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SELECCIÓN DE EXTRACTOS FÚNGICOS EXTRACELULARES (EFE)
CON POTENCIAL PARA EL CONTROL DE Botrytis cinerea EN TOMATE (Lycopersicon esculentum Mill.)
DIANA CATALINA POVEDA PARRA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D. C. 2006
SELECCIÓN DE EXTRACTOS FÚNGICOS EXTRACELULARES (EFE)
CON POTENCIAL PARA EL CONTROL DE Botrytis cinerea EN TOMATE (Lycopersicon esculentum Mill.)
DIANA CATALINA POVEDA PARRA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL
Director: ALBA MARINA COTES PRADO Ph. D.
Codirector: ANDRÉS DÍAZ GARCÍA I.Q.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D. C. 2006
NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
SELECCIÓN DE EXTRACTOS FÚNGICOS EXTRACELULARES (EFE) CON POTENCIAL PARA EL CONTROL DE Botrytis cinerea EN TOMATE
(Lycopersicon esculentum Mill.)
DIANA CATALINA POVEDA PARRA
APROBADO
_____________________________________ __________________________________ ALBA MARINA COTES PRADO Ph. D. ANDRÉS DÍAZ GARCÍA I.Q. Director Codirector
______________________________________ __________________________________ MARIA CARIDAD DE GARCÍA MsC. MARÍA MERCEDES MARTÍNEZ Jurado Jurado
SELECCIÓN DE EXTRACTOS FÚNGICOS EXTRACELULARES (EFE) CON POTENCIAL PARA EL CONTROL DE Botrytis cinerea EN TOMATE
(Lycopersicon esculentum Mill.)
DIANA CATALINA POVEDA PARRA
APROBADO
_______________________________________ _______________________________
ANGELA UMAÑA MUÑOZ M.Phil. LUIS DAVID GÓMEZ M. Decana Académica Director Carrera
A Dios mi Director Principal porque me dio la visión y fortaleza necesarias cada día, Él y mi familia con su amor, apoyo y guía sabia me han enseñado que la perseverancia, la
valentía, el no mirar atrás y el esfuerzo son baluartes de una vida en vía a la excelencia.
vi
AGRADECIMIENTOS
La autora manifiesta su gratitud a:
Dra. Alba Marina Cotes, por su enseñanza y por la oportunidad de formar el hábito
investigativo.
Andrés Díaz, por su enfoque y discusiones acertadas.
Carlos Andrés Moreno, por su asesoría.
Los estudiantes, profesionales y auxiliares del Laboratorio de Control biológico, por
su ayuda y colaboración.
Corpoica C.I. Tibaitatá por mostrarme posibilidades en un área que necesita ser
explorada, la investigación en la agricultura.
Mis Padres por su confianza y consejo sabio, a Moni mi hermana por su ayuda.
A todos aquellos que me acompañaron en esta carrera y me comunicaron sus
conocimientos y trabajos para la construcción de éste, su apoyo ha sido clave a lo
largo de esta etapa de mi vida.
vii
TABLA DE CONTENIDOS Página ÍNDICE DE TABLAS XI ÍNDICE DE FIGURAS XII RESUMEN ABSTRACT 2
INTRODUCCIÓN 3
1. MARCO TEÓRICO 5 1.1 LOS MICROORGANISMOS COMO FUENTE DE METABOLITOS DE INTERÉS 5
Biodiversidad Microbiana 5
Bioprospección: Proceso esencial en la investigación biotecnológica 7
Metabolitos Fúngicos en Medicina 9
Antibióticos 9
Anticancerígenos, Antidiabéticos e Inmunosupresores 12
Metabolitos Fúngicos en Alimentación e Industria 13
Metabolitos Fúngicos en Fitoprotección 14
Antibióticos 15
Enzimas 18
Volátiles 19
1.1.2 Metodologías empleadas para la bioprospección de metabolitos con
interés en fitoprotección 20
Bioprospección in vitro 20
Bioprospección in vivo e in planta 22
1.1.2.1Metabolismo secundario: Biosíntesis de productos naturales con
interés en fitoprotección 23
viii
1.2 IMPORTANCIA DEL TOMATE (Lycopersicon esculentum Mill.) 25
1.2.1 Principales patologías del Tomate 25
1.3 MOHO GRIS: Botrytis cinerea 26
1.3.1 Generalidades del Agente Etiológico del Moho Gris. 26
1.3.2 Características Microscópicas y Macroscópicas de Botrytis cinerea. 27
1.3.3 Epidemiología y Ciclo de Vida del Fitopatógeno B. cinerea 28
Diseminación del Patógeno 28
Ciclo de Infección de Botrytis cinerea 29
1.4 CONTROL DEL MOHO GRIS (Botrytis cinerea) 31
1.4.1 Control Químico 31
1.4.2 Metabolitos fúngicos reportados para el control de B. cinerea 33
1.4.3 Características de los metabolitos fúngicos utilizados para fitoprotección 33
2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 35
2.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA. 35
2.2 JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN. 35
3. OBJETIVOS 37
3.1 OBJETIVO GENERAL. 37
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 37
4. MATERIALES Y MÉTODOS 38 4.1 PRODUCCIÓN DE LOS EXTRACTOS FÚNGICOS EXTRACELULARES (EFE) 38
4.1.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS DE CULTIVO 38
Cepas nativas de hongos filamentosos 38
Colección de trabajo de los Hongos 38
Obtención de los Extractos Microbianos 39
Producción de los Extractos 39
ix
4.2 ENSAYOS in vitro. 40 4.2.1 Suspensión de conidios de Botrytis cinerea. 40
4.2.2 Lectura de las Placas 41
4.2.2.1 Curva de Calibración para Botrytis cinerea 42
4.2.2.2 Actividad Antifúngica de los Extractos (EFE) 42
4.2.3 Análisis Estadístico 43
4.3 ENSAYOS in planta. 44
4.3.1 Selección del Bioensayo 44
4.3.2 Evaluación de los Extractos Fúngicos Extracelulares (EFE) seleccionados 45
4.3.2.1 Material Vegetal 45
Inoculación en Foliolos de Tomate. 45
4.3.3 Análisis Estadístico 46
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 48 5.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS DE CULTIVO 48
5.1.1 Cepas nativas de hongos filamentosos 48
5.1.2 Producción de los Extractos Fúngicos Extracelulares (EFE) 53
5.2 ENSAYOS in vitro 59
5.2.1 Efecto de los extractos fúngicos (EFE) sobre la inhibición de la
germinación de B. cinerea 59
5.2.2 Cuantificación de la densidad óptica en relación con el efecto de los
extractos fúngicos (EFE) sobre la inhibición de la germinación de B. cinerea 74
5.3 ENSAYOS in planta 85
5.3.1 Selección del Bioensayo 85
5.3.2 Evaluación de la actividad antifúngica de los extractos en ensayos
in planta. 86
6. CONCLUSIONES 94
x
7. RECOMENDACIONES 95 8. REFERENCIAS 96
9. ANEXOS 109
xi
ÍNDICE DE TABLAS Página
Tabla 1. Taxonomía de Botrytis cinerea 28
Tabla 2. Morfoespecies recuperadas de los tubos de agar 48
Tabla 3. Morfoespecies recuperadas de los viales en aceite 51
Tabla 4. Características de los EFE provenientes de las morfoespecies
suelo 1 56
Tabla 5. Características de los EFE provenientes de las morfoespecies
suelo 2 57
Tabla 6. Características de los EFE provenientes de las morfoespecies
suelo 3 58
Tabla 7. Efectos potenciales de los extractos con actividad antifúngica
sobre la germinación de B. cinerea 68
Tabla 8. Características de los EFE pertenecientes al grupo de inhibición
alta de la germinación de B. cinerea y sus correspondientes
extractos producidos en el otro medio de cultivo 69
Tabla 9. Delta de diferencias de la densidad óptica para cuatro longitudes
de onda 74
Tabla 10. Valores de densidad óptica para diferentes concentraciones
de B. cinerea 75
Tabla 11. EFE producidos en el medio Czapeck-Dox, empleados para la
calibración 78
Tabla 12. EFE producidos en el medio YMG, empleados para la
calibración 80
Tabla 13. Relación entre el porcentaje de inhibición de la germinación de
B. cinerea y la densidad óptica, obtenido con los extractos
49 y 56 82
Tabla 14. Porcentajes de severidad y eficacia para los tratamientos EFE
56 y 158 después de 19 días de inoculación de B. cinerea 92
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
Página Figura 1. Estructura del metabolito paclitaxel 12
Figura 2. Estructura del antidiabético L-783,281 13 Figura 3. Estructura de la gliotoxina 15
Figura 4. Estructura de la glisoprenina C, neobulgarona D y scytalol D 17
Figura 5. Fotografías macroscópicas de diferentes morfoespecies de los
suelos 1, 2 y 3 49
Figura 6. Fotografías macroscópicas de diferentes morfoespecies de los
suelos 1, 2 y 3 50
Figura 7. Fotografías microscópicas de diferentes morfoespecies 52
Figura 8. Fotografías de algunos de los extractos producidos 53
Figura 9. Agrupamiento del efecto inhibitorio de los EFE producidos en
el medio Czapeck-Dox 59
Figura 10. Agrupamiento del efecto inhibitorio de los EFE producidos en
el medio YMG 60
Figura 11. Tubos germinales cortos de B. cinerea en presencia de algunos
EFE 63
Figura 12. Concentración del contenido citoplasmático de conidios de
B. cinerea en presencia de algunos EFE 64
Figura 13. Tubos germinales secundarios y terciarios de B. cinerea en
presencia de algunos EFE 64
Figura 14. Agrupamiento del efecto inhibitorio de los EFE producidos en
Czapeck-Dox pertenecientes a los grupos de inhibición media
y alta 66
Figura 15. Agrupamiento del efecto inhibitorio de los EFE producidos en
YMG pertenecientes a los grupos de inhibición media y alta 67
Figura 16. Fotografías de los extractos del grupo de inhibición alta 69
Figura 17. Fotografías del efecto de los EFE del grupo de inhibición alta
sobre la germinación de B. cinerea 71
xiii
Figura 18. Morfoespecies productoras de los extractos del grupo de
inhibición alta 72
Figura 19. Curva de calibración para B. cinerea, concentración vs.
densidad óptica 75
Figura 20. Disposición espacial de los tratamientos evaluados en una placa
de microtitulación de 96 pozos 76
Figura 21. Modelo de calibración lineal entre la densidad óptica y el porcentaje
de germinación para los EFE producidos en Czapeckl-Dox 79
Figura 22. Modelo de calibración lineal entre la densidad óptica y el
porcentaje de germinación para los EFE producidos en YMG 79
Figura 23. Incidencia B. cinerea en el modelo de foliolos de tomate 85
Figura 24. Incidencia B. cinerea en el modelo de tallos de tomate 86
Figura 25. Fitotoxicidad sobre foliolos de tomate en presencia del EFE 49 87
Figura 26. Fitotoxicidad sobre foliolos de tomate en presencia del EFE 66 87
Figura 27. Progreso moho gris sobre foliolos de tomate 88
Figura 28. Curva de progreso incidencia moho gris sobre foliolos tomate 88
Figura 29. Porcentaje de incidencia del moho gris en el día 19 89
Figura 30. Fotografías del área foliar con moho gris en presencia de los
tratamientos evaluados 90
Figura 31. Progreso severidad moho gris sobre foliolos expresado en
UABC 90
Figura 32. Porcentaje de severidad del moho gris en el día 19 91
Figura 33. Beauveria sp. cepa 223 productora del EFE 56 93
RESUMEN
Los hongos filamentosos presentes en zonas tropicales como el Amazonas, proveen
fuentes potenciales de compuestos con actividad para inhibir la germinación de
hongos fitopatógenos durante su ciclo de infección. Este tipo de alternativas
permitirá el control de brotes epidemiológicos como el producido por el moho gris B.
cinerea, durante la pre y postcosecha en cultivos de importancia agrícola, como el
tomate. Por otra parte, en la actualidad se han desarrollado técnicas de
bioprospección de alta eficiencia en el formato de placas de microtitulación de
96-pozos para evaluar el efecto de extractos crudos o moléculas puras sobre la
fisiología, morfología o actividad de microorganismos de importancia clínica,
agrícola e industrial. Dicho efecto puede ser cuantificado relacionando la
observación directa por microscopia del fenómeno con la densidad óptica obtenida
en un lector de ELISA. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue seleccionar
extractos fúngicos extracelulares (EFE) que inhibieran la germinación de B. cinerea
in vitro e in vivo mediante el empleo de una técnica de microtitulación. Se emplearon
cepas de hongos filamentosos aisladas previamente del Amazonas para la
producción de extractos fúngicos extracelulares (EFE) en dos medios de cultivo,
Czapeck-Dox y YMG. Los EFE fueron evaluados en placas de microtitulación de 96-
pozos para cuantificar la inhibición de la germinación de 5 x 105 conidios.ml-1 de
B. cinerea, relacionando la germinación del hongo observada mediante microscopia
óptica con la densidad óptica a 405 nm. En total, 22 extractos (15 producidos en el
medio YMG y 7 en Czapeck-Dox), lograron inhibir la germinación de B. cinerea en
más del 60% en comparación con el testigo patógeno. De estos, cuatro EFE
codificados como 49, 56, 66 y 158, producidos por las morfoespecies 44 (Penicillium
sp.), 223 (Beauveria sp.), 110 (Aspergillus sp.) y 150 (Phialophora sp.)
respectivamente, en los medios YMG y CD, presentaron inhibiciones de la
germinación de B. cinerea entre el 85% y 90%. De los cuatro extractos
seleccionados in vitro, dos de ellos presentaron actividad fitotóxica en las hojas de
tomate y el extracto 56 presentó la mayor actividad sobre foliolos de tomate
reduciendo la severidad del moho gris en un 74%, después de 19 días.
2
ABSTRACT
Filamentous fungi from tropical ecosystems as the Amazonas, possess potential
sources of compounds with activity to inhibit germination of fungal phytopathogens
during their infection cycle. These alternatives allow to control epidemic outbreaks
produced by the gray mould B. cinerea, during pre- and postharvest of importance
agricultural cultives as the Tomato. Nonetheless, currently high-troughput
bioprospection techniques have been developed based on the 96-well microtitre
plate format to evaluate the effect of crude extracts, or pure molecules over the
physiology, morphology or activity of clinical, industrial and agricultural
microorganisms. Such effect may be scored considering the direct observation by
optical microscopy with optical density obtained in ELISA´s microplate reader.
