Молекулярные механизмы передачи клеточного сигнала

Cell Signal Transduction

The activities and cellular locations of the main classes of proto-oncogenes

Локализация и перемещение участников клеточной сигнализации

Компоненты, участвующие в клеточной сигнализации, находятся “на своих местах”: в цитозоле, в клеточной мембране, ядре, в различных клеточных органеллах (митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме)

Важный этап многих процессов клеточной сигнализации – перемещение компонентов из цитозоля в ядро.

Способы проникновения компонентов сигнальных каскадов в ядро

а) через комплекс ядерной поры (nuclear pore complex)

б) активный транспорт с участием рецепторов

Факторы, влияющие на локализацию белка в цитозоле или ядре.

Белок удерживается в цитозоле:

а) сигнал ядерной локализации инактивирован из-за фосфорилирования белка.

б) перемещение в ядро блокируется из-за связывания с ингибиторным цитозольным белком.

Белки – важнейшие компоненты клеточной сигнализации

Функции белков:

преобразование движения

интеграторы сигналов

компоненты мультисубъединичных белковых машин

 

Изменение формы молекулы при связывании лигандов:

сближение доменов ферментов и формирование более “закрытых”

конформаций при связывании субстратов

образование более открытых конформаций (открывание канала) при

связывании лиганда соответствующими рецепторами-каналами.

Аллостерические взаимоотношения

наличие взаимозависимых центров связывания

неактивная и активная форма существуют в равновесии, и

связывание лиганда вызывает сдвиг равновесия в пользу активной

формы.

фосфорилирование: распространенный путь индуцирования

аллостерических переходов в процессах клеточной сигнализации.

 

Протеинкиназы образуют разветвленную сеть сигнальных путей: необходимая энергия – за счет гидролиза АТР или GTP

Signaling through scaffold, anchoring, and adaptor proteins.

T. Pawson and J.D.Scott (1997) Science 278, 2075

Pleckstrin homology domains and the cytoskeleton.

M.A. Lemmon et al.(2002). FEBS Lett. 513, 71-76

Клеточный рост, выживание и подвижность.

Сигнальные пути с участием фосфоинозитид-3-киназы (PI3K)

PI3K связывается с мембраной и активируется, благодаря взаимодействию с остатками фосфотирозина на рецепторе ростового фактора или на адапторном белке (GAB-1). Продукт, фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфат (PIP3) рекрутирует сигнальные белки, имеющие РН-домены, на мембрану, где они

активируются. Среди них: серин-треониновые киназы (Akt и PDK1), тирозиновые протеинкиназы (семейство Tec), обменные факторы GTP-связывающих белков (Grp1, Rac), адапторные белки (GAB-1).

 

Протеолиз – один из основных механизмов в клеточной сигнализации.

 Активация процессов:

получение активных форм протеолитических ферментов из их

неактивных про-форм:

прокаспазы и каспазы (апоптоз)

компоненты системы комплемента (амплифицирующий

протеолитический каскад)

активация рецептора тромбина

Внутримембранный протеолиз

Убиквитин-зависимый протеолиз:

удаление неправильно свернутых или поврежденных белков

Клеточная сигнализация: обеспечение короткого времени жизни белков, концентрация которых должна быстро изменяться в зависимости от состояния клетки.

Alzheimer’s disease and APP processing

Science 24.08.o1

Транскрипционная активность цитоплазматических фрагметов рецепторов

Science 7.12.01

Внутримембранный протеолиз в клеточной сигнализации

Пресенилины (presenelins): расщепляют предшественник -амилоидного пептида (АРР), Notch и Erb-B4 рецепторы, E-cadherin

 Signal peptide peptidase (SPP) – пептидаза сигнального пептида, аспартатная протеаза пресенилинового типа.

Weihofen A. et al. Identification of signal peptide peptidase, a presenelin-type aspartic protease. Science 296, 2215 (2002)

Убиквитин-протеасомная система, токсичные белки и

нейродегенеративные заболевания.

А: Белки, подлежащие последующей деградации, маркируются ковалентно присоединенным убиквитином. Это достигается серией ферментов (Е1, Е2, Е3), представляющих собой убиквитин-лигазную систему.

