FeSBE 2012

Resumo: 09.001

SEPARATION AND ACCESSIBILITY OF THE NUCLEOTIDE-BINDING DOMAIN (NBD) HETERODIMERIZATION INTERFACE WHEN A CFTR CHANNEL CLOSES

Autores 1POLETTO CHAVES, L. A.

1, MENSE, M.

1, GADSBY, D. C.

1 Laboratory of Cardiac/Membrane

Physiology - The Rockefeller Univ

Apoio Financeiro: NIH - DK51767

Resumo Objetivos The open state of a CFTR channel corresponds to a structure in which its two cytoplasmic NBDs, NBD1 and NBD2, form a stable head-to-tail heterodimer that encloses an ATP molecule in each of two composite sites, one catalytically active and the other catalytically dead. Evidence suggests that ATP hydrolysis triggers channel closure by disrupting the dimer interface, and that when a channel closes the NBDs separate at the active site, allowing ADP release and binding of fresh ATP at the head of NBD2. But how often NBD separation occurs at the dead site remains unclear. Métodos We addressed this by using inside-out patch recording to determine the gating-state dependence of accessibility to thiol-specific, methanethiosulfonate (MTS), reagents of interfacial target cysteines engineered into CFTR channels expressed in Xenopus oocytes. We introduced target Cys, one at a time, in equivalent ABC signature sequence positions, S549C (in LSGGQ of NBD1 tail in the active composite site) and S1347C (in LSHGH of NBD2 tail in the dead site) in a background construct in which eight native Cys (C832-1458S) were replaced by Ser. Resultados The Cys target in S549C or S1347C CFTR channels was rapidly modified by micromolar MTSET+ (2-trimethylammonium-ethyl-methanethiosulphonate) or MTSACE (2-aminocarbonyl-ethyl-methanethiosulphonate) applied when channels were opening and closing in 3 mM ATP, resulting in rapid macroscopic current decline with a time constant of ~2 s. That time course was closely similar to that of current decay due to channels closing following sudden withdrawal of ATP. Both target Cys were also stoichiometrically modified by micromolar MTSET+, MTSACE, or MTSES- (2-sulphonato-ethyl-methanethiosulphonate) applied for 20-60 s when channels were closed in the absence of ATP. Whether the channels were modified when they were closed, or when they were opening and closing in the presence of ATP, the modification could subsequently be reversed by 30-60 s exposure to 10-20 mM DTT. Modification in closed channels, and modification with the time course of channel closure when channels were opening and closing, suggested that MTS reagents could react with either target Cys as soon as a channel closed. To test this interpretation, we introduced the hydrolysis-impairing mutation K1250R (NBD2 Walker A Lys in the active composite site) in both S549C and S1347C channels, which resulted in ~15 fold slower channel closing, and hence current decay, on sudden withdrawal of ATP. When these channels were opening and closing in ATP, the current decline due to MTS modification of either Cys was similarly slowed ~15 fold. Conclusão We conclude that, when CFTR channels are open, both target Cys are buried in the NBD1-NBD2 interface so that neither can be modified, but both become accessible to MTS reagents as soon as the NBDs separate when a channel closes. The similarly rapid accessibility of S549C and S1347C, as well as modification of both Cys by the larger reagents MTS-glucose (~14Å x 9Å x 9Å), MTS-biotin (~15Å x 11Å x 8Å), and MTS-rhodamine (~17Å x 16Å x 11Å), suggests that active and dead composite interfacial sites both separate by ≥11Å during each gating cycle

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Resumo: 09.002

ANÁLISE TEÓRICA DO EFEITO DE CAMPO ELETROMAGNÉTICO DE 60HZ NA ATIVIDADE ELÉTRICA DAS CÉLULAS ΒETA-PANCREÁTICAS

Autores 1NEVES, G. F. D.

1,2, SILVA, J. R. F. D.

1, TENORIO, B. M.

1, NOGUEIRA, R. D. A.

1 Morfologia e

Fisiologia Animal - UFRPE, 2 Departamento de Pesca e Aquicultura - UFRPE

Apoio Financeiro: CAPES

Resumo Objetivos Nos últimos anos, tem havido um intenso debate envolvendo a comunidade científica para responder a seguinte pergunta: sistemas biológicos são compatíveis com os crescentes níveis de exposições a campos eletromagnéticos (CEM), principalmente de baixas frequências? CEM de baixa frequência são gerados na produção, distribuição e uso de energia elétrica e vêm despertando interesse com respeito aos seus efeitos em sistemas biológicos, tais como canais iônicos, receptores e enzimas celulares e na saúde humana e outros animais. Portanto, investigar in silico a influência de CEM de baixa frequência sobre a atividade elétrica das células beta-pancreáticas, pode trazer uma grande contribuição à compreensão dos fenômenos básicos envolvidos na secreção da insulina e na clínica endocrinológica. Métodos Para a simulação da atividade elétrica das células beta-pancreáticas foram utilizadas as equações diferenciais propostas por Watts et al. (J.Theor.Biol. 276:218, 2011). Neste modelo introduzimos uma voltagem senoidal para mimetizar o componente elétrico do campo eletromagnético, sendo a frequência da onda 60Hz e a amplitude variável entre 0 a 5 mV, aplicadas em intervalos de 0.5 mV. O sistema de equações diferenciais foi escrito em linguagem C para o software XPPAUT 6.1 (2002- 2011) com saídas gráficas no software MATLAB 7.8 (The MathWorks, Inc, 2009) e carregado numa estação de trabalho com dois computadores e dezesseis processadores de 2,8 GHz QUAD CORE, 32 GB de RAM, 4 discos rígidos de 1000 GB cada. Resultados A simulação permitiu como saídas gráficas as voltagens através das membranas das células beta em função dos tempos. Nestes gráficos pode-se observar o comportamento típico das células beta pancreáticas, com presença de bursts (oscilações de cálcio na fase ativa do potencial de ação). Nossos experimentos in silico mostraram que ao se aplicar um sinal senoidal de voltagem com frequência de 60 Hz, variando-se apenas a amplitude do sinal, ocorre um aumento na duração dos bursts, até se tornar contínuo em 3mV. Curiosamente, a partir de 5mV o burst é inibido. Uma análise dose (intensidade da voltagem) resposta(duração média dos bursts) mostra um aumento da duração média dos bursts com o aumento da intensidade da voltagem da onda senoidal. Os valores médios dos bursts para cada amplitude de voltagem e seus respectivos desvios padrões, foram: 0 mV: 1.227 ± 0.32ms (n=7, controle) ; 0.5mV: 1.455 ± 0.47ms (n=5); 1mV:1.744 ± 0.59ms (n=5); 1.5 mV:2.275 ± 0.82 (n=4); 2 mV: 3.245 ± 1.16ms (n=3); 2.5mV: 4.857 ± 2.77ms (n=2). Após 3.0 mV o burst permaneceu contínuo. Conclusão Os resultados obtidos neste trabalho mostram que as durações dos bursts aumentam em função da intensidade do campo eletromagnético. Uma provável justificativa para esse efeito do campo eletromagnético é a sua ação sobre os canais de cálcio dependentes de voltagem, envolvidos com a secreção de insulina nas células beta- pancreáticas.

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Resumo: 09.003

REGULATION OF CREB PHOSPHORYLATION BY VITAMIN C: INVOLVEMENT OF NMDA RECEPTOR ACTIVITY.

Autores 1 DOMITH, I. C. L.**

1, PORTUGAL, C. C.**

1, SOCODATO, R.**

1, PAES-DE-CARVALHO, R.

1,

CARVALHO, R. P. D. 1 Departamento de Neurobiologia - UFF

Apoio Financeiro: CAPES, CNPq, FAPERJ, PRONEX-MCT.

Resumo Objetivos The retina is an excellent model to study CNS development since all major classes of neurotransmitters and neuromodulators are expressed since early stages of retinal development. Retinal cell cultures are widely employed for neurochemical studies within the CNS and they preserve the main characteristics of the in vivo tissue. Vitamin C is an important antioxidant molecule found in the CNS. Its oxidized form, DHA, is mainly transported by glucose transporters (GLUTs), while its reduced form, ascorbate (asc), is transported by high-affinity transporters called the SVCTs. It has been demonstrated that glutamate-mediated asc release in retinal cells is mediated by SVCT-2. Several findings demonstrate that NMDA glutamate receptors (NMDAr) regulate the activity of CREB transcription factor, which in turn modulates activity-dependent gene transcription. Here we aimed at studying the regulation of NMDA activity by asc and its consequence on CREB activation. Métodos Mixed retinal cells were prepared using 8-day-old chicken embryos. NMDAr activity was assessed by a biding assay using [3H] MK-801. The radioactivity in the assay was determined by liquid scintillation. The determination of extracellular glutamate was achieved using a NAD/ADP/Gluamate dehydrogenase kit. CREB phosphorylation was determined by western blotting using antibodies specific for CREB phosphorylated at Ser 133 residue. The reaction was developed using the ECL chemiluninecence kit using the ChemicDoc device (BioRad). Data is expressed as the mean ± S.E.M. of at least 3 independent experiments. Data was analyzed by one-way ANOVA followed by the Bonferroni post-test using the GraphPad Prism software. CEUA 112/09. Resultados Cultured retinal cells were treated at C3/C4 with glutamate (50μM) as a positive control of NMDAr activity. We observed that glutamate treatment increased the biding of [3H] MK-801 245,9±38,0% (n=4) in cultured retinal cells. In cultures treated with asc (1,5mM) we also observed an increase of NMDAr activity (55,9±11,4% (n=8)). Interestingly, when cultures were co-incubated with glutamate and asc, we observed an increase of only 68,6±14,0% (n=5) in NMDAr activity. In line with, 30 min stimulation with asc promoted an increase of extracellular glutamate levels (110,2±17,1% (n=4)). Additionally, 30 min asc administration also increased pCREB levels (107,8±30,1% (n=17)) in cultured retinal cells. Conclusão We conclude that asc is an important modulator of both NMDAr and CREB phosphorylation. Furthermore, these data suggest a novel role played by asc in the activity-dependent neuronal gene transcription regulated by CREB transcriptional activity.

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Resumo: 09.004

Efeitos dos anestésicos locais sobre a liberação de citocinas e viabilidade celular em células epiteliais humanas.

Autores 1FERREIRA, L. E. N.

1, MUNIZ, B. V.

2, de PAULA, E.

1, VOLPATO, M. C.

1, GROPPO, F. C.