Therefore, the objective of this investigation was to select extracellular fungal
extracts (EFE) that inhibited B. cinerea germination in vitro and in vivo through the
microtitration technique. Strains of filamentous fungi isolated previously from the
Amazonas, were used and grown for the production of the extracellular fungal
extracts (EFE) in the Czapeck-Dox and YMG media. EFE were tested on the 96-well
microtitre plates to estimate inhibition of germination from B. cinerea 5 x 105
conidia.ml-1 which was related between optical microscopy with optical density at
405nm. Twenty two extracts (15 produced on YMG medium and 7 on Czapeck-Dox
medium), inhibited conidial germination of B. cinerea up to 60% as compared to the
pathogen. From of these ones, four EFE codified as 49, 56, 66 and 158, produced by
the morphospecies 44 of Penicillium sp., 223 of Beauveria sp., 110 of Aspergillus sp.
and 150 of Phialophora sp., respectively, on YMG and CD media, showed
germination inhibition of B. cinerea ranged between 85% and 90% after 16 h. From
these four extracts selected against B. cinerea two of them showed phytotoxic
activity over tomato leaves, and was only the EFE 56 that showed the highest
activity in vivo upon tomato leaves reducing severity of gray mould at 74 % after 19
days.
3
INTRODUCCIÓN
Los hongos filamentosos representan gran parte de la diversidad macro y
microscópica universal, con aproximadamente más de 250.000 especies, y más de
3.000 productos derivados de su metabolismo, identificados hasta la fecha. De
algunas de estas cepas y metabolitos, no se conocen todas sus propiedades y
actividades específicas, reflejando aún un amplio campo de interés para su
exploración e investigación. Esto es especialmente relevante en aquellos
microorganismos aislados de zonas megadiversas de nuestro país como el
Amazonas, donde la microbiota fúngica y productos derivados todavía no han sido
explorados ni explotados.
Adicionalmente, dentro del reservorio de productos naturales, existen varios
metabolitos fúngicos que han demostrado su utilidad en fitoprotección de cultivos,
debido tanto a sus efectos directos sobre los fitopatógenos, como a los efectos
indirectos sobre la planta. Esto es debido a que, estos pueden inhibir el desarrollo
de estructuras de infección y de penetración del patógeno, o actuar como inductores
de respuestas de defensa en el huésped, protegiendo en ambos casos a la planta
de los efectos deletéreos de los hongos fitopatógenos.
Las disminuciones en el rendimiento en muchos casos, también son una
consecuencia del desarrollo de resistencia por parte de los patógenos a los agentes
químicos de control tradicionalmente empleados, reduciéndose el efecto de los
agroquímicos y por ende ocasionando la persistencia de estas cepas dentro de los
cultivos. Como resultado de lo anterior se han presentado numerosos brotes
epidemiológicos de impacto económico, como los reportados para el moho gris una
enfermedad ocasionada por Botrytis cinerea, un patógeno de alto riesgo en lo
concerniente al manejo de resistencia, por su capacidad para adaptarse con
facilidad y rapidez a las condiciones del huésped y del medio.
4
Botrytis cinerea es un hongo necrótrofo y polífago que causa serios daños y
pérdidas en un amplio rango de cultivos de frutales, vegetales y ornamentales en
todo el mundo, genera pérdidas significativas ya que puede infectar y destruir hojas,
tallos, flores y frutos, durante la producción y el almacenamiento. Desencadena un
impacto negativo con repercusiones económicas, tanto por su distribución,
versatilidad como por sus características únicas de patogenicidad dentro del ciclo de
infección, porque es capaz de desarrollar estructuras de penetración especializadas,
así como una matriz extracelular cuya función es la adhesión en la superficie de la
planta, que junto con un amplio espectro de enzimas potencian su ingreso y acción
en el huésped, desencadenando efectos letales para los cultivos. El tomate
(Lycopersicon esculentum Mill.) se ve afectado por varios problemas fitosanitarios
dentro de los que también se encuentra la enfermedad del moho gris causada por
B. cinerea.
Tradicionalmente, el control de B. cinerea se ha realizado a través de aspersiones
químicas, se estima que el mercado de productos anti-Botrytis en los últimos años,
ha alcanzado alrededor de los US $ 15-25 millones. Sin embargo, existe el riesgo de
la aparición y el establecimiento de cepas resistentes de Botrytis sp. a dichos
químicos; creándose la necesidad de buscar otro tipo de estrategias de control del
moho gris, tales como los metabolitos fúngicos que representan una alternativa
natural. Estos beneficios potenciales pueden ser descubiertos mediante procesos de
bioprospección de algunas cepas de hongos filamentosos y de los metabolitos
producidos por estos.
5
1. MARCO TEÓRICO
1.1 LOS MICROORGANISMOS COMO FUENTE DE METABOLITOS DE
INTERÉS. Biodiversidad Microbiana.
Los microorganismos son una gran fuente de recursos biotecnológicos porque tanto
bacterias como hongos poseen una maquinaría enzimática y una composición
genética y fisiológica diversa, haciéndolos atractivos para la investigación, mediante
programas de búsqueda y exploración. Procesos que han permitido descubrir un
amplio número de especies, distribuidas en la mayoría de ecosistemas terrestres y
acuáticos, así como un potencial de compuestos microbianos. Hawksworth y
Rossman (1987) estiman, que existen al menos 1,5 millones de hongos en nuestro
planeta, donde para ese año, el 10% de la microbiota (100.000 especies) estaba
descrita. Pero, según datos de Selitrennikoff, en 2001, el número ha incrementado a
250,000 especies identificadas, un 25% de la población, lo que significa que aún
queda un 75% de nuevos géneros y biotipos por caracterizar. Sin contar con que, el
número de especies continúa creciendo, especialmente con el hallazgo de los
hongos endofíticos, con aproximadamente 1 millón de especies (Dreyfuss y
Chapela, 1994 citado por Strobel y Daisy, 2003), reflejando la diversidad de este
grupo de organismos asombrosos y extremadamente versátiles, porque además del
incremento en su número, se presume que con cada nueva especie se pueden
encontrar nuevos productos naturales y biomoléculas asociadas (Strobel y Daisy,
2003), de las cuales también es necesaria su identificación.
Demain (1999) reporta que existen 100,000 productos naturales, donde alrededor
del 50% corresponde a los producidos por microorganismos. De este porcentaje,
existen 12,000 antibióticos conocidos, donde el 22% pertenece a los derivados de
6
los hongos filamentosos, significando aproximadamente 2,640 sustancias con
propiedades antimicrobianas. El 78% restante, se divide entre los producidos por
bacterias filamentosas (66%) y no filamentosas (12%), confirmando al grupo de los
actinomycetes, especialmente al género Streptomyces, como la principal fuente de
antibióticos a nivel mundial (Strobel y Daisy, 2003).
El número de antibióticos derivados de fuentes fúngicas, pertenece a los más de
3,000 metabolitos producidos por esta microbiota (IBWF, 2005), con diferencias
tanto en sus estructuras químicas y moleculares, como las funciones que realizan,
las cuales no siempre son conocidas (Calvo et al., 2002).
Como se mencionó anteriormente, muchos de los metabolitos descritos se derivan,
de bacterias y hongos filamentosos que son habitantes del suelo (Fravel, 1988).
Encontrándose una marcada influencia del ecosistema, de donde se aísla el
microorganismo, sobre la tasa de producción de sustancias fúngicas, porque en su
microhábitat, el microorganismo desarrolla interacciones benéficas o negativas
(Atlas y Bartha, 2002) que posiblemente pueden resultar en un efecto inductor o
supresor, de la producción de sustancias antibióticas (Fravel, 1988). Investigaciones
realizadas por el IBWF (2005) basadas en el supuesto que los hongos nunca viven
solos, y por tanto se ven influenciados por las relaciones con otros organismos,
demuestran que existe una mutua inducción entre hongos, para la producción de
metabolitos secundarios, especialmente entre hongos que presentan el mismo
hábitat, porque cepas de Penicillium sp. inducen la producción de strobilurina en
Oudemansiella mucida, que a su vez incrementa la síntesis de crisogina en P.
notatum, en comparación a la inoculación de la misma cepa en un medio de cultivo
diseñado para su fermentación. Evidenciándose una diferencia de rendimiento para
aquellas cepas que se cultivan en medios de producción frente a las mismas pero
en condiciones naturales. Este fenómeno también se ha observado para algunos
basidiomycetes, que produjeron compuestos bioactivos, cuando se cultivaron en
medios enriquecidos, bajo condiciones de laboratorio, pero donde el porcentaje de
cepas productoras (50%) no fue comparable a los obtenidos al propiciar el
crecimiento en el sustrato natural (12 de 17 cepas, 70%), debido a que también se
7
producen antibióticos para suprimir el crecimiento de hongos que compiten por
sustrato o espacio (IBWF, 2005).
Este tipo de diferencias observadas al cultivar un microorganismo a escala de
laboratorio frente a las condiciones nativas, comprueba la influencia de los factores
abióticos y bióticos en la gran biodiversidad microbiana, que se ha desarrollado
como respuesta a las características que le proporciona el medio ambiente,
conllevando a la expresión y desarrollo de un sinnúmero de estrategias para poder
conservar su hábitat y nicho, dentro de un determinado ecosistema (Atlas y Bartha,
2002; Fravel, 1988; IBWF, 2005). Motivo por el cual se observan microorganismos
(bacterias y hongos) que pueden vivir en condiciones adversas o extremas, bien sea
de temperatura (-12°C a >110°C), radiación (ionizante, UV, luz visible), presión
(atmosférica, hidrostática, osmótica), salinidad, actividad de agua (0,60-1,00), pH (0,
ácidos y 13, básicos) y potencial redox, entre otros (Atlas y Bartha, 2002).
Todas estas características, también revelan el potencial biotecnológico de la
microbiota en general, porque todos los factores moleculares, enzimáticos,
metabólicos y estructurales, que le confieren resistencia y que suceden en
respuesta al escenario, son deseables para su aprovechamiento en diversos
procesos de interés industrial y económico, por la producción de pigmentos,
enzimas, polímeros, lípidos, ácidos, sales y demás derivados del reservorio
metabólico y bioquímico de los microorganismos.
Bioprospección: Proceso esencial en la investigación biotecnológica. El conocimiento de la biodiversidad y del potencial de un microorganismo, se define
a través del estudio de sus propiedades fisiológicas, metabólicas y bioquímicas así
como de los diferentes metabolitos sintetizados, lo cual se logra mediante la
realización de pruebas exploratorias para encontrar dentro de grandes poblaciones
(Guarro et al., 1999), aquellos organismos que posean las características
seleccionadas, proceso que se conoce como bioprospección.
8
La bioprospección da a la investigación una línea de tendencia, que puede resultar
en el desarrollo de nuevos productos naturales, de bioplaguicidas, o bien de
fungicidas, dependiendo del caso. Esquema de producción, que según el
Laboratorio de Control Biológico de Corpoica (C.I. Tibaitatá), comprende procesos
biológicos, tecnológicos y legales.
En los procesos biológicos, se concentran las exploraciones primarias, con las
etapas de aislamiento, selección y caracterización de microorganismos o de los
productos de síntesis, perfilando el potencial existente y haciendo de esta fase de la
investigación, el fundamento dentro de la consecución de nuevos productos. Porque
después de descubrir y seleccionar factores de interés, se continúa con los
siguientes procesos tecnológicos para el registro, comercialización y demás etapas
legales del producto.
La bioprospección de metabolitos secundarios de origen microbiano, ha permitido
identificar nuevas moléculas biológicamente activas. Esta práctica ha sido frecuente,
desde el siglo XVIII y el pasado, mediante la exploración de extractos de
fermentación microbiana con actividad antibiótica (Higgs et al., 2001). Desde, las
investigaciones realizadas por científicos visionarios como A. Fleming y S.
Waksman, resultado en el conocimiento de la mayoría de la microbiota actualmente
identificada y en el descubrimiento de algunos metabolitos, que ingresaron en la era
de los antibióticos, con la penicilina (1929) y la estreptomicina (1943), derivada de
Penicillium sp. (Atlas y Bartha, 2002; IBWF, 2005) y Streptomyces sp.
respectivamente, como los primeros metabolitos secundarios utilizados como
medicamentos con aplicaciones clínicas.
Además de las aplicaciones en salud humana, de los metabolitos secundarios
derivados de fuentes microbianas, se ha descubierto el gran potencial, de los
hongos filamentosos y de sus diferentes compuestos de biosíntesis, en diferentes
arenas. Encontrándose que esta microbiota comprende una colección de
microorganismos industrialmente muy importantes, por ser una rica fuente de
metabolitos secundarios (Calvo et al., 2002; Nieminen et al., 2002; Singh et al.,
2000; Thines et al., 2004) y de su prospección resultan grandes posibilidades de
encontrar nuevos compuestos potencialmente significativos para el tratamiento de
9
nuevas enfermedades en humanos, plantas y animales (Strobel y Daisy, 2003),
entre otras implicaciones futuras.
Metabolitos Fúngicos en Medicina. Antibióticos. Al explorar un amplio rango de hongos filamentosos, se han encontrado compuestos
orgánicos de bajo peso molecular, que a bajas concentraciones son deletéreos tanto
para el crecimiento como para el desarrollo de actividades metabólicas de otros
microorganismos (Fravel, 1988), los cuales se conocen como agentes
antimicrobianos o antibióticos, que pueden ser utilizados en medicina y salud
humana frente al creciente aumento de nuevas enfermedades microbianas así como
de cepas resistentes a los medicamentos, expresado por una amplia variedad de
bacterias y hongos patógenos.
Encontrándose compuestos con estructuras y modos de acción diversos, como lo
reportado por Singh y colaboradores (2000), durante la selección de extractos de
fermentación fúngica, donde encontraron un nuevo diterpenoide, el
guanacastapeno, con actividad bactericida frente a S. aureus y E. faecium,
resistentes a los fármacos, meticilina y vancomicina, tradicionalmente empleados
para su control. En ese mismo año, Nose y col., aislaron dos nuevos antifúngicos
PF1163A y B, de un caldo de fermentación de Penicillium sp., que mostraron una
potente actividad inhibitoria del crecimiento de Candida albicans, al interferir en la
biosíntesis de ergosterol. Estos resultados son interesantes, porque se podrían
utilizar este tipo de compuestos, para reemplazar los azoles y polienos que
presentan deficiencias en el tratamiento de varias micosis e infecciones sistémicas,
ocasionadas por hongos y levaduras oportunistas, en pacientes inmunodeprimidos;
infectados por el VIH o que han recibido quimioterapia.
