seqüenciamento e montagem do genoma humano e análise de transcriptoma
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Seqüenciamento e montagem do genoma humano e análise de transcriptoma. Seqüenciamento do Genoma Humano. Embate: Consórcio público x Celera genomics: Consórcio público: mapeamento físico, shotgun hieráriquico. Celera genomics: whole genome shotgun - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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Seqüenciamento e montagem do genoma humano
e análise de transcriptoma
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Seqüenciamento do Genoma Humano
• Embate: Consórcio público x Celera genomics:
– Consórcio público: mapeamento físico, shotgun hieráriquico.
– Celera genomics: whole genome shotgun
• Em fevereiro de 2001 foi publicada de forma independendente versão draft ou preliminar ambos grupos.
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Seqüenciamento do Genoma Humano
• 2003: Consórcio público apresenta versão final do seqüenciamento do genoma humano
– Comprimento total: 3 bilhões pb
– 99% deste total foi seqüenciado
– Erro de seqüenciamento estimado em 1/10.000 nt
– 99.9% não apresenta diferenças entre indivíduos.
– 25.000 genes
– Genes codificadores de proteínas correspondem a apenas 2% do genoma
– 50 % do genoma consiste de regiões repetitivas (D.melanogaster 3%, C.elegans 7%)
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Celera Genomics – Iniciativa privada
Whole genome shotgun (WGS)
Genoma
Biblioteca genômicaPlasmídeo (inserto 10 kb)BAC (inserto 100 kb)
Seqüenciamento das extremidadesdo inserto
Leituras ou reads
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Contig
Mate pairs
Celera Genomics – Iniciativa privada
Whole genome shotgun (WGS) – Montagem
AGCGTTA GTTACAAC
AGCGTTACAAC
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Contig Contig
Mate pairs
Celera Genomics – Iniciativa privada
Whole genome shotgun (WGS) – Montagem
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Contig Contig
Mate pairsBAC contendo inserto demaior comprimento
Celera Genomics – Iniciativa privada
Whole genome shotgun (WGS) – Montagem
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Contig Contig
Mate pairs
Contig ContigScaffold
Mate pairs
Celera Genomics – Iniciativa privada
Whole genome shotgun (WGS) – Montagem
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Consórcio públicoMapeamento físico, shotgun hierárquico
Cromossomo
Biblioteca genômicaem BAC (inserto 100Kb)
Fragmento cromossômico
Biblioteca genômicaem BAC
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Consórcio públicoMapeamento físico, shotgun hierárquico
Cromossomo
Biblioteca genômicaem BAC (inserto 100Kb)
Fragmento cromossômico
Biblioteca genômicaem BAC
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BAC
BibliotecaPlasmídeo (inserto 10 kb)
Seqüenciamento das extremidadesdo inserto
Leituras ou reads
Consórcio públicoMapeamento físico, shotgun hierárquico - Montagem
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Contig
Mate pairs
AGCGTTA GTTACAAC
AGCGTTACAAC
Consórcio públicoMapeamento físico, shotgun hierárquico - Montagem
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Consórcio públicoMapeamento físico, shotgun hierárquico
Cromossomo
Biblioteca genômicaem BAC (inserto 100 kb)
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Consórcio públicoMapeamento físico, shotgun hierárquico
Cromossomo
Biblioteca genômicaem BAC (inserto 100 kb)
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Consórcio públicoMapeamento físico, shotgun hierárquico
Cromossomo
Biblioteca genômicaem BAC (inserto 100 kb)
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Avaliação de estratégias de seqüenciamento
Vantagens WGS
• Estratégia mais simples com menos etapas.
Vantagens Shotgun Hierárquico
• Menos vulnerável que a estratégia WGS em relação a montagem de regiões repetitivas.
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Avaliação de estratégias de seqüenciamentoRepetições no genoma
X X
Cenário I
X
MontagemGenoma
Processo de montagem é suscetível a erros quando empregado em genomas com alto índice de repeticões.
WGS: Montagem de 3 bilhões de bases (todo genoma).
Shotgun hierárquico: Montagem de 100 mil bases (inserto de cada BAC).
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In silico
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Base-calling
• Geração de uma seqüência de nucleotídeos através da análise dos chromatogramas
PHRED
gaattcggcacgagagttctcccggagacgctccgtgcgaagattatggaggccgtcaatgtggtcggttcccgccactttgctcgcctgcgcatcgatgtaacagtccgtggtgacgaagtcataccgttaagtattacgtttttgttgtcgttgttgcagcaatagtagaggacgggcgcttttttttttgtcaagagaaagggggaggggcgtactaccgctttatcgaggttggtattatttcttatatataaagggaaagagcaacgtgaagcgggtaagggaagagtgaaagtcgag
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Mascaramento
• Eliminar fragmentos de vetor cross_match
>5’gctccaccgcggtggcggccgctctagaactagtggatcccccgggctgcaggaattcggcacgagagttctcccggagacgctccgtgcgaagattatggaggccgtcaatgtggtcggttcccgccactttgctcgcctgcgcatcgatgtaacagtccgtggtgacgaagtcataccgttaagtattacgtttttgttgtcgttgttgca
>3’gcaatagtagaggacgggcgcttttttttttgtcaagagaaagggggaggggcgtactaccgctttatcgaggttggtattatttcttatatataaagggaaagagcaacgtgaagcgggtaagggaagagtgaaagtcgagggggggcccggtacccaattc
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Montagem
• Produzir uma seqüência contígua através de seqüências menores que possuam regiões de sobreposiçãoPHRAP, Celera Assembler, Arachne
contig
leituras
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Anotação
• Localizar na seqüencia genômica final:• Genes que codificam proteínas e RNAs não traduzidos (tRNA, rRNA, snRNA)
• Determinar, se possível, o produto provável de cada gene encontrado.
