sirna / mirna transfection kit genomone - si6-well 2.5 μl 0.5 μl 10 μl 5μl 18 μl/well×1 well...

1

11

1

GenomONE ®-Si Instruction Manual

siRNA / miRNA transfection KIT

GenomONE - Si 取扱説明書（第 4 版）

1．．．

．概要

概要概要

概要 ................................................................................................................................................. 1

1-1：トランスフェクション原理・概要 ............................................................................................ 1

1-2：製品仕様 ................................................................................................................................... 2

2．細胞への

．細胞への．細胞への

．細胞への siRNA/miRNA の導入

の導入の導入

の導入 ..................................................................................................... 3

2-1：プロトコル(1) 基本プロトコル ................................................................................................ 3

2-2：プロトコル(2) 遠心プロトコル ................................................................................................ 4

2-3：プロトコル(3) 基本プロトコル＋遠心処理 .............................................................................. 5

3．．．

．多種類・多検体の

多種類・多検体の多種類・多検体の

多種類・多検体の siRNA/miRNA の

のの

の迅速

迅速迅速

迅速導入（

導入（導入（

導入（High throughput screening:HTS）））

） ................... 7

3-1：プロトコル(4) HTS-RT 法（リバーストランスフェクション） ............................................... 7

3-2：プロトコル(5) HTS-FT 法（フォワードトランスフェクション） ............................................ 9

4．動物個体への

．動物個体への．動物個体への

．動物個体への siRNA の導入（

の導入（の導入（

の導入（in vivo）））

） ....................................................................................... 11

4-1：プロトコル(6) in vivo siRNA/miRNA 導入用 ........................................................................... 11

使用

使用使用

使用上の注意

上の注意上の注意

上の注意 ...................................................................................................................................... 12

1．概要．概要．概要．概要 1-1：トランスフェクション原理：トランスフェクション原理：トランスフェクション原理：トランスフェクション原理・概要・概要・概要・概要

HVJ Envelope（以下 HVJ-E）内に siRNA、miRNA を封入して HVJ-E ベクターとし、融合(F)タン

パク質の膜融合活性を利用して標的細胞や組織に導入します。

基本のプロトコル(1)では、5 ステップ(5～10 分)でトランスフェクションが完了します。

この取扱説明書（以下「本書」と表記）では、GenomONE®-Si を用いて siRNA/miRNA をトランスフェクションする際の標準的な方法を記載し

ています。ここに記載された方法である程度の導入効率を得ることが可能ですが、細胞種ごとに最適となる条件は異なりますので、注意事項等

に記載のある項目について、適宜条件の最適化を行っていただくことをお勧めします。

®

①①①① ②②②② ③③③③ ④④④④ ⑤⑤⑤⑤

HVJ

HVJHVJ

HVJ-

--

-E

EE

E

懸濁液

懸濁液懸濁液

懸濁液

封入

封入封入

封入

促進剤

促進剤促進剤

促進剤

siRNA

siRNAsiRNA

siRNA

miRNA

miRNAmiRNA

miRNA

導入

導入導入

導入

ｴ

ｴｴ

ｴﾝﾊﾝｻｰ

ﾝﾊﾝｻｰﾝﾊﾝｻｰ

ﾝﾊﾝｻｰ

細胞に

細胞に細胞に

細胞に

添加

添加添加

添加

2

22

2


1-2：製品仕様：製品仕様：製品仕様：製品仕様

内容および容量

製品名製品コード

冷蔵（2～8℃）保存

Freeze-dried HVJ-E Reagent D Reagent E Buffer

0.26mL 相当/本 0.5mL/本 4.0mL/本 6.5mL/本

GenomONE-Si

GS001 1 1 1 1

GS004 4 1 1 1

GS016 16 4 4 4

GS040 40 10 10 10

【補助試薬の役割】

【補助試薬の役割】【補助試薬の役割】

【補助試薬の役割】

Reagent D（封入剤）：HVJ-E の膜の透過性を高めます。

Reagent E（導入エンハンサー）：siRNA/miRNA を封入した HVJ-E ベクターと細胞(または組織)

との親和性を高め、導入効率を向上させます。

【使用回数】

【使用回数】【使用回数】

【使用回数】

製品コード HVJ-E

（本）

使用回数 assays (wells)