Igualmente, el hongo filamentoso Acanthostigmella sp. aislado del jardín botánico de
Nueva York, USA, puede ser utilizado en terapias con estos mismos pacientes,
porque produce tres flavonas con propiedades antifúngicas, especialmente la de CJ-
19,784 (3´-bromo2´,5-dihidroxi-3,7,8-trimetoxiflavona) que inhibe el crecimiento de
10
los hongos C. albicans, C. neoformans y A. fumigatus (Watanabe et al., 2001),
patógenos de alto riesgo. Clavariopsis aquatica, un hongo hiphomycete, también
sintetiza compuestos deletéreos, para A. fumigatus y otras especies como A. niger
y C. albicans, conocidos como clavariopsinas A y B, depsipéptidos de carácter
cíclico, encontrados por Kaida y colaboradores (2001).
Otro compuesto que también podría ser empleado, es un nuevo antibiótico CJ-
17,665, derivado de Aspergllus ochraceus (Sugie et al., 2001) que inhibe cepas
bacterianas resistentes, como las mencionadas inicialmente, causantes de serios
problemas de salud pública. Chu y colaboradores en el 2003, también encontraron
dentro de cientos de extractos, dos antibióticos (Sch -484129 y -484130) de
naturaleza glicolipídica y acción frente a cepas de Saccharomyces como de
Aspergillus.
La mayoría de estos nuevos metabolitos tienen estructuras complejas con
propiedades únicas, como queenslandon, una micotoxina de la familia de las
zearalenonas (fórmula C20H26O8, estructura aromática, grupo ceto y éster carbonil,
E-configuración), encontrada dentro del grupo de las naftoquinonas, al que también
pertenece un complejo de tres altersolanoles (A, B, C), todos derivados de
Chrysosporium queenslandicum, un hongo patógeno aislado de una muestra de
suelo colectada en Egipto (Hoshino et al., 2002). Queenslandon, tiene además de
su función lactona, un fuerte espectro de actividad biológica contra bacterias y
hongos patógenos, como M. luteus, B. subtilis, A. alternata, P. chrysogenum, A.
nidulans y P. variotii, entre otros (Hoshino et al., 2002).
FR901469 es otro nuevo antimicrobiano (Fujie et al., 2000) que también presenta
una estructura y función de interés, porque es uno de los 40 miembros de las
lipopeptidolactonas macrocíclicas, con 12 aminoácidos y motilidad 3-
hidroxipalmitolil, que interfiere con las enzimas encargadas de la síntesis de 1,3-β-
glucanos, los cuales son componentes esenciales de la pared celular de hongos
patógenos de importancia clínica, como C. albicans y Aspergillus sp.. Este espectro
de actividad es ideal, porque no existen enzimas similares en las células de los
mamíferos (Fujie et al., 2000), que puedan ser inhibidas durante los tratamientos
terapéuticos con este tipo de metabolitos. Otro agente inhibidor, que también es
11
selectivo y específico dentro de vías metabólicas de los hongos patógenos, es la
Khafrefungina, aislada de un micelio estéril perteneciente a un hongo endofítico.
Porque la Khafrefungina, inhibe la síntesis de esfingolípidos en etapas claves para
su consecución (Mandala et al., 1997).
Hasta el momento, se han relacionado algunos de los antibióticos con espectro de
actividad prospectiva frente a bacterias y hongos patógenos, pero existen dos
inhibidores de proteasa, los ácidos citónicos A y B, aislados de la fermentación en
estado sólido de hongo endofítico Cytonaema sp. que presentan un modo de acción
llamativo, por la inhibición del citomegalovirus humano (Strobel y Daisy, 2003).
De todos los compuestos mencionados, se hace necesario no solo evaluar su
actividad biológica sino la citotóxica o genotóxica (Nieminen et al., 2002; Watanabe
et al., 2001) debido a que, muchos de estos productos se emplearán como fármacos
para humanos. Es así como algunos de ellos están en fase exploratoria, en
laboratorio, para conocer su posible toxicidad (Hoshino et al., 2002), mientras que
otros se encuentran en las últimas etapas dentro del desarrollo de nuevos
productos, como el caso de los lipopéptidos FK 463 y WF 11899A, derivados cepas
de hongos filamentosos que fueron clasificadas dentro de dos grupos, los
Coleomycetes e Hiphomycetes (Hino et al., 2001). Cabe resaltar que, muchas de las
cepas productoras de metabolitos secundarios, con potencial prospectivo
encontradas en procesos de selección, no han sido clasificadas porque se
desconoce su género y especie.
Los antibióticos de la clase de los β-lactámicos, ya han sido comercializados y son
un ejemplo destacado para la biotecnología, por su producción industrial por
fermentación, desde hace 50 años, y porque actualmente estos antibióticos,
particularmente penicilinas y cefalosporinas representan en el mundo productos de
importancia biotecnológica con ventas mundiales de alrededor de US$ 15 billones,
aproximadamente el 65% del mercado total de antibióticos en el mundo (Elander,
2003). Muchos de estos antibióticos han sido modificados químicamente mediante
un proceso conocido como semisíntesis, desde 1974 (Demain, 1981).
Europa permanece como el área manufacturera dominante para penicilinas y
cefalosporinas. Sin embargo, debido a un creciente trabajo, costos de energía y de
12
materias primas, la mayor parte de industrias se están moviendo hacia el este, con
China, Corea e India como los países más favorecidos (Elander, 2003).
Además de los antibióticos, existen otro tipo de metabolitos fúngicos con actividad
prospectiva en medicina, pero con otros modos de acción diferentes, como los
mencionados a continuación.
Anticancerígenos, Antidiabéticos e Inmunosupresores.
De la revisión realizada por Strobel y Daisy (2003), se puede inferir que muchos de
los metabolitos fúngicos descubiertos son de interés para su aplicación en humanos,
especialmente algunos aislados de hongos endofíticos, porque se han encontrado,
entre otros, compuestos anticancerígenos, como el Paclitaxel (Figura 1) y algunos
de sus derivados, que representan el principal grupo de fármacos de este tipo,
producidos por estos microorganismos, llegando a ventas de billones de dólares a
nivel mundial.
Figura 1. Paclitaxel (Strobel y Daisy, 2003)
Paclitaxel, ha sido aislado de varios hongos endofíticos alrededor del mundo, p. Ej.
T. andreanae y nuevas especies como Seimatoantlerium tepuiense, en Venezuela
(Strobel et al., 1999; Strobel y Daisy, 2003).
Además de los beneficios mencionados, este compuesto ha sido empleado para
tratar otras enfermedades en tejidos humanos y también presenta actividad frente a
oomycetes fitopatógenos (Strobel y Daisy 2003).
13
Lee y colaboradores 1996, citado por Strobel y Daisy (2003), aislaron de una cepa
de Pestalotiopsis microspora, el ácido toreyanico una quinona dímerica citotóxica y
selectiva, empleada también como agente anticancerígeno.
En 1999, Zhang y col. encontraron, de una muestra de hongos nativos de selvas del
África (Kinshasa, República democrática del Congo), un metabolito
L-783,281(Figura 2) de Pseudomassaria sp., que actúa de manera similar a la
insulina y por ende, puede utilizarse en nuevas terapias para la diabetes, ya que a
diferencia de la insulina, este compuesto puede ser administrado oralmente porque
no es destruido en el tracto digestivo y además, ha demostrado una reducción de
los niveles de glucosa en la sangre, en ensayos realizados en ratones.
Otro descubrimiento sobresaliente para la medicina, ha sido la ciclosporina, aislada
de Tolypocladium inflatum (Borel y Kis, 1991, citado por Strobel y Daisy, 2003), así
como otros metabolitos fúngicos con modo de acción parecido (IBWF, 2005; Strobel
y Daisy, 2003), que actúan de forma similar a los inmunosupresivos empleados en
la actualidad en pacientes que han sido transplantados, para prevenir el rechazo a
los injertos. Lo cual, abre un amplio espectro, para el desarrollo de nuevos
fármacos, dentro de los que también se pueden contar algunos metabolitos que
presentan, actividad antitumoral (Strobel y Daisy, 2003), acción frente a la
hipercolesterolemia (IBWF, 2005), entre otros.
Figura 2. Estructura del antidiabético L-783,281 aislado de Pseudomassaria sp.
(Zhang et al., 1999. Science)
Metabolitos Fúngicos en Alimentación e Industria.
Los hongos filamentosos también han sido empleados para la elaboración de una
amplia variedad enzimas industriales (Pazouki et al., 2000), como proteasas, lipasas
14
y celulasas, entre otras, que aceleran diversos procesos industriales. Utilizándose
para la degradación de materiales (p. ej. papel, residuos vegetales, grasas),
obteniéndose productos y subproductos de interés. Beneficios que se derivan de la
versatilidad de los microorganismos para aprovechar los materiales y recursos
existentes en el ambiente.
Descubriéndose, un sinnúmero de enzimas de fuentes fúngicas; amilasas
encontradas en varios cultivos de Aspergillus sp. como la α-amilasa de A. oryzae
(Pedersen y Nielsen, 2000); pectinasas (Endo- y Exo- Poligalacturonasas PG) en A.
awamori (Blandino et al., 2002); Celulasas (β- glucosidasas, β−1-4 glucanasas)
producidas por varias cepas de Aspergillus, Phoma, Fusarium y Trichoderma (Atlas
y Bartha, 2002), proteasas y lipasas.
La mayoría de estos metabolitos fúngicos son empleados en la industria de
alimentos para la fabricación de bebidas alcohólicas, edulcorantes, jugos, quesos
madurados y en la producción detergentes, enzimas, entre otros.
Además, de las enzimas fúngicas, el ácido cítrico derivado de la fermentación de
Aspergillus niger (Demain, 1981), ha demostrado ser uno de los metabolitos más
importantes en varios alimentos, por su carácter acidulante y conservante.
Metabolitos Fúngicos en Fitoprotección. Muchos de los metabolitos fúngicos utilizados como agentes de biocontrol de
microorganismos fitopatógenos, presentan diferentes modos de acción específicos o
no específicos, y comprenden tanto agentes líticos, enzimas, compuestos volátiles y
otras sustancias tóxicas, siendo considerados como mecanismos de antibiosis,
según Fravel (1988). A continuación, se enumeran algunos de los metabolitos
fúngicos utilizados en fitoprotección, que han sido agrupados dentro de estos
fenómenos de antagonismo como antibióticos, sustancias volátiles y enzimas.
15
Antibióticos Desde los años 50´s, existen varios reportes (Fravel, 1988) que mencionan la
producción de metabolitos fúngicos para el control de ciertas enfermedades
ocasionadas por fitopatógenos. Como la gliotoxina (Figura 3) (Wright, 1956 citado
por Fravel, 1988) producida por Trichoderma viride (G. virens), para el control de
Pythium, patógeno que induce volcamiento en plantas.
En 1962, Barnett y col. (referido por Fravel, 1988) citan la producción in vitro de un
antibiótico que explica el antagonismo de G. roseum, frente a varios hongos,
relacionándolo como uno de los posibles mecanismos responsables, además del
hiperparasitimo. Otra correlación, pero entre la actividad in vitro y en invernadero,
fue realizada para la quetomina producida por Chaetomium globosum, viéndose una
inhibición del patógeno Venturia inequalis, en ambos modelos de estudio (Cullen y
Andrews, 1984 citado por Fravel, 1988).
Fravel (1988), considera algunas investigaciones realizadas durante la década de
los 80´s, donde se mencionan varios estudios que relacionan el empleo de
diferentes extractos de fermentación fúngica con la inhibición de algunos
fitopatógenos. En 1982 (Papavizas et al.), el extracto del medio de cultivo de
Trichoderma harzianum resultó en una inhibición de la pudrición blanca ocasionada
por S. cepivorum. En 1986, Ricard y Bollen, encontraron una sustancia producida
por Scytalidium sp. que inhibía a Poria carbonica. El año siguiente, Fravel et al.,
aislaron un metabolito del medio de cultivo de Talaromyces flavus, que destruía los
esclerocios de V. dahliae.
Figura 3. Estructura de la Gliotoxina
Wilson y Wisniewski (1994), también exponen una revisión de diversas
investigaciones, de donde se aislaron algunos metabolitos bioactivos de cultivos
16
líquidos, principalmente de especies de Trichoderma sp., varios compuestos de
estructura 6-pentil-α-pirona, siendo de este grupo, el 6-amil- α-pirona el más común
y potente in vitro e in vivo. Otras especies como T. lignorum y T. viride producen
trichodermina, que inhibe no solo a hongos filamentosos sino también a Candida
albicans.
Otros metabolitos fúngicos derivados de este género, son las koninginas, aisladas
de T. Koningi que produce Koningina A, y de T. harizianum que sintetiza tanto la
Koninginas A y B, así como dos nuevas estructuras butenolidas, estas últimas con
actividad frente a Gaeumannomyces graminis, un patógeno de cereales (Wilson y
Wisniewski, 1994).
Para favorecer el ingreso a la planta, después de la germinación del conidio,
muchos fitopatógenos desarrollan una estructura conocida como apresorio, la cual
también se ha visto afectada por numerosos metabolitos orgánicos, con diferentes
estructuras químicas y modos de acción, dentro de las que se cuentan 4
glisopreninas de carácter lipofílico (Figura 4A) de cultivos de Clonostachys rosea, 6
dímeros derivados de la antraquinona, las Neobulgaronas A-F, con mayor actividad
de la Neobulgarona D (Figura 4B), purificadas del micelio de Neobulgaria pura
(asomycete) (Eilbert et al., 2000). Así como, varios ácidos grasos de longitud de
cadena de 16,18 ó 20 átomos de C, hallados en extractos de micelio de hongos,
viéndose según Eilbert y colaboradores (1999; citado por Thines et al., 2004) una
mejor actividad inhibitoria frente a M. grisea, para aquellos que presentaban
configuración –cis en su instauración, como el ácido palmitoléico, el octadecenico y
el petroselínico (C18, cis-6) principalmente.
Otros compuestos con la misma afinidad por el sitio de acción son Scytalol D (Figura
4C), producido por el hongo anamórfico Scytalidium sp. (Thines et al. 1998) y una
cerulenina obtenida de un aislamiento originalmente llamado Cephalosporium
caerulens (Matsumae et al. 1963 y Sano et al. 1967 en Thines et al. 2004).