1

Ciências Fisiológicas - FOP/UNICAMP, 2 Bioquímica - IB/UNICAMP

Apoio Financeiro: FAPESP # 2011/12666-8

Resumo Objetivos Efeitos modulatórios dos anestésicoslocais sobre citocinas pró-inflamatórias e a citotoxicidade destes fármacos, sobre diversos tipos celulares, tem sido reportados na literatura indexada internacional. Desta forma, objetivou-se comparar os efeitos da lidocaína, bupivacaína e ropivacaína sobre a liberação das citocinas pró-inflamatórias IL-1α, IL-6, IL-8 e TNF-α, além de verificar alterações na viabilidade celular em culturas de células epiteliais humanas. Métodos Queratinócitos humanos (HaCaT) foram expostos a concentração de 100 μM dos diferentes anestésicos locais por 6 e 24 horas. Células que não receberam tratamentos formaram o grupo controle. A quantificação das citocinas foi feita utilizando o teste de ELISA de captura e a viabilidade celular foi estimada através do ensaio de redução do XTT. Os experimentos foram realizados em triplicatas em três tempos diferentes. Análise estatística foi feita por ANOVA, teste de Tukey com índice significância de 5% (α=0.05). Resultados Os valores da quantificação, nas primeiras 6h, de IL-8 foram: 14,36 pg/mL controle, 20,71 pg/mL lidocaína, 151,91 pg/mL bupivacaína e 8,67 pg/mL ropivacaína. IL-6: 222,90 pg/mL controle, 207,61 pg/mL lidocaína, 116,93 pg/mL bupivacaína e 4.849 pg/mL ropivacaína. Os valores de TNF-α foram: 301,50 pg/mL controle, 488,76 pg/mL lidocaína, 47,92 pg/mL bupivacaína e 2,48 pg/mL ropivacaína. Desta forma, verificou-se um aumento significativo ( p < 0.05) na liberação de IL-8 pela bupivacaína, IL-6 pela ropivacaína e TNF-α pela lidocaína. Após 24 horas os valores da quantificação de liberação de IL-8 foram: 137,38 pg/mL controle, 20,55 pg/mL lidocaína, 119,86 pg/mL bupivacaína e 7,61 pg/mL. Para IL-6: 282,96 pg/mL controle, 250,76 pg/mL lidocaína, 113,19 pg/mL bupivacaína e 3.359 pg/mL ropivacaína. TNF-α: 349, 01 pg/mL controle, 493,13 pg/mL lidocaína, 20,76 pg/mL bupivacaína e 2,41 pg/mL ropivacaína. Após 24h verificou-se que bupivacaína não apresentou diferença estatística ( p > 0.05) na liberação de IL-8 em relação ao controle, os demais tratamentos reduziram significativamente a liberação desta citocina. A ropivacaína manteve uma maior liberação de IL-6 ao longo do tempo ( p < 0.05), já os demais tratamentos não diferiram estatisticamente do controle. No tempo 24 horas, não houve diferença entre lidocaína e o controle na liberação de TNF-α, já os demais tratamentos foram significativamente inferiores ao controle ( p < 0.05). Todos os tratamentos reduziram significativamente ( p < 0.05) a liberação de IL-1α ao longo do tempo. Após 6h de exposição aos anestésicos, a viabilidade celular foi de: 96% lidocaína, 70,1% bupivacaína e 65,6% ropivacaína. Nas primeiras 6 horas a lidocaína não diferiu do controle, enquanto que bupivacaína e ropivacaína reduziram significativamente ( p < 0.05) a viabilidade celular. Após 24 h de exposição verificou-se uma viabilidade de 74,2% lidocaína, 63,9% bupivacaína e 68,7% ropivacaína. Neste tempo não houve diferença entre os tratamentos e todos apresentaram uma redução significativa da viabilidade celular quando comparados ao controle. Conclusão Mesmo em baixas concentrações os anestésicos locais mostraram-se capazes de exercer efeitos imunomodulatórios sobre os queratinócitos humanos, onde anestésicos testados exerceram efeitos distintos sobre a liberação das citocinas IL-6, IL-8 e TNF-α. O aumento da secreção dessas citocinas pode conduzir o desenvolvimento de processos inflamatórios. Os três

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anestésicos apresentaram uma ação semelhante apenas sobre a liberação de IL-1α pelas células HaCaT. Os anestésicos locais afetaram diretamente a viabilidade dos queratinócitos, onde este efeito pode estar relacionado a indução da apoptose por estes fármacos.

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Resumo: 09.005

MODULAÇÃO DA CAPTAÇÃO DE ÁCIDO ASCÓRBICO POR CAFEÍNA: RECEPTORES E VIAS DE SINALIZAÇÃO ENVOLVIDOS

Autores 1SAGRILLO, M. A.

1, PORTUGAL, C. C.

1, ENCARNAÇÃO, T. G. D.

1, PAES-DE-CARVALHO, R

1 Departamento de Neurobiologia - UFF

Apoio Financeiro: CNPq, CAPES, FAPERJ, PRONEX/MCT

Resumo Objetivos A vitamina C, cujo constituinte principal é o ascorbato (asc), possui muitas funções nos humanos e em outros mamíferos e é encontrada em altas concentrações na retina. A adenosina, também encontrada em concentrações significativas na retina, é uma molécula de sinalização celular, que se liga a receptores específicos presentes na superfície da célula, A1, A2A, A2B e A3, sendo a cafeína capaz de antagonizar principalmente aos receptores A1 e A2a. Nosso objetivo neste trabalho foi observar o efeito da cafeína na captação do asc em culturas de células da retina, e investigar vias e receptores envolvidos. Métodos 112/09 Foram utilizadas culturas mistas de retina de embriões de galinha de oito dias. Após dissecadas em CMF, as retinas foram dissociadas quimica e mecanicamente, plaqueadas e incubadas a 37o em placas de 24 poços. Os experimentos foram realizados em três ou quatro dias de cultura. Para o experimento de captação, cada poço foi lavado duas vezes com Hank’s e incubado por 10 min. na mesma solução. Em seguida, as células foram incubadas com diferentes concentrações de cafeína por mais 10 min. Asc foi acrescentado em cada poço e a incubação foi mantida por mais 40 min. Novamente, os poços foram lavados com salina duas vezes e as células lisadas com água. Por fim, as amostras tiveram sua atividade mensurada por cintilação líquida. Para o experimento de Western blot, as placas foram também lavadas com Hank’s e incubadas com cafeína por 50 min. Em seguida, as células foram lisadas com tampão de amostra e as amostras fervidas por 5 min. Foi realizada a dosagem de proteína pelo método de Bradford e as proteínas foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida, sendo posteriormente transferidas para membrana de PVDF. As membranas foram incubadas com anticorpo primário por 12h, novamente incubadas com anticorpo secundário por 1h e, por fim, reveladas. Resultados Primeiramente, foi investigado se a cafeína seria capaz de modular a captação de asc em culturas de células de retina de embrião de galinha. Para isso as culturas foram tratadas com concentrações crescentes de cafeína (1nM-200µM), que induziram a inibição da captação (inibição máxima em 25µM: 65,41 ± 7,91% , n=3). Como a cafeína é antagonista de receptor de adenosina, investigamos a participação dos receptores A1 de adenosina na captação. Para isso utilizamos o DPCPX, antagonista A1, que promoveu inibição significativa da captação do asc (inibição máxima em 0,5nM: 71,03 ± 5,14%, n=1). Conclusão A partir dos resultados obtidos, podemos concluir que a cafeína atua inibindo a captação do asc em cultura de células de retina, sendo que há evidências de que essa inibição pode estar relacionada a receptores A1 de adenosina.

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Resumo: 09.006

ATIVIDADE DE METALOPROTEINASES HEPÁTICAS NA FIBROSE EXPERIMENTAL INDUZIDA EM CAMUNDONGOS KNOCKOUT DE RECEPTOR B1 DE CININAS

Autores

1RAMOS-SILVA, A. P.*

3, MAXENIUC-SILVA, K.

4, PESQUERO, J. B.

4, CARMONA, A. K.

2,

KOUYOUMDJIAN, M. 3, BORGES, D. R.

1, GAZARINI, M. L.

1, NAGAOKA, M. R.

1 Biociências -

UNIFESP, 2 Bioquímica - UNIFESP,

3 Medicina - UNIFESP,

4 Biofísica - UNIFESP

Apoio Financeiro: FAPESP (08/08916-6 e 08/55928-0) e CNPq (477868)

Resumo Objetivos Recentemente, verificamos que a expressão do receptor B1 de cininas (B1R) está aumentada com a progressão da fibrose hepática (Nagaoka et al, 2006). Estudo com animais knockout de B1R revelou que a fibrogênese aumentou em modelo induzido por CCL4- e diminuiu em modelo de ligadura do ducto biliar (BDL). Na fibrose hepática há um balanço entre a expressão de metaloproteinases (MMP) e seus inibidores associados com o remodelamento e reparo tecidual envolvidos na lesão hepática em animais normais. Assim, o objetivo deste trabalho é analisar a atividade proteolitica de MMPs em figados de camundongos knockout de receptor B1 de cininas submetidos a modelos experimentais de fibrose Métodos A fibrose foi induzida em camundongos selvagens e knockout de receptor B1 em duas situacoes: (1) injecao i p < /i> de CCl4 (diluido em oleo, 3 vezes por semana); (2) ligadura do ducto biliar (BDL). Apos 6 sem de indução por CCl4 ou 8 sem após BDL, os figados foram removidos, processados e analisados. A fibrose foi confirmada histologicamente em figados corados com Picrus Sirius. A participacao das metaloproteinases (MMP) foi avaliada por zimograma e a atividade proteolitica ( < i>slopes) em cada situacao foram calculadas a partir da cinetica enzimatica (UAF/seg) do homogenato com os substratos Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2 (Substrato 1, R&D Systems) para atividade total das MMPs e Abz-GPQGLAGQ-Eddnp (Substrato 2) seletivo para as gelatinases (MMP 2 e 9). A analise estatistica foi realizada pelo programa GraphPad Prism 5.0 e foi utilizada ANOVA, seguida de Bonferroni. O nivel de significancia para rejeicao da hipotese nula foi considerado inferior ou igual a 0,05. CEP 0698/07. Resultados As atividades das MMPs foram obtidas nas amostras estudadas e apresentaram variacoes conforme o nivel de fibrose observado histologicamente. Nao houve diferenca na hidrolise sobre o substrato 1 em todas as amostras estudadas nos dois modelos experimentais. Entretanto, utilizando o substrato seletivo para gelatinases (substrato 2) pudemos observar que houve diferenca estatisticamente significante (ANOVA, p=0,0001) entre os grupos estudados no modelo experimental de CCl4. Nos animais selvagens, verificamos menor atividade nos animais tratados com CCl4 (2,0 ± 0,3, n=5) em relação ao controle oleo (2,7± 0,2, n=5). Por outro lado, os animais knockout tratados com CCl4 apresentaram atividade maior (2,6 ± 0,2, n=5) que os animais controle (óleo, 1,9 ± 0,2, n=5). No modelo BDL, verificamos que os animais tanto selvagens quanto knockouts, apresentaram menor atividade que os animais sham. Nos animais knockouts, a atividade sobre o substrato 1 foi significativamente (p=0,003) menor nos animais BDL (1,0 ± 0,04, n=3) em relacao ao sham (3,0 ± 0,3, n=5). Conclusão Nossos dados demonstram que na fibrogenese hepatica a atividade proteolitica das MMP 2 e 9 acompanham os achados morfometricos, no qual esta aumentada no modelo experimental de CCl4 e diminuida no modelo BDL nos animais knockouts de receptor B1 de cininas.

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Resumo: 09.007

DOPAMINE REGULATES SRC ACTIVATION THROUGH THE CANONICAL D1 RECEPTOR PATHWAY

Autores 1SANTIAGO, F. N.

1, SOCODATO, R.

1, Paes-de-Carvalho, R.

