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Seminario: Bacillus thuringiensis (Bth)
y sus aplicaciones...
Alejandro Crosa & Juan Pablo Oliver
Agroquímicos I
Noviembre 2006
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Bacilo Gram +Esporulador
Aerobio FacultativoDistribuido en el AmbientePatógeno natural de InsectosICP (inclusiones cristalinas paraesporales)
Cry I => LepidópterosCry II => Lepidópteros, DípterosCry III => ColeópterosCry IV => Dípteros Cry V => Lepidópteros, ColeópterosCyt => Mosquitocidal y Citolítica
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Receptores de membrana:
Caderinas
Aminopeptidasa N (APN)
Fosfatasa alcalina
entre otras...
1 a 2 nm
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Productos a base de toxinas BthInsectecidas a base Bth:
1era Generación: esporas y cristales
2da Generación : esporas y toxinas expresadas con otras bacterias
3era Generación : bacterias recombinantes muertas
4ra Generación : quimeras proteicas de toxinas
Forma de Aplicación de toxinas de BthDispersión superficial de la pro-toxina y se deja secar
Microgoteo de pro-toxina más una atrayente (como sacarosa)
Aspersión, barnizado o inmersión de la pro-toxina (hoja, tubérculos, tallos)
Toxicidad:
Nula => Animales superiores
Nula => Insectos no blanco (artropodos, abejas y abejorros)
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Advertencias y precauciones :
Aplicación estados tempranos de Lepidópteros
No mezclar con sust. de pH básico
Persistencia: Baja
Los cristales de Pro-toxina son solubles en agua
Captafol, captan, Demeton S-etil, Difolatan, Dimetoato, Dinocap, Fentoato, Fosalon,
Isoprocarb, Leptofos, Propargita, Propoxur y
Tetraclorvinfos.
Acefato, Azinfos metil, Carbofurano, Clordimeform,
Diazinon, Dicofol, Diflubenzuron, Endosulfan,
Fenitrotion, Hidrácida maléica, Malatión, Maneb,
Metomilo, Mevinfos, Monocrotofos, Paration (etil
paration), Paration metil, Permetrin y Triclorfon,
Verticillium lecanii y Zineb.
Bacillus thuringiensisvariedad kurstaki
No CompatibleCompatible
IPM: Compatibilidad con otros Agroquímicos
Productos a base de toxinas Bth
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2Ab1LepidópteroskurstakiBioprotec
10Aa1, 11Aa1 , CytAaDípteros israelensisTeknar
TransconjuganteLepidópterosaizawaiGC91 (T)Agree
DesconocidoLepidópteroskurstaki SA12Coestar
DesconocidoLepidópteroskurstakiAble
Termo Trilogy Cop.
β-exotoxinaDesconocidodesconocidoDibeta
1Aa1, 1Ab1 , 1Ba1 , 1Ca1 , 1Da1LepidópterosaizawaiThuricide
1Aa1, 1Ab1 , 1Ba1 , 1Ca1 , 1Da1LepidópterostenebrionisNovodor
4Aa1, 4Ba1 , 10Aa1 , 11Aa1 , CytAa, 3Aa3
Coleóptero DípteroisraelensisGnatrol
1Aa1, 1Ab1 , 1A c1, 2Aa1 , 2Ab1
LepidópteroskurstakiDipel, Biobit
Abbott Labs.
ProteinasBlancoVariedadNombre ComercialCompañía
Productos a base de toxinas Bth
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Métodos de Transformación
• Naturales: Agrobacterium tumefaciens
Vectores Virales.
• No Naturales: BioBalística (fuerzabruta).Protoplastos.
• Mixtos: Agrolística.
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Etapas en el desarrollo de Plantas Transgénicas
1) Clonado: · Identificación.· Clonado· Secuenciación
2) Diseño de la · Promotor.construcción: · Targeting.
· Selección.
3) Transformación: · Selección del método de transformación.
4) Selección: · Sistema de selección.· Eliminación del gen de selección.
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Agrobacterium tumefaciens
Ciclo Natural de Infección
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Sistema Binario
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Procedimiento1) Incubación de A. tumefaciens
con explantes (cocultivo).2) Regeneración de explantes
infectados con hormonas (auxinas y citoquininas). Eliminación de A. tumefaciens, incubación en medio selectivo. Producción de callos.
3) Producción de brotes.4) Transferencia de brotes a
medio de cultivo.5) Crecimiento en tierra.
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Limitaciones
• Poco eficiente en monocotiledóneas.
• Los genes se incorporan únicamente en el genoma nuclear, no sirven para transformar cloroplastos.
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Biolística• Permite transformar prácticamente todas las plantas
y también permite transformar los genomas de mitocondrias y cloroplastos (los cuales son generalmente de herencia “materna”).
• Se utilizan proyectiles de oro o tungsteno de aproximadamente 1 µm de diámetro.
• Las partículas son aceleradas por el uso de gas Helio o Nitrógeno de alta presión. Alcanzan velocidades de más de 440 m/s (necesarias para la penetración).
• En general la primera línea de células muere por el impacto, pero las células enseguida por debajo sobreviven.
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Biolística
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Limitaciones
• Alto grado de daño al tejido.
• Relativamente bajo grado de transformantes estables (1 – 5 % de las células).
• Grandes variaciones entre cada experimento, los niveles de expresión génica son totalmente diferentes entre cada experimento.
• Limitaciones en el tamaño de las construcciones.
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Agrolística• Combina la transformación de por Biolística con la mediada
por A. tumefaciens.
• Se incorporan a la construcción los genes virD1 y virD2, bajo la regulación del promotor p35S CaMV. Esto permite la correcta escisión de la hebra-T in planta. Aumenta mucho la frecuencia de transformación.
• Las construcciones se cotransforman por bombardeo de partículas.
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Transformación de Protoplastos
• Métodos: · Electroporación.· Shock osmótico.· Otros.
• Limitaciones: Bajo · 1 – 2 % de transformantes.rendimiento
· 0,1 % de regeneración.
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Consideraciones finales• Efecto de la posición:
· Existe una gran variación en los niveles de expresión de los transgénicos.
· Baja correlación entre el número de copias del transgen y el nivel de expresión.
• Patrones de integración:
· Los transgenes se pueden integrar en varias copias con una correlación directa o invertida.
· La presencia de repetidos, especialmente de orientación inversa, se correlaciona con el fenómeno de silenciamineto génico (cosupresión).
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EL PODER CONTROLAR EL PATRÓN DE INTEGRACIÓN Y
ELIMINAR EL NÚMERO DE COPIAS EXTRA DE UN
TRANSGEN ES UN OBJETIVO PRIORITARIO DE LA
INVESTIGACIÓN EN EL CAMPO DE LA BIOLÓGÍA
MOLECULAR VEGETAL
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Preguntas?
y el futuro?
Muchas gracias