17
Figura 4. (A) Glisoprenina C, la más activa de las 4 glisopreninas de C. rosea,
(B) Neobulgarona D, (C) Scytalol D (Thines et al., 2004).
Algunos metabolitos también han sido aislados de hongos basidiomycetes, puesto
que según el IBWF (2005) la mitad de ellos producen antibióticos, como los
encontrados en el extracto de Resupinatos leightonii, dos sesquiterpenos, el 4-
germacradieno-2,6,12-triol y 1,6-farnesadieno-3,10,11-triol, asimismo inhibidores de
M. grisea (Eilbert et al., 2000; Thines et al., 2004).
Strobilurina A, ha sido un ejemplo destacado de metabolitos empleados como
moléculas modelo para el desarrollo de nuevos productos originalmente aislados de
fuentes fúngicas, en este caso de basidiomycetes. Porque según el IBWF (instituto
de investigación en Biotecnología y Drogas) junto con la Universidad de
Kaiserslautern (2005), de Alemania, esta es la clase más importante de fungicidas
utilizados en agricultura, descubiertas por Anke y colaboradores en 1977 de cultivos
líquidos de Strobilurus tenacellus un basidiomycete que crece en los conos de los
pinos.
En 1986 se produjeron los primeros derivados sintéticos que tenían estabilidad
frente a la radiación UV, porque aplicaciones del compuesto natural en campo
demostraron una relativa volatilidad e inestabilidad fotoquímica (Gullino et al. 2000),
además que existían dificultades para producir el compuesto a gran escala. De la
optimización química han resultado varios análogos, especialmente kresoxin-metil,
desarrollada por BASF y comercializada como Stroby®, Brio®, Discus® y Juwel®.
A
C
B
18
Las strobilurinas en el presente, están dentro de los fungicidas más vendidos
alrededor del mundo, siendo usados como protectantes de plantas frente a los más
importantes hongos fitopatógenos. Porque análogos químicos como kresoxin-metil,
azoxystrobina, metominostrobina y trifloxystrobina, tienen un amplio espectro de
actividad ya que, son inhibidores de la respiración fúngica controlando ascomycetes
y basidiomycetes, mildeos (polvoso y velloso) y royas (Gullino et al., 2000),
presentes en hojas, tallos, frutos y espigas principalmente de cebada, trigo, arroz.
Además de su uso para cultivos de cereales, estos fungicidas se emplean para en
otros cultivos para el control de Alternaria, Rhizoctonia solani, Pythium spp.,
Venturia, Botrytis cinerea y Sclerotinia, entre otras enfermedades (Gullino et al.,
2000).
Estos fungicidas del tipo strobilurina son un ejemplo del éxito en la aplicación
comercial de un producto a base de hongos ó de sus metabolitos, evidenciando que
las sustancias naturales pueden ser una importante fuente de agentes antifúngos,
que luego pueden ser desarrollados como productos o bien como moléculas modelo
para la síntesis de nuevos fungicidas selectivos (Gullino et al., 2000; Thines et al.,
2004). Este último autor, además menciona su importancia para el ambiente, porque
se asume que los compuestos naturales, siendo parte del ecosistema, pueden ser
biodegradables, compatibles y menos tóxicos.
Enzimas Las enzimas son otro tipo de metabolitos fúngicos que median el antagonismo
ejercido por agentes de biocontrol, lo que significa su uso potencial sobre
poblaciones de fitopatógenos y de insectos plaga. Debido a que, las enzimas
pueden degradar las paredes celulares y otros compuestos estructurales, o bien
actuar frente a algunos eventos relacionados con la patogénesis de organismo.
Fravel (1988) menciona dos investigaciones realizadas en 1982 y 1987, por Marois
y colaboradores y Lewis y Papavizas respectivamente, donde encontraron
compuestos que tenían una acción enzimática en fitopatógenos como Sclerotinia y
R. solani, derivados de Talaromyces flavus, Gliocladium virens y especies de
Trichoderma sp. Cabe resaltar, que la mayoría de enzimas de importancia
19
agroecológica, son las que producen varias especies de este género, como las
chitinasas y B-1,3-glucanasas reportadas por Elad y Kapat (1999) para Trichoderma
harzianum cepa T39.
Además de estas enzimas, De la Cruz y Llobell (1999) y Ait-Lahsen y colaboradores
(2001) indican la producción de B-1,6-glucanasas y proteasas corroborando la
producción de una gran variedad de estos metabolitos que lisan la pared celular, de
micelios y conidios en hongos fitopatógenos, por diferentes aislamientos de
Trichoderma.
Volátiles Como se mencionó anteriormente, T. harzianum es una fuente de antifúngicos con
diferentes modos de acción, como los metabolitos volátiles reportados por Claydon
et al. (1987, citado por Fravel, 1988) identificados como alquilpironas con acción
fungicida y mayoritariamente fungistática sobre patógenos como R. solani.
Otro microorganismo que produce sustancias volátiles protectoras, es Boletus
varigatus (Krupa y Nyland; 1972 por Fravel, 1988) dentro de las que se incluyen
alcoholes como etanol e isobutanol y ácido isobutírico.
Por lo general los principales compuestos volátiles, pertenecen al grupo de los
alcoholes y de los ácidos, como los compuestos reportados para el hongo endofítico
Muscodor albus, denominado “biofumigante” según Mercier y Jiménez en el 2004,
porque este micelio estéril aislado de una árbol de canela (Cinnnamomum
zeylanicum) en Centro América (Strobel et al., 2001) produce 28 compuestos que
inhiben y destruyen varias especies de hongos, oomycetes y bacterias (Mercier y
Jiménez, 2004).
Este tipo de metabolitos principalmente 2-metil-1-butanol y el ácido isobutírico,
pueden ser empleados para controlar algunas de la enfermedades que se presentan
en postcosecha durante el almacenamiento de los frutos, ocasionadas por Botrytis,
Colletotrichum, Geotrichum, Monilinia, Penicillium y Rhizopus, ya que no se requiere
el contacto del hongo con el fruto o el fitopatógenos para ver un efecto inhibitorio,
fungicida o fungistático de los volátiles (Mercier y jiménez, 2004).
20
1.1.2 Metodologías empleadas para la bioprospección de metabolitos con interés en fitoprotección. Para definir el perfil de un metabolito fúngico, es decir su modo de acción y
aplicabilidad, se hace necesario evaluar su actividad biológica en protocolos que
permitan cuantificar la sensibilidad del fitopatógeno respecto de los compuestos
antifúngicos, lo cual se puede lograr mediante ensayos in vitro e in vivo, en los que
se enfrenta el compuesto con el patógeno.
Bioprospección in vitro. Bauer y colaboradores (1966, citado por Hadacek y Greger, 2000) implementaron la
metodología in vitro, para la evaluación de la actividad antagónica de los metabolitos
frente a los hongos filamentosos, mediante protocolos de difusión del producto en
cajas de petri que contienen un medio de cultivo (p.ej. Agar Papa Dextrosa –PDA-,
Extracto de Malta), que queda mezclado con el compuesto en una proporción
definida. Para luego, colocar un disco (5-10 mm de diámetro) con desarrollo del
hongo fitopatógeno en el centro de la caja sobre la superficie del medio y evaluar la
inhibición del crecimiento radial respecto del control (Daoubi et al., 2004; Folman et
al., 2004). Una variación de esta metodología, es disponer una suspensión de
esporas (10-20µl) en el centro de la caja (Hadacek y Greger, 2000), o bien, colocar
la suspensión (0.5-1ml) distribuida sobre la superficie del medio de cultivo, donde se
colocan discos de papel filtro (3-5 mm de diámetro) impregnados con el metabolito,
para medir el halo de inhibición producido (zonas libres de micelio), después del
tiempo de incubación, tomando como parámetros de aceptación los valores dentro
del rango de 10-20 mm (Dardari et al., 2004; Hadacek y Greger, 2000; Santamarina
et al., 2002; Zhang et al., 2001).
Para evaluar estos compuestos difusibles, también se pueden colocar discos con
crecimiento del hongo (7mm) enfrentados con discos (5mm) inoculados con el
metabolito, conservando una distancia entre ellos de 2,0-2,5 cm, dentro de cajas de
petri con medio de cultivo (Chaurasia et al., 2005), para estimar igualmente el
crecimiento radial.
21
Además de estos ensayos de difusión en medio sólido, desde mediados de los 90´s
se desarrollaron protocolos de dilución (microdilución) en medio líquido, en placas
tipo ELISA de 96-pozos, protocolo ampliamente adoptado por autores como
Alemany, 2001; Dardari et al., 2004; Hadacek y Greger, 2000; Hjeljord et al., 2001;
López-García et al., 2002; Meepagala et al., 2003; Pohanka et al., 2004; Salah et al.,
2003; Slawecki et al., 2002; Thines et al., 2004; Wilson et al., 1997; Wedge et al.,
2000 y Zhang et al., 2001, entre otros, para evaluar la susceptibilidad de los
fitopatógenos, a este tipo de compuestos antifúngicos. El formato de placas de
microtitulación es un bioensayo cuantitavo (Roberts y Boyce, 1972 citado por
Hadacek y Greger, 2000) que permite evaluar el modo de acción, al valorar la
inhibición de la adhesión y germinación del conidio, mediante observación directa
por microscopia (Alemany, 2001; Hadacek y Greger, 2000; Hjeljord et al., 2001;
Slawecki et al., 2002), así como la interferencia en el crecimiento del hongo, por
determinación de la absorbancia (Wilson et al., 1997).
Junto con las metodologías mencionadas, existen otros protocolos que buscan
evaluar únicamente una variable, como la inhibición de la germinación, al disponer
en láminas de vidrio un volumen (µl) del compuesto y de la suspensión de esporas
del hongo, como lo realizado por Silva y colaboradores (2002) y por Walker y
colaboradores (2001), para evaluar extractos vegetales de Caryocar brasiliense
Camb. y metabolitos de Pseudomonas antimicrobica frente a Botrytis cinerea,
respectivamente.
Otro efecto in vitro que también puede ser cuantificado, es el carácter volátil de los
metabolitos, una variable que ha sido estimada para extractos vegetales y aceites
esenciales en microplacas, al sellar cada pozo con láminas de cera dental para
prevenir la contaminación cruzada (Wilson et al., 1997). Esta variable también
puede ser evaluada en cajas de petri, creando dos áreas con medio de cultivo al
retirar una tira de agar, del centro de la caja, con el fin de inocular a un lado del plato
un microorganismo productor de volátiles (p. Ej. M. albus) y en el otro lado, 7-10
días después, un disco de agar con el hongo fitopatógeno, para ver el efecto sobre
su crecimiento y desarrollo (Mercier y Jiménez, 2004; Strobel et al., 2001).
22
De todos los ensayos de antagonismo, se puede inferir que la metodología en
microplacas ofrece por una parte, un potencial para una alta eficiencia en el análisis
de 10,000 o más compuestos por semana ya que, se reduce la cantidad de
metabolito y de inóculo necesarias y por otro lado, permite una observación directa
para detectar anomalías morfológicas (Hadacek y Greger, 2000), como inhibición en
la germinación y daño de las hifas, entre otros.
Bioprospección in vivo (in planta). En los ensayos in vivo principalmente se busca ver el desarrollo de los signos y
síntomas del fitopatógeno estimado como incidencia y severidad de la enfermedad,
evaluando también la inhibición de la germinación o del crecimiento del patógeno,
expresado como la supresión de la enfermedad en la planta.
Conduciendo en muchas ocasiones, a que los parámetros evaluados in vitro puedan
ser o no correlacionados con el biocontrol in vivo, en condiciones similares a la
naturales (Fravel, 1988). Por ejemplo, este autor cita un ensayo realizado por
Richard y Bollen (1986), donde se vio la inhibición de un fitopatógeno frente a una
sustancia microbiana, tanto en ensayos in vitro en agar como in planta, sobre trozos
de madera.
Elad y Kapat, 1999; Fravel, 1988; O´Neill et al., 1997 y Mercier y Jiménez, 2004,
entre otros autores, reportan la aplicación de los extractos fúngicos, sobre hojas o
segmentos de éstas, en tallos, en frutos, o en suelo estéril y en combinación o no
del fitopatógeno para observar la supresión del microorganismo o de estructuras de
resistencia como esclerocios (Fravel, 1988), lo que resulta en la disminución de la
enfermedad. De Meyer y colaboradores (1998) indican que al emplear la totalidad
de la planta, también se puede observar la inhibición de los fitopatógenos, porque
dependiendo del sitio de inoculación se pueden inducir respuestas de defensa en el
huésped.
23
1.1.2.1 Metabolismo secundario: Biosíntesis de productos naturales con interés en fitoprotección.
Brakhage y colaboradores (2004), estudiaron algunos mecanismos que regulan la
biosíntesis de penicilina en hongos filamentosos, encontrando que la producción de
este metabolito secundario, no es esencial para la directa supervivencia del
organismo productor, indicando que los genes para la biosíntesis son controlados
por una red compleja de regulación; por el pH del ambiente, la fuente de carbono,
nitrógeno, aminoácidos, entre otros elementos, coincidiendo con Calvo y
colaboradores (2002), en que varios aspectos internos y externos, como factores
ambientales y genéticos pueden influenciar la producción de metabolitos
secundarios. Incluyendo en algunos casos, reacciones muy alejadas del
metabolismo energético (Doran, 1998), ya que muchos de estos compuestos no son
esenciales ni para el crecimiento ni como intermediarios del metabolismo básico del
microorganismo, entendiéndose que probablemente juegan algún otro rol en la vida
de los hongos (Turner 1971; Demain, 1981; Guarro et al., 1999).
Cabe resaltar que toda la producción de metabolitos, está enmarcada dentro del
comportamiento cinético del microorganismo, en este caso de los hongos
filamentosos, los cuales experimentan una tendencia diferente que se caracteriza
por tener una primera fase llamada trofofase o de crecimiento, en la cual se
sintetizan los metabolitos primarios y la idiofase donde se producen los metabolitos
secundarios (Demain, 1981; Poutou, 2002). En la trofofase o fase de crecimiento, se
le proporcionan condiciones apropiadas al hongo filamentoso para que crezca de
manera eficaz y es donde el microorganismo produce metabolitos relacionados con
su crecimiento. Para la fase siguiente, la Idiofase, se producen metabolitos
secundarios, esta producción puede no derivarse del sustrato primario de
crecimiento, sino a partir de un producto que él mismo formó, a partir de esa fuente
primaria (Demain, 1981; Poutou, 2002). Sirviendo el metabolismo primario, en las
vías biosintéticas de antibióticos, como un proveedor de precursores y cofactores
para el metabolismo secundario (Gunnarsson et al., 2004) con la consecuente
producción de antifúngicos.
