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173Biotecnología y Mejoramiento Vegetal

V.-Capítulo 2

Semilla sintética

Rey, Hebe Y.; Mroginski, Luis A.

1 Concepto

Resulta difícil determinar como se originóla idea de producir semillas sintéticas o artifi-ciales. Estas son el resultado de la aplicaciónen agricultura del fenómeno de embriogé-nesis somática, descripto por primera vez en1958 por Jakob Reinert y F.C.Steward y cola-boradores. Sin embargo, un gran propulsorde su utilización para la propagación a granescala de plantas fue Toshio Murashige, quienen un simposio realizado en 1977 en Ghent(Bélgica) presentó formalmente la idea de laproducción de las semillas sintéticas, enten-diendo como tal a un simple embrión somá-tico encapsulado. Esta semilla se diferenciade la semilla verdadera en que el embrión essomático (producido por el fenómeno cono-cido como embriogénesis somática) y nocigótico, y que si tiene endosperma y cubier-ta, éstos son artificiales (Fig.1 a y b). Esta se-milla, puesta en condiciones adecuadas, ger-mina (Fig.1 c) y se convierte en una planta(Fig.1 d). Muchos grupos de investigación hancontribuido al desarrollo de tales semillas.Entre ellos se deben destacar el grupoliderado por Keith Walker de la CompañíaMonsanto, quien a partir de mediados de ladécada que va de 1970 a 1980 trabajó espe-cialmente con alfalfa. También hay que men-cionar la labor de Robert Lawrence de laUnion Carbide, quienes comenzaron los tra-bajos con especies forestales, lechuga y apio.Otros investigadores como Drew, Kitto yJanick realizaron sus trabajos con zanahoria.El aporte del grupo liderado por KeithRedenbaugh de la Plant Genetic Inc. fue muyimportante, especialmente por su descubri-miento de que hidrogeles como el alginatode sodio podían utilizarse para producir se-millas artificiales que podían germinar en con-diciones de invernadero.

Existe otro tipo de semilla sintética, dife-rente del definido más arriba, donde, en lu-

gar de encapsular embriones somáticos seencapsulan yemas. Este tipo de «semillas sin-téticas» –de una utilización muy restringida–no será tratado en este capítulo.

2 Tipos de semillas sintéticas

Las semillas sintéticas pueden fabricarsede diferentes maneras (Fig. 2). Básicamentepueden utilizarse embriones hidratados, talcomo resultan del proceso de embriogénesissomática, o bien pueden ser desecados. Enalgunos casos estos embriones están prote-gidos por cubiertas protectoras. De esta ma-nera se pueden distinguir 5 tipos básicos desemillas sintéticas:

1) Semillas sintéticas con embrionesdesecados sin cubierta (Tipo 1, Fig. 2). Se

Figura 1: a) Partes de una semilla sintética. b, c y d)Obtención de plantas de Arachis pintoi (2n=3x=30)mediante semillas sintéticas (las barras verticales indican3 mm).

174 REY, Hebe Y.; MROGINSKI, Luis A.

trata de un sistema muy simple donde losembriones son desecados hasta alcanzarporcentajes de humedad del 8 al 20% y noestán provistos de ningún tipo de cubiertaprotectora. En el caso de alfalfa, embrionessometidos a la desecación mostraron porcen-tajes de conversión en plantas de hasta el95% (Tabla 1). Es posible mantener la viabili-

dad de este tipo de embriones por un año,aproximadamente, en condiciones de labo-ratorio.

2) Semillas sintéticas con embrionessomáticos desecados y provistos de cubier-ta protectora (Tipo 2, Fig. 2). Esta técnica hasido utilizada en zanahoria y apio, donde losembriones fueron recubiertos conpolyoxietileno y luego desecados. Los resul-tados han mostrado que es factible lograruna buena supervivencia de éstos; sin embar-go, la conversión en plantas es realmentebaja.

3) Semillas sintéticas con embrioneshidratados sin cubierta (Tipo 3, Fig. 2). Es elsistema más simple; consiste en la utilización

de los embriones somáticos tal como resul-tan del proceso de embriogénesis somática,sin ningún tipo de cubierta protectora. Estesistema ha sido desechado en la práctica porla escasa conversión de embriones en plan-tas.

4) Semillas sintéticas con embrionessomáticos hidratados suspendidos en un gel

viscoso («fluid drilling»)(Tipo 4,Fig. 2). Inicialmente fue desarrolla-do en zanahoria y más reciente-mente en batata; consiste en lainclusión de varios embriones enuna especie de tubo que contie-ne un gel viscoso.

