1

P Rohner HUG 1

Sepsis - Hémocultures

Peter Rohner Laboratoire Central de Bactériologie Service des Maladies InfectieusesHôpitaux Universitaires de Genève

18 mars 2004

• Introduction• Pathophysiologie, définitions, diagnostic, laboratoire• Hémocultures, indication, prélèvement, transport• Systèmes d'hémocultures• Hémocultures positives:

procédure au laboratoireinterprétation clinique

P Rohner HUG 2

Sepsis ~putréfaction (grec).

Terme utilisé historiquement pour inflammationavec pus malodorant, considéré commepathologique.

Pasteur et Lister révision, pus = infection.

Plaies séptiques – lymphangite.

2

P Rohner HUG 3[Bone RC et al, Chest 1992:1644-55]

Infection, Sepsis, SIRS

Infection Sepsis

Trauma oubrûlure ou

pancréatite ouautre

Syndromeinflammatoirede réponsesystémique

P Rohner HUG 4

Hémoculture positivePseudobactériémie ou contaminant

Infection Sepsis

Trauma oubrûlure ou

pancréatite ouautre

Bactériémie vraie oufongémie vraie ou

pathogène

Syndromeinflammatoirede réponsesystémique

[Bone RC et al, Chest 1992:1644-55]

Hémocultures positives, Infection, Sepsis et SIRS

3

P Rohner HUG 5

Nature 2002, 420:885

P Rohner HUG 6

Nature 2002, 420:885

LPS binding protein

Toll-like receptor 4

Macrophage scavanger receptor

IL1 receptor-associated kinase

Nucleotide-binding oligomerization domain

4

P Rohner HUG 7

Nature 2002, 420:885

P Rohner HUG 8

Nature 2002, 420:885

5

P Rohner HUG 9

P Rohner HUG 10

6

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7

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8

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Manifestations cliniques des bactériémies et des fongémies:fièvre (>38°C) ou hypothermie (<36°C), tachycardie (>90 / min.),tachypnée (>20 / min.),leucocytose (>12'000 / mm3) ou leucopénie (<4’000 / mm3)

Confirmation de la suspicion clinique → hémoculture

Le résultat d'une hémoculture dépend du:

• Moment du prélèvement• Volume de sang prélevé• Nombre de flacons inoculés• Milieu de culture utilisé• Système d’hémoculture choisi

Manifestations cliniques d'une sepsis

9

P Rohner HUG 17

N° prélèvements - total 100'000

Hémocultures 24'000Varia (frottis, liquide, etc.) 24'000 (dont 750 LCR)Urines 22'000Respiratoire 10'000MST 7‘000Selles 6‘000Mycobactéries 4'000

Répartition des prélèvements analysés aulaboratoire central de bactériologie HCGenève

2003

P Rohner HUG 18

Hémocultures analysées au LCB HUGenève 1990 à 2003

0

5'000

10'000

15'000

20'000

25'000

1990

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

NEG ( 60.-)POS (150.-)

10

P Rohner HUG 19

Historique des systèmes d'hémocultures

Méthode Fréquence Système de détection de lecture Références

Bouillon turbidité / visuelle 12 à 24 h [Judd CCW et al, JAMA 1915:822]

Biphasique colonies / visuelle 12 à 24 h [Castaneda MR, Proc Soc 1947:114-5]

"Gas capture" pression < 12h [Sawhney D et al, J Clin Pathol 1986:1259-63]

Instrument 14CO2 / radiométrie 8 h [Schrot JR et al, Appl Microbiol 1973:867-73]

Automate NR CO2 / infra-rouge 8 h [Courcol RJ et al, J Clin Microbiol 1986:26-9]

Monitorage CO2 / colorimétrie 10 min. [Thorpe TC et al, J Clin Microbiol 1990:1608-12]

continu CO2 / fluorimétrie 10 min. [Nolte FS et al, J Clin Microbiol 1993:552-7]