В: Ub-маркированные субстраты распознаются, разворачиваются и подвергаются деградации в протеасомах. Taylor J.P. et al. Science 291, 1991 (2002)

Регуляция транскрипционного фактора HIF-1:

При нормальных концентрациях Q2, ODD в HIF-1

модифицируется HIF-1 пролингидроксилазой, в результате HIF-1 распознается pVHL и затем подвергается деградации в протеасомах. Аспарагинилгидроксилаза модифицирует C-TAD в HIF-1 и блокирует взаимодействие с коактиватором транскрипции р300.

 Гипоксия блокирует обе гидроксилазы, HIF-1 накапливается, связывается с р300, транскрибируются гены, необходимые для адаптации клетки и организма

HIF – hypoxia-inducible transcription factors (транскрипционные факторы, индуцируемые при гипоксии).

Состоит из HIF-1 субъединицы и HIF-1 субъединицы (обозначается также ARNT) (регулируемой гипоксией).

ODD – oxygen-dependent degradattion domain (кислород-зависимый домен деградации в HIF-1)

PVHL – product of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene

C-TAD – C-концевой трансактивационный домен

 

Восприятие уровня кислорода клетками млекопитающих

 

Нарушения в сборке белков, их агрегация

и нейродегенеративные заболевания

 

нарушения протеолитического процессинга белков, образование токсичных форм

недостаточно эффективная деградация «неправильных» белков убиквитин-протеасомной системой

мутации в самих белках, делающие их токсичными

изменения конформации: повышение содержания -структуры, образование олигомеров и высокомолекулярных нерастворимых агрегатов

отложение агрегатов снаружи или внутри нервных клеток и нарушение функции нейронов

Нейродегенеративные заболевания, связанные с агрегацией и отложением аномальных белков

____________________________________________________________________________________________________________

болезнь отложения белков токсичный белок гены, связанные с заболеванием

____________________________________________________________________________________________________________________________

болезнь Альцгеймера внеклеточные бляшки амилоидный пептид (А) АРР* (предшественник амилоидного пептида)

(plaques) пресенилин 1+, пресенилин 2+

внутриклеточные (тау)

образования (tangles)

болезнь Паркинсона тела Леви -синуклеин -синуклеин*, паркин1, паркин2+

 

прионная болезнь прионовые бляшки Pr psc PRNP*

(plaques)

заболевания, связанные ядерные и цитоплазм белки, содержащие 9 различных генов, содержащих

с наличием фрагментов включения. фрагменты полиглутамина CAG повторы*

полиглутамина

 таупатии цитоплазм tangles. (тау) (тау)*

семейный амиотрофный тела Бунина (?) супероксиддисмутаза 1 SOD 1*

латеральный склероз Bunina bodies (SOD 1)

_

_____________________________________________________________________________________________________________

_ * патогенные мутации связаны с приобретением токсичной функции + патогенные мутации связаны с утратой функции

Taylor J.P. et al Science 296, 1991 (2002)

 

Белок SUMO в регуляции клеточной активности

Marx J. Science 307, 836 (2005)

SUMO – small ubiquitin-like modifier; участвуют в транскрипции генов, деградации и в клеточной пролиферации. SUMO и убиквитин присоединяются своим С-концом к -аминогруппе лизина. Есть случаи, когда модификация SUMO предохраняет белки от деградации, блокируя посадку убиквитина.

Длительное воздействие лиганда:

уменьшение чувствительности рецепторов

(десенситизация)

     

  уменьшение числа активных рецепторов

Идентифицированы белки, сортирующие рецепторы для ре-циркулирования или деградации. Эти белки распознают участки в цитоплазматическом домене (С-концевом фрагменте).

GASP (GPCR – associated sorting protein)

NSF – N-ethylmaleimide-sensitive factor.

Удаление рецепторов с поверхности клетки

Transduction of receptor signals by -arrestins

Lefkowitz R.J., Sheniy S.K. Science 308, 512(2005)

Новые функции в регуляции внутриклеточных сигнальных путей: активация и сборка цитоплазматических сигнальных комплексов через -аррестины 1 и 2 -мультифункциональные адапторы и преобразователи (transducers) ;например, адапторы при эндоцитозе, связывая GPCR с «клатриновой машиной».