5) Semillas sintéticas conembriones somáticos hidratados y provis-tos de una cubierta protectora (Tipo 5, Fig.2). Es el sistema más usado. Por esta razón,de aquí en adelante, cuando se mencione«semilla sintética» se referirá a este tipo. Tie-ne la ventaja de que los embriones no estánsujetos a la desecación, que constituye la prin-cipal causa de los bajos valores de conversiónen plantas. Si bien se han ensayado nume-rosas sustancias para encapsular a los embrio-nes somáticos (agar, gelrite, gomas), una dela técnicas más utilizadas consiste en lograrla formación de una cubierta protectora dealginato de calcio, compuesto que no es tóxi-co para el embrión y permite una rápidaencapsulación. El proceso es muy simple y

consiste básicamente en sumergir a losembriones somáticos en una solución dealginato de sodio al 2%, pasándolos lue-go a una solución acomplejante de, porejemplo, 100 mM de Ca (NO

3)

2 (Fig. 3).

Con esta técnica se genera una semillasintética consistente en un embrión so-mático recubierto con una cubiertaseminal y provisto de un endospermaartificial (Fig.1 a y b). Eventualmente es-tas cápsulas pueden ser recubiertas porsustancias tales como polioxieti-lenglicol,que sirve para mantener una adecuadahidratación de las cápsulas y embriones.Este procedimiento ha posibilitado laobtención de semillas sintéticas de nu-merosas especies de interés económico,entre las que pueden mencionarse alfal-fa, zanahoria, apio y especies forestalescomo Picea abies, Pinus radiata,Santalum album y Pseudotsuga

Tabla 1: Ejemplos de semillas sintéticas basadas en la desecación deembriones sin cubierta protectora.

Explante

Cultivo e inducción de laembriogénesis somática

Embriones somáticos

HidratadosDesecados

Gel ViscosoEncapsulado

Siembra en el suelo

1 2 3 4 5

Encapsulado

Figura 2: Tipos de semillas sintéticas.

Especie % humedad en la semilla % conversión en plantas

Apium graveolens 10-13 35-85Dactylis glomerata 13 5-30

Medicago sativa 8-20 33-95


menziesii.

3 Producción de semillas sintéticas

En la Fig.4 se esquematizan 6 aspectosque deben tenerse en cuenta para la pro-ducción y manipulación de las semillas sinté-ticas.

En primera instancia es necesario contarcon un sistema eficiente de inducción deembriogénesis somática in vitro, es decir, laproducción de embriones sin la necesidad dela fusión de gametas. Estos embriones de-ben ser estructuras bipolares perfectas (conun polo que genere el vástago y el otro laraíz) capaces de convertirse («germinar») enplantas enteras (ver II.-2).

Si bien la existencia de embriogénesissomática ha sido informada en centenaresde especies de angiospermas y gimnos-permas, en muchos casos no es de utilidadpara iniciar la producción de semillas sintéti-cas debido a la baja tasa de producción deembriones aptos para la encapsulación.

En los últimos años se han hecho nota-bles avances en el conocimiento de los fac-

tores que re-gulan laembriogénesissomática. Sinembargo, enmuchos ca-sos, la basegenética deeste fenóme-no no estác o m p l e t a -mente diluci-dado. En al-falfa es un ca-rácter here-dable, codifi-cado por dosgenes domi-nantes de se-gregación in-dependien-te.

Una vezinducida laembriogénesissomática, els e g u n d o

Figura 3: A-D) Inducción de la embriogénesis somática,E))))) selección de embriones somáticos, F)inmersión de los embriones en alginato de sodio,G) acomplejamiento con nitrato de calcio, H)lavado, I) semilla sintética (i)

Inducción de la embriogénesis somática

Producción sincronizada y en gran escala de losembriones somáticos

Encapsulamiento mecanizado

Almacenamiento de las semillas sintéticas

Siembra en invernadero o a campo

Maduración de los embriones somáticos

Figura 4: Etapas en la producción de las semillassintéticas.

A B CD

E

FGH

I


paso consiste en lograr una producciónsincronizada, a gran escala, de los embriones.Es fundamental contar con embriones sim-ples, en estado cotiledonar, que no se fusio-nen entre sí y que no generen embriones se-cundarios. A fin de seccionarlos se han desa-rrollado diferentes procedimientos basadosen filtros y equipos clasificadores automáti-cos. Para la producción a gran escala se handiseñado biorreactores y sistemas mecaniza-dos de encapsulamiento adaptados a lasparticularidades de cada especie.

Gran parte de la investigación se hallacentrada en lograr una adecuada maduraciónde los embriones, que es un factor esencialpara la obtención de altos valores de con-versión en el suelo. En alfalfa se ha demos-trado la necesidad del empleo de tratamien-tos con ácido abscísico, maltosa y depretratamientos con temperaturas bajas(4ºC).