24
En estudios con biorreactores realizados por Saha y colaboradores, 2004, se ha
demostrado que la producción de este tipo de metabolitos, también depende
fuertemente de la escala de operación, donde existe una relación definitiva entre la
concentración de oxígeno disuelto, pH del medio, empleo de glucosa, diferenciación
celular y producción. Ratificando que todas las condiciones del cultivo y de la
fermentación, soportan e influencian la síntesis de metabolitos secundarios (Higgs et
al., 2001).
La morfología fúngica, en algunas ocasiones, es otro parámetro clave dentro de la
producción industrial, porque puede variar durante el proceso de fermentación, ya
que también está influenciada por aspectos como la velocidad de agitación, la tasa
de crecimiento, el oxígeno disuelto, el número de esporas o conidias por litro de
medio de fermentación, aspectos de importancia que deben ser considerados
cuando se quieren altos rendimientos en el proceso (Pazouki et al., 2000).
Además de los diferentes parámetros y condiciones de fermentación, mencionados
anteriormente, cabe resaltar que al interior de las células es donde se evidencia el
impacto de este tipo de factores, lo que desemboca en la consecución del producto
de interés y en el desarrollo de vías metabólicas para tal fin. Una de las rutas
metabólicas de donde se derivan los metabolitos secundarios, es la vía del
shikimato o ácido shikímico (Demain, 1981), porque según Adachi y colaboradores
(2003), la producción y vía salvaje de shikimato, es favorable para la biosíntesis de
muchos antibióticos, herbicidas y aminoácidos aromáticos, porque en esta vía se
sintetiza el corismato, un precursor común de muchos metabolitos aromáticos, tanto
primarios como secundarios (Herrmann y Weaver, 1999; Stryer, 1995).
25
1.2 IMPORTANCIA DEL TOMATE (Lycopersicon esculentum Mill.). El Tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) es la principal hortaliza a nivel mundial,
se cultiva en cerca de casi 4,0 millones de hectáreas, con más de 100 millones de
toneladas promedio de producción (FAO 2005). Siendo países como China y
Estados Unidos de América, los principales productores con 30 y 12 millones de
toneladas, respectivamente.
En Colombia, según datos emitidos por la FAO (2005), el cultivo de tomate ocupa un
lugar representativo dentro de los productos básicos del país, en cuanto a
producción e importancia alimenticia. La producción promedio es de 382,438
toneladas, durante los últimos seis años (1999-2004), con una superficie cultivada
promedio para el mismo período de 16.200 hectáreas, siendo para él último año
(2004) de 15.000 Ha. En cuanto a rendimiento, los datos suministrados entre 1999-
2003 arrojan un valor medio de 23.502 kg/Ha (2,3 Ton/Ha). Variables que presentan
crecimientos para los últimos dos años. Pero, cuyos resultados son sustancialmente
inferiores, comparados con países como Brasil y Chile, primer y segundo productor
suramericano, que presentan datos de producción de 3,4 y 1,3 millones de
toneladas, frente a las 370,000 toneladas nacionales, lo que significa una diferencia
de 3 millones (Ton), respecto de Brasil y de 930,000 toneladas menos frente a Chile.
Estos datos son un reflejo de la brecha tecnológica existente, que traduce en una
menor productividad. Porque, aunque existe una baja diferencia de área cultivada p.
Ej., entre Colombia y Chile, con 15,000 y 20,000 Ha, este último país, triplica la
producción deduciéndose que realiza un mejor aprovechamiento de los recursos
junto con la introducción de programas de cultivo sostenible.
Cabe resaltar que el cultivo de esta hortaliza presenta una gran variedad de
enfermedades, que minan su producción, de las cuales Colombia no es una
excepción.
1.2.1 Principales Patologías del Tomate. Algunos de los principales problemas fitosanitarios que enfrenta el cultivo de tomate
son causados por; insectos como mosca blanca, minadores de hoja, Spodoptera sp;
26
nemátodos; virus, como el mosaico del tomate; bacteriosis, Pseudomonas syringae,
y hongos filamentosos, dentro de los que se consideran, al moho gris (Botrytis
cinerea), mildeo polvoso y velloso, moho blanco (S. sclerotiorum), Alternaria sp.,
Fusarium oxysporum f sp.lycopersici y Verticillium dahliae (Infoagro, 2004), como los
más representativos, por su incidencia sobre todas las partes de la planta lo cual,
conduce a la reducción en el rendimiento porque se limita el desarrollo de la planta,
entre otros efectos. Estas enfermedades, concuerdan con lo reportado Bareño
(citado por Moreno, 2003) quien relaciona la presencia en el país, de algunos de
estos problemas fitosanitarios del ambiente foliar, tanto en época seca como
húmeda. Para el primer período algunos son causados por la mosca blanca, el
pasador de fruto, el gusano cogollero y Oidium sp., y en tiempo húmedo son
Phytophthora infestans, Alternaria solani, Fulvia fulva, bacteriosis, mildeo velloso y
Botrytis cinerea los factores restrictivos.
Por estas y otras patologías microbianas que afectan al tomate, se ha creado la
necesidad de buscar e implementar nuevas alternativas de control que aumenten la
productividad del cultivo, además de minimizar el uso indiscriminado de productos
químicos (Infoagro, 2004) a los que se expone esta hortaliza, surgiendo nuevas
estrategias que pueden ser implementadas dentro de un Manejo Integrado de las
Plagas (MIP) que afectan al tomate. Diseñadas también, en respuesta a la
resistencia que adquieren algunos de los patógenos. El Laboratorio de Control
Biológico, de Corpoica C.I, Tibaitatá, ha encaminado algunos de sus proyectos de
investigación, en la búsqueda de alternativas de manejo, en pre y postcosecha del
tomate, derivadas de fuentes microbianas que disminuyan algunos problemas de
importancia hortícola, como los ocasionados por Botrytis cinerea un fitopatógeno
frecuente del ambiente de invernadero.
1.3. MOHO GRIS: Botrytis cinerea. 1.3.1 Generalidades del Agente Etiológico del Moho Gris. Botrytis cinerea es un hongo polífago que causa serios daños y pérdidas en un
amplio rango de cultivos (Meyer et al., 2001) en todo el mundo (Agrios, 1988),
27
atacando prácticamente plantas de todas las especies hortícolas, frutícolas y
florícolas (Kerssies, 1993; De la Isla, 1994; Malolepsza, 2004), durante la
producción y el almacenamiento (Malolepsza, 2004) en la pre- y poscosecha
(Morandi et al., 2000, 2001).
El moho gris causado por Botrytis cinerea es probablemente una de las
enfermedades de vegetales, ornamentales, frutales y cultivos de campo, más
comunes y ampliamente distribuidas a lo largo del mundo (Ben-Shalom et al., 2003;
Barka et al. 2002; Elad, 1996), generando un impacto negativo con repercusiones
económicas, tanto por su distribución como por la capacidad de infectar las hojas,
los tallos, las flores y los frutos (O´Neill et al., 1997). Ocasionando la enfermedad
conocida como Moho o podredumbre gris, que durante epidemias severas puede
destruir la totalidad del follaje (Elad et al., 1999), porque el patógeno ocasiona una
propagación de lesiones necróticas en hojas (Morandi et al., 2001).
B. cinerea se disemina por el aire, se comporta como saprófito mientras encuentra
las condiciones favorables para infectar el hospedero y convertirse en patógeno
(Avila, 1993). Esta habilidad de desarrollarse como saprófito es esencial pues le
permite incrementar su inóculo sin recursos de sostenimiento derivados de la
patogénesis de las células del huésped (Blakeman, 1993 citado por Moreno, 2003).
1.3.2 Características Microscópicas y Macroscópicas de Botrytis cinerea. Botrytis cinerea Pers ex Fr, es el hongo más importante de las especies de Botrytis
(Daoubi et al., 2004), siendo un hongo Deuteromycete (Hyphomycete) (Tabla1), es
el estado imperfecto de Botryotinia fuckeliana (su teleomorfo) (De Meyer et al.,
1998) (Ellis y Waller, 1974 citado por Kerssies, 1993).
Microscópicamente B. cinerea, presenta los extremos de las hifas ramificados, al
comienzo de su formación se ven hialinas, con el tiempo se tornan pardas o negras
(Piñeros et al., 1998). La célula terminal de cada ramificación tiene forma de ampolla
a partir de la cual se forma en un dentículo una conidia hialina, esférica o elipsoide y
ligeramente pigmentada. Poseen doble membrana (Jarvis, 1981; citado por Millán,
28
1996) y su tamaño es aproximadamente de 10 x 8.5 µm (Pezet y Pont, 1990; citado
por Tenberg, 2004).
Tabla1. Taxonomía de Botrytis cinerea
Botrytis cinerea División Mycota
Clase Hiphomycetos
Orden Moniliales
Familia Botrytidiaceae
Género Botrytis
Especie Botrytis cinerea
En cuanto al desarrollo macroscópico, el hongo presenta colonias de crecimiento
moderado de color blanco o gris dependiendo del medio empleado, éstas pueden
ser de tipo micelial o esclerocial. Las colonias de tipo micelial son de crecimiento
rápido, abundantes, algodonosas y de color pardo, mientras que las de tipo
esclerocial son de crecimiento lento, de micelio escaso, inicialmente de color blanco
y a medida que van envejeciendo se tornan gris pardo con abundantes esclerocios
de color negro distribuidos irregularmente en el medio (Avila, 1993; Millán, 1996).
1.3.3 Epidemiología y Ciclo de Vida del Fitopatógeno B. cinerea. Diseminación del Patógeno. El agente causal del Moho gris, puede esporular profusamente en tejidos necróticos
como hojas senescentes y partes de la flor, en el cultivo de invernadero. Los
conidios producidos en estos son el mayor inóculo para otros brotes, debido a que
se distribuyen por el aire dentro del ambiente de invernadero (Elad et al., 2004). La
temperatura óptima de infección se encuentra entre 10 y 20°C, pero la infección
puede ocurrir incluso por debajo de los 2°C y por arriba de los 25°C (Elad, 1996;
Elad et al., 1999).
29
Botrytis cinerea puede entrar en hojas senescentes como saprofito (Blakeman, 1980
citado por Kerssies, 1993) y puede producir un gran número de conidios en hojas
colonizadas (Jarvis, 1980 citado por Kerssies, 1993), las cuales son dispersadas por
corrientes de aire, gotas de agua o insectos.
Conidias, ascosporas, fragmentos de micelio y esclerocios son importantes para la
dispersión (Jarvis, 1980 citado por Kerssies, 1993), aunque solamente las conidias,
promotores de infección o primera fuente de inóculo (Doss, 1999), pueden propagar
la enfermedad en invernaderos.
La liberación de conidias ocurre principalmente por cambios rápidos de humedad
relativa (Winspear et al., 1970; Jarvis, 1980; Van Holsteijn, 1985 citado por Kerssies,
1993), debido a que el fitopatógeno necesita alta humedad relativa (Diánez et al.,
2002) para germinar, colonizar y esporular en los tejidos de las hojas muertas
(Blakeman, 1980 citado por Kerssies, 1993) y de las sanas.
Ciclo de Infección de Botrytis cinerea. La infección tiene lugar a través de heridas, de tejido muerto o en decaimiento y por
penetración directa (Kerssies, 1993; Agrios, 1988; Elad et al., 2004).
Mientras que comienza la penetración B. cinerea, por ser un necrótrofo, requiere
nutrientes exógenos en muchas circunstancias durante la germinación de sus
esporas y durante el crecimiento del micelio en la superficie de la planta, antes de la
infección (Elad, 1996; Elad et al., 1999) y colonización del tejido.
Los hongos patógenos han elaborado estrategias para tener acceso a los tejidos de
la planta (Dean, 1997), donde los eventos iniciales comprenden la adhesión del
conidio a la cutícula, la germinación y el crecimiento del tubo germinal sobre la
superficie de la planta, seguido del desarrollo y maduración del apresorio para la
penetración y posterior crecimiento y esporulación del fitopatógeno en el huésped
(Mendgen et al., 1996; Thines et al., 2004). Para la entrada de B. cinerea, parásito
facultativo de plantas, al hospedero, ocurre una interacción de los conidios con la
superficie de la planta, conocida como adhesión de los conidios y tubos germinales,
que ocurre en dos etapas diferentes. La primera etapa ocurre inmediatamente
después de la hidratación de la conidia y está caracterizada por fuerzas adhesivas
30
débiles que incluyen interacciones hidrofóbicas. La segunda etapa, retrasa la
adhesión, ocurre después que la conidia viable ha sido incubada por varias horas
bajo condiciones que promueven la germinación. En este tiempo o estado, los tubos
germinados se unen fuertemente tanto a sustratos hidrofóbicos e hidrofílicos (Doss
et al., 1995), a través de la secreción de una matriz extracelular (Doss et al., 1993;
1995 citado por Doss 1999).
En el ciclo de infección de B. cinerea, durante la etapa de introducción al huésped,
la hifa de penetración, acumula componentes del citoesqueleto en la punta de la
misma y secreta una variedad de enzimas degradadoras de modo muy regulado
para penetrar la cutícula de la pared celular de la planta (Mendgen et al., 1996).
Las principales enzimas que segrega B. cinerea, encargadas de la ruptura de las
barreras físicas, son: exo- y endo poligalacturonidasas (PG), pectin metil esterasa
(PME), pectin liasa (PL), quitinasa, β-1.3-glucanasa, cutinasa y celulasa (Doss,
1999; Elad y Kapat, 1999; Elad, 2000; Elad et al., 2004).
Además, de las enzimas reportadas, Doss (1999) ha realizado estudios que revelan
que B. cinerea, produce una matriz extracelular (ECM por sus siglas en inglés),
implicada en la adhesión de la conidia germinada, a la superficie de la planta.
Kamoen (1992, citado por Doss, 1999), ha sugerido posibles funciones de esta
matriz extracelular entre las que se cuentan, el tropismo por el sitio de infección,
evitar la desecación de los conidios germinados y proporcionar una matriz donde las
toxinas o enzimas fúngicas requeridas para el proceso de infección puedan estar
resguardadas.
Una vez que la espora ha germinado, sigue un período de crecimiento durante el
cual el tubo germinal se extiende sobre la superficie de la hoja, buscando un sitio
favorable para penetrar, proceso que está precedido por modificaciones de las hifas
(Dickinson et al., 1987). En el sitio apropiado, la elongación polar del tubo
germinativo cesa y la punta de la hifa se une a la superficie, hinchándose para
formar un apresorio, estructura única de infección organizada (Dickinson et al.,
1987; Dean, 1997).