6-well plate 24-well plate 96-well plate 384-well plate

GS001 1 100 400 2,000 5,000

GS004 4 400 1,600 8,000 20,000

GS016 16 1,600 6,400 32,000 80,000

GS040 40 4,000 16,000 80,000 200,000

【保存安定性】

【保存安定性】【保存安定性】

【保存安定性】

キットの品質保証期限：HVJ-E のアルミ袋に記載

Freeze-dried HVJ-E は加湿により活性が低下しますので、必ずアルミ袋に密封して冷蔵(2～8℃)で保

存してください。

Buffer を用いて調製後の HVJ-E 懸濁液：分注後-80℃で 6 ヶ月間（凍結融解は 3 回まで可能です）。

冷蔵庫に保存しないでください。

【品質】

【品質】【品質】

【品質】

HVJ-E は、ウイルスを原料としていますが、その増殖性、感染性を完全に不活化した精製品です。

無菌試験でバクテリア、カビ類の混入がないことを確認しています。

血清存在下においても、培養細胞に siRNA や miRNA を導入することが可能です。

HVJ Envelope (HVJ-E)は、センダイウイルス (HVJ:Hemagglutinating virus of

Japan) のゲノムRNAを完全に不活化・精製し、外膜にあるHN、Fタンパク質の結

合および膜融合活性のみを残した粒子 (不活化センダイウイルス粒子) です。増殖

性・感染性はありません。

汎用される正電荷脂質系の導入試薬と異なり、膜融合を介して目的分子が直接細

胞質内に導入されますので、リソソームでの分解を受けにくい利点があります。

HHVVJJ EEnnvveellooppee（（HHVVJJ--EE））ととはは??

HVJ

(Sendai virus)

HVJ Envelope (HVJ-E)

(inactivated Sendai virus)

不活化

F protein HN protein

精製

3

33

3


2．．．．細胞への細胞への細胞への細胞への siRNA/miRNAの導入の導入の導入の導入

2-1. プロトコルプロトコルプロトコルプロトコル(1) 基本プロトコル基本プロトコル基本プロトコル基本プロトコル

【適用】

接着系、浮遊系何れの細胞も、初回はプロトコル(1)でご検討ください。

▼HVJ-E懸濁液の調製

Freeze-dried HVJ-Eに、氷冷したBuffer0.26mLを添加し、泡立たないよう穏やかにピペッティングして

均一な懸濁液としてください。懸濁後は活性の低下を防ぐため直ちに氷冷してください。保存法はP. 2

を参照。

▼使用上の注意

・

・・

・HVJ-E 懸濁

懸濁懸濁

懸濁液

液液

液、

、、

、siRNA/miRNA溶液、

溶液、溶液、

溶液、Reagent D、

、、

、Reagent Eははは

は氷冷したものを

氷冷したものを氷冷したものを

氷冷したものをご

ごご

ご使用ください。

使用ください。使用ください。

使用ください。

▼オリゴ型 siRNA/miRNA 溶液濃度：10μM(2～50μM)（21nt siRNA:10μM＝10pmol/μL= ～0.14μg/μL）

▼プロ

プロプロ

プロトコル

トコルトコル

トコル (1)

基本プロトコル

基本プロトコル基本プロトコル

基本プロトコル

Step 手順試薬量（6-well plate 1well分）

① HVJ-E懸濁液をマイクロテストチューブに採取 HVJ-E懸濁液： 2.5μL

② Reagent Dを添加・混合（タッピング） Reagent D ： 0.5μL

③ siRNAまたはmiRNA溶液を添加・混合（タッピング） siRNA/miRNA溶液： 10μL

④ Reagent Eを添加・混合（タッピング） Reagent E ： 5μL

⑤

Step④で調製した懸濁液をwell 中の細胞培養液に添加し、

37℃・5%CO2 下で培養

※1（必要に応じて0.5～4時間後に培

地交換）

HVJ-Eベクター懸濁液

（①+②+③+④)： 18μL

①～④の操作は、必ず氷上で行ってください（温度上昇によるHVJ-Eの活性低下を防ぐため）。

Reagent Dの添加量は、HVJ-E懸濁液の1/5量としてください。 ※1：遺伝子サイレンシング効果は適切な時間にモニタリング（例：実験系にもよりますがトランスフェクション