1 Departamento de Neurobiologia -

UFF

Apoio Financeiro: CAPES, CNPq, FAPERJ, PRONEX-MCT

Resumo Objetivos Dopamine is an important catecholamine neurotransmitter present in the retina of several species. Previous data demonstrated that dopamine promotes cAMP accumulation in the developing avian retina. Src is a non-receptor tyrosine kinase, which belongs to the SFKs family of cytoplasmic tyrosine kinases. Src has been demonstrated to tightly modulate nerve cells function within the CNS such as the process of neuronal signaling triggered by the activation of either growth factors or G protein-coupled receptors. Our main goal was to correlate dopaminergic neurotransmission, mediated by the activation of dopamine receptors, with the regulation of Src activity in retinal neurons. Métodos To investigate whether dopamine regulates Src phosphorylation in the retina and to study the receptors and signaling pathways involved in this effect, we used cultured retinal cells from chicken embryos. The analyses of phospho-Src (pSrc) levels were evaluated mainly by western blotting. CEUA 112/09. Resultados Initially, we performed a time-response curve with dopamine (50µM) and found that after 5 minutes of stimulation a small decrease in pSrc levels was observed (-16.7 ± 3.1%; n=6),reaching a maximum effect after 30 minutes (-49.7 ± 7.0%; n= 8) which is maintained up to 90 minutes of stimulation (-41.4 ± 15.7%; n=6). To verify the receptor type involved in this dopamine effect, we performed a time-response curve with quinpirole (10µM),a D2 receptor agonist, or SKF38393, a D1 receptor agonist. Stimulation with quinpirole promoted a decrease of pSrc levels in30minutes (-51.9 ± 2.2%; n=5) but returned to basallevels in 60minutes(-4.9 ± 4.5%;n=3). The increase was blocked by the D2 receptor antagonist butaclamol (10µM) (-5.5 ± 10.8%; n= 3). The SKF 38393 effect, which is similar to the effect of dopamine (-76.1 ± 6.2%; n= 5), was blocked by the D1antagonist SCH 23390 (10µM) (-11.7 ± 11.6%, n= 5). The inhibitory effects of dopamine and SKF 38393 were mediated by the cAMP/PKA signaling pathway since they were both inhibited by MDL-12,330A, an adenylyl cyclase inhibitor (-20.1 ± 7.8%; n=5). Conclusão Our data suggest that dopamine can modulate pSrc levels through the activation of metabotropic D1 and D2 dopamine receptors. The signaling pathway triggered by activation of D1 receptor appears to involve the classical adenylyl cyclase/cAMP/PKA pathway. The signaling pathway involved in the D2 receptor effect deserves further investigation.

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Resumo: 09.008

ATIVIDADE DA ENZIMA CONVERSORA DE ANGIOTENSINA HEPÁTICA DE RATOS APÓS TRATAMENTO COM FRUTOSE

Autores

1PINTO*, A. A. S.

1, KIMURA**, D. C.

1, MONTANARO, S. M.

2, BORGES, D. R.

3, NAGAOKA,

M. R. 1, KOUYOUMDJIAN, M.

1 Bioquímica - UNIFESP,

2 Medicina - UNIFESP,

3 Biociências,

Baixada Santista - UNIFESP

Apoio Financeiro: PIBIC/CNPq e FAPESP (2011/13974-8)

Resumo Objetivos No fígado, AII tem efeitos hemodinâmico (via receptor AT1) e metabólico (liberação de glicose) e esses dois tipos de efeitos são pelo menos em parte dissociados. O aumento sistêmico de receptor AT1 foi verificado no modelo de síndrome metabólica pelo pré-tratamento com frutose, mas que pode estar associado com aumento da atividade da enzima conversora de angiotensina. O objetivo deste estudo foi verificar se o tratamento com frutose para indução síndrome metabólica ocorre, no fígado, aumento da resposta hipertensiva portal e liberação de glicose após injeção de angiotensina I e sua conversão em angiotensina II Métodos Ratos Wistar, machos, adultos (230-280 g) de 6 semanas foram divididos em dois grupos: 1) Controle (C), que receberam água ad libitum até a perfusão, e 2) Frutose (F), que receberam solução de frutose 10% por 8 semanas antes da perfusão. Após anestesia com injeção i.p. de uretana (1,3 g/kg), a veia porta e a veia cava inferior acima do diafragma foram canuladas, tornando-se as vias de entrada e saída do perfusato no fígado, respectivamente. O fígado foi exanguinado com solução Krebs-Henseleit-bicarbonato (pH 7,4–7,5), saturada com 5%CO2/95%O2, contendo BSA (1mg/ml), num fluxo constante de 3–4 ml/min.g de fígado, em sistema sem recirculação. O consumo de oxigênio e a pressão portal foram monitorados durante todo experimento. Após período de estabilização (~20 min), AI (0,83, 1,65 ou 3,3 nmol) foi injetada na cânula aferente e a pressão portal registrada em diferentes tempos de perfusão. A viabilidade hepática foi avaliada através de produção de bile e consumo de oxigênio. Alíquotas do perfusato foram coletadas para dosagem de glicose. A resposta hipertensiva portal (RHP) representa a área sobre a curva do gráfico Δ pressão portal (cmH2O) versus tempo de perfusão (min). Glicose e a triglicérides sérica dos animais foram avaliadas no sangue retirado antes da perfusão. CEP 1287/11. Resultados A liberação de bile e consumo de O2 do grupo tratado com frutose foram semelhantes aos do grupo controle. O peso dos animais (g) do grupo C (389,8±10,3; n=10) e do grupo F (396,0±7,8; n=13), assim como os pesos dos fígados (C: 12,0±0.4g; F: 13,1±0,4g), foram semelhantes. A trigliceridemia do grupo C (0,3±0,05 mg/dl; n=10) e do grupo F (0,3 ± 0.04 mg/dl; n=13), assim como a glicemia (C: 254,5±27 mg/dl; F: 288,6±29,9) também não foram diferentes. Após injeção de diferentes doses de AI, a liberação de glicose (μmol/g.min) do grupo F (0,83nmol: 7,8±1,5 n=4; 1,65nmol: 5,9±0.78 n=2; 3,3nmol: 7,8±1.8; n=6) foi semelhante ao do grupo C (0,83nmol: 3,9±1,0 n=5; 1,65nmol: 9,2±2,1 n=2; 3,3nmol: 6,7±1,8 n=5). Com relação à RHP, observamos que no grupo C (0,83nmol: 13,9±3,1 n=4; 1,65nmol: 15,9±1,3 n=3; 3,3nmol: 16,9±2,2 n=6).esta resposta foi equivalente, independente da dose de AI utilizada. Interessante notar que no grupo F observamos efeito dose-resposta (0,83nmol: 9,8±2,3; n=4; 1,65nmol: 12,7±2,5 n=4; 3,3nmol: 16,9±1,8; n=6). Esse resultado sugere que a quantidade da enzima conversora de angiotensina no grupo F é maior do que no grupo C e que a atividade máxima ainda não foi atingida. Uma dose maior (6,6nmol) de AI deverá ser usada para verificar se esse efeito continua Conclusão Embora a síndrome metabólica ainda não tenha sido instalada, nossos resultados sugerem que após 8 semanas de tratamento com frutose há aumento, no fígado, da atividade da enzima conversora de angiotensina. Entretanto, não

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podemos descartar a hipótese de aumento do número de receptores AT1.

FeSBE 2012

Resumo: 09.009

MUSCARINIC AND BETA-ADRENERGIC RECEPTORS ACTIVATE TRPV4-DEPENDENT MECHANISMS IN MICE BLADDER

Autores 1RAMOS-FILHO, A.C.S.

2, GRANT, A.D.

1, ANTUNES, E.

1 Department of Pharmacology -

UNICAMP/FCM, 2 Wolfson-CARDS - KCL

Apoio Financeiro: FAPESP project #2010/10553-9 and a Capacity Building Award in Integrative

Mammalian Biology funded by the BBSRC, BPS, HEFCE, KTN and MRC

Resumo Objetivos The mechanosensitive Ca2+ permeable cation channel TRPV4 is a member of the Transient Receptor Potential Vanilloid family of channel proteins. Immunohistochemical and functional studies have identified TRPV4 expression in the urothelium and detrusor smooth muscle (DSM) of rodent bladders. Urothelial stretch during bladder filling activates TRPV4 and produces a Ca2+-dependent release of ATP. This ATP release activates P2X3 receptors on sensory nerves to produce a sensation of bladder filling. Activation of TRPV4 in the DSM by the selective agonist GSK1016790A (10-100nM) produces a slow and sustained contraction, which can be inhibited by nifedipine. We hypothesised that deletion of the TRPV4 channel would reduce the contractility of isolated DSM strips by reducing the intracellular [Ca2+]. Métodos Male C57BL/6 wild type (+/+) and TRPV4 knockout (-/-) mice (22-30g) were used in this study. Mice were euthanased with an overdose of pentobarbital (1mg/g) and the bladder removed. The bladder dome was removed above the level of the ureters, and cut into 2 longitudinal strips. These were suspended in a 10ml organ bath containing Krebs’ solution (117mM NaCl, 4.7mM KCl, 2.5mM CaCl2, 1.2mM MgSO4, 1.2mM KH2PO4, 24.8mM NaHCO3 and 11mM glucose, pH7.4) at 37ºC and bubbled with a mixture of 95% O2 and 5% CO2. Changes in isometric force were recorded using a Power Lab v.4 system (AD Instruments, UK). Following 60 min equilibration, the resting tension was adjusted to 0.5 g at the beginning of the experiments. Concentration-response curves to the muscarinic agonist carbachol, KCl (both cumulative) and the P2X receptor agonist alfa,beta-methylene ATP (non-cumulative) were constructed. Following pre-contraction of the tissue strips with KCl, a concentration-response curve was obtained for relaxation to the beta-adrenergic agonist isoprenaline. All drugs were dissolved and administered in Krebs’ solution. Frequency-response curves to electrical field stimulation (EFS: 10s; 80V; pulse width 1ms) were also obtained. Emax and pEC50 values (stated as mean ± S.E.M) were compared by unpaired t-tests. Animals Act, 1986 - n°30149. Resultados Maximal contractions to carbachol were significantly increased in TRPV4 -/- strips (1nM-30µM; +/+ = 0.029±0.004 vs -/- = 0.077±0.011g/mg, p < 0.05) with no effect on pEC50 values. Contractions to EFS (4,8,16,32Hz) were also increased in TRPV4 -/- strips compared to +/+ strips. Conversely, the pEC50 of KCl contractions was decreased in TRPV4 -/- strips (1mM-1M; +/+ = 1.6±0.2 vs -/- = 1.2±0.1), p < 0.05) with no effect on maximal contractions. Maximal relaxation to isoprenaline was significantly decreased in TRPV4 -/- strips (1nM-30µM; +/+ = 61.6±8.3 vs -/- = 41.8±3.8 % of KCl contraction, p < 0.05). Contractions to alfa,beta-methylene ATP (1-10µM) were unaltered by loss of TRPV4. Conclusão

These data suggest that muscarinic and -adrenergic receptors activate a TRPV4-dependent mechanism, probably in urothelial cells, that inhibits DSM contraction. In contrast, DSM TRPV4 receptors contribute to the Ca2+ entry and contraction following exposure to KCl.