El apresorio puede tener paredes melanizadas y desarrollar una alta presión de
turgencia para soportar el proceso de penetración (Mendgen et al., 1996), además
31
de aumentar el área de contacto y de fijación entre el hongo y la superficie del
hospedero (Dickinson et al., 1987) de tal modo que, la hifa infectiva tenga fuerza
para penetrar (De la Isla, 1994) a través, de las capas de cera, cutina, pectina y una
red de fibrillas de celulosa impregnadas de otros polímeros de pared, antes de
entrar en contacto con el protoplasma de la planta (Avila de Leal, 1993).
Después de la formación y maduración del apresorio, ocurre la penetración en el
tejido del huésped, se inicia la colonización y crecimiento in planta (Thines et al.,
2004), donde las células infectadas colapsan y se desintegran (Agrios, 1988).
Con esta pudrición y daño del tejido, la epidermis se agrieta y el hongo fructifica
abundantemente (Agrios, 1988), los conidióforos emergen sobre la superficie de la
planta y se observa esporulación (Thines et al., 2004).
Los tejidos pueden volverse arrugados y secos, apareciendo en algunos casos
esclerocios sobre la superficie o hundidos dentro del mismo (Agrios, 1988).
En este desarrollo del patógeno, se destruyen las células del hospedero tan
rápidamente que no pueda desencadenarse respuesta eficaz, lo que ocurre con los
patógenos necrotróficos (Dickinson et al., 1987).
1.4 CONTROL DEL MOHO GRIS (Botrytis cinerea).
1.4.1 Control Químico.
Tradicionalmente, el control de B. cinerea se ha realizado a través de aspersiones
químicas, con varias familias de fungicidas químicos, que han sido parcialmente
exitosas. Se estima que el mercado de productos anti-Botyrtis en los último años, se
encuentra alrededor de los US$ 15-25 millones (Elad et al., 2004). Pero, existe el
riesgo de la aparición y el establecimiento de cepas resistentes de Botrytis sp. a
esos químicos (Barka et al., 2002; Leroux, 2004; Rosslenbroich y Stuebler, 2000).
Los grupos químicos más utilizados, para el control de B. cinerea, tradicionalmente
han sido dicarboximidas, benzimidazoles y Diethofencarb (Rosslenbroich y Stuebler,
2000). Sin embargo, las estrategias para controlar el hongo con fungicidas clásicos
32
o comúnmente usados, puede producir efectos secundarios, como una notable
contaminación ambiental y el desarrollo de cepas del hongo multi-resistentes
(Daoubi et al., 2004; Leroux, 2004), siendo poco efectivos (Malolepsza, 2004).
Sólo el recurso de fungicidas químicos antes de la fase logarítmica de la epidemia
ha ofrecido un control satisfactorio de la enfermedad. Pero como resultado, las
cepas que son resistentes a varios fungicidas sistémicos se han desarrollado
rápidamente (Elad et al., 1999).
Desde la mitad de la década de los 90´s, nuevos compuestos con excelente
actividad frente a B. cinerea han sido comercializados (Daoubi et al., 2004),
productos botryticidas de tres diferentes grupos químicos y con diferentes modos de
acción a los usados habitualmente, tales como las Anilinopirimidinas, Fenilpirroles e
Hidroxianilidas (Rosslenbroich y Stuebler, 2000).
Las anilopirimidinas están representadas por tres compuestos principalmente;
pirimetanil, mepanipirim y ciprodinil, los cuales inhiben la elongación del tubo
germinal y el crecimiento inicial del micelio in vivo, así como la excreción de
hidrolasas asociadas a la patogénesis del hongo (Rosslenbroich y Stuebler, 2000).
El fludioxonil pertenece a la clase química de los fenilpirroles, derivados del
antibiótico pirrolnitrina, producido por varias especies de Pseudomonas (Gullino et
al., 2000), el fludioxonil inhibe la germinación, elongación y crecimiento del micelio
(Rosslenbroich y Stuebler, 2000) se ha observado resistencia cruzada hacia estas
dos clases químicas (Gullino et al., 2000). Por último, las Hidroxianilidas
(fenhexamida), a altas concentraciones inhiben la germinación porque interfiere con
dos sitios en la biosíntesis de ergosterol (Rosslenbroich y Stuebler, 2000).
Varios de botrycidas se encuentran disponibles en el mercado y se han clasificado
de acuerdo a su modo de acción en cinco categorías conocidas; 1) fungicidas que
afectan la respiración del hongo, 2) tóxicos anti-microtúbulos, 3) compuestos que
afectan la osmorregulación, 4) fungicidas cuya toxicidad es revertida por
aminoácidos, y 5) los inhibidores de la biosíntesis de esterol (Leroux, 2004).
33
1.4.2 Metabolitos fúngicos reportados para el control de B. cinerea.
Algunos de los metabolitos reportados para el control de Botrytis, se han derivado
de procesos de bioprospección de hongos filamentosos (Gullino et al., 2000; Thines
et al., 2004). Encontrándose algunos compuestos que pueden inhibir la germinación
de conidios, como las Tricozianinas A1 y B1 y la gliotoxina de especies de
Trichoderma (Di Pietro et al., 1993; Schirmböck et al., 1994 citados por Elad, 1996),
las eniatinas derivadas de Fusarium (Pohanka et al., 2004) y lipopéptidos como la
cryptocandina, aislada del hongo endofítico Cryptosporiopsis cf. quercina (Strobel et
al., 1999), entre otros metabolitos descubiertos.
También se han utilizado enzimas que interfieren con el desarrollo del patógeno
porque degradan componentes estructurales de la pared celular del hongo, como
las quitinasas, exo- y endoglucanasas y proteasas principalmente producidas por T.
harzianum (Ait-Lahsen et al., 2001; Elad y Kapat, 1999). Además de lisar polímeros
estructurales, Elad en el 2000, encontró una cisteín-proteasa derivada de T.
harzianum, que interfiere con el proceso de patogenicidad, ya que inhibe las exo- y
endopoligalacturonasas producidas por B. cinerea.
1.4.3 Características de los metabolitos fúngicos utilizados para fitoprotección. Un cada vez más riguroso requerimiento para los nuevos fungicidas es su
biodegradabilidad en situaciones naturales. Un segundo parámetro importante es la
selectividad del modo de acción. Idealmente, un fungicida debe prevenir o curar
infecciones causadas por hongos patógenos de plantas sin herir especies neutrales
o benignas, como hongos saprofíticos del suelo o microrrizas asociadas, y por
supuesto sin toxicidad frente a otros organismos (Thines et al., 2004). Estos efectos
diferentes del blanco, pueden ser reducidos por bioprospección o screening de
fungicidas que no inhiban el crecimiento hifal vegetativo pero que si interfieran
específicamente con eventos implicados en el desarrollo de la patogénesis, como
germinación de esporas, formación de estructuras de penetración o esporulación
(Thines et al., 2004).
34
Por tanto, si se aplican metabolitos que interfieran con las etapas de patogénesis,
en el ciclo de infección, antes del establecimiento y colonización de patógeno en el
interior del huésped, es menos probable que los hongos desarrollen resistencia
frente a estas sustancias, porque dichos compuestos controlan el hongo al inicio de
su ciclo de vida sin interferir con el crecimiento vegetativo, lo que sería una posible
ventaja de este tipo de compuestos anti-penetrantes. Una desventaja sería que
estos compuestos pueden ser solamente protectivos y no curativos, porque las
sustancias atacan las etapas o blancos de pre- y penetración (Thines et al., 2004).
Sea cual sea el tipo de metabolito fúngico elegido para su aplicación en
fitoprotección, se deben tener en cuenta, además de los parámetros mencionados
anteriormente, algunos factores cada vez más importantes en la selección y
desarrollo de fungicidas lo cuales son, baja toxicidad para humanos como para la
flora y fauna, mínimo impacto medioambiental, bajos residuos en alimentos y
compatibilidad con los programas de manejo integrado de plagas (MIP) (Knight et
al., 1997). Lo que haría del uso de microorganismos o en especial de sus
excreciones una alternativa atractiva sola o como un suplemento de los plaguicidas
para prevenir y manejar fitopatologías, sin el impacto negativo del control químico,
facilitando una agricultura sostenible (Wang et al., 1999).
35
2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 2.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA. En el sector agropecuario, el rendimiento y la productividad de un cultivo se ven
influenciados por muchos factores, entre ellos el correcto manejo de los hongos
fitopatógenos que lo afectan. Dentro de este grupo se encuentra el hongo Botrytis
cinerea, un patógeno de alto impacto, no solo por la enfermedad que desencadena
en una amplia gama de cultivos durante la pre- y postcosecha, sino porque la
mayoría de las veces, el moho gris (B. cinerea) ha sido controlado con productos
químicos, ocasionando además del deterioro ambiental, problemas de salud para
quienes aplican y consumen los productos tratados con ellos, junto con el desarrollo
de resistencia en el fitopatógeno, resultando en una pérdida de la rentabilidad de los
cultivos.
Esta situación plantea la necesidad de buscar otro tipo de estrategias de control del
moho gris, mediante programas de fitoprotección, en los que se empleen
metabolitos microbianos como una alternativa natural, derivada del amplio
reservorio de compuestos bioactivos producidos por los hongos filamentosos
nativos, que pueda ser aplicada de manera preventiva, conduciendo a un manejo
integrado del fitopatógeno Botrytis cinerea; esta alternativa es ambientalmente
amigable y puede generar mayores dividendos económicos para los agricultores.
2.2 JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN.
La biodiversidad encontrada dentro de la microbiota fúngica, ha resultado en el
descubrimiento de un gran número de productos bioactivos con aplicación en
diferentes campos. Para la fitoprotección de cultivos agrícolas, se han encontrado
metabolitos con potencial biocontrolador, que pueden inhibir el crecimiento o
36
interferir con eventos relacionados con la patogénesis de fitopatógenos como
Botrytis cinerea, contribuyendo así con la disminución de la resistencia a los
fungicidas químicos empleados comúnmente y minimizando los efectos negativos
de ambos factores (patógeno y productos químicos), sobre las cosechas.
Estos beneficios potenciales pueden ser descubiertos mediante procesos de
bioprospección de hongos filamentosos y de los metabolitos producidos por estos, al
explorar el amplio reservorio de microorganismos de diferentes zonas Colombianas,
planteándose el reto de estudiar los productos naturales derivados, para seleccionar
aquellos que sirven de base para el desarrollo de nuevos fungicidas, requeridos en
el campo agroindustrial.
En trabajos previos a nivel internacional se ha demostrado que las aplicaciones de
productos bioactivos que pueden ejercer un control de fitopatógenos, presentan
mecanismos de acción potencialmente selectivos, haciendo elegible su uso por su
especificidad contra patógenos de alto riesgo, como Botrytis cinerea, el agente
causal del moho gris en diferentes cultivos de importancia económica durante la
producción y el almacenamiento.
Todo lo anterior significa un avance dentro de la necesidad de implementar nuevas
estrategias de control de este patógeno a nivel nacional, ya que ha generado
grandes pérdidas debido a su fácil dispersión y rápida acción, además de la
resistencia que ha adquirido frente a varios productos actualmente disponibles. Por
tanto, el Laboratorio de Control Biológico de Corpoica ha iniciado investigaciones
enfocadas en el desarrollo de procesos de screening y producción de metabolitos
secundarios para ser incorporados en programas de manejo integrado de
fitopatologías de importancia económica
37
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL.
• Seleccionar extractos fúngicos extracelulares (EFE), por su potencial efecto
en el control de Botrytis cinerea.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
• Estandarizar una técnica sencilla y eficiente para la evaluación preliminar de
extractos fúngicos extracelulares (EFE) con actividad sobre la germinación
del hongo Botrytis cinerea.
• Seleccionar extractos fúngicos extracelulares (EFE) por su habilidad para
inhibir la germinación de Botrytis cinerea in vitro.
• Evaluar in planta los extractos fúngicos seleccionados, por su efecto de
control directo de Botrytis cinerea.
38
4. MATERIALES Y MÉTODOS.
Para el desarrollo de los objetivos propuestos, el trabajo se llevó a cabo en las
instalaciones del Laboratorio de Control Biológico del Programa de Manejo
Integrado de Plagas, ubicado en el Centro de Investigaciones Tibaitatá de Corpoica
(Mosquera, Cundinamarca).
4.1 PRODUCCIÓN DE LOS EXTRACTOS FÚNGICOS EXTRACELULARES (EFE). 4.1.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS DE CULTIVO. Cepas nativas de hongos filamentosos.
Los microorganismos cuyos extractos se evaluaron en este trabajo corresponden a
cepas de hongos filamentosos, que fueron originalmente aisladas de muestras de
suelo de tres zonas ambientales homogéneas del noroccidente de Leticia,
Amazonas por Cabrera (2000). Dado que estas cepas se encontraban conservadas
tanto en tubos de agar Czapeck-Dox (CD) inclinado como en viales con aceite,
fueron reactivadas. A las primeras se les adicionó medio Saboureaud líquido
acidificado (pH 4.5) y se llevaron a incubación a 26°C +/- 2°C, en oscuridad y sin
agitación hasta observar crecimiento en el tubo. Posteriormente se sembraron en
agar Saboureaud (pH 4.5) y se llevó a incubación bajo las mismas condiciones.
Los hongos conservados en aceite, fueron inoculados en agar Saboureaud
acidificado (pH 4.5), después de descartar el aceite de los viales. Estas cajas se
llevaron a incubación con una temperatura de 26°C +/ 2°C, durante 5-7 días en
oscuridad, hasta observar el desarrollo de la colonia.
Colección de trabajo de los Hongos.
Después de reactivar las cepas y de verificar su viabilidad y pureza las cepas fueron
conservadas en tubos con agar inclinado y mediante crioconservación a -70°C.
39
Para las primeras, se prepararon tubos con agar inclinado Saboureaud acidificado
(pH 4.5) (dos por cepa) que se inocularon por estría, después del período de
incubación (25°C, por 5-7 días en oscuridad) se conservaron en refrigeración.
