sensores em linha para propriedades celulares determinação da concentração de biomassa -são...
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SENSORES EM LINHA PARA PROPRIEDADES CELULARES
Determinação da concentração de biomassa
- São medidas indiretas- Necessitam de uma curva de calibração (correlação entre a
variação da propriedade medida e a concentração celular)- Um dos maiores problemas é a falta de linearidade de tal
curva em altas concentrações de biomassa- Não existe um método de aplicação geral, por causa das
restrições devido às características do crescimento e do meio de cultivo
- A maioria dos métodos mede a biomassa total
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A. Turbidimetria
A turbidez de um meio depende do número de partículas que ele contém, do tamanho e da forma destas partículas
Os métodos levam em conta que a turbidez do meio é proporcional à sua concentração de biomassa
O feixe de luz incidente na suspensão celular está sujeito a pelo menos cinco fenômenos:
- Absorção da luz pela biomassa- Transmissão da luz- Espalhamento da luz na mesma direção de incidência do feixe- Espalhamento perpendicular à direção de incidência do feixe- Espalhamento na direção contrária ao de incidência do feixe
Embora existam aparelhos para medir estes fenômenos, a maioria mede, em meios biológicos, a luz transmitida
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Fenômenos envolvidos na determinação da biomassa celular.
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Fenômenos envolvidos na determinação da biomassa celular.
Espalhamento 90o
Espalhamento frontal
Luz incidente
Amostra turva
Espalhamento 180o
Luz transmitida
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Esquema de uma sistema de medida de biomassa em linha por turbidimetria.
Medidor de
turbidez
Biorreator
Meio
Câmara de desgaseificação
Análise e registro
de dados
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Diagrama esquemático de uma célula de fluxo para medida de luz transmitida (a) e variação da densidade ótica com a concentração de biomassa para diferentes valores de d (b).
Uma das formas de se determinar concentrações de biomassa em faixas maiores é variar a espessura do caminho de percurso do feixe de luz.
Tubo interno
Densidade ótica
Entrada da amostra
Saída da amostra
Densidade celular
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Esquema de turbidímetro para medida da luz transmitida e da luz espalhada no sentido de incidência do feixe (a) e para medida da luz espalhada no sentido oposto ao de incidência do feixe (b).
(a)
(b)
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Esquema de determinação de biomassa por medida da luz espalhada no sentido oposto ao de incidência do feixe: (a) detalho do instrumento de medida e (b) esquema geral.
a b
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B. Fluorescência
• Princípio do método: fluorescência do NADH e NADPH de células vivas quando irradiados com luz ultravioleta
• Comprimento de onda de incidência: 340-360 nm• Comprimento de onda de fluorescência: cerca de 460 nm• A intensidade de fluorescência é afetada pela quantidade
de biomassa, pelo estado metabólico das células e também por fatores abióticos como bolhas e componentes fluorescentes do meio
• Não há circulação de amostra pelo equipamento, o que indica uma montagem mais simples em relação a outros
• O método tem potencial para uso em sistemas com células imobilizadas
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Desenho esquemático de um sensor de fluorescência.
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Fluorescência de uma cultura de Zymomonas mobilis em função da concentração de biomassa, em diferentes concentrações de glicose.
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• A produção de calor é um parâmetro relacionado com atividade metabólica, concentração de biomassa e consumo de substrato
• O maior problema é “separar” o calor produzido pelas células do calor produzido ou consumido por outros processos (aeração, agitação, adição de ácido/base, ou nutrientes)
• O estado metabólico das células influencia na quantidade de calor gerado, alterando os termogramas. Neste caso, a relação entre calor produzido e quantidade de biomassa fica comprometida
C. Calorimetria
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• A concentração de biomassa pode ser estimada a partir do volume da torta filtrada, do fluxo de filtração, do volume de filtrado e da diferença de pressão através do sistema de filtração
• Corresponde a um sistema de medida semicontínuo• Foi demonstrado que a concentração de biomassa pode ser
obtida pela equação: X = (1/ν). VC/(Vf+VC)
Onde:X é a concentração de biomassa (g/L)v é o volume específico da torta (L/g)VC é o volume da torta (L)
Vf é o volume do filtrado (L)
D. Filtração
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Diagrama esquemático de um sistema de filtração para medida de biomassa.
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Comparação de dados de biomassa obtidos por filtração em linha com os obtidos por métodos off-line, para o cultivo de Penicillium chrysogenum.