FeSBE 2012

Resumo: 09.010

CAFEÍNA POTENCIALIZA A LIBERAÇÃO DE GABA INDUZIDA POR D-ASPARTATO PELO BLOQUEIO DE RECEPTORES DE ADENOSINA A1.

Autores 1FERREIRA, D. D. P.

2, STUTZ, B.

2, DE MELLO, F. G.

1, KUBRUSLY, R. C. C.

1 MFL - UFF,

2

IBCCF - UFRJ

Apoio Financeiro: CNPq, Capes, Proppi, INNT, Pronex, Faperj, Reuni

Resumo Objetivos Investigar os efeitos modulatórios da exposição aguda de cafeína, um antagonista não seletivo de receptores de adenosina (A1R e A2AR) na regulação da liberação de GABA induzida por D-Aspartato em retinas de embriões de galinha de 13 dias (E13). Métodos Retinas de galinha E13 foram dissecadas e incubadas com 3 H-GABA ou 3 H-D-Aspartato em 1mL de solução Hanks4 por 1h a 37ºC. Foram realizados ensaios de captação de 3 H-GABA e liberação de 3 H-GABA ou 3 H-D-Aspartato. Além disso, os níveis de AMPc foram quantificados após a incubação do tecido com drogas utilizadas como estímulo por métodos descritos previamente (GILMAN, Proc Natl Acad Sci USA. 67:305, 1970). Os resultados foram analisados pelo programa GraphPad Prism. Os valores foram expressos como média±EPM e os níveis de significância foram considerados quando p < 0,05. Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo IBCCF 035 aprovado pelo Comitê de Ética do CCS. Resultados Em retinas E13, D-Aspartato (500μM) (D-Asp), um agonista seletivo de receptores NMDA aumentou a liberação de 3 H-GABA em 4,5 vezes em relação aos níveis basais (B) (B=2,21±0,05, n=6; D-Asp=9,95±0,24, n=6). Na presença de cafeína, (500μM) (Caf + D-Asp) essa liberação induzida por D-Asp foi aumentada em 60% (Caf + D-Asp=16,10±2,29, n=7). No entanto, a cafeína (500μM) não foi capaz de aumentar a liberação de 3 H-D-Aspartato na presença (Mg 2+ ) ou ausência de íons magnésio (s/Mg 2+ ), embora a quantidade total de 3 H-D-Aspartato liberado na ausência de magnésio seja maior do que na presença destes íons (Mg 2+ =5,80±0,15, n=4; s/Mg 2+ =7,05±0,30, n=4). MK-801 10μM (MK), um antagonista não competitivo do receptor NMDA, foi capaz de bloquear o efeito da cafeína na liberação de 3 H-GABA (MK=3,18±0,58, n=3), corroborando o envolvimento deste receptor. O bloqueio da liberação também foi observado na presença de NNC 711 (NNC), inibidor do GAT-1 (NNC=2,42±0,33, n=3). Para verificar se a cafeína estaria regulando o transporte de GABA, foi realizada a captação de 3 H-GABA na presença de cafeína 500μM (Caf), porém não houve diferença em relação aos níveis controle (C) (C=100%, n=3; Caf=105%±11,14%, n=3). O efeito da cafeína foi mimetizado por DPCPX 100nM (DPCPX), antagonista A1R, (DPCPX=21,95±1,42, n=4) e por forscolina 10μM (F), ativador da adenilil ciclase (F=18,76±1,82, n=4); e bloqueado por H-89 1μM (H-89), inibidor da PKA (H-89=11,58±0,98, n=4), genisteína 10μM (Gen), inibidor de proteína tirosina cinase (Gen=9,19±0,31, n=3) e PP1 3μM (PP1), inibidor da família src cinase (PP1=9,76±0,42, n=3). Os níveis de AMPc estimulados com forscolina (F) foram reduzidos na presença do agonista A1R, CHA 200μM (CHA) (F=2317±447, n=3; CHA=1094±420, n=2). Conclusão Os resultados apresentados sugerem que a cafeína potencializa a liberação de GABA induzida por D-Aspartato via inibição de receptores de adenosina A1, com participação da via da PKA e src.

FeSBE 2012

Resumo: 09.011

DOPAMINA INDUZ LIBERAÇÃO DE ASCORBATO DE CÉLULAS DE RETINA ATRAVÉS DA ATIVAÇÃO DE RECEPTORES D1, PRODUÇÃO DE AMP CÍCLICO E ATIVAÇÃO DA EPAC

Autores 1Encarnação, T. G.

1, Portugal, C. C.

1, Paes-de-Carvalho, R.

1 Departamento de Neurobiologia - UFF

Apoio Financeiro: CNPq, CAPES, FAPERJ, PRONEX/MCT

Resumo Objetivos O ascorbato (asc) desempenha papéis bioquímicos importantes como anti-oxidante e na integridade da sinalização dopaminérgica. A dopamina (DA) é um importante neurotransmissor no sistema nervoso central, inclusive na retina, sendo capaz de estimular a liberação de asc no estriado de camundongos através da ativação conjunta de receptores D1 e D2-like. Nosso objetivo neste trabalho foi investigar se a DA é capaz de modular a liberação de asc em culturas mistas de células da retina e estudar os receptores, vias de sinalização e mecanismos de liberação envolvidos nessa função. Métodos Foram utilizados embriões de galinha no oitavo dia desenvolvimento, cujas retinas foram dissecadas e dissociadas e mantidas em cultura por 3/4 dias. As células foram incubadas com [14C]asc por 40min; em seguida, incubadas com salina por 10min, quando foi recolhido o primeiro basal (b1); depois incubadas com os inibidores por 10min, para obtenção do b2; em seguida, incubadas com os agonistas por 10min para obtenção da fração de estímulo. Finalmente, as células foram lisadas e as amostras tiveram sua atividade mensurada por cintilação líquida. CEUA 112/09. Resultados Concentrações crescentes de DA (10nM-100μM) induziram um aumento dose-dependente na liberação de asc (EC50=26,07µM e Liberação máxima=179,1±11,6%; n=3). O tratamento com DA (50μM) promoveu um aumento na liberação de asc (71,1± 18,3%;n=3), e esse efeito pôde ser obervado após um segundo tratamento com DA (115,9±21,3%;n=3). SKF-38393 (10μM), agonista do receptor D1, também estimulou a liberação de asc (55,8±12,2%;n=12), um efeito que foi inibido na presença de SCH-23390 (10μM), antagonista do receptor D1 (16,9±7,1%;n=3). Quinpirole (10μM), agonista do receptor D2, não apresentou efeito significativo (-2,3±4,5%;n=5). Embora os efeitos da DA (50μM) e do SKF-23390 (10μM) tenham sido inibidos pelo MDL (10µM), um inibidor da adenilil ciclase (22,5±6,8%;n=3 e 15,5±3,6%;n=3, respectivamente), H-89 (5µM) e KT5720 (1µM), inibidores de PKA, não foram capazes

de bloquear esses efeitos (DA+H-89:73,221,1%,n=5;DA+KT5720:79,6±10,9%, n=3) (SKF-23390+H-89: 41,8±9,9%,n=4). Contudo, os efeitos da DA foram mimetizados pelo Me-AMPc (52,8±10,8%;n=5), um ativador de EPAC, uma GEF alvo do AMPc. Também foi investigado o envolvimento das vias da PI3K/AKT e da MEK/ERK. Ly 29 (10µM), um inibidor da PI3K, bloqueou o efeito da DA (11,3±11,1%,n=3), assim como PD 98 (10µM) e UO126 (10µM), inibidores da MEK (15,9±3,2%,n=3; 15,7±11,3%,n=2, respectivamente). Estudamos também o mecanismo de liberação de asc estimulado por DA e observamos que o bloqueio do SVCT2 (Transportador de Vitamina C dependente de sódio) por Sufinpirazona (1mM), quercetina (500µM) ou ausência de sódio inibiu completamente o efeito da DA (59,4±5,7%,n=6; 12,2±5,6%,n=2; -12,6±5,2%,n=4, respectivamente). Conclusão Os resultados são fortes evidências de que a DA é capaz de estimular a liberação de asc em células da retina em cultura via receptor D1/Adenilil ciclase/AMPc. No entanto, este efeito é claramente independente de PKA, mas dependente de EPAC/PI3K/MEK e reversão do SVCT2.

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Resumo: 09.012

ADENOSINE-DEPENDENT NEURONAL SURVIVAL IN CULTURED RETINAL CELLS IS REGULATED BY SRC KINASE

Autores 1DE OLIVEIRA, N. A.*

1, SOCODATO, R.**

1, PAES-DE-CARVALHO, R.

1 Neurobiologia - UFF

Apoio Financeiro: CNPq, CAPES, FAPERJ, PRONEX/MCT

Resumo Objetivos Adenosine is an important neuromodulator in the Central Nervous System (CNS), including the retina. It acts through four types of metabotropic receptors, which may be coupled to either Gi (A1 and A3 receptors) or to Gs proteins (A2A and A2B receptors). Adenosine bioavailability to signaling events is regulated by plasma membrane transporters and its intracellular metabolism. The transport of adenosine is mediated by bidirectional nucleoside transporters, which can be divided in two systems: equilibrative nucleoside transporters (ENTs) and concentrative nucleoside transporters (CNTs). Previous results from our group established that adenosine has a potent neuroprotective action upon cultured retinal neurons when these cells were challenged by either excitotoxic glutamate stimulation or medium refeeding of cultured cells. Our goal in this work was to analyze the pathways involved in the neuroprotection mediated by adenosine in cultured retinal neurons. Métodos Purified cultures of retinal neurons obtained from 8-day-old chicken embryos (E8) were used. After 1 day in culture (C1), specific compounds were added to culture medium and cultures incubated up to C3, when cells were refed with fresh medium, a protocol that induces neuronal death in these cultures. Afterwards, cultures were fixed and the cells counted at C4 using a phase-inverted optic microscope. The control cultures were incubated with the same drugs, but with no medium refeeding. The number of protocol approval from the ethics committee of the Federal University Fluminense is 112/09. Resultados Our results demonstrated that medium refeeding induced a massive neuronal cell death (59.79 ± 3.93, n=23, P < 0.05) and the pre-treatment with 5 μM of Nitrobenziltioinosine (NBI, a selective inhibitor of ENTs) completely blocked this effect (109.1 ± 5, n=15, P < 0.05). The control NBI-treated cultures displayed an interestingly pro-survival development in vitro compared to untreated cultures (124.3 ± 4.4, n=9, P < 0.05). Next, we decided to investigate whether this adenosine protective effect was dependent on the activation of A2A receptors. To this end we used an A2A receptor agonist (CGS 21680 at 100 nM), which was capable of blocking medium refeeding-induced neuronal loss (84.4 ± 4.4, n=8, P < 0.05). CGS did neither block nor potentiate NBI effect (98 ± 10.1, n=5) when compared to NBI treatment alone. To verify whether Src and MEK pathways were involved in the protective effect of adenosine, we used their respective pharmacological inhibitors, PP1 and PD 98059, both at 10 µM. PP1 was capable of blocking the survival effect exerted by NBI (35.23 ± 12.97, n=3, P < 0.05). Preliminary results using PD indicated that the inhibition of MEK also blocked NBI effect (44.56 ± 14.91, n=3, P < 0.05). Conclusão These results suggest that the accumulation of adenosine at the extracellular medium is proficient in stimulating a survival pathway in cultured retinal neurons. Activation of adenosine A2A receptors also seems to be involved in NBI-induced neuroprotection. Therefore, we conclude that to adenosine achieve its pro-survival effect upon cultured retinal neurons, it is essential the activation of A2A receptors and signal transduction to Src pathway.