Para la crioconservación de los hongos, se siguieron los procedimientos operativos
estándar definidos por el Banco de germoplasma de microorganismos con interés
en control biológico que maneja Corpoica, para lo cual en tubos eppendorff se
adicionaron de 4 a 5 cuadros de agar (0.5 - 0.6 cm2 aproximadamente) previamente
crecidos con el microorganismo, luego se adicionó una solución criopreservante (1
ml) de glicerol al 10% p/v y peptona 0.1% p/v. Los tubos, 8 para cada cepa, se
rotularon y se colocaron en un ultracongelador a -70°C.
Obtención de los Extractos Microbianos.
Para cada uno de los hongos reactivados, se tomó un vial de la colección de trabajo
crioconservada previamente y se descongeló hasta alcanzar 37°C (procedimiento
operativo estándar; Banco de germoplasma de microorganismos con interés en
control biológico, Corpoica). Posteriormente, se tomó un cuadro de agar y se colocó
sobre la superficie de una caja con agar Saboureaud acidificado (pH 4.5). Las cajas
con cada una de las cepas se llevaron a incubación a una temperatura de 26°C +/-
2°C durante 8 días en oscuridad.
Una vez se verificó el desarrollo óptimo de los hongos filamentosos, se preparó el
inóculo para cada microorganismo en Tween 80 al 0.1% removiendo con ayuda de
un asa el hongo crecido en la caja de Petri. La concentración de conidios se
determinó mediante recuento en un hemocitómetro, con el fin de ajustar el inóculo a
una concentración de 1 x 106 propágulos/ ml (Elad y Kapat, 1999).
Para aquellas cepas que presentaron micelio estéril o que no exhibieron producción
de propágulos durante el período de incubación (8 días), se utilizaron discos de agar
(6 mm diámetro) previamente colonizados con el microorganismo.
Producción de los Extractos.
Los extractos fúngicos extracelulares (EFE) fueron producidos en dos medios de
cultivo líquido, Czapeck-Dox (CD) y YMG ajustados a pH 7.0 (Anexo 1) (Thines,
2005 comunicación personal) adicionados con Tween 80 al 0.1% y dispuestos en
Erlenmeyers de 125 ml con un volumen efectivo de trabajo (VET) de 25 ml, en los
40
que se adicionó un inóculo al 10% v/v, de las suspensiones (1 x 106 propágulos/ ml)
o 5 discos de agar de 6 mm de diámetro. Los Erlemeyers se llevaron a incubación a
una temperatura de 26°C +/- 2°C durante 7 días, en un agitador orbital a 160 r.p.m.
(Kaida et al., 2001).
El contenido de cada uno de los Erlenmeyers de la etapa anterior, se hizo pasar a
través de una muselina estéril, con el objetivo de retener la fracción celular obtenida
durante el tiempo de fermentación y así, recolectar la solución acuosa donde se
encuentran los productos extracelulares del metabolismo, además de remanentes
del medio de cultivo y células libres. La centrifugación de este filtrado se realizó a
10,000 r.p.m. durante 15 minutos a 8 °C, empleando una centrífuga Sorvall® Biofuge
stratos (serie No. 40340227, año de manufactura: 2003). Los extractos crudos
resultantes, se dispusieron en tubos eppendorff de 1,5 - 2 ml, debidamente
codificados como EFE (extracto fúngico extracelular), que se conservaron en un
ultracongelador a -70°C, para ser utilizados posteriormente en los ensayos in vitro e
in planta.
4.2 ENSAYOS in vitro. 4.2.1 Suspensión de conidios de Botrytis cinerea Para este ensayo la suspensión del hongo se preparó a partir de un subcultivo
proveniente de viales conservados de Botrytis cinerea cepa Bo004, realizado en
cajas de Petri con agar PDA (Anexo 1) incubadas a 26°C +/- 2°C en oscuridad
durante 10-14 días, con períodos de exposición a luz blanca para inducir
esporulación.
Después del tiempo de incubación, se hizo una suspensión del hongo en una
solución de agua estéril con Tween 80 0.1%, para ser aplicada (25 µl) sobre
segmentos de tallos de tomate, de diferentes edades, de 4 cm de longitud,
dispuestos sobre un cubo de icopor en condiciones de cámara húmeda (Moreno
2003), para reactivar la cepa. Luego de la infección y la esporulación en los tallos,
se hicieron pases del hongo, a cajas de Petri con PDA y se incubaron durante 10
días a 26°C +/- 2°C en oscuridad.
41
La suspensión de conidios de B. cinerea reactivado para este ensayo se preparó,
adicionando 20 ml de una solución de agua estéril y Extracto de Malta al 0.1% sobre
el hongo crecido en caja de Petri, empleando un asa se removió el hongo, y se filtró
a través de una tela de muselina estéril, para obtener los conidios. La suspensión se
ajustó a una concentración de 5x105 conidios/ml, por adición de Extracto de Malta al
0.1%.
De esta suspensión de B. cinerea se inocularon 100 µl en microplacas de 96 pozos
(Corning®, Corning Glass Works) con 100 µl de los extractos fúngicos extracelulares
(EFE) producidos en cada medio de cultivo (4.1.1), siguiendo el protocolo reportado
por varios autores que han trabajado con Botrytis cinerea o con otros hongos
filamentosos dispuestos para su evaluación en placas de microtitulación (Hadacek y
Greger, 2000; López-García et al., 2002; Slawecki et al., 2002; Thines et al., 2004,
Wilson et al., 1997).
4.2.2 Lectura de las Placas.
Los tratamientos incluidos correspondieron a los diferentes extractos fúngicos
extracelulares (EFE) en combinación con 5 x 105 conidios/ml de B. cinerea y los
siguientes controles: (a) suspensión de 5 x 105 conidios del patógeno en extracto
de malta 0.1% sin el extracto (control negativo), (b) extractos EFE más la solución
blanco sin la suspensión de B. cinerea y (c) solución blanco (extracto de malta al
0.1%), con cuatro repeticiones por tratamiento.
Las placas de microtitulación se llevaron a un agitador orbital para su incubación a
26°C +/- 1°C con agitación de 100 r.p.m, en oscuridad, durante 16 horas.
Para la lectura de absorbancia previamente se probaron cuatro diferentes longitudes
de onda (405 nm, 450nm, 492nm, 620 nm) en el lector de placas de ELISA ASYS®
Hitech Expert 96, con el fin de seleccionar aquella longitud que presentara mayor
sensibilidad, después de obtener el delta de diferencias de los datos de densidad
óptica. En este ensayo se empleó una suspensión de conidios de Botrytis cinerea
preparada como se mencionó anteriormente en el numeral 4.2.1.
42
4.2.2.1 Curva de Calibración para Botrytis cinerea. Con el fin de correlacionar las dos metodologías seleccionadas para la evaluación in
vitro (absorbancia y germinación), en primera instancia se realizó una curva de
calibración, que sirvió para relacionar la germinación de los conidios del patógeno
con valores de absorbancia a la longitud de onda seleccionada anteriormente (405
nm). Por tanto, se prepararon varias concentraciones de B. cinerea dentro del rango
de 1x105 hasta 1x106 conidios/ml, mediante diluciones con una solución de extracto
de malta al 0.1% hasta llegar a un volumen final de 200µl en cada pozo una placa
de microtitulación (Corning®, Corning Glass Works), con cuatro repeticiones para
cada una de las concentraciones. Como blanco, se empleó la solución de extracto
de malta al 0.1%. Posteriormente, las placas se llevaron a un lector de placas de
ELISA ASYS® Hitech Expert 96 para evaluar la densidad óptica en el tiempo cero
con una longitud de onda establecida.
4.2.2.2 Actividad Antifúngica de los Extractos (EFE).
De cada uno de los extractos fúngicos extracelulares (EFE) producidos (dos por
cepa) se evaluó una concentración de 50% v/v (Slawecki et al., 2002). La cual se
preparó en combinación con la suspensión de conidios de B. cinerea ajustada en
una solución de extracto de malta al 0.1%. Para disponer por cada pozo dentro de la
placa de 96 pozos (Corning®, Corning Glass Works) un volumen final de extracto y
conidios de 200 µl con cuatro repeticiones por extracto. Al tiempo cero se realizó la
lectura de densidad óptica (λ=405nm) en el lector de ELISA ASYS® Hitech Expert
96. Después de 16 horas en incubación y agitación de las microplacas, se realizaron
tanto las lecturas de absorbancia en el lector de ELISA ASYS® Hitech Expert 96
como las observaciones directas en microscopio con un objetivo de 40X para
cuantificar la inhibición de la germinación de conidios del hongo B. cinerea.
La metodología fue la siguiente; se seleccionó aleatoriamente un pozo por
tratamiento y se dispensó dentro del pozo 10 µl de azul de lactofenol, para aumentar
el contraste visual de las estructuras del hongo. Se tomaron 20 µl que se colocaron
sobre una lámina portaobjetos para capturar las imágenes de la germinación con
43
una cámara digital. Posteriormente, se eligieron campos al azar con mínimo 10
conidios por campo y se estimó a las 16 horas de incubación, el porcentaje de
germinación (sumando el No. de conidios germinados y dividiendo entre el No. total
de conidios germinados y no germinados), al promediar cada uno de los campos
seleccionados por tratamiento.
Para calcular el porcentaje de inhibición de la germinación de B. cinerea en cada
uno de los tratamientos (EFE) se empleó la fórmula:
% Inhibición (I) = (100 - %GEFE) – (100 - % GBo)
donde:
%GEFE = porcentaje de germinación de B. cinerea en presencia del EFE.
% GBo = porcentaje de germinación de B. cinerea en ausencia del EFE (Díaz,
2006).
4.2.3 Análisis Estadístico. Los extractos fúngicos extracelulares (EFE) dependiendo de los medios líquidos de
producción (Czapeck-Dox y YMG) de donde provenían, se agruparon de acuerdo al
porcentaje de inhibición (I) de la germinación, constituyendo 3 grupos de inhibición
(1: baja; 2: media; 3: alta) mediante el análisis de agrupamiento con el método de
vínculos unitarios nearest neighbor y la distancia métrica del cuadrado euclidiano
squared euclidean del programa STATGRAPHICS versión 4.2. Se seleccionó de
cada bloque de medio de producción, los extractos del grupo de inhibición alta que
fueron probados en los ensayos in planta.
Para la correlación de las dos metodologías, porcentaje de germinación de
B. cinerea y densidad óptica (λ=405nm), empleadas en la técnica in vitro, en
primera instancia se calculó el delta (∆) de densidad óptica a las hora 16 en cada
tratamiento EFE después de promediar las repeticiones (4) y corregir con los valores
de densidad óptica de los controles extracto EFE más solución blanco y suspensión
de B. cinerea en extracto de malta 0.1%, en el tiempo cero. Para comparar el
44
porcentaje de germinación de B. cinerea y delta de densidad óptica se retiraron los
extractos con DO superiores a 0.9 a la hora 0 y coeficientes de variación superiores
al 10% de la DO de la hora 0 respecto de la hora 16 para los controles de los
extractos sin el inóculo del patógeno. Se aplicó un modelo de calibración usando el
programa STATGRAPHICS 4.2.
4.3 ENSAYOS in planta. 4.3.1 Selección del Bioensayo.
Se seleccionó un bioensayo entre dos modos de aplicación por aspersión o
puntual, en dos modelos; segmentos de tallos y foliolos de tomate.
El material vegetal fue obtenido de un cultivo de tomate (Lycopersicon esculentum
Mill.) tipo milano híbrido Rocío®, ubicado en el C.I. Tibaitatá, se colectaron brotes
secundarios con longitud mayor a 20 cm. De estos tallos se eliminaron 10 cm del
ápice y el resto se cortó en secciones de 4 cm de longitud. Estos segmentos se
insertaron verticalmente en cubos de icopor (10 x 10 x 2 cm) con la parte más joven
hacia arriba. Cada cubo de icopor contenía 4 segmentos de tallo de diferente edad.
Cada cubo se colocó en un recipiente plástico (24 x 24 x 10 cm) con dos capas de
papel estéril humedecido en el fondo. De cada tratamiento se hicieron 3
repeticiones.
Para el modelo de foliolos se recolectaron hojas de 6-7 semanas (Meyer et al.,
2001), con tamaños similares, para minimizar variables por área de infección, para
todos los foliolos empleados primero se realizó un lavado de las hojas seguido de
una desinfección con Hipoclorito de sodio a 0.7%, con dos enjuagues en agua
estéril y secado en cabina de flujo laminar. Las hojas previamente desinfectadas se
colocaron sobre una malla plástica, dentro de cajas de plástico (24 x 24 x 10 cm)
selladas y con papel estéril humedecido en el fondo, para crear condiciones de
cámara húmeda (Meyer et al., 2001). Las cajas con 15 hojas por tratamiento con
tres repeticiones (Unidad experimental: 1 bandeja con 5 hojas), fueron mantenidas
en un cuarto climatizado a 19 +/- 1°C, de igual manera que para las cajas del
modelo de tallos.
45
La suspensión de B. cinerea se preparó como se describió en el numeral 4.2.1, en
una solución de agua estéril con Tween 80 al 0.1% y después de recuento en
hemocitómetro se ajustó la concentración a 1 x 105 conidios/ml de B. cinerea. En el
modelo de tallos, se aplicó para los dos tratamientos evaluados; aplicación puntual
(25µl) y por aspersión (500 ml con un atomizador de PVC de 30 cm3 de capacidad),
la suspensión a cada segmento de tallo recién cortado y ubicado en su recipiente,
en el sitio de corte, se evaluó un testigo con tallos no tratados. Para el modelo de
foliolos, sobre la superficie de las hojas de tomate, se hizo una aplicación de la
suspensión del patógeno por aspersión (1 ml con un atomizador de PVC de 30 cm3
de capacidad) o en el ápice de las hojas 25µl, se evaluó un testigo no tratado.
Se hicieron lecturas de los tratamientos día intermedio durante 15 días hasta
encontrar valores cercanos al 100% de incidencia (número de hojas o tallos
infectados por tratamiento).
4.3.2 Evaluación de los Extractos Fúngicos Extracelulares (EFE) seleccionados. 4.3.2.1 Material Vegetal. El material vegetal utilizado fue recolectado de un cultivo de tomate (L. esculentum)
tipo milano híbrido Rocío®, ubicado en el C.I. Tibaitatá de Corpoica, del que se
tomaron hojas de 6-7 semanas (Meyer et al., 2001), con tamaños similares, para
minimizar variables por área de infección.
Para todos los foliolos empleados, primero se realizó un lavado de las hojas,
seguido de una desinfección con Hipoclorito de sodio a 0.7%, con dos enjuagues en
agua estéril y secado en cabina de flujo laminar.