後6～72時間）してください。

プレートサイズ別試薬量（添加量/well）

プレート

サイズ

HVJ-E 懸濁液 Reagent D siRNA/miRNA Reagent E HVJ-E ベクター懸濁液 ⑤

① ② ③ ④ 添加量/well

6-well 2.5μL 0.5μL 10μL 5μL 18μL/well×1 well

24-well 2.5μL 0.5μL 10μL 5μL 4.5μL/well×4 wells

96-well 2.5μL 0.5μL 10μL 5μL 0.9μL/well×20 wells

【接着系細胞の細胞数】

プレートサイズ播種細胞数

*

6-well 0.4～2.0×105 cells/2.0mL of medium/well



*トランスフェクションは上記条件で 1日培養後、50～80% confluentの状態で実施

【浮遊系細胞の細胞数】（初代培養免疫系細胞の場合は下記の 10倍の細胞数を目安としてください）

プレートサイズ播種細胞数




4

44

4


【トラブルシューティング】

【トラブルシューティング】【トラブルシューティング】


導入効率が低い場合は、以下の処理で効率を高めることが可能な場合があります。

・ siRNA/miRNA溶液の濃度を上げる

・ HVJ-E懸濁液の添加量を増やす

・プロトコル(3)で検討する

細胞毒性が認められる場合は、以下の対応で毒性を軽減させることが可能な場合があります。

・ HVJ-E懸濁液、Reagent D、Reagent EをBufferで～4倍の範囲で希釈して使用する

・プロトコル(2)(3)で検討する

2-2. プロトコルプロトコルプロトコルプロトコル(2) [遠心プロトコル遠心プロトコル遠心プロトコル遠心プロトコル]

【適用】

プロトコル(1)で細胞毒性が高い場合は、HVJ-E懸濁液にReagent Dを添加･混合した後に遠心、上清除去後

にBufferで再懸濁を行うプロトコル(2)で改善できるケースがあります。



均一な懸濁液としてください。懸濁後は活性の低下を防ぐため直ちに氷冷してください。保存法はP2を

参照。

▼オリゴ型 siRNA/miRNA溶液濃度：10μM(2～50μM)（21nt siRNA:10μM＝10pmol/μL= ～0.14μg/μL）

▼使用上の注意使用上の注意使用上の注意

使用上の注意

HVJ-E懸濁液懸濁液懸濁液

懸濁液、

、、

、siRNA/miRNA溶液、溶液、溶液、

溶液、Reagent D、、、

、Reagent E、、、

、Bufferは氷冷したものをご使用ください。は氷冷したものをご使用ください。は氷冷したものをご使用ください。

は氷冷したものをご使用ください。

▼プロトコル

プロトコルプロトコル

プロトコル(2)

遠心プロトコル

遠心プロトコル遠心プロトコル

遠心プロトコル

Step 手順試薬量（6-well plate 1well 分）



③ 10,000g(10,000～12,000rpm)・4℃で5分間遠心

④ 上清除去後、Bufferで再懸濁 Buffer： 3.0μL

⑤ siRNAまたはmiRNA溶液を添加・混合（タッピング） siRNA/miRNA溶液： 10μL

⑥ Reagent Eを添加・混合（タッピング） Reagent E ： 5μL

⑦ Step⑥で調製した懸濁液を well 中の細胞培養液に添加し、

37℃・5%CO2 下で培養

※1

HVJ-E ベクター懸濁液

（④+⑤+⑥)： 18μL

①～⑥の操作は、必ず氷上で行ってください（温度上昇によるHVJ-Eの活性低下を防ぐため）。

Reagent Dの添加量は、HVJ-E懸濁液の1/5量としてください。 ※1：遺伝子サイレンシング効果は適切な時間にモニタリング（例：実験系にもよりますがトランスフェクション後

6～72時間）してください。


プレート

サイズ

HVJ-E懸濁液 Reagent D Buffer siRNA/miRNA Reagent E HVJ-Eベクター懸濁液⑦

① ② ④ ⑤ ⑥ 添加量/well

6-well 2.5μL 0.5μL 3.0μL 10μL 5μL 18μL/well×1 well

24-well 2.5μL 0.5μL 3.0μL 10μL 5μL 4.5μL/well×4 wells

96-well 2.5μL 0.5μL 3.0μL 10μL 5μL 0.9μL/well×20 wells

【細胞数】

【細胞数】【細胞数】

【細胞数】

接着系細胞および浮遊系細胞のトランスフェクション時の細胞数は P. 3 を参照。

5

55

5


【トラブル

【トラブル【トラブル


シューティング】シューティング】

シューティング】


・ siRNA/miRNA溶液の濃度を上げる

・ HVJ-E懸濁液の添加量を増やす


細胞毒性が認められる場合は、以下の対応で毒性を軽減させることが可能な場合があります。

・ HVJ-E懸濁液、Reagent D、Reagent EをBufferで～4倍の範囲で希釈して使用する


2-3. プロトコルプロトコルプロトコルプロトコル(3) [基本基本基本基本プロトコル＋遠心処理プロトコル＋遠心処理プロトコル＋遠心処理プロトコル＋遠心処理]