Эндоканнабиоидные рецепторы в мозге

Экзогенный лиганд (активнное начало марихуаны) : ∆9 – тетрагидроканнабинол (ТНС)

Эндогенные лиганды: анандамид (anandamide) и

2-арахидонилглицерин (2- arachidonylglycerol).

В отличие от классических нейротрансмиттеров, эндогенные каннабиоиды являются ретроградными синаптическими мессенджерами:

высвобождаются в постсинаптических нейронах,

переносятся через синапс,

активируют СВ1 на пресинаптических аксонах и подавляют высвобождение трансмиттеров.

СВ1 – G-белокзависимый рецептор (один из наиболее широко представленных рецепторов нейромодуляторов в мозге).

Обнаружено повышенное содержание эндоканнабиоидов в мозге после болевого стимула .

Ретроградная сигнализация эндоканнабиоидами.

Деполяризация постсинаптической мембраны открывает потенциал-зависимые Са2+-каналы

Постсинаптический Са2+ активирует ферменты биосинтеза эндоканнабиоидов из липидных предшественников

Другой возможный путь биосинтеза эндоканнабиоидов: активация глутаматных рецепторов mGluR активация фосфолипазы С образование диацилглицерина его расщепление диацилглицеринлипазой образование 2-арахидонилглицерина

эндоканнабиоиды покидают постсинаптическую клетку (диффузия? с помощью белков-переносчиков?) и активируют пресинаптические СВ1 рецепторы

активация сопряженного G белка, G

ингибирует вход Са2+ в пресинаптический аксон

в результате снижается вероятность высвобождения везикул с нейротрансмиттерами.

Wilson R.I., Nicoll R.A. Science 296, 678 (2002)

Биологические часы (циркадный ритм)

Отрицательная обратная связь в циклической экспрессии генов per и tim.

Промоторы генов per и tim связывают гетеродимер активаторов транскрипции Clk и Cyc.

Синтез mRNA до достижения высокой концентрации белковых продуктов Per и Tim , которые подавляют транскрипцию per и tim. Распад Per и Tim (свет, фосфорилирование). Циклическое возобновление экспрессии.

Млекопитающие: казеинкиназа CKI (кодируемая геном tau) фосфорилирует PER, что предотвращает его доставку в ядро и ведет к его деградации. Периодическое повышение концентрации PER, он соединяется с другими компонентами (CRY, TIM), доставляется в ядро и подавляет транскрипцию per.

Дрозофила: киназа CKI кодируется dbt (double-time), проникающий в ядро димер PER/TIM подавляет транскрипцию обоих соответствующих генов.

ЦИРКАДНЫЙ РИТМ

Криптохром (CRY) у дрозофилы поглощает свет и выставляет часы. У млекопитающих в поглощении света участвуют родопсины, а криптохром действует на более поздних стадиях, включая транскрипцию соответствующих генов.

Множественные пути апоптоза и взаимодействие про- и антиапоптотических факторов

 1)   Антиапоптотический фактор Bcl-xL

связывает адаптер Apaf-1, предотвращая его участие в активации прокаспазы 9.

2) В результате сигнала апоптоза, апоптотический фактор Bik нейтрализует Bcl-XL; в присутствии цитохрома

С Apaf-1 связывается с прокаспазой-9, способствуя ее димеризации и аутокатализу.

Образование пор в наружной мембране митохондрий, высвобождение белков из межмембранного пространства в цитозоль. Белки семейства Bсl-2 регулируют пермеабилизацию, каспазы разрушают клетку. . Активированные белки Bax и Bak образуют поры , Bсl-2 ингибирует образование пор. Ингибирование обращается несколькими ВН-3 only белками (“derepressors” or sensitizers). Другой путь активации: фосфорилирование или деамидирование. Цитохром с связывается с мономерным apoptotic protease activating factor – 1 (APAF-1), который oлигомеризуется в «апоптосому». На апоптосоме связываются молекулы про-каспаз-9, они олигомеризуются и активируются. Активная каспаза-9 расщепляет “execution” каспазы 3 и 7 ,которые расщепляют набор субстратов и разрушают клетки. Каспазы регулируются by inhibitor of apoptosis proteins (IAP), которые связываются с каспазами и убиквитинилируют их для последующей протеасомной деградации. В

свою очередь, есть и ингибиторы

Митохондриальный путь апоптоза.

