä
t
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
N: NormothermT: Torpid
Abb. 16: Densitometrische Auswertung der Autoradiographie des Southernblots aus Abb. 15. Die Anreicherung des im N-Amplicon in höherer Konzentration vorhandenen N2/9 cDNA ist als Zunahme der Signalintensitäten nach densitometrischer Messung dargestellt.
Abb. 15: Autoradiographie eines Southernblots nach Hybridisierung mit cDNA des Klons N2/9. Die N2/9 cDNA wurde aus dem zweiten Normotherm-Differenzprodukt (N-DP 2) isoliert. Der Unterschied in der Konzentration der N2/9 cDNA in den Amplicons (AMP) für Normothermie und Torpor (N, T) führte zu einer Anreicherung der Sequenz im ersten und zweiten N-Differenzprodukt (DP1, DP2).
N T N T N T
AMP DP2DP1
AMP DP 1 DP2
dens
itom
etris
che
Inte
nsitä
t
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000 N: NormothermT: Torpid
N T
AMP
N T
DP2
N T
DP1
Abb. 17: Autoradiographie eines Southernblots nach Hybridisierung mit cDNA des Klons T2/6. Die T2/6 cDNA wurde aus dem zweiten Torpid-Differenzprodukt (T-DP 2) isoliert. Der Unterschied in der Konzentration der T2/6 cDNA in den Amplicons (AMP) für Normothermie und Torpor (N, T) führte zu einer Anreicherung der Sequenz im ersten und zweiten T-Differenzprodukt (DP1, DP2).
Abb. 18: Densitometrische Auswertung der Autoradiographie des Southernblots aus Abb. 17. Klon T2/6 war im T-Amplicon etwa 50% stärker repräsentiert. Eine deutliche Anreicherung erfolgte im zweiten T-Differenzprodukt.
N
T
T4/6 T2/6 N3/11
Abb. 19: Mittels Phosphor Imager Screen detektierte Dotblot-Signale. Obere Reihe: Nach Hybridisierung mit dem radioaktiv markierten Amplicon der normotherm-cDNA. Untere Reihe: Nach Hybridisierung mit dem radioktiv markiertem Amplicon der torpid-cDNA. Klon T4/6: Signal 20% intensiver nach Hybridisierung mit den T-Amplicon. Klon T2/6: Signal 40% intensiver nach Hybridisierung mit dem T-Amplicon. Klon N3/11: Ausschließlich nach Hybridisierung mit dem N-Amplicon detektierbar.
normotherm torpid
Rat
io T
3/4
mR
NA
/ 28
S rR
NA
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Abb. 21: Densitometrische Auswertung der Autoradiographie des Northernblots nach Hybridisierung mit der Sonde des Klons T3/4. Die dargestellten Mittelwerte ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den T3/4 und den jeweiligen 28S rRNA (Gelphoto) Signalstärken (SEM). Normotherm: 1,36 0,41 (n=7). Torpid: 1,4 0,14 (n=5). T-Test für nicht verbundene Stichproben: p=0,39.
Abb. 20: a,b: Autoradiographien eines Northernblots mit 30 µg Herz-RNA von torpiden (T) und normothermen Hamstern (N) nach Hybridisierung mit der Sonde des Klons T3/4 und Actin. c: Photo des denaturierenden Northerngels vor dem Transfer der RNA auf die Nylonmembran.
a
b
c
Probe # 1
T
2
N
3
N
4
N
5
N
12
N
11
T
10
T
9
N
8
N
7
T
6
T
Actin
18S rRNA
28S rRNA
T3/4
N/T
normotherm torpid
T2-6
mR
NA
/ 28
S rR
NA
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0*
Abb. 23: Densitometrische Auswertung der Autoradiographie des Northernblots nach Hybridisierung mit der Sonde des Klons T2/6. Die dargestellten Mittelwerte ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den T2/6 und den jeweiligen 28S rRNA (Gelphoto) Signalstärken (SEM). Normotherm: 1,33 0,02 (n=7). Torpid: 1,8 0,11 (n=5). T-Test für nicht verbundene Stichproben: p=0,0142.
Abb. 22: a,b: Autoradiographien eines Northernblots mit 30 µg Herz-RNA von torpiden (T) und normothermen Hamstern (N) nach Hybridisierung mit der Sonde des Klons T2/6 und Actin. c: Photo des denaturierenden Northerngels vor Transfer der RNA auf die Nylonmembran.
T2/6
Probe # 1
T
2
N
3
N
4
N
5
N
12
N
11
T
10
T
9
N
8
N
7
T
6
T
Actin
18S rRNA
28S rRNA
a
b
c
N/T
Abb. : 20 µg Herz-RNA Hybrid. mit N2/9
Probe # 1
T
2
N
3
N
4
N
5
N
12
N
11
T
10
T
9
N
8
N
7
T
6
T
N2/9
normotherm torpid
Rat
io P
DK
-4 m
RN
A /
28S
rRN
A
0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.21.31.41.5
Abb. 11: Densitometrische Auswertung der Autoradiographie aus Abb. 10. Die dargestellten Mittelwerte ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den PDK-4 Signalstärken auf der Autoradiographie und den jeweiligen 28S rRNA Signalstärken des Gelphotos (+/- SEM). RNA aus normothermen Gewebe (N): 0,78 +/- 0,09 (n = 7). RNA aus torpidem Gewebe (T): 0,94 +/- 0,13 (n = 5). T-Test für nicht verbundenen Stichproben: p= 0,304.
Abb. 10: Autoradiographie eines Northernblots mit 20 µg Herz-RNA nach Hybridisierung mit PDK-4 und Actin cDNA. N: RNA aus Herzmuskelgewebe normothermer Hamster . T: RNA aus Herzmuskelgewebe aus Gewebe torpider Hamster.
PDK-4
Actin
Probe # 1
T
2
N
3
N
4
N
5
N
12
N
11
T
10
T
9
N
8
N
7
T
6
T
28S rRNA
18S rRNA
a
b
c
Langtag Kurztag
Rat
io P
DK
-4 m
RN
A /
28S
rRN
A
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Proben # 1 2 3 4 5 76 4
N
5
N
6
T
7
T
8
N
10
T
9
N
8 9 10 11 1
T
3
N
2
N
11
TN/T
Langtag Kurztag
Abb. 12: Autradiographien eines Northernblots mit 20 µg Herz-RNA pro Bahn von Langtag- und Kurztag-akklimatisierten Hamstern nach Hybridisierung mit der PDK-4 Sonde und 28S rRNA Sonde.
PDK-4
28S rRNA
Abb. 13: Densitometrische Auswertung der Autoradiographien aus Abb. 12. Die dargestellten Mittelwerte ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den PDK-4 und den jeweiligen 28S rRNA Signalstärken (+/- SEM). Herz-RNA von Langtag-Hamstern: 0,38 +/- 0,01 (n = 11). Herz-RNA von torpiden und normothermen Kurztag-Hamstern: 0,39 +/- 0,1 (n = 11). T-Test für nicht verbundenen Stichproben: p= 0,84.