seminario biología molecular pdf
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SEMINAR.
MOLECULAR BIOLOGY.
TEACHING: Lina Martínez
PRESENTED BY:
Mariana Arias Ramírez
Kiara Tatiana Cuesta Martínez
Michelle T. Barati,1 James C. Gould,1,2 Sarah A. Salyer,1,3 Susan Isaacs,1
Daniel W. Wilkey,1 and Michael L. Merchant1
1. Kidney Disease Program, Department of Medicine, University of Louisville, Louisville,
KY 40202, USA
2. HarvardMedical School, Boston,MA 02115,USA
3. Tuskegee University School of Veterinary Medicine, Tuskegee, AL 36088, USA
• Rats.
• Models that help the understanding of
the pathogenesis of many diseases and
can aid in the development of therapies
to replace the defective function of a
particular gene.
A large part of their
biochemical
processes are similar
to man
They have a very short generation
time, are very prolific and easily
adapt to life in the animal facility,
which allows you to control
environmental variables in the
experiments.
It is the only animal that has
conditional efficient cropping
systems embryonic stem
cells ( "ES cells") to generate
chimeras, allowing the
realization of targeted
mutations (eg .: KO mice) or
(eg .: the Cre / loxP) system.
• Renal corpuscle cells.
• Renal extra-glomerular cells: lacis
cells (juxtaglomerular apparatus).
Features:
• Maintain the structure and
function of the glomerular barrier
by phagocytosis and endocytosis.
• Structural support to the
podocytes.
• Discharge: Molecules glomerular
response to injury, such as IL-1,
PGE2, platelet-derived growth
factor (PDGF).
Enclosed by the glomerular
basement membrane (GBM).
Taken from: 11–3926S, N. P. (2011). U.S. Department of Health and human services. National Institutes of Health. NIDDK.
LEVELS GLOMERULAR MESANGIAL CELLS
High glucose Protein glycosylation: pyrroles and imidazoles which alter
glomerular function: lipoprotein entrapment, Ig, etc.
Receptors glycosylated proteins: production of insulin-like growth
factor-1 (IGF-1), interleukin 1 and tumor necrosis factor, tissue
activation of clotting factors.
Thickening of the glomerular basement membrane
Normal glucose Normal cellular function as phagocytosis, endocytosis and
mechanisms for the conservation of glomerular filtration barrier.
Low glucose Chronic Kidney Disease.
Placas con medios líquidos que contienen
pequeñas cantidades de una serie de
moléculas necesarias para la supervivencia y
multiplicación celular: sales, glucosa,
aminoácidos y vitaminas.
Generalmente tamponados para
mantener un pH alrededor de 7,4
Suelen agregarse también antibióticos
y antimicóticos para impedir la
contaminación con microorganismos.
RMC (ATCC® CRL-2573™)
Rattus norvegicus
Medición de
supervivencia y
proliferación celular
Método del MTT para
determinar el posible efecto
citotóxico de un agente sobre
líneas celulares tumorales ó
cultivos primarios de células
normales. *DO:
Densidad
óptica
Permite:
• Comparar de forma
cualitativa y cuantitativa la
expresión de proteínas de
dos muestras.
• La aparición y
desaparición de manchas
proporciona información
sobre la expresión
diferencial de proteínas
La electroforesis es un método de separación de
moléculas biológicas que se basa en la migración
de las mismas según su carga en un campo
eléctrico.
2DE es una combinación
secuencial de:
• El enfoque isoeléctrico y
• La electroforesis en gel
de poliacrilamida con
SDS
Es el estudio de las proteínas, su estructura y su función, y como varían estas frente a diferentes situaciones como el estrés. Son estudios comparativos que permite ver como se comporta una proteína frente a diferentes situaciones metabólicas o patológicas.
En este caso se utilizo MALDI-OF que es una técnica de ionización
suave utilizada en espectrometría de masas (medición de moléculas, su
composición) y TOF/TOF es el detector de iones que acompaña al
MALDI. Este método es ideal para analizar proteínas ya que estas
pueden tender a hacerse frágiles con otros métodos.