El almacenamiento de las semillas sintéti-cas es otro aspecto importante a tener encuenta. Lo ideal sería que las semillas sintéti-cas tuvieran un comportamiento similar al dela mayoría de las semillas verdaderas y per-manecieran viables por mucho tiempo. Losresultados obtenidos con semillas sintéticasde muchas especies muestran que aún hayque trabajar arduamente para que ello ocu-rra. La criopreservación con nitrógeno líqui-do (ver V.3) podría resolver este punto.

Por último, si bien muchos factores inci-den negativamente para que ello ocurra, loideal sería que la semilla sintética fuera sem-brada directamente en el suelo, rindiendoelevados porcentajes de conversión en plan-tas. Actualmente, en la mayoría de los casos,las semillas sintéticas son sembradas prime-ramente en cámaras climatizadas o en inver-naderos para luego ser llevadas al campo.

4 Calidad de la semilla sintética

Otro aspecto de gran importancia tecno-lógica es el contar con semillas sintéticas que,además de no generar variantes somaclo-nales, tengan un alto porcentaje de conver-sión en plantas cuando éstas son sembradasen el suelo. Este aspecto se ve afectado porvarios factores, entre los que figuran el tipode embrión, la calidad del endosperma sin-tético, la dureza de la cápsula y la protección

contra agentes patógenos.Generalmente, la carencia de embriones

de calidad es el factor limitante para la pro-ducción de semillas sintéticas. Los mismosdeben poder generarse rápidamente, engrandes cantidades, sin fusionarse entre sí niformar callos. Deben desarrollarse de mane-ra sincronizada y convertirse rápidamente enplantas. Es además altamente deseable queconserven su viabilidad por largo tiempo encondiciones de laboratorio o preservados enrefrigeradores comerciales.

El endosperma sintético tiene que prote-ger y nutrir al embrión hasta que germine ypueda crecer autotróficamente. En este pun-to es preciso recordar que si bien los embrio-nes somáticos son muy similares a los embrio-nes cigóticos, carecen de las sustancias dereserva necesarias para su conversión enplántulas. El endosperma sintético general-mente está compuesto de los mismos me-dios de cultivo que se usan para inducir lagerminación in vitro de los embriones. Estosmedios contienen macro y micronutrientes,vitaminas, sacarosa y sustancias reguladorasde crecimiento. La composición de esteendosperma lo hace susceptible al ataque depatógenos, por lo que también se incorpo-ran compuestos de acción fungicida ybactericida. Es común el agregado de 1-5 mg/L de benomyl y de algunos antibióticos comocefotaxina o ampicilina.

La dureza de la cápsula puede afectar, poracción mecánica o por dificultar la respiración,la conversión de los embriones en plantas.En general, la dureza debe ser del orden de0,2 y 2 Kg/cm2 de presión, y puede obtenersemediante una adecuada manipulación de laconcentración de alginato y de los tiemposde la reacción de acomplejamiento.

5 Ventajas del empleo de semillassintéticas

La mayoría de las plantas de interés eco-nómico son propagadas mediante semillasverdaderas. Estas constituyen excelentespropágulos que pueden ser producidos a bajocosto, en forma rápida, y pueden ser sem-brados mecánicamente. Además, la mayoríade ellas pueden ser conservadas fácilmentepor mucho tiempo. Sin embargo, existenmuchas plantas que no se propagan median-


te semillas verdaderas y lo hacen a través desus partes vegetativas, como es el caso, en-tre otras, de la caña de azúcar, mandioca,ajo, frutilla, papa, batata, varios árboles yplantas ornamentales. Otras especies tienensemillas de baja calidad (muchas coníferas) opresentan dificultades para la germinación(como, por ejemplo, la yerba mate). En otrasun alto grado de heterocigosis hace que laspoblaciones derivadas de semillas sean muyheterogéneas (té, yerba mate, paraíso), loque hace muy recomendable su propagaciónasexual. También es el caso de muchoshíbridos y de plantas que no producen semi-llas verdaderas o bien el caso de ciertas plan-tas transgénicas. En todas estas situacionesel uso de semillas sintéticas resultaría venta-joso. Las plantas podrán ser clonadas y sem-bradas en el campo utilizando sembradorassimilares a las que hoy se emplean con las

semillas verdaderas. Adicionalmente las se-millas sintéticas podrán actuar como trans-portadoras de reguladores de crecimiento,microorganismos y pesticidas que se quieranincorporar durante la siembra. De esta ma-nera, los costos de los transplantes se veránreducidos, las poblaciones serán gené-ticamente uniformes y podrán ser comercia-lizados ciertos híbridos resultantes de costo-sas manipulaciones manuales.