FeSBE 2012

Resumo: 09.013

ANGIOTENSIN II RECEPTOR ANTAGONIST PROMOTES CARDIAC PROTECTOR EFFECTS IN RATS SUBMITTED TO CHRONIC UNDERNUTRITION

Autores

1,3SILVA, P. A.

1,3, CAHLI, G. M.

1,3, LUZARDO, R. L.

1,3, PEREIRA-ACÁCIO, A.

2,3, VIEIRA-

FILHO, L. D. 2,3

, PAIXÃO, A. D. O. 1,3

, EINICKER-LAMAS, M. 1,3

, VIEYRA, A. 1,3

, MEDEI, E. 1

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ, 2 Fisiologia e Farmacologia - UFPE,

3 Laboratório

17 - INBEB

Apoio Financeiro: INBEB, MCT-CNPq-MS-DECIT-FAPERJ, CAPES-PROCAD

Resumo Objetivos Objectives: Epidemiological studies in the Northeastern region of Brazil and in the periphery of big cities show an association between hypertension and undernutrition, especially in areas where protein-deficient diets are combined with high salt intake. The aim of the study was to investigate the modifications induced by chronic undernutrition in cardiac Na + -ATPase, (Na + +K + )ATPase, and in Ang II-type AT1 and AT2 receptors; and to evaluate whether the treatment of undernourished rats with losartan (an antagonist of AT1 receptors): (i) impacts the activities of both ATPases, (ii) modifies Ang II receptors expression. Métodos Methods: Male Wistar rats submitted were to the Northeast basic regional diet (BRD) from weaning to the 13 th week of life. Rats were divided in four groups: control (C) (fed with standard chow after weaning), D (undernourished fed with BRD), CL and DL (control and undernourished treated with losartan (30 mg/kg/day from weaning. The ATPase activities from plasma membranes of left ventricular cells were measured from the P < sub>i released from ATP. Receptors expression was evaluated by immunoassay. Project approved by the Committee for Ethics in Animal Experimentation of the Federal University of Rio de Janeiro (protocol No IBCCF 104). Resultados Results: After 13 weeks the D group showed an increase in the heart weight/body weight ratio (3.56 ± 0.03) (in g/mg; mean ± SEM) when compared with the C group (3.45 ± 0.01; P < 0.01); losartan had no influence on the relative decrease of cardiac mass (CL = 3.45 ± 0.01; DL = 3.45 ± 0.02). The rats given BRD presented an increased Na + -ATPase activity (in nmol P < sub>i×mg -1 ×min -1 ) (D = 148.5 ± 12.7) that was prevented by losartan (DL = 62.2 ± 4.7; C = 56.6 ± 4.8; P < 0.005). (Na + +K + )ATPase decreased from 86.1 ± 7.0 (C) to 53.1 ± 8.5 ( P < 0.001). Losartan additionally decreased the activity of this ATPase without differences between CL (31.1 ± 10.8) and DL (41.3 ± 10.5). AT1 receptors expression decreased by 35% in D when compared with C, an effect completely reversed by losartan. AT2 receptors expression decreased by 10% in D and, interestingly, this effect was accentuated by losartan especially in DL (35%). Conclusão Conclusions: Ang II plays an important role, via its AT1 and AT2 receptors, in the alterations of Na + pumping activities from left ventricular cells caused by chronic undernutrition. These molecular alterations in cardiac tissue could be associated with electrical remodeling, facilitating the appearance of arrhythmias and sudden death.

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Resumo: 09.014

Efeito da crotamina na permeabilização de membranas miméticas

Autores 1COSTA, B. A.

4, PEREZ, K. R.

2, OLIVEIRA, E. B. D.

1, HAYASHI, M. A. F.

1 Farmacologia -

UNIFESP, 2 Bioquímica e Imunologia - USP,

4 Biofísica - UNIFESP

Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP

Resumo Objetivos A crotamina é um peptídeo catiônico isolado do veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus, composto por 42 resíduos de aminoácido, sendo dentre eles nove lisinas e duas argininas. Interessantemente, o padrão de distribuição das pontes de dissulfeto e a sua estrutura tridimensional são semelhantes às descritas para as β-defensinas humanas, que são peptídeos antimicrobianos encontrados na epiderme de mamíferos. As β-defensinas humanas tem atividade antimicrobiana e são capazes de interagir e romper as membranas bacterianas, promovendo assim a sua permeabilização. E isto nos levou a estudar e demonstrar uma significativa atividade antifúngica para a crotamina, apesar da sua baixa eficiência como antibacteriano. Portanto, propomos aqui estudar o efeito da crotamina na permeabilização de membranas miméticas (Large Unilamellar Vesicles – LUVs) formadas por fosfolipídeos neutros ou com carga negativa, visando avaliar a importância destas cargas na interação da crotamina com a membrana dos microorganismos. Métodos A interação da crotamina com membranas foi estudada acompanhando-se o aumento da permeabilidade de dois sistemas diferentes de LUVs. O primeiro composto pelo fosfolipídeo neutro palmitoil oleoil fosfatidilcolina (POPC) e o segundo composto por uma mistura deste fosfolipídeo com 30 mol % de palmitoil oleoil fosfatidilglicerol (POPG), o que garante uma carga superficial final negativa. Filmes de lipídeos preparados a partir de soluções clorofórmicas de POPC e POPG, foram hidratados com uma solução de carboxifluoresceína (CF) 50 mM, e a suspensão resultante foi extrusada 11 vezes através de membranas de policarbonato com poros de 100 nm para a obtenção das LUVs. A CF livre foi removida pela eluição das LUVs por uma coluna de Sephadex-G25 medium (1,2 x 20 cm) com tampão 30 mM HEPES pH 7,4 e 200 mM glicose. O vazamento da CF encapsulada para o meio extralipossomal leva ao aumento da fluorescência, que foi monitorado em espectrofluorímetro em função do tempo. Diferentes concentrações de crotamina 10, 40 e 80 µM foram adicionadas às LUVs (100 µM) para verificar a interação peptídeo-membrana. A adição de 20 µL de Triton X-100 10% (p/v) permitiu observar a fluorescência total após a completa ruptura das LUVs (100% de vazamento de CF). A taxa de vazamento da CF em função do tempo foi calculada considerando-se a fluorescência basal da CF encapsulada, a fluorescência da CF no tempo de análise e a fluorescência após o rompimento completo das LUVs pela adição do surfactante. Resultados A cinética da interação da crotamina com os dois sistemas diferentes de LUVs foi monitorada, e observou-se que a crotamina tem uma maior interação com as membranas compostas de POPC/POPG sendo capaz de permeabilizá-las, uma vez que o aumento da emissão da fluorescência da CF em função do tempo pode ser observado. Já nas LUVs constituídas por POPC não se observou aumento da emissão de fluorescência, indicando que não ocorreu um aumento na permeabilidade da membrana no tempo de análise para este sistema. Conclusão O vazamento da CF de LUVs monitorada pelo aumento da fluorescência em função do tempo sugere que a crotamina é capaz de interagir e permeabilizar as membranas com carga superficial negativa, possivelmente devido a efeitos eletrostáticos envolvidos na interação das cargas positivas de aminoácidos básicos deste peptídeo com as cargas negativas do POPG presente nas LUVs.

FeSBE 2012

Resumo: 09.015

NANOPORO “ENGENHEIRADO” PARA DETECÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS: UMA ABORDAGEM COMPUTACIONAL.

Autores 1BRITO, A. M. S.

1, RODRIGUES, C. G.

1 Biofísica e Radiobiologia - UFPE

Apoio Financeiro: CNPq, INCT- INAMI, CAPES

Resumo Objetivos Biossensor é um dispositivo sensor que tem como elemento de reconhecimento molecular um material biológico ou biomimético. O nanoporo proteico formado pela alfa-hemolisina (αHL) incorporada à bicamada lipídica plana vem sendo utilizado como principal modelo de nanoestrutura proteica altamente promissora para detecção de diversas moléculas (ácidos nucléicos, peptídeos, polietilenoglicol), cuja dimensão seja menor que o diâmetro do lume aquoso do nanoporo. Apesar de todos os estudos, ainda não há um dispositivo comercial baseado neste nanoporo para detectar adequadamente DNA, pois, a alta velocidade de translocação desta molécula através do lume aquoso do nanoporo, impossibilita a identificação precisa de seus nucleotídeos (Nts). Uma das estratégias de diminuir a velocidade de translocação e aumentar a energia de interação nanoporo-Nts é a alteração estrutural da proteína via engenharia genética ou modificação química. Neste trabalho, usamos técnicas de modelagem computacional para obtenção das medidas do diâmetro do nanoporo e considerá-las como preditor para otimização desta nanoestrutura como biossensor, ou até mesmo como sequenciador molecular. Este estudo é importante, pois permitirá a realização dos experimentos somente com as configurações do nanoporo que são mais viáveis à detecção de nucleotídeos. Métodos : A molécula da alfa-hemolisina disponível no PDB (código 7AHL.pdb) foi usada como modelo para as alterações estruturais de substituição de aminoácidos (mutações) e a colocação (acoplamento) dos seguintes adaptadores: Metil Metanetiosulfonato (MMTS); Etil Metanetiosulfonato (EMTS);Propil Metanetiosulfonato (PMTS); Butil Metanetiosulfonato (BMTS). O PyMol (DeLano Scientific LLC) foi usado para geração das mutantes, acoplamento dos adaptadores e realização das medidas do diâmetro do nanoporo, em cada uma das conformações moleculares produzidas. As moléculas dos adaptadores e dos analitos; 2'-Deoxicitidina 5'-monofosfato (dCMP) e o 2'-Deoxiguanosina 5'-monofosfato (dGMP) foram geradas no Chemoffice (CambridgeSoft). Na análise dos resultados e apresentação dos gráficos usamos o OriginPro 8 (OriginLab Corporation). Resultados A alteração no valor do diâmetro do nanoporo foi proporcional ao tamanho do adaptador ou grupamento químico adicionado, na seguinte ordem BMTS< PMTS< EMTS< MMTS. A única exceção foi o acoplamento na posição 129, localizada na entrada TRANS do nanoporo, que apresentou um aumento do diâmetro, mesmo com a colocação dos adaptadores MMTS e EMTS, os menores entre os estudados. A alfa-hemolisina mutante cuja alteração ocorreu na posição 133, apresentou os menores valores de diâmetros com todos os adaptadores, principalmente com o BMTS (11,38Å ±1,83), portanto, é a molécula que esperamos no futuro testar experimentalmente. Conclusão A substituição da glicina na posição 133 da alfa-hemolisina por uma cisteína, juntamente à adição do adaptador , principalmente o BMTS, teoricamente, torna a molécula mais viável para formação do nanoporo ideal à detecção de nucleotídeos.