【適用】

浮遊系細胞への導入において、プロトコル(1)(2)で細胞毒性が高いあるいは導入効率が低い場合は、

siRNAまたはmiRNAを封入したHVJ-Eベクター懸濁液と細胞とを混合後に遠心処理を行うプロトコル(3)

で改善できるケースがあります。


Freeze-dried HVJ-Eに、氷冷したBuffer 0.26mLを添加し、泡立たないよう穏やかにピペッティングして


を参照。

▼オリゴ型 siRNA/miRNA溶液濃度：10μM(2～50μM)（21nt siRNA:10μM＝10pmol/μL=～0.14μg/μL）


使用上の注意使用上の注意

使用上の注意

HVJ-E 懸濁液

懸濁液懸濁液

懸濁液、

、、

、siRNA/miRNA 溶液、

溶液、溶液、


、、

、Reagent E は氷冷したものを

は氷冷したものをは氷冷したものを

は氷冷したものをご

ごご




▼プロトコル


プロトコル(3)

基本プロトコル＋遠心処理

基本プロトコル＋遠心処理基本プロトコル＋遠心処理

基本プロトコル＋遠心処理

①～④はプロトコル(1)と同じ手順です

Step 手順試薬量（6-well plate 1well 分）



③ siRNAまたはmiRNA溶液を添加・混合（タッピング） siRNA/miRNA溶液： 10μL

④ Reagent Eを添加・混合（タッピング） Reagent E ： 5μL

⑤ Step④で調製した懸濁液と培地に懸濁した細胞とを

マイクロテストチューブ内で混合

HVJ-E ベクター懸濁液：18μL

細胞： 0.5mL

⑥ 5,000g、4℃で 10 分間遠心

※1

⑦ 上清を除去し、培地 2.0mL に再懸濁後、培養プレートに

播種して、37℃・5%CO2 下で培養

※2

再懸濁培地： 2.0mL

プレートサイズに合わせて分注

①～⑤の操作は、必ず氷上で行ってください（温度上昇によるHVJ-Eの活性低下を防ぐため）。

Reagent Dの添加量は、HVJ-E懸濁液の1/5量としてください。 ※1：⑥の遠心は、細胞へのダメージが無い範囲で条件（回転数、温度、時間）を設定してください。

※2：遺伝子サイレンシング効果は適切な時間にモニタリング（例：実験系にもよりますがトランスフェクション後

6～72時間）してください。

【浮遊系細胞のプレートサイズ別分注量、細胞数および assay 数】

プレート

サイズ

遠心処理時⑤ 再懸濁培地⑦ プレート播種時⑦ assay 数

細胞数/チューブ /チューブ分注量/well 細胞数/well*1 (wells)

6-well 0.8～8.0×105 cells

/0.5mL of medium 2.0mL

2.0mL 0.8～8.0×105 cells 1

24-well 0.5mL 0.2～2.0×105 cells 4

96-well 0.1mL 0.4～4.0×104 cells 20

*1：細胞数/wellはプロトコル(1)(2)と同じです。

6

66

6


【接着系細胞(剥離させて浮遊状態の細胞)のプレートサイズ別分注量、細胞数および assay 数】

プレート

サイズ

遠心処理時⑤ 再懸濁培地⑦ プレート播種時⑦ assay 数

細胞数/チューブ /チューブ分注量/well 細胞数/well*2 (wells)

6-well 0.8～4.0×105 cells

/0.5mL of medium 2.0mL

2.0mL 0.8～4.0×105 cells 1

24-well 0.5mL 0.2～1.0×105 cells 4

96-well 0.1mL 0.4～2.0×104 cells 20

*2：細胞数/wellはプロトコール(1)(2)の 2倍です。





・ siRNA/miRNA 溶液の濃度を上げる

・ HVJ-E 懸濁液①の添加量を増やす

細胞毒性が認められる場合は、以下の対応で毒性を軽減させることが可能な場合があります

・ HVJ-E懸濁液①、Reagent D、Reagent EをBufferで～4倍の範囲で希釈する

浮遊系細胞へのトランスフェクションの考え方

7

77

7


3．．．．多種類・多検体の多種類・多検体の多種類・多検体の多種類・多検体のsiRNA/miRNAのののの迅速迅速迅速迅速導入導入導入導入（（（（High throughput screening:HTS））））