P Rohner HUG 20

Prélèvement d’hémoculture

• Désinfecter soigneuse de la peauteinture PVP- iode ou alcool, puis PVP-iode

• Ponctionner de sites différentspour chaque paire de flacons

• Eviter les prélèvements par cathéters

11

P Rohner HUG 21

10%n=166

14%n=105

10%n=199

11%n=298

02468

10121416

-12 -2.5 1 12

Heures avant

% p

ositi

f

[Thomson RB et al, ASM 1989:431]

-0.5

Pic fébrile Heures après

Positivité des hémocultures en fonction duprélèvement par rapport au pic fébrile

P Rohner HUG 22[Li J et al, J Clin Microbiol 1994:2829-31]

Positivité des hémocultures en fonction del’intervalle entre deux prélèvements

No. d'épisodes No. (%) d’épisodes

Intervalle testés supplémentaires positifs

simultanément 184 35 (19%)

10 min. à 2 h 30 5 (17%)

2 h à 24 h 72 12 (17%)

12

P Rohner HUG 23

0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

<=4 5 6 7 8 9 10 11 12 >=13Volume de sang inoculé (ml)

% p

ositi

f

3.8%

11.5%

avec des germes pathogènes

2.2% 2.8%

avec des germes contaminants

[Rohner P et al, Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1989:150-3,Rohner P et al, Eur C Clin Microbiol 1989:103]

Positivité des hémocultures et volume de sang inoculéSystèmes manuels, flacons aérobies (n=10’500), patients adultes

P Rohner HUG 24

Volume de sang à inoculer

Chez l’adulte circulent 0.1-10 UFC/ml de sang en cas de

bactériémie, d’où l’importance de cultiver 8-10 ml de sang.

Chez l’enfant à bas âge le nombre de germes est de 10-1000

UFC/ml, d’où le volume de sang suffisant de 1-3 ml.

13

P Rohner HUG 25[Rohner P et al, J Clin Microbiol 1997:2634-8]

Augmentation de la sensibilité par prélèvements multiples%

pos

itif c

umul

é 81%

66%

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

Patients sansantibiothérapie

(n=448)

Patients sousantibiothérapie

(n=149)

première

95%83%

deuxième

98%90%

troisième

Série d'hémoculture

100 % défini sur la base de ~3 sériesd'hémocultures

P Rohner HUG 26

Milieux de base Bouillon digéré de soja-caséine (TSB)Infusion de cervelle et de cœur (BHI); 50 à 100 ml

Anticoagulant Polyanéthol sulfonate de sodium (SPS)

Aérobies O2 atmosphériqueAnaérobies Milieux pré-réduits, CO2 et N2

Saponine Agent lytiqueRésines Agent neutralisant l'activité antimicrobienFAN Ecosorb, Fullers earth

Choix des milieux d’hémocultures

14

P Rohner HUG 27

SignalSepti-Chek

IsolatorCastaneda

Automates (invasif) BACTEC 460 660/730 860

BioArgos

19451950

19551960

19651970

19751980

19851990

1995

Systèmes manuels

BacT

/Ale

rt

BAC

TEC

900

0ES

PVI

TAL

Automates à monitorage continu

Deg

ré d

’aut

omat

isat

ion

Systèmes d’hémocultures disponibles

Date de commercialisation

P Rohner HUG 28

15

P Rohner HUG 29

Système d'hémoculture bi-phasique Hémoline bioMérieux

P Rohner HUG 30

Système d'hémoculture bi-phasique Septi-Chek BD

16

P Rohner HUG 31

Système d'hémoculture lyse centrifugation Isolator Oxoid

P Rohner HUG 32

Système d'hémoculture fluorimetic Bactec BD

17

P Rohner HUG 33

Flacons d'hémoculture fluorimetic Bactec BD

P Rohner HUG 34

Controller ModuleIncubator Module

Système d'hémoculture colorimetric Bact/Alert bioMérieux

18

P Rohner HUG 35

FAN MediaStandard Media

Flacons d'hémoculture colorimetric Bact/Alert bioMérieux

P Rohner HUG 36

Détection de la croissance microbienne par colorimetrieBacT/Alert

Colorimetric Sensor in all bottlespatented technology

Semi-permeable Silicon Layerno direct interference with broth

CO2 + H2O <-> H2CO3 <-> H+ + HCO3-

Growing organisms produce CO2Sensor changes from green to yellow

19

P Rohner HUG 37

Détection de la croissance microbienne par colorimetrieBacT/Alert

Next Generation systemContinuous Scanning and Analysisof Bottles

More stableVirtually no Influence by Lightand/or Temperature

Visual growth historyImmediate identification of positivebottles prior to incubation