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E. Outros métodos
• Métodos por viscosidade
• Métodos Eletroquímicos - Métodos Impedométricos - Sensores potenciométricos- Sensores tipo células de combustível- Sensores amperométricos
• Métodos acústicos
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Determinação de biomassa ativa
- A viabilidade celular pode ser medida em separado por três principais métodos:
- Coloração vital- Replicação celular- Atividade metabólica
- Tais métodos demandam tempo considerável
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Citometria de fluxoTécnica que permite analisar várias características celulares ao mesmo tempo
O aparelho, citômetro de fluxo, capta e digitaliza a dispersão de luz provocada pela passagem de partículas em suspensão alinhadas uma a uma, num fluxo laminar, frente a um feixe de luz
Componentes básicos do citômetro de fluxo:
Fluido – suspensão de partículas e fluxo laminar
Óptico - Fonte de iluminação, Captação da dispersão da luz e da fluorescência e Filtração da dispersão e da fluorescência
Eletrônico - Conversão do sinal em valores analógico-digitais Aquisição, Processamento, Análise e Armazenamento por computador
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Exemplo do que pode ser analisado por citometria de fluxo.
MetabolismosMetabolismos
ReceptoresReceptores ADNADN CitoquinasCitoquinas
EnzimasEnzimas
Antigénios celularesAntigénios celularesTamanhoTamanho
ComplexidadeComplexidade
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FILTRO DE AR GERA PRESSÃO AO FLÚIDO ENVOLVENTE “SHEATH”
Baixa pressão da amostra
12µl/min
Amostra
Fluxo Laminar
BAIXA PRESSÃO DIFFERENCIAL
Bainha Bainha Amostra
Fluxo Laminar
Bainha Bainha
ALTA PRESSÃO DIFFERENCIAL
Alta pressão da amostra
60µl/min
SISTEMA FLUIDO
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FACSCaliburFL1
Red Diode LaserRed Diode Laser~635 nm~635 nm
SSC
FL3
FL4
670LP
661/16
585/42
488/10
90/10 Beam Splitter
DM 560SP
FluorescenceCollection Lens
DM 640LP
Half Mirror
488/10
.488 nm488 nmBlue LaserBlue Laser FSC Diode
FocusingLens
FL2
530/30
Beam Combiner FlowCell
FlowCell
SISTEMA ÓTICO
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Diagrama esquemático representando os sistemas ótico e fluido de um citômetro de fluxo.
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Ótica de espalhamento frontal
Sensor de FSSensor de FS
LaserLaser
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Ótica de espalhamento lateral
LaserLaser
Sensor de FSSensor de FS
Sensor SS 90Sensor SS 9000
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Ótica de fluorescência
LaserLaser
Sensor de FSSensor de FS
Detectores de FluorescênciaDetectores de Fluorescência(PMT1, PMT4 etc.)(PMT1, PMT4 etc.)
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ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)
ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)
LASER
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Foto de um citômetro de fluxo.
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Foto do sistema ótico de um citômetro de fluxo.
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Tipos de diagramas (Resposta)
• 1 parâmetro– Histograma
• 2 parâmetros– Gráfico de pontos– Gráfico de Contorno– Gráfico de Densidade
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Foto de um citômetro de fluxo.
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Análise por Injeção em Fluxo (Flow Injection Analysis)
Fundamento: Injeção de uma amostra numa corrente líquida contínua não segmentada.
À corrente de amostra são adicionados reagentes, de modo a formar uma zona de reação que é continuamente transportada para um detector, o qual pode determinar absorbância, potencial elétrico ou qualquer outra propriedade física da solução
A análise (FIA) compreende três blocos principais:
- Manipulação da amostra e transporte, que consiste em retirar uma amostra do reator e condicioná-la para a análise
- Especificação, que consiste na eliminação de interferentes e outros produtos, de maneira a assegurar a proporcionalidade da propriedade medida com o analito
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- Detecção, que consiste no emprego de um transdutor, de forma a gerar um sinal proporcional à espécie a ser determinada
Existe uma grande flexibilidade para se compor esses três blocos, de modo a se montar distintos sistemas de análise.
Principais vantagens do sistema FIA:
- Alta frequência de análises- Pequenos volumes da amostra- Amostragem e preparação da amostra integrados ao sistema- Calibração a qualquer momento- Poucas interferências- Confiabilidade- Longos períodos de operação dos sensores- Flexibilidade para incorporação de novas técnicas analíticas
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Determinação de biomassa em bioprocessos
• Essencial para o conhecimento e controle de bioprocessos
• Variável utilizada para a determinação das velocidades específicas de crescimento, de consumo de substrato e de formação de produtos
• Modelagem matemática do crescimento, do consumo de substrato e da formação de produto
• Comportamento cinético do processo