En la Tabla 2 se señalan algunas especiespara las cuales sería necesario contar con unsistema de semilla sintética.

La falta de una difusión masiva de estatecnología en la actualidad obedece a razo-nes técnicas, ya que en muchas especies aúnno se ha logrado inducir eficientes sistemasque permitan la generación de grandes can-tidades de embriones somáticos de calidad,y económicas. Los cálculos realizados en rela-

Especie Interés en contar consemillas sintéticas

Estado de desarrollode la inducción de la

EmbriogénesisSomática

Estado dedesarrollo de la

producción de lasemilla sintética

Aguaí(Chrysophyllumgonocarpum )

XXX X ---

Araucarias(Araucaria spp.)

XXX XX ---

Algarrobo(Prosopis spp)

XXX --- ---

Cítricos *(Citrus spp.)

XX XXX X

Eucaliptos*(Eucalyptus spp.)

XXX X ---

Mango(Mangifera indica)

XX X ---

Paraíso(Melia azedarach)

XXX XX X

Pinos* (Pinus spp.) XXX XX X

Quebracho(Schinopsisbalansae)

XX --- ---

Té(Camellia sinensis)

XXX XXX ---

Toona (Toonaciliata)

XXX --- ---

Yerba mate (Ilexparaguariensis)

XXX X ---

Ref.:* depende de la especie --- Nulo, X escaso, XX regular, XXX elevado

Tabla 2. Necesidad de contar con semillas sintéticas en algunas plantas leñosassubtropicales de interés para la Argentina y estado actual de su desarrollo.


ción a alfalfa indican que su costo de produc-ción supera en casi cien veces el costo de pro-ducción de la semilla verdadera. Sin embar-go, este costo es casi similar o incluso inferioral de la producción de semillas verdaderaspara algunos híbridos de alcaucil, geranio ygerbera.

6 ConclusionesSi bien el uso de semilla sintética en la

agricultura es aún incipiente y sólo es utiliza-da en ciertos grupos de árboles forestales,las perspectivas para esta tecnología son al-tamente promisorias, pudiendo llegar a con-vertirse, en un futuro cercano, en el principalmétodo de propagación de plantas. Si bienlos progresos logrados en los últimos 20 añoshan sido notables, existe aún la necesidadde realizar estudios básicos sobre embriogé-nesis somática para luego abordar los aspec-tos «industriales» de la producción a gran es-cala de semillas sintéticas, tanto deangiospermas como de gimnospermas. En laArgentina, la mayor demanda proviene delsector de productores de plantas leñosas,donde el desarrollo de esta tecnología es aúnincipiente (Tabla 2). Existe, sin embargo, lacapacidad técnica y humana para encarareste desafío.

7 Lecturas recomendadas

CANTLIFFE, D. J. 2001. Bioreactor technology in plantcloning, Proceedings of the Fourth InternationalSymposium on In Vitro Culture and HorticulturalBreeding. Acta Horticulturae. 560: 345-351.

CARLSON, W. C.; HARTLE J. E. 1995. Manufactured seedsof woody plants. In S.M. Jain , P K.Gupta,R.J. Newton(eds.) Somatic embryogenesis in woody plants. London,Kluwer Acad. Press. 1 : 253-263.

GRAY, D. J. P., A. 1991. «Somatic embryogenesis anddevelopment of synthetic seed technology.» CriticalReviews in Plant Sciences 10: 33-61.

GUERRA, M. P. T., A.C.; TEIXEIRA, J.B. 1999. Embriogenesesomática e sementes sintéticas. In: A.C.Torres, L.S.Caldas,J.A.Buso (eds.) Cultura de Tecidos e TransformacaoGenética de Plantas. CBAB. Embrapa. Brasilia . 2: 533-568.

IBARAKI, Y. K., K. 2001. Automation of somatic embryoproduction. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 65: 179-199.

JIMÉNEZ GONZÁLEZ,E.A.; MENDOZA ,E.Q. 1998. In :PérezPonce,J.N. (ed.) Propagación y Mejora Genética de Plantaspor Biotecnología. Instituto de Biología de Plantas.SantaClara. Cuba. pp.225-240.

McKERSIE,B.D.; BROWN D.C.W. 1996. Somaticembryogenesis and artificial seeds in forage legumes.Seed Science Research 6: 109-126.

MROGINSKI, L. A.; REY, H.; OLMOS, S.; GONZALEZ, V.1995. Semillas artificiales para la propagacion de plantas.Paradigmas 1: 5-9.

TIMMIS,R. 1998. Bioprocessing for tree production in theforest industry: Conifer somatic embryogenesis.Biotechnol. Progress 14: 156-166.

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