3-1. ププププロトコルロトコルロトコルロトコル(4) HTS用プロトコル用プロトコル用プロトコル用プロトコル HTS-RT法法法法

【適用】

細胞培養用プレートで HVJ-Eベクター懸濁液（siRNAまたはmiRNAを封入したHVJ-E）を調製し、そのプレート

に細胞を添加するリバーストランスフェクション（RT）による方法（HTS-RT法）でご使用いただけます。


Freeze-dried HVJ-Eに、氷冷したBuffer 0.26mLを添加し、泡立たないよう穏やかにピペッティングして均一な

懸濁液としてください。懸濁後は活性の低下を防ぐため直ちに氷冷してください。保存法はP. 2 を参照。

▼HTS用プロトコルで用プロトコルで用プロトコルで

用プロトコルで別途

別途別途

別途ご用意いただくもの

ご用意いただくものご用意いただくもの

ご用意いただくもの

・ Bufferが不足する場合は、が不足する場合は、が不足する場合は、

が不足する場合は、リン酸緩衝生理食塩水

リン酸緩衝生理食塩水リン酸緩衝生理食塩水

リン酸緩衝生理食塩水(PBS: Ca、、、

、Mg不含不含不含

不含)をごをごをご

をご使用ください。



・浮遊系

浮遊系浮遊系

浮遊系細胞

細胞細胞

細胞へのトランスフェクションには必ず表面無処理

へのトランスフェクションには必ず表面無処理へのトランスフェクションには必ず表面無処理

へのトランスフェクションには必ず表面無処理プレートをご使用くだ

プレートをご使用くだプレートをご使用くだ

プレートをご使用ください

さいさい

さい。

。。

。

▼オリゴ型 siRNA/miRNA溶液濃度：1μM(0.05～4μM)（21nt siRNA:1μM＝1pmol/μL= ～0.014μg/μL）


使用上の注意

・ HVJ-E懸濁液懸濁液懸濁液

懸濁液、

、、




、Bufferは氷冷したものをは氷冷したものをは氷冷したものを


ごご

ご使用くださ

使用くださ使用くださ

使用くださ

い

いい

い。

。。

。

・ Step①①①

①～

～～

～④

④④

④の操作は、必ず氷上で行ってください（温度上昇による

の操作は、必ず氷上で行ってください（温度上昇によるの操作は、必ず氷上で行ってください（温度上昇による

の操作は、必ず氷上で行ってください（温度上昇によるHVJ-Eの活性低下を防ぐため）。の活性低下を防ぐため）。の活性低下を防ぐため）。

の活性低下を防ぐため）。

・表面処理

表面処理表面処理

表面処理した細胞培養用

した細胞培養用した細胞培養用

した細胞培養用プレートを使用すると

プレートを使用するとプレートを使用すると

プレートを使用すると、

、、

、HVJ-Eがプレートの表面に吸着するため、がプレートの表面に吸着するため、がプレートの表面に吸着するため、

がプレートの表面に吸着するため、浮遊系細胞で

浮遊系細胞で浮遊系細胞で

浮遊系細胞で

は、

は、は、

は、必ず

必ず必ず

必ず表面

表面表面

表面無処理プレートを

無処理プレートを無処理プレートを

無処理プレートをご使用

ご使用ご使用

ご使用ください

くださいください

ください。一方

。一方。一方

。一方、

、、

、接着系細胞で

接着系細胞で接着系細胞で

接着系細胞では、

は、は、

は、表面無処理プレートを使用するこ

表面無処理プレートを使用するこ表面無処理プレートを使用するこ

表面無処理プレートを使用するこ

とで細胞によっては生育の低下がみ

とで細胞によっては生育の低下がみとで細胞によっては生育の低下がみ

とで細胞によっては生育の低下がみられる場合があ

られる場合があられる場合があ

られる場合があるため

るためるため

るため、

、、

、表面

表面表面

表面無処理プレート

無処理プレート無処理プレート

無処理プレートと表面処理プレートのど

と表面処理プレートのどと表面処理プレートのど

と表面処理プレートのど

ちら

ちらちら

ちらを使用した方が

を使用した方がを使用した方が

を使用した方が最適な結果が得られるかを

最適な結果が得られるかを最適な結果が得られるかを

最適な結果が得られるかを予め検討の上、

予め検討の上、予め検討の上、

予め検討の上、使用

使用使用

使用されることをお奨めします。

されることをお奨めします。されることをお奨めします。

されることをお奨めします。

▼プロトコルプロトコルプロトコル

プロトコル(4) HTS-RT法（法（法（

法（96-wellプレートのプレートのプレートの

プレートの 100well分を調製する分を調製する分を調製する

分を調製する場合）

場合）場合）

場合）

Step 手順試薬量

① HVJ-E懸濁液をマイクロテストチューブに採取 HVJ-E： 12.5μL

② Reagent Dを添加・混合（タッピング） Reagent D： 2.5μL

③ 10,000g(10,000～12,000rpm)・4℃で5分間遠心し、上清除去

④ 沈殿をBufferで懸濁（100μLでピペッティング

※110～20回した後、

400μL加えてから１回ピペッティング） Buffer： 500μL

⑤ siRNAまたはmiRNA溶液を96-wellプレート各ウェルに添加 siRNA/miRNA溶液： 5μL

⑥ Step④で調製した懸濁液を各ウェルに添加・混合

※2

（ピペッティング1～3回）懸濁液（④）： 5μL

⑦ Bufferで20倍希釈したReagent Eを各ウェルに添加・混合

※2

(ピペッティング1～3回) 1/20 Reagent E： 5μL

⑧ 予め調製しておいた細胞を各ウェルに添加し、37℃・5%CO2 下

で培養

※3（必要に応じて0.5～4時間後に培地交換）

細胞： 100μL


④の状態であれば、冷蔵（4℃）で24時間保存可能です。

自動分注装置などを用いて⑤～⑦の操作を室温で行う場合、温度上昇によるHVJ-Eの活性低下を防ぐため、必ず氷

冷した各溶液を使用し、各ステップの操作を速やかに行ってください。

Reagent Dの添加量は、HVJ-E懸濁液の1/5量としてください。 ※1：チューブの底の部分を持つとペレットの温度が上昇し失活につながります。チューブの上部を持ってピペッ

ティングを行ってください。 ※2：導入効率に影響が出るため、必ずピペッティング等で十分に混合してください。

※3：遺伝子サイレンシング効果は適切な時間にモニタリング（例：実験系にもよりますがトランスフェクション


8

88

8



プレートリバーストランスフェクション(RT)