P Rohner HUG 38

Bouillon

Senseur de CO2

Schéma du flacon BACTEC9000 et de la détection de CO2

Détection de la croissance microbienne par fluorimétrie

Détecteur à photodiode

Filtre d'émission

Diode d'émission

Filtre d’excitation

20

P Rohner HUG 39

Souscultures d’hémocultures positives

[Clinical Microbiology Procedures Handbook]

Milieux de Culture

Microscopie GS, 5% CO2 Choc Mac CNA Anaérobie

Coques Gram positifs + + + +Bâtonnets Gram positifs + + + +Coques Gram négatifs + + + +Bâtonnets Gram négatifs + + + +

P Rohner HUG 40

Recommandations pour l'évaluation des hémocultures

• Inoculer les flacons des systèmes à volume égale et en parallèle

• Contrôler le volume inoculé (exclure les séries avec des flacons mal rempli)

• >500 séries d'hémocultures positives, >20 espèces microbiennes différentes

• >5000 séries conformes

• Distinguer entre micro-organismes pathogènes et contaminants

• Evaluer par épisode septique

• Evaluer séparément les patients sous antibiothérapie

• Comparer à des systèmes existants ≠ "gold standard"

[Wilson ML. Clin Lab Med 1994:1-7;Mathieu D et al, Bull Soc Fr Microbiol 1994:179-85]

21

P Rohner HUG 41

Evaluations des systèmes d’hémocultures HUGenève

Systèmes évalués No. évalué Référence

Septi-Chek, Signal 2’266 [Rohner P et al, Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1989:150-3]

Hémoline, Septi-Chek, Signal 2’010 [Rohner P et al, Eur C Clin Microbiol 1989:103]

Septi-Chek, Signal 2’394 [Rohner P et al, Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1991:620-4]

BacT/Alert, BACTEC 90004’632 [Auckenthaler R et al, Eur C Clin Microbiol 1993:36]

Septi-Chek, Signal 5’122 [Rohner P et al, Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994:28-32]

BacT/Alert, Signal 5’566 [Rohner P et al, J Clin Microbiol 1995:313-7]

BACTEC 9000, Septi-Chek6’116 [Rohner P et al, J Clin Microbiol 1996:126-9]

BACTEC 9000 (résines et lytique)10’914 [Rohner P et al, J Clin Microbiol 1997:2634-8]

Systèmes manuels, automates

P Rohner HUG 42

But de l'étude: Comparer les résultats obtenus avec des pairesd'hémocultures, dont un milieu contenait de lasaponine.

La saponine est un détergent qui lyse à 0.05% lesparois des cellules sanguines et libère donc lesmicro-organismes intracellulaires, ceci sans diminuerla croissance des micro-organismes.

Evaluation d'un milieu "lytique"

22

P Rohner HUG 43[Rohner P et al, Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1991:620-4]

Avantage des milieux "lytique" (0.05% saponine)

Système Septi-Chek

N° de germes isolés lytique 213 non lytique 189

Avantage de 13%

P valeur 0.004

BHI-lytique seul positif

31

10

19

38

42

29

3

2

6

6

3

10

5

15

12

0 10 20 30 40 50 60

Autresbactéries

Levures

Autres entérobactéries

E. coli

Streptocoques

S. aureus

BHI-S seul positif

Les deux positifs

P Rohner HUG 44

Systèmes manuels ->automates

[Rohner P et al, J Clin Microbiol 1996:126-9]

23

P Rohner HUG 45[Rohner P et al, J Clin Microbiol 1996:126-9]

Comparaison du temps de détection système manuel versus automate

10%

20%

30%

40%50%

60%70%

80%90%

100%

0%0 1 2 3 4 5

Jours après inoculation

Automat BACTEC, aérobie résine (n=524)

Manuel Septi-Chek, aérobie lytique (n=574)

% p

ositi

f cum

ulé

P Rohner HUG 46

But de l'étude: Comparer les résultats obtenus avec des pairesd'hémocultures, dont un milieu contenait des résines.