FeSBE 2012

Resumo: 09.016

INVESTIGAÇÃO DA ATIVIDADE FUNCIONAL DA PROTEÍNA ABCC1 EM CELOMÓCITOS DO OURIÇO-DO-MAR Echinometra lucunter

Autores 1LIMA-SANTOS, L.

1, Honorato, T. B. M.

1, DA SILVA, P. M.

1, Marques-Santos, L.F.

1

Departamento de Biologia Molecular - UFPB

Apoio Financeiro: CNPq

Resumo Objetivos Celomócitos são células do fluido celômico de equinodermos responsáveis pela imunidade inata. Em ouriços do mar, tais células compreendem quatro diferentes subpopulações: fagócitos, células vibráteis, esferulócitos vermelhos e incolores. Os celomócitos estão envolvidos nos processos de fagocitose, migração celular, reparo tecidual, e na produção de substâncias com atividades antibacterianas; e têm sido utilizados como biossensores, uma vez que condições de estresses físicos e químicos alteram as suas populações celulares ou a expressão de proteínas. Os transportadores ABC estão envolvidos no transporte de compostos endógenos e exógenos, estando, também, relacionados à proteção contra estressores físicos. A atividade funcional dos transportadores ABCB1 (P-gp) e ABCC1 (MRP) já foi descrita em gametas e células embrionárias de ouriço do mar (Biosci Rep. 20:257, 2010). No entanto, ainda não foram realizados estudos sobre a atividade destes transportadores em células somáticas de equinodermos. O objetivo do presente trabalho foi investigar a atividade funcional do transportador ABCC1 em celomócitos de Echinometra lucunter. Métodos Os animais foram coletados na costa de João Pessoa (Paraíba/Brasil) e mantidos em aquário, a 25oC, sob constante aeração. O fluido celômico foi obtido através de punção na membrana peristomial utilizando uma seringa contendo ISO-EDTA. A concentração celular foi ajustada para 500.000 células/mL em mar filtrada e estéril. A análise da atividade do transportador ABCC1 foi realizada por meio do ensaio de acúmulo intracelular do corante fluorescente calceína. As células foram incubadas com calceína-AM (100 a 200 nM), por 30 minutos, na presença ou ausência dos bloqueadores glibenclamida e MK-571, e a intensidade de fluorescência analisada em citometria de fluxo. O MK571 é um bloqueador específico do transportador ABCC1 (Biochem Biophys Res Commun 208:345,1995), ao passo que a glibenclamida é um modulador dos transportadores ABCA1, ABCB1, ABCC1 e ABCC8 (Br J Pharmacol 132:778, 2001). A análise do acúmulo intracelular de calceína foi realizada somente em células viáveis (não marcadas com iodeto de propídeo). Resultados O grupo não-tratado, incubado com calceína-AM, apresentou três populações celulares distintas: sem fluorescência (50,8 ± 8,8%); com baixa fluorescência (42,8 ± 8,2%); e com alta fluorescência (6,4 ± 1,4%). O tratamento com MK-571 aumentou o acúmulo intracelular de calceína, promovendo uma elevação no percentual de células na população com alta fluorescência (29,4% ± 2,5%) e uma redução no percentual de células sem fluorescência, quando comparado ao grupo não-tratado (32,0 ± 0,3%). O tratamento com a glibenclamida reduziu o percentual de células sem fluorescência (31,7 ± 10,1%) e aumento o percentual de células com elevada fluorescência (25,0% ± 1,5%). O MK571 e a glibenclamida não alteraram o percentual de células da população de baixa fluorescência em comparação com o grupo controle (38,7 ± 2,7%, 43,3 ± 8,6% e 42,8 ± 8,2%, respectivamente). Conclusão Os nossos dados evidenciam a presença da atividade funcional da proteína ABCC1 em celomócitos de Echinometra lucunter. Estudos adicionais devem ser realizados para investigar o papel funcional desta proteína na resposta inata mediada pelos celomócitos. O presente trabalho é o primeiro relato na literatura da atividade funcional de proteínas ABC em células somáticas de equinodermos. Apoio Financeiro: CNPq.

FeSBE 2012

Resumo: 09.017

Soluble β-amyloid peptide accumulation and intracellular trafficking in cultured neurons.

Autores

1,4OLIVEIRA, L. T.

4, LEON, G. V. O.

2, Provance, D. W.

3, MELLO, F. G.

1, SORENSON, M. M.

4,1,

SALERNO, V. P. 1 Instituto de Bioquímica Médica - UFRJ,

2 Centro Desenvolvimento Tecnológico de

Saúde - IOC, 3 Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ,

4 Departamento de Biociências da

Atividade Física - UFRJ

Apoio Financeiro: Faperj, CNPq, CNPq/INCT

Resumo Objetivos It has been recognized that β-amyloid, an important hallmark in Alzheimer’s disease (AD), also accumulates within neurons causing disruption of synapses and cognitive function. Here we report the internalization and transport of a fluorescently labeled β-amyloid peptide (Aβ) into cultured neurons. Métodos We have shown that Aβ42 is internalized by neurons and leads to the redistribution of MVb, a motor protein involved in intracellular traffic. The internalization process is specific for the Aβ42 isoform, and exhibits characteristics of a constitutive process without a specific point of saturation, since incubating neurons with FITC-labeled Aβ42 for 30 min followed by 30 min with biotin-labeled Aβ42 leads to internalization of both (Cytoskeleton. 69(3):166, 2012). CEUA IBCCF 035. Resultados The Aβ40/Aβ42 balance regulates Aβ42 internalization. In the presence of a 1:1 mixture of Aβ40/ Aβ42 the Aβ42 internalization is not affected, but when the concentration of Aβ40 is raised to 2:1, Aβ42 internalization is reduced. Rab proteins are myosin-binding partners essential for specific transport functions, and can be also used as tools to assess involvement of the endosomal pathway during intracellular trafficking of Aβ42 peptide. Our results showed that Rab 8 and Rab 10 also co-localize with internalized Aβ, suggesting that they are inserted on a characteristic recycling pathway mediated by myosin Vb and those GTPases. Conclusão These observations are consistent with the hypothesis that AD proceeds as a result of an imbalance between Aβ production and Aβ clearance, suggesting a role for myosin Vb and its binding partners in this process.

FeSBE 2012

Resumo: 09.018

Modulação GABAérgica na liberação de glutamato induzida por hiperosmolalidade no hipotálamo in vitro

Autores 1GRISÓLIA, A. B. A.

1, HERCULANO, A. M.

1, OLIVEIRA, K. R. M.

1, BATISTA, E. D. J. . O.

2,

PICANÇO-DINIZ, D. L. W. 1 ICB - UFPA,

2 campus de oriximiná - UFOPA

Apoio Financeiro: UFPA; EGPA;

Resumo Objetivos Objetivo do presente trabalho é avaliar o efeito do GABA sobre a liberação de glutamato em fragmentos hipotalâmicos in vitro durante o estimulo hipertônico Métodos Número de aprovação do presente projeto no comitê de ética em experimentação animal do instituto de ciências biológicas: CEPAE-BIO021-11. Ratos Wistar Machos (270-300g) foram mantidos em condições padrões de laboratório, com controle de temperatura (23 ±2ºC) e luz ambiente 12/12-h ciclo claro e escuro, com água e ração ad libitum. Após decapitação o cérebro foi retirado rapidamente, os fragmentos hipotalâmicos foram imediatamente dissecados em gelo, sendo o tempo total de dissecação inferior a um minuto. Os fragmentos foram colocados no sistema de perinfusão com solução de

incubação Krebs-Ringer Bicarbonato-Glicose isotônico (280 mOsm/Kg H₂O) fluxo de 0,5 ml/min e após estabilização de trinta minutos, foram feitas as coletas com intervalo de um minuto, durante 10 minutos. O estímulo hipertônico (340

mOsm/Kg H₂O) ocorreu durante 3 minutos, na ausência e presença do GABA (3 μM) no intervalo do terceiro ao sexto minuto. O glutamato e GABA foram dosados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), com detector de fluorescência após derivação com OPA (o-phthalaldehyde–ethanethiol). Resultados A liberação basal de GABA com Ringer isotônico, foi em torno de 3.9 ± 0.72 nmol/mg ptn, com uma diminuição aproximada de 90% (0.7 ± 0.25 nmol/mg ptn (P≤0.01), 1.4 ± 0.33 nmol/mg ptn (P≤0.05) e 1.3 ± 0.17 nmol/mg ptn (P≤0.05), no primeiro, segundo e terceiro minuto de estímulo hipertônico respectivamente), retornando aos valores basais após o fim do estimulo. Simultaneamente foram feitas as dosagem de glutamato, apresentando níveis basais em torno de 2.4 ± 0.22 nmol/mg ptn. Este valor foi significativamente elevado para 4.3 ± 0.21 nmol/mg ptn (P≤0.05) e 6.1 ± 0.47 nmol/mg ptn (P≤0.01) no segundo e terceiro minuto de estímulo osmótico respectivamente, no primeiro minuto não foi observado alteração significativa. O padrão de liberação temporal obtido direcionou o presente estudo para caracterizar o papel modulador do GABA sobre a liberação de glutamato durante a hiperosmolalidade. Nesse sentido realizamos o experimento adicionando GABA (3 µM) durante o estímulo osmótico, que induziu um bloqueio na liberação de glutamato, mantendo os valores em 1.7 ± 0.57 e 1.8 ± 0.30 nmol/mg ptn no segundo e terceiro minuto de hiperosmolalidade Conclusão O presente estudo mostrou que o GABA é capaz de bloquear o aumento da liberação de glutamato induzido por meio hipertônico. Baseado neste, concluímos que a hiperosmalalidade facilita o aumento dos níveis de glutamato em parte por produzir diminuição da atividade GABAérgica no hipotálamo

FeSBE 2012

Resumo: 09.019

Efeito da adenosina no transporte de glutamato em cultura de astrócitos hipotalâmicos em condições de hiperosmolaridade

Autores

1BRAGA, D. V.

1, GRISÓLIA, A. B. A.

1, OLIVEIRA, K. R. M.

1, HERCULANO, A. M.