siRNA/miRNA溶液 ⑤ HVJ-E懸濁液 ⑥ 1/20 Reagent E ⑦

96-well 5μL 5μL 5μL

384-well 2μL 2μL 2μL

【細胞数】（初代培養免疫系細胞の場合は表示の 10倍の細胞数が目安）

プレート播種細胞数







・ siRNA/miRNAの濃度を上げる

・ HVJ-E懸濁液①の添加量を増やす

・ Step⑧で細胞とHVJ-Eベクター懸濁液をピペッティング等で十分混合する

・ 384ウェルプレートなどウェル径が小さい場合、Step⑧の細胞と HVJ-Eベクター懸濁液の混合が

難しくなり、導入効率が下がります。細胞とHVJ-Eベクター懸濁液を十分混合してください。混

合が難しい場合は 1500g･25℃･5分の遠心で細胞とHVJ-Eベクターを接触させることで導入効率

を維持できます。

・プレートの表面処理の種類によっては、導入効率に影響を与える可能性がありますので、

その場合は、プロトコル(4) HTS-FT法で検討してください。

・導入効率に影響を与えますので、Step⑤～⑦については必ず、順番通りに添加･混合してください。

9

99

9


3-2. プロプロプロプロトコルトコルトコルトコル(5) HTS用プロトコル用プロトコル用プロトコル用プロトコル HTS-FT法法法法

【適用】

表面無処理のプレートでHVJ-Eベクター懸濁液（siRNAまたはmiRNAを封入したHVJ-E）を調製し、

それらを予め細胞を播種したプレート（細胞培養用プレート）に添加するフォワードトランスフェクシ

ョン（FT）による方法（HTS-FT法）でご使用いただけます。




を参照。

▼オリゴ型 siRNA/miRNA溶液濃度：1μM(0.05～4μM)（21nt siRNA:1μM＝1pmol/μL= ～0.014μg/μL）

▼HTS用プロトコルで

用プロトコルで用プロトコルで

用プロトコルで別途

別途別途

別途ご用意いただくもの

ご用意いただくものご用意いただくもの

ご用意いただくもの

・ Buffer が不足する場合は、リン酸緩衝生理食塩水

が不足する場合は、リン酸緩衝生理食塩水が不足する場合は、リン酸緩衝生理食塩水

が不足する場合は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS: Ca、、、

、Mg 不含

不含不含

不含)をご使用くださ

をご使用くださをご使用くださ

をご使用ください。

い。い。

い。

・浮遊系

浮遊系浮遊系

浮遊系細胞の培養に使用される表面無処理プレートをご使用ください

細胞の培養に使用される表面無処理プレートをご使用ください細胞の培養に使用される表面無処理プレートをご使用ください

細胞の培養に使用される表面無処理プレートをご使用ください。

。。

。


使用上の注意使用上の注意

使用上の注意

・ HVJ-E 懸濁液

懸濁液懸濁液

懸濁液、

、、

、siRNA/miRNA 溶液、

溶液、溶液、


、、


、Buffer は氷冷したものを

は氷冷したものをは氷冷したものを


ごご

ご使用

使用使用

使用

ください。

ください。ください。

ください。

・ HVJ-E ベクター懸濁液

ベクター懸濁液ベクター懸濁液

ベクター懸濁液の調製（

の調製（の調製（

の調製（Step⑤⑤⑤

⑤～

～～

～⑦

⑦⑦

⑦）は、必ず表面無処理プレートを

）は、必ず表面無処理プレートを）は、必ず表面無処理プレートを

）は、必ず表面無処理プレートをご使用

ご使用ご使用


ください。ください。

ください。

▼プロトコル


プロトコル(5)

HTS-FT 法（

法（法（