• Associar cada gene à uma categoria funcional ou via metabólica. Ex.: síntese de lipídeos, maquinaria de tradução, fosforilação oxidativa, etc.
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Anotação
Streptococcus pneumoniae R6
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Anotação Automática
Glimmer
contig
RBSfinder tRNAscanGeneMark
CDS
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Anotação Automática
BLAST contra KEGG
InterproBLAST contra GenBank
PSORTBLAST contra COG
Anotação manual
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BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)
BLASTKEGG
COG
GenBankNucleotídeos
> SEQ1atgggcacgagagttctcccggagacgctccgtgcgaagattatggaggccgtcaatgtggtcggttcccgccactttgctcgcctg
Bancos de seqüências
GenBankProteínas
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BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)
Aldolase Trypanosoma cruzi
.........1.........2.........3.........4.........5.........6.........7.........8.........9.........10 acaagctggagctcccgcggtggtcggcgctctagaactagtggatcccccgggctgcaggaattcggcacgagaacaacttcaaccgcgtctggaaggcgccacgccgcccgtttgagaaggaacgccttgaccgcgagatgaaactctgcggccagtacggccttcngttgcaacgcgtgagatttggcgccgtgaacatgacgctctccaagatgcgtcgtaccgcccgtctgttgttgacgttgccggagaaccacccgcgccggcagctggagggttccgccatcatgcgccgctgccacgactacggcttcctcgagggggggcccggtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacannattcactggccgntcgntnntttacaacgtcgntnngactgggnannaaaccctggnnncgttacccaacttaatcgcctt
BLAST it!
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Anotação Automática
BLAST contra KEGG
InterproBLAST contra GenBank
PSORTBLAST contra COG
Anotação manual
![Page 29: Seqüenciamento e montagem do genoma humano e análise de transcriptoma](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062321/56813b48550346895da42f76/html5/thumbnails/29.jpg)
Aldolase Trypanosoma cruzi
.........1.........2.........3.........4.........5.........6.........7.........8.........9.........10 acaagctggagctcccgcggtggtcggcgctctagaactagtggatcccccgggctgcaggaattcggcacgagaacaacttcaaccgcgtctggaaggcgccacgccgcccgtttgagaaggaacgccttgaccgcgagatgaaactctgcggccagtacggccttcngttgcaacgcgtgagatttggcgccgtgaacatgacgctctccaagatgcgtcgtaccgcccgtctgttgttgacgttgccggagaaccacccgcgccggcagctggagggttccgccatcatgcgccgctgccacgactacggcttcctcgagggggggcccggtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacannattcactggccgntcgntnntttacaacgtcgntnngactgggnannaaaccctggnnncgttacccaacttaatcgcctt
Interpro
• Procura na seqüências por domínios, assinaturas ou motivos conhecidos.
• Se utiliza de outros bancos de domínios para produzir seu relatório final. PFAM, SMART, PROSITE, etc
Interpro
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Anotação Automática
BLAST contra KEGG
InterproBLAST contra GenBank
PSORTBLAST contra COG
Anotação manual
![Page 31: Seqüenciamento e montagem do genoma humano e análise de transcriptoma](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062321/56813b48550346895da42f76/html5/thumbnails/31.jpg)
Anotação
Streptococcus pneumoniae R6
![Page 32: Seqüenciamento e montagem do genoma humano e análise de transcriptoma](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062321/56813b48550346895da42f76/html5/thumbnails/32.jpg)
SabiáSystem for Automated Bacterial Integrated Annotation
• LNCC – Coordenação do Projeto Genoma Brasileiro
• Gerenciamento de todos softwares de Base-calling, Mascaramento, Montagem e Anotação automática.
• Disponibilização da Anotação automática dos resultados via Web possibilitando a realização da Anotação manual por pesquisadores distribuídos geograficamente.
Exemplo Sabiá Mapa Antes Mapa Depois
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Análise do transcriptoma
Projetos que precedem seqüenciamento do genoma nuclear:
• Identificação de novos genes.
• Estimativa do perfil de expressão da linhagem celular, estágio de desenvolvimento ou tecido avaliado
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Transcrição e Transcriptoma
EST
RNA total
cístron Poli A mRNACAP5’ 3’
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Transcrição e Transcriptoma
ESTPoli A
Poli A
Poli A
Poli A
cDNA
Vetor + cDNA
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Transcrição e Transcriptoma
EST
Sequenciamentoextremidades
5’ Poli A
3’ Poli A
3’
5’
~ 800 pb
Vetor Vetor
VetorVetorcDNA completo
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Transcrição e Transcriptoma
ESTRemoçãoSequencia de vetor(cross_match, Lucy)
Remoção Poli A (Script Perl)
EST
5’ Poli A3’Vetor Vetor
Poli A
X X
X5’ 3’
5’ 3’
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Análise do transcriptoma
EST – Anotação
BLASTXE
BLASTN
GenBankNucleotídeos>clone_23 5’
ggcacgagagttctcccggagacgctccgtgcgaagattatggaggccgtcaatgtggtcggttcccgccactttgctcgcctg
Bancos de seqüências
GenBankProteínas
5’ 3’
clone_23 5’ = amastina
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Análise do transcriptoma
EST – Anotação
Agrupamento deseqüência similaresouagrupamento via anotação
= amastina>clone_23 5’ggcacgagagttctcccggagacgctccgtgcgaagattatggaggccgtcaatgtggtcggttcccgccactttgctcgcctg
Número de ESTs Anotação
4 amastina
6 TcMUC II
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Transcrição e Transcriptoma
Transcriptoma de amastigotas
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Transcrição e Transcriptoma
Transcriptoma de amastigotas