Les résines sont ajoutées sous forme de billes. Leurfonction principale est de neutraliser les antibiotiques.

De plus elles augmentent la surface dans le milieu,permettant ainsi les micro-organismes de croître enbiofilms.

Evaluations des milieux à résines

24

P Rohner HUG 47

Avantage des milieux à résines

[Auckenthaler R et al, Eur C Clin Microbiol Infect Dis 1993:36]

Systèmes BACTEC 9000BacT/Alert

N° de germes isolés résines 492 non résines 409

Avantage de 20%

P valeur <0.00161

70

49

43

43

75

19

10

7

6

7

19

20

20

10

20

33

48

0 50 100 150

Autresbactéries

Autresentérobactéries

E. coli

Levures

S. aureus

SCN

BACTEC résines seul

BacT/Alert non-résinesseul positif

Les deux positifs

P Rohner HUG 48

Avantage d'associer un milieu à résines avec un milieulytique, Système BACTEC 9000 fluorimétrie

[Rohner P et al, J ClinMicrobiol 1997:2634-8]

[Rohner P et al, J ClinMicrobiol 1996:126-9]

611

420

283

105

241

107

0% 20% 40% 60% 80% 100%

résines aérobie seul résines anaérobie seulLes deux positifs

Les deux positifs résines aérobie seul lytique anaérobie seul

(n=632)

(n=1'135)

25

P Rohner HUG 49

Resin versus Fan

[Jorgensen JH et al; J Clin Microbiol 1997:53-8]

Système BACTEC 9000BacT/Alert FAN

N° d'isolats BACTEC 594 BacT/Alert 577

Différence 3%

Valeur P = NS45

101

24

39

79

125

35

23

21

5

15

23

27

23

12

8

20

18

0 50 100 150 200

Levures

Entérobactéries

Entérocoques

Streptocoques

SCN

S. aureus

FAN seul +Resin seul +deux +

P Rohner HUG 50[Rohner P et al, J Clin Microbiol 1996:126-9]

Temps de détection automate Bactec

10%

20%

30%

40%50%

60%70%

80%90%

100%

0%0 1 2 3 4 5

Jours après inoculation

Automat BACTEC, aérobie résine (n=524)

% p

ositi

f cum

ulé

26

P Rohner HUG 51

0%

10%20%30%40%

50%60%70%

80%90%

100%

Jours après inoculation

% p

ositi

f cum

ulé

S. pneumoniaeE. coliautres entérobactéries

0 1 2 3 4 5

[Rohner P et al, J Clin Microbiol 1996:126-9]

Temps de détection automate BACTEC 9240

S. aureusPseudomonas spp.

P Rohner HUG 52[Rohner P et al, J Clin Microbiol 1996:126-9]

Durée d’incubation Septi-Chek

durée d’incubation5 j 6 – 15 j gain

Germes pathogènes 574 14* 2.4%

Contaminants 99 41** 41.4%

* 4 Candida albicans, 2 Actinomyces meyeri, 2 Campylobacter fetus, 1Citrobacter freundii, 1 Gemella morbillorum, 1 Staphylococcus aureus, 1Staphylococcus epidermidis, 1 Streptococcus pneumoniae, 1 Candida glabrata,

** 17 Propionibacterium spp., 16 Corynebacterium spp., 3 Coagulase-negativestaphylococci, 2 Bacillus spp. and 3 Micrococcus spp.