самих IAP: Smac (или DIABLO). После пермеабилизации апоптоз может идти и независимо от каспаз, с

участием других высвобожденных летальных факторов: apoptosis inducing factor (AIF).

Рецепторы апоптоза: сигнализация и модуляция

A.Ashkenasi, V.M.Dixt (1998) Science 281, 1305-1308.

p53 and PUMA: a deadly Duo Vousden K.H. Science 309,1685 (2005)

Опухолевый супрессор p53 вызывает апоптоз и может проявлять эту активность, находясь в ядре или цитоплазме (в последнем случае по транскрипционно-независимому механизму). Р53 индуцирует продукцию белка PUMA: как р53, так и PUMA могут взаимодействовать с про- и антиапоптотическими факторами (Bax, Bcl-xL и др.).

АПОПТОЗ

Иллюстрация некоторых основных процессов и структурных основ клеточной сигнализации

Многообразие путей реализации запрограммированной клеточной смерти

Многоступенчатый протеолиз – важнейший механизм этого процесса

Роль адаптерных белков и присутствия в них и других компонентах (рецепторах, ферментах) сходных структурных доменов

Сборка многокомпонентных белковых комплексов при участии канонических доменов

Фосфорилирование, смена белковых партнеров, изменение направления процесса.

 

Разнообразие и взаимосвязь различных лиганд-рецепторных взаимодействий ( “cross-talk” )

Один трансмиттер различные классы рецепторов

Гомологичные пептидные трансмиттеры

фармакологически различные подтипы рецепторов

 

Наличие множественных центров связывания на рецепторах:

действие лигандов на “свои” и “чужие” рецепторы

 

Совместная локализация трансмиттеров

 

Совместная локализация рецепторов

 

Рецепторы инсулина в функционировании мозга. L.Gasparini et al. (2002). Trends in Pharm. Sci. 23, 288-293

Увеличение продолжительности жизни при нарушении сигнализации с участием инсулина или IGF-1 (инсулиноподобного ростового фактора). Гормон Klotho (трансмембранный белок, 1 ТМ)

Взаимосвязь сигнальных путей (cross-talk)

Как сигнальные пути, общие для многих систем (т.называемые канонические сигнальные кассеты), интегрируют сигналы от одних и тех же молекул (например, гормонов и нейротрофинов), чтобы реализовать разные биологические ответы?

 Дифференцировка клеток РС12 под влиянием NGF- и РАСАР-зависимых сигнальных путей.

NGF – nerve growth factor (фактор роста нервов)

PACAP – pituitary adenylate cyclase – activating polypeptide , (гипофизарный пептид, активирующий аденилатциклазу)

TrkA – рецептор NGF, PAC1 – рецептор, специфичный для PACAP

AC – аденилатциклаза , PKA – протеинкиназа А

MEK – митоген-активируемая протеинкиназа

ERK – extracellular signal-regulated kinase

внеклеточная сигнал-регулируемая киназа

RSK – ribosomal S6 protein-kinase CBP – CREB binding protein

белок, связывающий CREB

CREB – cAMP response element-binding protein

cАМР-зависимый связывающий белок

TH – тирозингидроксилаза

Vaudry D. et al. (2002). Science 296, 1648

 

Каналообразующие токсины

Водорастворимая форма токсина Связывание с мембраной (рецептором) Олигомеризация

I II III

Встраивание в мембрану Образование канала

IV V

__________________________________________________________________________________________________

Токсин Трансмембранная структура Состояние олигомеризации

___________________________________________________________________________________________________

колицин Ia E.coli пучок -спиралей мономер/олигомер ?

Аэролизин Aeromonas hydrophila -бочонок мономер/гептамер

Защитный антиген сиб.язвы Bacillus anthracis -бочонок мономер/гептамер

-гемолизин Staphylococus aureus -бочонок мономер/гептамер

___________________________________________________________________________________________________

Обычно протеолитическая активация удаляет те области токсина, которые препятствуют олигомеризации, или

делают экспонированными гидрофобные области молекулы, которые принимают участие в сборке.

(E.Gouaux Cur.Opin. Struct.Biol. 7, 566-573 (1997)