法（96-well プレート

プレートプレート

プレートで

でで

で 100well 分を調製する

分を調製する分を調製する

分を調製する場合）

場合）場合）

場合）

①～④はプロトコル(3)と同じ手順です


① HVJ-E懸濁液をマイクロテストチューブに採取 HVJ-E： 12.5μL

② Reagent Dを添加・混合（タッピング） Reagent D： 2.5μL

③ 10,000g(10,000～12,000rpm)・4℃で5分間遠心し、上清除去

④ 沈殿をBufferで懸濁（100μLでピペッティング※110～20回した後、

400μL加えてから１回ピペッティング） Buffer： 500μL

⑤ siRNAまたはmiRNA溶液を表面無処理96-wellプレート各ウェルに添

加 siRNA/miRNA溶液： 5μL

⑥ Step④で調製した懸濁液を各ウェルに添加・混合※2

（ピペッティング1～3回）懸濁液（④）： 5μL

⑦ Bufferで20倍希釈したReagent Eを各ウェルに添加・混合※2

（ピペッティング1～3回） 1/20 Reagent E： 5μL

⑧

予め細胞を播種しておいたプレートの各ウェルにHVJ-Eベクター懸濁液

を添加し、37℃・5%CO2 下で培養※3（必要に応じて0.5～4時間後に培

地交換）

HVJ-Eベクター懸濁液

（⑤+⑥+⑦）： 15μL


④の状態であれば、冷蔵（4℃）で24時間保存可能です。

自動分注装置などを用いて⑤～⑦の操作を室温で行う場合、温度上昇によるHVJ-Eの活性低下を防ぐため、必ず氷

冷した各溶液を使用し、各ステップの操作を速やかに行ってください。

Reagent Dの添加量は、HVJ-E懸濁液の1/5量としてください。 ※1：チューブの底の部分を持つとペレットの温度が上昇し失活につながります。チューブの上部を持って

ピペッティングを行ってください。 ※2：導入効率に影響が出るため、必ずピペッティング等で十分に混合してください。

※3：遺伝子サイレンシング効果は適切な時間にモニタリング（例：実験系にもよりますがトランスフェクション


1

11

10

00

0



プレートフォワードトランスフェクション(FT)

HVJ-Eベクター懸濁液（⑤+⑥+⑦）

96-well 15μL

384-well 6μL

接着系細胞は、トランスフェクション時に 50～80% コンフルエントになるように、細胞をトランスフ

ェクション前日に播種してください。浮遊系細胞のトランスフェクション時の細胞数は P8を参照。

【ワンポイントアドバイス】

【ワンポイントアドバイス】【ワンポイントアドバイス】


・HVJ-Eベクター懸濁液の調製は、表面処理プレートではHVJ-Eが吸着してしまうため、

必ず表面無処理プレートをご使用ください。





・ siRNA/miRNAの濃度を上げる

・ HVJ-E懸濁液①の添加量を増やす

・ Step⑧で細胞とHVJ-Eベクター懸濁液をピペッティング等で十分混合する

・ 384ウェルプレートなどウェル径が小さい場合、Step⑧の細胞とHVJ-Eベクター懸濁液の混合が難

しくなり、導入効率が下がります。細胞とHVJ-Eベクター懸濁液を十分混合してください。混合が

難しい場合は1500g･25℃･5分の遠心で細胞とHVJ-Eベクターを接触させることで導入効率を維持

できます。

・導入効率に影響を与えますので、Step⑤～⑦については必ず、順番通りに添加･混合してください。

1

11

11

11

1


4．．．．動物個体へのトランス動物個体へのトランス動物個体へのトランス動物個体へのトランスフェクション（フェクション（フェクション（フェクション（in vivo））））

