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Seqüenciamento de DNA
Profa. Dra. Aline Maria da Silva
Instituto de Química- USP
Bibliografia:
Recombinant DNA – James Watson & Michael Gilman
Guia de Rotas na Tecnologia do Gene – Matthew Walker & Ralph Rapley
Biologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha
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Seqüenciamento de DNA
Clivagem química ou Método de Maxam-Gilbert (utilizado apenas em situações especiais)
Método de Sanger: Terminação controlada da replicação
Manual
Automatizado
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Método de Sanger
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Reação da DNA Polimerase I
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2´, 3´didesoxirribonucleotídeo trifosfato (ddNTP)
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2, 3´didesoxirribonucleotídeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reação de polimerização da cadeia de DNA
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Sequenciamento método de SangerObtenção do molde: DNA dupla fita desnaturadoAnelamento do “primer” (iniciador) ao molde
Primer pode estar radioativamente marcado com 32P
Extensão do “primer”: dCTP, dGTP, dTTP e dATP + DNA polimerase
Terminação da síntese: adição dos ddNTPsNo sequenciamento automatizado cada um dos ddNTPs está
acoplado a um cromóforo fluorescente distinto
Separação dos fragmentos de DNA com 1base de diferença em eletroforese
Gel de poliacrilamida ou Capilar
Detecção dos fragmentos após eletroforeseAutorradiografia (sequenciamento manualLaser (sequenciamento automatizado)
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Sequenciamento método de Sanger
Anelamento do “primer”
Extensão do “primer”
Terminação da síntese: adição dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
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Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferença
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Autorradiograma de um gel de sequenciamento de DNA
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Sequenciamento automatizado
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Imagem de um gel de sequenciamento com detecção por fluorescência
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Cromatograma: Sequenciamento automatizado com “dye terminators” (método da interrupção controlada
da replicação com ddNTPs)
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Programa para montagem (PhredPhrapConsed)
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Estratégia de sequenciamento do genoma humano
Nature 15 Feb 2001 409(6822)
Wh
ole
gen
om
e s
ho
tgu
n
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Análise de Sequências de genes e de genomas
Comparação da sequência obtida com sequências depositadas em Bancos de Dados de Sequências de DNA e Proteínas (www.ncbi.nlm.nih.gov)
Programa BLASTIdentificação de fases abertas de leitura (ORFs) na seqüência
de bases no caso de seqüências codificadorasAnálise de domínios proteicos na seqüência de aminoácidos
deduzida a partir da seqüência de basesIdentificação de regiões regulatórias (promotores, enhancers,
etc)Estabelecimento de relações filogenéticas entre a sequência de
interesse e sequencias similares de outros organismosEtc, Etc, Etc......
Bioinformática
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Busca por comparação no GenBank com programa BLAST>geneXGGCACGAGGGAGAAGTTTGTGGTAGTAATAATAATAGTAATGAACAACCAATAAACGAAAATTTAAATATATAAAATATATTTAAAATAAAAATAAAAAATAAAACAAAACAAAACAAAACAAAAACAAAAAAAAATAAAAAGAGAAAGAAAATAAATAAAAATAAAATAATATAAATAAAAAAGAATGGAAATTGATTTAGATTCAATCATTACAAGATTATTGGAACCAAGAACTACAAAACCAGGTAAATTAGTTGATTTAGCAGAGGAGGAAATTAGATATTTAACAGTTCAAGCCACTGAAATCTTTATAAATCAACCAATTTTATTGGAATTAGAAGCACCAATCAAGATCTGTGGTGATATTCATGGACAATACTACGATTTACTTCGTCTCTTTGAGTACGGAGGATTCCCACCACAAAGTAATTATCTTTTTTTAGGTGATTATGTCGATCGTGGTAAGCAATCCTTAGAGACCATTTGTTTATTGTTGGCCTATAAAATCAAATATCCAGAGAACTTTTTCATTCTTCGTGGAAATCACGAATGTGCATCCATCAATCGTATCTATGGTTTTTACGATGAATGCAAGAGAAGATACAACAGCAAATTATGGAAAGCATTTACAGATTGCTTCAACTGTCTCCCAGTTGCAGCCATCATTGACGAGAAAATCTTTTGTATGCATGGTGGTCTCTCACCAGATCTCAAGAATATGGATCAAATTCGTAGAATCACTAGACCAACCGTTGTTCCAGATTTTGGTCTTTTATGTGATCTCTTGTGGGCTGATCCTGATAAAAACATTCAAGGTTGGGAAGATAATGACCGTGGTGTCTCCTATACTTTTGGTGCCGACGTTGTCGAATCATTCTTAAAGAAACACGATCTCGATTTAGTTTGTAGAGCTCATCAAGTTGTAGAAGATGGTTATGAATTCTTTGCTAAACGTCAATTGGTAACCCTCTTTTCCGCTCCAAATTACTTTGGTGAATTTGATAACGCTGGTGCTATGATGGGTGTCGATGAAACTTTAATGTGTTCATTCCAAATTTTAAAACCTGCCGATAAAAAAAAACTTACAAACGATAGTAATGGTAGACCATTAACTCCTCCAAGAAATAAACAACAAAAACCAAAAAAATAAATTAAAATAACTACTTTTTTAAAAAAAAAG
BLASTx no GenBank
Tradução em todas as 6 fases de leitura e busca contra banco de sequência de proteínas
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