2,2,

PICANÇO-DINIZ, D. L. W. 1 NEUROCIÊNCIAS - LABORATÓRIO DE

NEUROENDOCRINOLOGIA - UFPA, 2 CAMPUS ORIXIMINÁ - UFOPA

Apoio Financeiro: UFPA, CAPES

Resumo Objetivos Dados da literatura demonstram que a liberação de glutamato por células gliais no hipotálamo é uma importante resposta fisiológica em situações de hiperosmolaridade, da mesma forma que estudos prévios apontam sobre o efeito da adenosina na regulação do transporte de glutamato em situações isosmóticas. Neste contexto, o objetivo do presente estudo é caracterizar a possível relação da liberação de adenosina com a liberação de glutamato em culturas astrocitárias expostas à situação de hiperosmolaridade Métodos Os procedimentos do presente estudo foram aprovados pelo comitê de ética da Universidade Federal do Pará CEPAE-BIO 021-11. Foram cultivados astrócitos hipotalâmicos de ratos Wistar em período pós natal (P1-P2) Após a confluência, os astrócitos foram submetidos à variação de osmolaridade em solução de Hank hipertônica (340 mOsm/L) por 5, 15 e 20 minutos. A captação de glutamato, foi avaliada, nos períodos supracitados utilizando 1µCi de [3H] – D –Aspartato sendo a análise feita por cintilação líquida. Utilizamos cromatografia líquida de alta eficácia (CLAE) para avaliar o efeito da osmolaridade na liberação de Adenosina. Utilizamos N6-(R-phenylisopropyl)-adenosina (R-PIA) 10µM e 1,3-Dipropyl-8-(2-amino-4-chlorophenyl)-xanthine PACPX 10µM, como respectivos agonista e antagonista dos receptores A1. O valores foram normatizados pelo conteúdo total de proteína nas culturas utilizando o método descrito por Bredford e expressos em percentagem do controle. Resultados O estímulo hiperosmótico diminuiu a captação de glutamato após 5 e 15 minutos, no entanto, em 20 minutos não houve diminuição significativa (5 min.= 58 ± 9% p < 0.01; 15 min.= 70 ± 12% p < 0.01 e 20 min.= 91 ± 14% p > 0.05; de captação, comparada ao controle 100 ± 8%, n=4). A análise por CLAE-UV mostrou uma elevação significativa dos níveis extracelulares de adenosina nos tempos 10 e 15 minutos após o estímulo hiperosmótico (5 min. = 110 ± 7%, n=5, p > 0.05; 10 min.= 133 ± 1.7% n=5, p < 0.01; 15 min.= 149 ± 3.3% n=5, p < 0.01). A partir deste resultado, utilizamos o tempo de 5 minutos para verificar o papel do receptor A1 na captação de glutamato. O agonista R-PIA, diminuiu a captação em condições isotônicas (47 ± 5 %, vs controle n=5, p < 0.01). Já em meio hipertônico, o agonista não intensificou o efeito da hiperosmolaridade (56 ± 3%, n=5 vs hipertônico 5 min. 50 ± 9%, p > 0.05). O antagonista PACPX, não alterou a captação de glutamato em condições isotônicas quando comparado ao controle (89 ± 6% vs controle 100%, n=5, p > 0.05). Intrigantemente, o antagonista não reverteu o efeito da hiperosmolaridade na captação de glutamato (60± 2% vs hipertônico 5 min. 58 ± 9%, n=5, p > 0.05). Conclusão Nossos resultados mostraram uma diminuição da captação de glutamato após 5 minutos de estímulo hiperosmótico, e que após 20 minutos esta captação volta para os níveis basais. Interessantemente, os níveis de adenosina se elevam após 10 minutos de estímulo, sugerindo uma participação da adenosina na captação de glutamato após hiperosmolaridade. Os resultados obtidos com o tratamento com agonistas e antagonistas A1, sugerem que este receptor não está envolvido com a captação de glutamato por astrócitos hipotalâmicos após estímulo hiperosmótico.

FeSBE 2012

Resumo: 09.020

O PRÉ-CONDICIONAMENTO COM NMDA PROTEGE CAMUNDONGOS CONTRA CONVULSÕES VIA RECEPTORES A1 DE ADENOSINA E SUBTIPO NR1 DE NMDA

Autores

1GHISLANDI, A.

1, ZAMBON, G.

1, CONSTANTINO, L. C.

1, GARCEZ, M. L.

1, MATOS, D. N.

1,

PESCADOR, B. B. 1, BOECK, C.

1, TASCA, C. I.

1, BOECK, C. R.

1 Programa de pos graduação -

UNESC

Apoio Financeiro: UNESC, Fapesc, CNPQ

Resumo Objetivos A neurotransmissão excitatória no sistema nervoso central é mediada por aminoácidos excitatórios como L-, ou D-aspartato e por glutamato, sendo este o principal neurotransmissor excitatório, envolvido também em sinalizações patológicas e fisiológicas através da ativação dos seus receptores. O glutamato acumulado na fenda sináptica leva a excitotoxicidade celular devido a excessiva estimulação dos seus receptores N-Metil-D-Aspartato (NMDA). O précondicionamento cerebral refere-se a um estado de tolerância transitória do tecido a um estímulo letal evocado por um insulto moderado prévio. O précondicionamento com NMDA pode ser promovido in vivo pela administração de uma baixa dose de NMDA. Este trabalho tem como objetivo principal avaliar a participação dos receptores de adenosina e das subunidades dos receptores NMDA na proteção induzida por NMDA contra convulsões por AQ em camundongos. Métodos Os procedimentos experimentais foram previamente aprovados pelo comitê de ética para uso de animais da Universidade do Extremo Sul Catarinense, Protocolo 60/2009. Os camundongos albinos CF-1 machos, adultos, pesando em média 30-40g, receberam doses subconvulsivas de NMDA (75mg/Kg, i.p.) ou salina (NaCl 0,9 g%; i.p.), e foram observados por 30 minutos. Após 24 horas foi administrado AQ (36,8nmol; i.c.v.), e observadas as mudanças comportamentais nos animais. Os animais foram mortos 24 horas após a injeção de AQ e áreas do córtex cerebral e hipocampo foram dissecadas para análise por western blot. Os resultados de convulsão estão apresentados como animais com convulsão/animais totais) e foram analisados pelo Teste Exato de Fisher. Todos os animais que receberam apenas AQ convulsionaram (9/9; P < 0,05). Resultados O tratamento com NMDA por si só, não provocou convulsão nos animais, e os animais pré-condicionados apresentaram uma menor incidência de convulsões após a administração de AQ, com 53,8% dos animais protegidos (6/13; P < 0,05). O antagonista dos receptores A1 de adenosina, o CPT, bloqueou a proteção induzida pelo précondicionamento quando administrado imediatamente ou 6 horas após a injeção de NMDA (0h = 3/8; 6h = 6/12; P < 0,05). O antagonista dos receptores A2A de adenosina, o ZM241385, não teve efeito sobre a neuroproteção evocada por NMDA (0h = 6/13; 6h = 3/6; P > 0,05). Os dados de conteúdo dos receptores estão expressos como média ± erro padrão da média, e foram analisados por ANOVA de uma via seguida por Duncan. O conteúdo das subunidades NR1 no hipocampo diminuiu nos animais prétratados com NMDA que não convulsionaram após a injeção de AQ (salina = 9,78 ± 5; NMDA+AQ = 4,75 ± 2; n = 4; P < 0,05). Observamos que a subunidade NR2A manteve-se inalterada entre os grupos de tratamento (salina = 6,53 ± 3; n = 4-5; P < 0,05). Conclusão Os resultados indicam que o précondicionamento com NMDA protege os animais contra convulsões induzidas por AQ com participação dos receptores A1 de adenosina no período inicial e horas após o précondicionamento ter iniciado. Sugerimos ainda, que a diminuição da expressão da subunidade NR1 no hipocampo, tenha contribuído para a neuroproteção, provavelmente pela diminuição no número total de receptores NMDA.

FeSBE 2012

Resumo: 09.021

CARACTERIZAÇAO FUNCIONAL DE PROTEINA TRANSPORTADORA DO TIPO MRP EM CEPAS DE LEISHMANIA RESISTENTES AO ANTIMÔNIO UTILIZANDO SONDA FLUORESCENTE.

Autores 1REIS, P. G. D.

1, NETO, R. L. M.

1, FRÉZARD, F. J. G.

1, NEVES, F. T. P.

2, MELO, M. N. D.

1

Fisiologia e Biofísica - UFMG, 2 Parasitologia - UGMG

Apoio Financeiro: CNpQ, , Fapemig

Resumo Objetivos As leishmanioses são importantes causas de morbidade e mortalidade em vários países no mundo. O tratamento de primeira escolha no Brasil é o sal de antimônio (Sb) pentavalente, no entanto, têm-se relatado um aumento da resistência a este fármaco. Busca-se, assim, uma maior compreensão dos mecanismos de resistência com o intuito de desenvolver métodos diagnósticos, acompanhar a evolução e disseminação desta resistência bem como desenvolver meios de revertê-la ou impedi-la com a utilização de novas estratégias terapêuticas. As alterações encontradas com mais frequência em Leishmania resistentes ao Sb são o aumento da concentração intracelular de tióis, a superexpressão de proteína transportadora do tipo MRP e a diminuição do acúmulo intracelular do Sb, entretanto, as vias de transporte responsáveis por esta redução não foram ainda plenamente caracterizadas. Diante disto, este trabalho objetivou a caracterização funcional da participação de proteína transportadora do tipo MRP em mecanismo de resistência ao Sb em cepas de Leishmania de diferentes espécies. Métodos Promastigotas em fase log de crescimento do tipo selvagem (WT) e resistentes (R) de L. amazonensis (Ba199) e L. braziliensis (M2904), isoladas in vitro por este grupo de pesquisa, foram comparadas quanto à capacidade de efluxo de antimônio trivalente através da dosagem de Sb residual intracelular e extracelular em tempos definidos após carregamento das células com este semimetal. Ainda, no intuito de investigar quais transportadores estariam envolvidos utilizou-se a sonda fluorescente calceína –AM que é um substrato clássico de proteína transportadora do tipo MRP em estudo para avaliar a capacidade de efluxo deste substrato e em estudo de competição com o Sb. . Para a análise estatística dos dados foram utilizados os testes de One Way Anova seguido do teste de Bonferroni (diferença significativa com p < 0,05). Resultados Foram observadas diferenças significativas a partir de 30 minutos de leitura nas taxas de efluxo de Sb e calceína na cepa M2904 (aproximadamente 2,0 e 2,4 vezes maiores de Sb e calceína, respectivamente, na resistente em relação a selvagem após 120 minutos de análise). A cepa Ba199 apresentou taxa de efluxo de Sb significativamente maior em relação a selvagem (aproximadamente 2,1 vezes maior após 120 minutos de análise) e taxa de calceína 1,62 vezes maior na resistente em relação a selvagem não apresentando diferença estatística. O estudo de competição ente calceína e Sb mostrou que na cepa resistente Ba199 a presença da calceína-AM aumentou significativamente a quantidade intracelular de Sb em aproximadamente 50%, o que não foi observado na selvagem. Já as cepas M2904 resistente e selvagem apresentaram perfis de concentrações de Sb intracelular semelhantes, sendo que observou-se um ligeiro aumento da quantidade de Sb nas células incubadas com CA-AM, no entanto não significativo. Conclusão Em conclusão, mostramos que as cepas resistentes ao Sb apresentam um efluxo de Sb e calceína aumentados com relação à cepa selvagem e que há indícios da participação de transportador do tipo MRP neste transporte na cepa resistente de Ba199, o que não pode ser confirmado na cepa M2904.

FeSBE 2012

Resumo: 09.022

MODULAÇÃO DA GERAÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E COOPERAÇÃO ENTRE A HEXOQUINASE MITOCONDRIAL, ADENILATO QUINASE E NUCLEOSÍDEO DIFOSFOQUINASE EM MITOCÔNDRIAS DE Solanum tuberosum L.

Autores 1JARDIM-MESSEDER, D.

1, PACHEDO, F. M.

1, CAMACHO-PEREIRA, J.

1, GALINA, A.