動物個体への適用の一例として、ここではマウスの臓器、組織、血管内に投与する場合の例を記載して

います。対象となる動物の種類や標的臓器・部位などにより、投与方法や投与量などの条件は多岐に考

えられますので個別の事例についてはご検討いただくか、弊社担当までご相談ください。

4-1. プロトコルプロトコルプロトコルプロトコル(6) in vivo siRNA/miRNA 導入用導入用導入用導入用




を参照。


使用上の注意

・

・・

・HVJ-E懸濁液懸濁液懸濁液

懸濁液、

、、



、Reagent Eは氷冷したものをは氷冷したものをは氷冷したものを


ごご




▼オリゴ型 siRNA/miRNA 溶液濃度：1μg/μL （21nt siRNA:10μM＝10pmol/μL= ～0.14μg/μL）

プロトコル


プロトコル(6) 動物個体への動物個体への動物個体への

動物個体への siRNA/miRNA導入プロトコル導入プロトコル導入プロトコル

導入プロトコル


① HVJ-E懸濁液をマイクロテストチューブに採取 HVJ-E懸濁液： 40μL

② Reagent Dを添加・混合（タッピング） Reagent D： 8μL

③ 10,000g (10,000～12,000rpm)、4℃で10分間遠心し、上清除去

④ 沈殿をsiRNAまたはmiRNA溶液にて懸濁（ピペッティング20～30回） siRNA/miRNA溶液： 10μL

⑤ HVJ-Eベクター懸濁液を動物に投与

（必要に応じ生理食塩水などで希釈）投与量：目的に応じて調整


Reagent Dの添加量は、HVJ-E懸濁液の1/5量としてください。


・ HVJ-E 懸濁液①の使用量は、マウスの場合 40～80μL、ラットでは 200～400μL を目安にお考えく

ださい。HVJ-E 懸濁液①の使用量に応じて、以降の各種試薬量も比例計算して調整してください。

・投与量は、投与対象部位、投与ルート等の実験系に応じ、HVJ-E ベクター懸濁液⑤に適宜 Buffer

または生理食塩水等を加えて調整してください。

・動物への投与では、基本的に Reagent E を使用（添加）しないことを推奨いたします。導入物質

を投与部位近傍の組織に留めたい場合には、HVJ-E ベクター懸濁液⑤に Reagent E を添加するこ

とで調製を行うことも可能です。

・ HVJ-E は生体内、特に血液中で血球細胞への吸着が起こる可能性がありますので、できるだけ血

液との接触が少ない投与ルートを選択するか、投与前に灌流処理することを推奨いたします。

1

11

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22

2


使用上の注意使用上の注意使用上の注意使用上の注意

1. 本製品は、研究目的にのみご使用ください。ヒト・動物への医療・臨床目的および生体内外診断の

目的には使用できません。

2. 本製品は「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律（カルタヘ

ナ議定書担保法）」の規制を受けずにご使用いただけますが、組換えDNA実験の実施に際しては、

当該法律および各研究機関内の安全性委員会の定める「組換え DNA 実験指針」を遵守し、実験目

的に応じた適切な設備を有する実験室をご使用ください。

3. 本製品を用いた実験は、細胞培養および遺伝子工学に関する基本的な知識と手技を習得した実験者

により実施してください。

4. 本キットに含まれる HVJ Envelope（HVJ-E）は、HVJ（センダイウイルス）を不活性化しており増

殖性･感染性を完全になくしてありますが、膜の融合活性は保持していますので、万一の人体への吸

入や付着を防ぐため安全キャビネット内で操作し、実験者は手袋、マスク等の防護具をご使用くだ

さい。

5. 実験後の空容器の廃棄に際しても取扱に注意し、適切に処置してください。

6. キット付属の他の試薬類については、毒物や劇物に属するものではありませんが、取扱に際しては

手袋・マスク等の防護具をご使用ください。

7. Freeze-dried HVJ-E は、無菌試験でバクテリア、カビ類の混入がないことを確認していますが、全

ての微生物の存在を否定するものではありませんので、ご使用に際してはご注意ください。

8. 本製品の使用によって生じた如何なる事故、損害に対しても、弊社では責任を負いかねますので、

予めご了承の上ご使用ください。

9. 弊社の文書による事前許諾なしに本製品の商業目的でのご使用、製品の改変等による再販売はでき

ません。

取扱説明書の記載内容は変更される場合があります。最新版は下記ホームページよりダウンロードできます。

https://www.iskweb.co.jp/products/hvj-e/

〒550-0002 大阪市西区江戸堀1丁目 3番 15号

【お問い合わせ先】

TEL：06-6444-7182 FAX：06-6444-7183

E-Mail：[email protected]

URL：https://www.iskweb.co.jp/products/hvj-e/

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