El TOF/TOF mide la velocidad del ion según
la masa de carga, El tiempo que se tarda la
partícula para alcanzar un detector a una
distancia conocida se mide. Este tiempo
dependerá de la relación masa-carga de la
partícula (las partículas más pesadas
alcanzan velocidades inferiores).
Sección
óptica de
una muestra
La fuente de iluminación puntual ilumina una región
del objeto y el detector puntual
recibe la radiación de esta área objeto
Útil para medir perfiles de
superficie y cuando se acopla
con la fluorescencia da una
representación tridimensional
de la morfología interna de la
muestra
INMUNOBLOT O WESTERN BLOT
Técnica utilizada para detectar proteínas especificas en una muestra
determinada, mediante una electroforesis en gel que separa las
proteínas, estas van desde el gel hasta la membrana
electroforéticamente.
¿QUÉ SE UTILIZÓ? Se utilizó la electroforesis de dos
dimensiones , es una electroforesis
en gel donde se separan las
proteínas en dos dimensiones , es
de alta resolución, donde se
separan mezcla proteínas
altamente complejas , son
separadas por dos criterios físicos:
Tras esta separación por carga las
proteínas son separadas de acuerdo
con su masa molecular por
electroforesis discontinua en gel de
poliacrilamida Tras la tinción del gel
las proteínas aparecen formando
manchas circulares (spots).
En primer lugar las proteínas
son separadas en un gel con
gradiente de pH en
condiciones desnaturalizantes
de acuerdo con su punto
isoeléctrico
Se utlizó Ingenuity Pathways Analysis es una base de
datos para análisis, integración e interpretación de
experimentos basados en secuencias de RNA,
microanálisis de ADN, metabólica y proteómica , en
este caso fue enfocado sobre la biología de los
mamíferos para evaluar los coeficientes de expresion
de proteínas.
El propósito de esta evaluación fue establecer la expresión de
las interacciones de las proteínas ( relación proteína proteína
directa , su interacción y transcripción), se utlizó este tipo de
bases para mostrar la interacción entre ortólogos de mamíferos
que son secuencias homologas o que se han separado por un
evento de especiación, es decir secuencias que están en
diferentes especies y que son altamente similares debido a que
se originaron de un ancestro común.
“El necio colecciona hechos,
el sabio los selecciona”
John Wesley Powell
ALTERACIÓN DE LA
EXPRESIÓN DE
PROTEÍNA POR HG
EXPRESIÓN DE LA RED DE PROTEÍNAS
ANÁLISIS INMUNOQUÍMICO
No varió viabilidad Ingeniuty Pathways Analysis Prohibitina (PHB)
• 51 puntos proteína
tenían un volumen de
mancha de menos de
0,35
• 𝑡-prueba valores de
≤0.05.
• Motilidad actina por
Rho
• Señalización de RhoA
• Ruta de ubiquitinación
de proteínas.
Inmunotransferencia (IB)
el análisis de las proteínas
seleccionadas se utilizaron
para confirmar los
hallazgos 2DE.
• 35 proteínas: Aumentó
expresión
• 16 proteínas:
Disminuyó expresión
• 23 proteínas:
Observación de
variación de pI 0,5
unidades de pH
Proteínas implicadas en
ubiquitinación, ciclina D,
MAPKinase, HSP90,
VEGF, el TNF, TGFß1, etc.
• Las proteínas se
separan en un primer
momento mediante
enfoque isoeléctrico
en un gel cilíndrico.
• Se extiende el gel
horizontalmente sobre
un segundo gel, en
forma de plancha, y
las proteínas se
separan mediante
electroforesis SDS-
PAGE.
• Separación horizontal
refleja las diferencias
de pI; la vertical
refleja las diferencias
en masa molecular.