2

Instituto de BioquÃmica Médica - UFRJ

Apoio Financeiro: FAPERJ, PRONEX, INCTEN

Resumo Objetivos O estresse oxidativo ocorre quando existe um desbalanço entre a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e os mecanismos de defesa antioxidante, sendo um fator central para o fenótipo de plantas submetidas a estresses bióticos e abióticos. Nosso grupo tem demonstrado que a atividade de quinases mitocondriais, como a isoforma de hexoquinase associada à membrana externa mitocondrial (mt-HK), através de um mecanismo de ciclagem de ADP, exerce um papel antioxidante preventivo na geração de ERO em tecidos animais (da-Silva et al, 2004. . J Biol Chem. 17;279(38):39846-55; Meyer et al., 2006. Arch Biochem Biophys. 217(1):312-323) e vegetais (Camacho-Pereira et al, 2009. Plant Physiol. 149(2):1099-110). Em mitocôndrias de tubérculos de batata ( < i>Solanum tuberosum L.) é verificada uma significante atividade de adenilato quinase (AK) e nucleosídeo difosfoquinase (NDPK). O objetivo deste trabalho é a avaliação do potencial anti-oxidante dessas quinases mitocondriais. Métodos As mitocôndrias foram isoladas por centrifugação diferencial. Foram realizadas medidas do consumo de oxigênio, através de oxigrafia de alta resolução, análises de potencial de membrana e geração de ERO por fluorimetria, utilizando safranina O e Amplex Red, respectivamente, e medida da atividade da mt-HK por método espectrofotométrico. Todos os experimentos foram realizados pelo menos cinco vezes em preparações independentes de mitocôndrias de tubérculos de batata. Resultados Foi verificado que a adição de AMP é capaz de induzir o estado 3 respiratório. Além disso, a eficiência catalítica da cadeia transportadora de elétron (CTE) por AMP é o dobro da verificada para ADP, indicando que todo o AMP adicionado no meio é utilizado pela AK. A adição de AMP também é capaz de dissipar o potencial de membrana mitocondrial em aproximadamente 10%, prevenindo totalmente a geração de ERO. A adição de Ap5A inibidor da AK, abole o efeito da adição de AMP. A adição de outros dinucleotídeos, como CDP, GDP e UDP, substratos para a DNPK, também são capazes de induzir o estado 3 respiratório, e inibir a geração mitocondrial de ERO em aproximadamente 75% da geração máxima. No entanto a adição de TDP não foi capaz de inibir a geração de ERO. Além disso, foi verificado que a afinidade aparente por GDP e UDP foi a mesma verificada para o ADP (KM = 25 mM), indicando que estes NDPs são fosforilados preferencialmente. Entre os NDPs, A mitocôndria apresentou menor afinidade por TDP (KM = 200 mM). Conclusão A AK possui um importante papel antioxidante em mitocôndria de tubérculo de batata. Esse mecanismo pode ser importante na prevenção da geração de ERO em situação de estresses abióticos, como anóxia, condição em que o AMP é o nucleotídeo de adenilato predominante. A DNPK também possui um papel antioxidante notável e o potencial redox de cada dinucleotídeos será dependente da afinidade da CTE de elétron por cada um.

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Resumo: 09.023

LIBERAÇÃO DE GLICOSE INDUZIDA POR AII EM FÍGADO DE RATOS TRATADOS COM FRUTOSE E DE RATOS ESPONTANEAMENTE HIPERTENSOS

Autores 1KIMURA**, D. C.

1, PINTO*, A. A. S.

1, MONTANARO, S. M.

1, BORGES, D. R.

2, NAGAOKA,

M. R. 1, KOUYOUMDJIAN, M.

1 Bioquímica - UNIFESP,

2 Biociências - UNIFESP-Santos

Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP (2011/13974-8)

Resumo Objetivos O consumo crônico de frutose em roedores leva à resistência à insulina, obesidade, diabetes mellitus tipo 2 e pressão arterial elevada, podendo ocorrer o desenvolvimento da síndrome metabólica. Ratos espontaneamente hipertensos (SHR) é linhagem de animais que apresentam pressão sanguínea elevada após 3-4 meses de vida. O sistema renina-angiotensina vem sendo relacionado tanto à hipertensão essencial como a síndrome metabólica. Dessa forma, nosso objetivo foi comparar a liberação glicose e a resposta hipertensiva portal (RHP) por infusão de AII em fígados de ratos submetidos a tratamento crônico de frutose e de SHR. Métodos Ratos Wistar ou SHR (8 semanas), foram divididos em grupos: 1) Controle-Wistar (C), que receberam água ad libitum; 2) Frutose-Wistar (F), que receberam solução de frutose 10% por 10 semanas antes da perfusão; e 3) SHR (S), que receberam água ad libitum. A pressão arterial sistólica caudal e o peso dos animais foram acompanhados durante todo o período do tratamento. Perfusão de fígado de rato: após anestesia com uretana ( < i>i.p. 1,3 g/kg) as veias porta e cava inferior acima do diafragma foram canuladas, tornando-se as vias de entrada e saída do perfusato, respectivamente. O fígado foi exsanguinado com solução Krebs-Henseleit-bicarbonato (pH 7,4–7,5), saturada com 5%CO2/95%O2, contendo BSA (1 mg/ml), num fluxo constante de 3–4 ml/min.g de fígado, em sistema sem recirculação. Após período de estabilização (~20 min) do consumo de oxigênio e da liberação de glicose, AII (1μM) foi infundida durante 10 min. A pressão portal foi registrada, na via aferente, em diferentes tempos de perfusão. A viabilidade hepática foi avaliada pela produção de bile e consumo de oxigênio. Alíquotas do perfusato foram coletadas para dosagem de glicose; a glicose liberada foi calculada pelo gráfico liberação de glicose versus tempo de perfusão e expressa como AUC (μmol/g fig). A RHP corresponde a área sobre a curva do gráfico Δ pressão portal (cmH2O) versus tempo de perfusão (min) e expressa em cmH2O.min. CEP 1287/11 Resultados A curva de crescimento dos animais do grupo F foi semelhante ao grupo C, assim como a pressão arterial sistólica de cauda. A hipertensão arterial do grupo S foi confirmada, caracterizando a linhagem. Este grupo apresentou peso corporal menor quando comparado à linhagem Wistar. A glicemia de jejum foi igual em todos os grupos de animais, entretanto, a trigliceridemia do grupo F foi maior do que dos outros grupos sendo esse parâmetro uma das primeiras alterações descritas para o modelo da síndrome metabólica. A resposta hipertensiva portal (cmH2O.min) foi semelhante nos três grupos (C: 42,3±6,7 n=6; F: 45,6±4,2 n=9; S: 36,1±3,8, n=8; ANOVA: P=0,3507). Por outro lado, a glicose liberada (μmol/g fig) após infusão de AII foi maior (ANOVA, P=0,0123) no grupo F (17,6±2,2, n=7) quando comparado aos grupos C (10,8±1,8, n=7) e S (10,2±1,2, n=6). A interação da AII com AT1R causa dessensibilização do receptor, o que pode ser evidenciado no gráfico de pressão portal ao longo do tempo. Interessante observar que, a liberação de glicose induzida por AII se mantém aumentada ao longo do tempo, indicando uma possível participação de outro receptor nessa resposta metabólica. Conclusão Nossos resultados sugerem que o número de receptores AT1 pode estar aumentado ou existe outro receptor envolvido na liberação de glicose induzida por AII após 10 semanas de tratamento com frutose.

FeSBE 2012

Resumo: 09.024

LESÃO POR ISQUEMIA E REPERFUSÃO EM FÍGADO DE CAMUNDONGO KNOCKOUT DE RECEPTOR B1 DE CININAS

Autores 1DEZORZE, L. F.

2, KOUYOUMDJIAN, M.

1, BORGES, D. R.

3, NAGAOKA, M. R.

1 Medicina -

Unifesp, 2 Bioquímica - Unifesp,

3 Biociências - Unifesp

Apoio Financeiro: Fapesp (08/55928-0 e 11/04001-6) e CNPq (477869 e 502065)

Resumo Objetivos As ações biológicas e os efeitos farmacológicos do sistema cinina são mediados por dois receptores, um constitutivo (B2R) e outro induzido (B1R). O B1R geralmente está ausente em tecidos normais e sua expressão pode ser induzida por estímulo inflamatório. Recentemente, nós verificamos que a lesão por isquemia e reperfusão hepática em ratos é capaz de induzir a expressão do B1R e a presença de um antagonista desse receptor foi capaz de alterar negativamente os parâmetros metabólicos (liberação de glicose, secreção de bile), bem como os níveis de morte celular por apoptose, sugerindo um papel importante desse receptor na lesão. Assim, o objetivo deste trabalho é avaliar dano hepatocelulares em camundongos knockout de receptor B1 de cininas submetidos à isquemia e reperfusão (IR) in vivo. Métodos (CEP 34/09) Foram utilizados camundongos selvagens (wild) e knockout de receptor B1 (KOB1R) de cininas de aproximadamente 8 semanas de idade. Os animais foram anestesiados com xilazina e ketamina e mantidos em mesa cirúrgica aquecida (37oC). Após laparotomia, a tríade portal foi localizada e clampeada acima do lobo direito, impedindo, desse modo, o fornecimento de sangue aos lobos mediano e esquerdo, caracterizando 70% de isquemia. Após 1h de isquemia hepática parcial, o clampe foi removido e o fígado reperfundido por 2, 6 ou 24h. Depois da reperfusão, as veias porta e cava foram canuladas e o parênquima hepático foi perfundido in situ com solução de Hrebs-Henseleit e corado com azul de Tripan, sob fluxo contínuo de 3 mL/min. Liberação de glicose no perfusato foi utilizada como parâmetro de viabilidade hepática. Dano hepatocelular foi avaliado mediante liberação de Aspartato Aminotransferase (AST) e Lactato Desidrogenase (LDH) no plasma. Análise histológica do tecido corado com hematoxilina-eosina também foi realizada. Resultados Nós verificamos aumento da liberação de transaminases em função do aumento do tempo de reperfusão nos animais selvagens e KOB1R. Não houve diferença significativa na liberação das transaminases entre os animais selvagens e KOB1R, embora após 24h de reperfusão os animais KOB1R liberaram menos (1350 ± 390 U/L, n=6) que os animais selvagens (3382 ± 962 U/L, n=5). A liberação de glicose pelo fígado submetido a IR apresentou perfil semelhante entre os grupos e ao fígado não isquêmico: aumento da liberação no 1º minuto de perfusão com forte declínio aos 5 mim. Animais KOB1R reperfundidos por 24h apresentaram significativamente (ANOVA, p < 0,0001) maior (1285 ± 356 mg/mL) liberação de glicose no 1º minuto de perfusão que os animais KOB1R reperfundidos por 2 (385 ± 73 mg/mL, n=6) e 6h (493 ± 94 mg/mL, n=5) e que os animais selvagens reperfundidos por 24h (671 ± 123 mg/mL, n=7). A análise histológica dos fígados revelaram padrão de lesão por isquemia e reperfusão com importante necrose das células hepáticas. Há ligeiro aumento da necrose em animais KOB1R submetidos a IR. Análise molecular da morte celular por necrose e apoptose está sob investigação. Conclusão Nosso estudo é pioneiro na padronização da isquemia e reperfusão hepática em animais KOB1R e os resultados sugerem que os animais KOB1R respondem sistemicamente de forma semelhante aos animais selvagens após isquemia e reperfusão in vivo.

FeSBE 2012