27

P Rohner HUG 53

Transport - entreposage

BacT/Alert et BACTEC• Au plus vite au laboratoire• Entreposer à la temperature ambiante

Temps de détection après préincubation 36°C de8h 16h 24h

P. aeruginosa >7d >7d >7d A. baumannii >7d >7d >7dS. maltophilia 6.2h >7d >7dE. coli 1.2h 1.2h 1.2hK. pneumonie 1.2h 1.2h 1.2hS. marcescens 1.2h 1.2h 1.0h [Klaerner HG et al; J Clin Microbiol 2000:1036-41]

• Au plus vite dans l’incubateur de l'instrument

P Rohner HUG 54

Durée d’incubation

Prolonger la durée d'incubation >10 j pour les suspicions cliniques :

Brucella sp.

Endocardite : Abiotrophia spp., Haemophilus spp., Actinobacillus spp.,

Cardiobacterium spp., Eikenella spp., Kingella spp. HACEK

Candida spp.

Uniquement avec des milieux spéciaux (Middlebrook)

Mycobacterium spp.

28

P Rohner HUG 55

Systèmes d'hémocultures utilisés 1996 PHLS311 utilisateurs

BACTEC 11938%

BacT/Alert 5919%

Vital 103%

Conventionnel 3411%

Sentinel 206%

Septi-Chek 124%

Hémoline 62%

Signal 4916%

Vacutainer 21%

[Snell JJS; 1996]

P Rohner HUG 56

Résultats

29

P Rohner HUG 57

1 7 1131 24 29 23 13 10 10

2537 36 35

53

85 6876

9584

10093

98 9682 60

7362 74

75

0

20

40

60

80

100

120

140

1989

1990

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

N° p

atie

nts

MSSAMRSA

Bactériémies à S. aureus HUGenève

P Rohner HUG 58

30

P Rohner HUG 59

Bactériémies HUGenève

20

52

7872

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1989

1990

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

N°

patie

nts

Enterococcus faecalis

Streptococcus pneumoniae

P Rohner HUG 60

Bactériémies HUGenève

180

222

2440

2130

50

100

150

200

1989

1990

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

N°

patie

nts

E. coliPseudomonas aeruginosaHaemophilus influenzae

31

P Rohner HUG 61

Evolution en Suisse http://www.bag.admin.ch/infreporting/

P Rohner HUG 62

32

P Rohner HUG 63

20

25

23

18

16

12

1011

7

9

16

11

34

2

4

1

4

1

5

1

54

2

0

5

10

15

20

25

1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000

N° d

e Pa

tient

s

Salmonella spp.

Campylobacter spp.

Bactériémies HUGenève

P Rohner HUG 64

79

8894

84

73

95

67

78

63

7276

100103 101

77

93

68

59

68

80

42

3135

69

0

20

40

60

80

100

120

1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000

Campylobacter spp.

Salmonella spp.

Coprocultures HUGenève

Salmonella spp.hémoculture

20

11

N° d

e Pa

tient

s

33

P Rohner HUG 65

Bactériémies HUGenève

15 18

38 36

0

10

20

30

40

50

60

70

1989

1990

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

N°

patie

nts

anaérobies Gram pos

anaérobies Gram nég

P Rohner HUG 66

Candidémies HUGenève

8

30

1713

0

10

20

30

40

1989

1990

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

N°

patie

nts

Candida albicans

autres levures

34

P Rohner HUG 67

13

3023 20

28 2419 18

914 14 13 10

188

17

11

10 18

1519

1018

6

11 118

10

19

13

0

10

20

30

40

50

1989

1990

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

N° p

atie

nts

autres levuresCandida albicans

Candidémies HUGenève

P Rohner HUG 68

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997

N° p

atei

nets

ave

c C

andi

dém

ie

Candidémies et consommation de fluconazol, HUGenève

0

5'000

10'000

15'000

20'000

25'000

30'000

35'000

40'000

Con

som

mat

ion

fluco

nazo

le (D

DD

)

[Garbino J]