Incluyó 25 proteínas
identificadas de los 35
componentes totales de la red
• Cáncer
• Enfermedades del sistema
reproductor
• Enfermedades hematológicas
Proteínas implicadas en
ubiquitinación, ciclina D,
MAPKinase, HSP90,las histonas
H3 y H4.
• Muerte celular dirigida
• Supervivencia
• Metabolismo de fármacos
• Metabolismo de lípidos
Incluyó 9 proteínas identificadas
de los 35 nodos de proteína
VEGF, el TNF, TGFß1
La expresión por 1DE apoyaron
una tendencia en aumento de la
abundancia total de PHB
PHB: localizada en el núcleo y modulan
la transcripción mediante la interacción
con diversos factores de transcripción,
como TNF. Proliferación celular.
β-actina: migración, motilidad división
celular, y la regulación de la expresión
génica.
1. Se analizó la isoforma PBH en
medio HG Y NG , 1/3 del PHB se
fue para el extremo acido y 2/3
para el lado básico
2. Los PI ácidos fueron mayores en el
medio con alta concentración de
glucosa y mucho menos en el medio
NG*.
3. Los puntos isoeléctricos básicos
fueron mayor en el medio NG* que en
el HG.
1. En las imágenes se puede
evidenciar que la prohibitina
aumento en la HG (expandió)
2. Se muestra con otro colorante el
núcleo de las células mesangiales
3. En la tercera imagen podemos ver
ambas coloraciones, una proporción
núcleo / prohibitina, donde en las HG
es mas amplia la expansión de la
prohibitina.
El PSMA2 (subunidad a2 del proteosoma)
aumento considerablemente en en medio
con alto contenido de glucosa lo que quiere
decir que hubo aumento de degradación de
proteínas afectadas o dañadas.
La disminución del PDI en en medio con
alto contenido de glucosa fue considerable
frente al NG*, lo que indica aumento de
proteínas desplegadas e inducción de
degradación por proteosoma.
El GAPDH tuvo una representación similar
en ambos grupos, siendo mas evidente en el
medio GH, este intermediario glicolitico
puede estar inhibido en personas
DIABÉTICAS.
AFFIRMATION OUR AUTHORS
“It is well established that chronic
hyperglycemia such as in an
uncontrolled diabetic state detrimentally
affects the renal glomerulus and
produces a pathologic GMC phenotype”
M. E. Cooper; G. Wolf
They are agree
“Increased glucose levels are known to
stimulate a variety of responses within
GMC including remodeling of
cytoskeletal elements like actin and actin
binding proteins” M. R. Clarkson, M.
Murphy, S. Gupta
They find it, and compare whit PHB
expressions level.
AFFIRMATION OUR AUTHORS
“Increased kidney size, glomerular filtration rate and
renal plasma flow in short-term insulin-dependent
diabetics” J. S. Christiansen, J. Gammelgaard, M.
Frandsen, and H.-H.
Parving
YES
“Reversal
of glomerular hyperfiltration and renal hypertrophy by
blood
glucose normalization in diabetic rats” S.
Stackhouse,P.L.Miller, S. K. Park, and T.W.Meyer
YES
Molecular mechanism, such as protein
expression, could explain the renal
pathophysiology of diabetes insipidus
.
PSMA2 Increasing and decreasing the PDI in the
middle With HG Indicate that there Were Mayor
Increased protein degradation by the proteasome ,
Allowing conclude That in hyperglycemia is greater
the number of proteins Affected and must be
removed by the proteasome , this proteins are no longer functional
Concentrations higher glucose induce changes in
different types of protein in mesangial cells
belonging to survival signals group and stress
group , this Indicates that diabetes or
hyperglycemia affect mesangial cell function
(regular blood flow).
Although it is widely studied the effect of
chronic hyperglycemia on renal cells, it is
essential to know the acute effect of
hyperglycemia on these cells.
CMAP: Mariana Arias Ramírez
CMAP: Kiara Tatiana Cuesta Martínez