35

P Rohner HUG 69

P Rohner HUG 70

36

P Rohner HUG 71

Interprétation

P Rohner HUG 72

Bactéries à Gram positifs pathogènes ou contaminants

0% 20% 40% 60% 80% 100%

Propionibacterium spp., n=48

Corynebacterium spp., n=53

SCN, n=703

Autres Gram positifs, n=38

Autres streptocoques, n=84

Entérocoques, n=93

Streptocoques ß A et B, n=18

S. aureus, n=204

Pneumocoques, n=34

pathogène incertain contaminant

[Weinstein MP et al, Clin Infect Dis 1997:584-602]

37

P Rohner HUG 73

Bactéries à Gram négatifs pathogènes ou contaminants

[Weinstein MP et al, Clin Infect Dis 1997:584-602]

0% 20% 40% 60% 80% 100%

B. fragilis, n=18

Autres Gram nég. aérobies, n=16

Autres Pseudomonas, n=15

A. baumanii, n=16

P. aeruginosa, n=55

H. influenzae, n=3

Autres entérobactéries, n=173

E. coli, n=143

pathogène incertain contaminant

P Rohner HUG 74[Weinstein MP et al; Clin Infect Dis 1997:584-602]

0 50 100 150

S. aureusCNS

S. pneumoniaeβ B Streptoc.

α Streptoc.Enterocoques

E. coliK. pneumoniae

E. cloacaeS. marcescens

P. mirabilisP. aeruginosa

A. baumaniiB. fragilis

Candida spp Inconnu

Intavascular catheter

Voies urogénitales

Voies respiratoires

Intraabdominal etabcèsPeau

Voies biliaires

Os articulation

Sources des bactériémies et des fongémies ( laboratoire)

38

P Rohner HUG 75[Weinstein MP et al; Clin Infect Dis 1997:584-602]

Sources des bactériémies et des fongémies (clinique)

0 50 100 150 200 250 300

intra vasculaire

peau

respiratoire

génito-urinaire

os artic

abdominal

inconnu S. aureusCNSS. pneumoniaeStrep BAutres streptoEntérocoquesE. coliAutres entérobP.aeruginosaCandida

P Rohner HUG 76

25% 26%

19%7%

5%19%17%

17%18%

12%9%

12%3%

5%4%

1%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1983 1997

Plaies chirurgicalesPeauAbdominauxVoies respiratoires

Voies uro-génitales

Cathéters

Autres

Inconnu

[Weinstein MP et al,Clin Infect Dis 1997:584-602]

[Weinstein MP et al,Rev Infect Dis 1983:54-70]

Sources des bactériémies et des fongémies 1983 / 1997

39

P Rohner HUG 77[Weinstein MP et al; Clin Infect Dis 1997:584-602]

Mortalité des bactériémies et des fongémies

5.5

12

12

13

13

17

18

25

36

0 10 20 30 40

SCN 73

S. aureus 159

E. coli 116

Autres strepto 38

Enterocoques 38

P.aeruginosa48

S. pneumoniae 34

Autres entérob 125

Candida 53

mortalité %

moyenne 17.5

P Rohner HUG 78[Weinstein MP et al; Clin Infect Dis 1997:584-602]

Mortalité des bactériémies et des fongémies

30

25

15

20

18

10

13

0.1

0 5 10 15 20 25 30

>80

70-79

60-69

50-59

40-49

30-39

20-29

<20

Tran

che

d'âg

e

mortalité %moyenne 17.5

40

P Rohner HUG 79

Bactériémies: traitementempirique

[Byl et al. Clin. Infect. Dis. 29; 1999: 60-66]

Type de micro-organisme Pourcentage detraitement correct

Coques Gram positif 59%Bacilles Gram négatif 69%Champignons 32%

P Rohner HUG 80

Conclusions

41

P Rohner HUG 81

Prise en charge optimale despatients avec sepsis (PCT, hémocultures…)

permet de:

• réduire la durée d’hospitalisation• réduire la mortalité• recommander une antibiothérapie empirique• proposer une antibiothérapie ciblée• fournir le diagnostic précis et rapide• réduire les coûts