Inoculación en Foliolos de Tomate. Las cajas con 16 hojas por tratamiento con cuatro repeticiones (UE: 1 bandeja con
4 hojas), fueron mantenidas en un cuarto climatizado a 19 +/- 1°C, durante 10-15
días. Los tratamientos correspondieron a los EFE pertenecientes al grupo de
inhibición alta seleccionados mediante el agrupamiento (STATGRAPHICS 4.2) más
46
la suspensión del patógeno (Bo004), los extractos crudos sin el patógeno, un testigo
patógeno (Bo004) y un testigo no tratado (hojas sin inocular).
Las hojas previamente desinfectadas se colocaron sobre una malla plástica, dentro
de cajas de plástico (24 x 24 x 10 cm) selladas y con papel estéril humedecido en el
fondo, para crear condiciones de cámara húmeda (Meyer et al., 2001).
Sobre la superficie de la hoja de tomate, se hizo una aplicación por aspersión de los
extractos EFE y sobre el ápice de la hoja se inocularon 25µl de 1 x 105 conidios/ml
de B. cinerea, suspensión preparada como se describió en el numeral 4.2.1, en una
solución de agua estéril con Tween 80 al 0.1%. En el testigo patógeno se aplicó
Tween 80 al 0.1% por aspersión y el inóculo en el ápice, en los controles de
fitotoxicidad para los extractos seleccionados se aplicó en el ápice Tween 80 al
0.1%.
Durante 15-20 días se hicieron observaciones cada 48-72 horas, se cuantificó el
progreso en el desarrollo de la infección a lo largo de la estructura (desde el ápice),
expresado como incidencia (número de hojas infectadas por tratamiento) y
severidad (porcentaje de la hoja infectado). Para esta última variable se tomaron
fotos de las hojas con una cámara digital para calcular el área total e infectada con
ayuda de un programa de análisis de imágenes (ImageJ 1,33u).
4.3.3 Análisis Estadístico.
La incidencia de la enfermedad se determinó como el número de hojas con la
presencia del moho gris (B. cinerea) sobre el total de hojas. Se calculó el progreso
de la enfermedad estimado con el porcentaje de severidad al cuantificar el área
foliar cubierta por el fitopatógeno sobre la totalidad del área foliar con ayuda del
programa de análisis de imágenes (ImageJ 1,33u) durante el desarrollo del ensayo,
estos porcentajes de severidad fueron transformados a UABC (Unidades de área
Bajo la curva).
El porcentaje de eficacia en el último día de lectura (19 d) se estimó mediante la
ecuación (a-b/a) * 100 (Elad, 2000), donde;
a = índice de enfermedad (severidad) en el testigo patógeno
b = índice de enfermedad (severidad) en el tratamiento
47
Se aplicó un análisis de diferencia de medias de mediante la prueba de Fisher LSD
(α =0.95) STATGRAPHICS 4.2, para los datos de incidencia y severidad
recolectados durante el ensayo y en el último día de lectura.
48
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS DE CULTIVO. 5.1.1 Cepas nativas de hongos filamentosos.
En total se recuperaron 86 morfoespecies de hongos filamentosos aisladas por
Cabrera del Amazonas (2000), que se encontraban conservadas en medio
Czapeck-Dox o en aceite, 36 accesiones del Suelo 1 (S1), 19 accesiones del Suelo
2 y 31 accesiones del Suelo 3 (S3) (Tablas 2 y 3), cada una con características
macroscópicas y microscópicas particulares (Figuras 5 y 6), con diferentes tipos de
crecimiento micelial; por ejemplo, se observaron hongos dematiáceos (Figuras 5a,
5b, 5c, 5d, 5e y 5f) otras cepas presentaron micelio aéreo abundante y con
esporulación pigmentada (Figuras 5g, 5h y 5i), micelio algodonoso (Figuras 5j, 5k y
5l) y pulverulento (Figuras 6a, 6b, 6c, 6d), entre otras características. Igualmente se
observaron cepas con producción de pigmentos difusibles en el medio de cultivo, de
distintos colores; rojo (Figuras 6e, 6f y 5k), amarillo (Figuras 6g y 5i) y café (Figura
6h).
Tabla 2. Morfoespecies recuperadas de los tubos de agar.
Los números representan morfoespecies diferentes.
Suelo 1 Código
Suelo 2 Código
Suelo 3 Código
17 28 67 74 169 197
110 144
2
15 18 23 28 36 44 46 115 125 157 223
49
Figura 5. Fotografías macroscópicas de las morfoespecies 226(a), 1(b), 134(c), 80(d),
149(e), 167(f), 62(g), 96(h), 113(i), 31(j), 152(k), 143(l) provenientes de los suelos 1, 2 y 3.
Fuente: El Autor.
aa bb cc
dd ee ff
gg hh ii
jj kk ll
50
Figura 6. Fotografías macroscópicas de las morfoespecies 112(a), 197(b), 212(c), 27(d),
150(e), 228(f), 217(g), 153(h), provenientes de los suelos 1, 2 y 3. Fuente: El Autor.
aa bb cc
dd ee ff
gg hh
51
Tabla 3. Morfoespecies recuperadas de los viales en aceite.
Los números representan morfoespecies diferentes.
Microscópicamente, se observaron conidióforos penicilados (Figuras 7a y 7b),
micelio septado (Figura 7c), coenocítico (Figuras 7d, 7e, 7f, y 7g), hifas hialinas
(Figura 7h), conidios agrupados (Figuras 7g y 7i), artroconidias (Figuras 7j) y
esporas (Figura 7k), entre otros.
Suelo 1 Código
Suelo 2 Código
Suelo 3 Código
1
12 29 31 40 57 62 83 91 93 96 100 112 127 134 139 150 160 163 166 172 188 198 205 212 213 217 226 228 243
4 5
46 47 62 74 76 90
124 129 134 152 153 154 156 175 185
10 27 30 52 62 64 80
113 143 149 150 167 169 179 182 197 210 211 212
52
Figura 7. Fotografías microscópicas 40X de las morfoespecies 17(a), 18(b), 2(c), 213(d),
205(e), 28(f), 36(g), 151(h), 112(i), 23(j), 62(k). Fuente: El Autor.
aa bb cc
dd ee ff
gg hh ii
jj kk
53
5.1.2 Producción de los Extractos Fúngicos Extracelulares (EFE).
En total se produjeron 172 extractos fúngicos, con diferentes características en
cuanto a la coloración y pH final (Figura 8 y Tablas 4, 5 y 6). Para su producción se
requirió ajustar el inóculo a una concentración estándar de 1 x 106 propágulos/ml
para todos los aislamientos, sin embargo se observó que este parámetro no pudo
ser conservado en todas las accesiones, pues aunque Cabrera (2000) reporta sólo
una accesión como micelio estéril (212), otras 37 cepas no produjeron propágulos,
por lo que se inocularon discos de agar (6 mm diámetro) con micelio del hongo.
En total un 41,27% de los EFE presentaron variaciones en la coloración con
respecto del color inicial, de estos 40 extractos fueron producidos en Czapeck-Dox y
31 en YMG. Los pigmentos fúngicos producidos estuvieron dentro de la gama del
negro (Figuras 8a y 8b), café (Figuras 8c y 8d) y rojo (Figuras 8e y 8f).
Figura 8. Algunos extractos producidos en Czapeck-Dox y YMG, pertenecientes a las
morfoespecies 1(a), 83(b), 213(c), 150(d), 139(e), 115(f). Fuente: El Autor.
aa bb cc
dd ee ff
54
Hubo 36 extractos que no presentaron variaciones en la coloración para ninguno de
los dos medios empleados (Tablas 4, 5 y 6), mientras que para 22 EFE hubo
variaciones en los dos medios de producción (Tablas 4, 5 y 6). Se observó una
mayor proporción de extractos pigmentados producidos en Czapeck-Dox con
respecto a YMG y, aunque no hubo una determinación cuantitativa, cualitativamente
se observó que el medio YMG incrementó la producción de biomasa y formación de
pellets con relación al medio CD (Figuras 8a, 8b, 8c, 8d, 8e y 8f).
Para 21 cepas, las morfoespecies 93, 127, 134, 150, 166, 169, 172, 243 (Tabla 4),
74, 124, 154 (Tabla 5), 15, 28, 36, 44, 167, 169, 182, 197, 210 y 223 (Tabla 6) se
observó el mismo valor de pH final, en los dos extractos producidos. Un 44,1% de la
totalidad de los extractos presentó pH final ácido, 35 EFE producidos en Czapeck-
Dox y 41 en YMG, con un rango entre 2.0 y 6.0 (Tablas 4, 5 y 6), mientras que el
25,58% del total de los EFE conservaron el pH inicial (pH 7.0), 23 en Czapeck-Dox y
21 en YMG (Tablas 4, 5 y 6). De otro lado, el rango de los valores de pH final básico
estuvo entre 7.5 y 10.0 presentado por el 30,23% del total de los extractos
producidos, 28 en Czapeck-Dox y 24 en YMG (Tablas 4, 5 y 6). Sólo 34 extractos
correspondientes a 17 cepas producidas tanto en Czapeck-Dox como en YMG
presentaron el mismo valor de pH y la coloración final (Tablas 4, 5 y 6).
De la totalidad de los EFE producidos en ambos medios, se presentó la producción
de un polímero extracelular color crema por la cepa 150 en el medio Czapeck-Dox,
correspondiente al EFE 126 (Figura 8f).
En algunos de los extractos presumiblemente se encuentran los metabolitos
secundarios con algún potencial antifúngico, ya que los extractos de una
fermentación invariablemente resultan en mezclas complejas de cientos de
compuestos (Borders, 1999). La producción de algunos de los compuestos con
potencial inhibitorio puede desarrollarse bajo condiciones limitantes de nutrientes,
como disminución de fuentes de C, N ó P fácilmente asimilables, esto conlleva a
que el microorganismo entre en un período de crecimiento lento con alteraciones
morfológicas y cambios en el metabolismo, lo que se conoce como metabolismo
secundario (Drew y Demain, 1977, citado por Schimmel et al., 1998; Turner, 1971),
55
éste según Zhang y colaboradores (2001) puede presentarse a partir del día 1 con
máximos niveles de concentración el día 3, pero según Schimmel y colaboradores
(1996) se presenta a partir del día 5. La producción de metabolitos fúngicos,
depende de las características de las moléculas y está influenciada por varios
parámetros; temperatura, pH, oxígeno disuelto, entre otros (Brakhage et al., 2004;
Calvo et al., 2002; Higgs et al., 2001; Saha et al., 2004). Esto indica que aunque los
microorganismos pueden producir sustancias de bajo peso molecular con efectos
antifúngicos, su obtención es particular para cada cepa o metabolito de interés
(Broberg et al., 2004).
56
Tabla 4. Características de los extractos fúngicos extracelulares (EFE) producidos en el medio Czapeck-Dox y YMG, durante 8 días, provenientes de las morfoespecies del Suelo 1.
Código Czapeck-Dox YMG de la cepa EFE*
pH final Color EFE* pH final Color
1 78 8,0 + amarillo 79 7,5 + marrón 12 164 7,0 + rosado 165 6,0 + marrón 17 84 4,5 - transparente 85 7,0 + amarillo 28 38 7,5 + amarillo 39 7,0 + negro 29 15 7,0 + amarillo 16 5,5 - amarillo 31 122 8,0 + rosado 123 7,0 + rojizo 40 94 7,5 + amarillo 95 7,0 - amarillo 57 120 4,5 + amarillo 121 7,0-8,0 + marrón 62 1 7,0 - transparente 2 7,5 - amarillo 67 96 7,0 - transparente 97 5,5 + amarillo 74 86 6,0 - transparente 87 7,0 - café 83 68 7,0 + marrón 69 5,5 + marrón 91 128 8,0 + amarillo 129 7,0 - amarillo 93 146 4,1-4,2 - transparente 147 4,5 - amarillo 96 98 7,0 - transparente 99 5,5 - amarillo
100 88 4,2 - transparente 89 7,0 - amarillo 112 70 4,5 - transparente 71 7,0 - amarillo 127 17 5,5 + amarillo 18 5,5 + crema 134 139 7,5 - transparente 140 7,5 - amarillo 139 108 7,5 + rosado 109 5,4 + rojo 150 126 8,0 + crema** 127 8,0 - amarillo 160 143 4,1-4,2 + amarillo 144 5,5 + amarillo 163 76 4,5 - transparente 77 8,0 - amarillo 166 137 7,0 - transparente 138 7,0 - amarillo 169 135 8,0 + amarillo 136 8,0-8,2 + transparente 172 172 7,0 + marrón 173 7,0 + negro 188 110 8,5 - transparente 111 4,5 - amarillo 197 64 5,5 - transparente 65 7,0 - amarillo 198 3 7,5 - transparente 4 7,0 - amarillo 205 74 7,5 - transparente 75 7,0 - amarillo 212 168 6,0 - transparente 169 7,0 + marrón 213 72 7,0 + amarillo 73 7,5 - café 217 28 5,0 + amarillo 29 5,5 - amarillo 226 36 7,0 - transparente 37 4,0 + negro 228 80 7,0 + rosado 81 6,0 + rojizo 243 145 4,5 + marrón 157 4,5 - amarillo
* Códigos de los extractos fúngicos extracelulares (EFE), en cada medio de producción. (+):
Variaciones respecto del color inicial del medio; (-): sin variaciones respecto del color inicial.
** Producción de un polímero extracelular.
57
Tabla 5. Características de los extractos fúngicos extracelulares (EFE) producidos en el medio Czapeck-Dox y YMG, durante 8 días, provenientes de las morfoespecies del Suelo 2.
Código Czapeck-Dox YMG de la cepa EFE* pH final Color EFE* pH final Color
4 32 9,5 - transparente 33 8,0 - amarillo 5 170 4,5 + amarillo 171 7,0 - amarillo
46 19 9,0 - transparente 20 7,0 + crema 47 100 9,0 - transparente 101 6,0 - amarillo 62 148 4,5 - transparente 149 5,5 - amarillo 74 90 7,0 - transparente 91 7,0 + marrón 76 102 4,5 - transparente 103 5,5 - amarillo 90 5 8,0 - transparente 6 6,0 - amarillo
110 66 4,5 - transparente 67 5,5 - amarillo 124 104 4,5 + amarillo 105 4,5 - amarillo 129 166 7,0 + rosado 167 4,5 - amarillo 134 141 7,5 - transparente 142 7,0 + café 144 92 8,5 + rojo 93 4,5 - amarillo 152 21 8,5 + rosado 22 6,0 - amarillo 153 178 7,0 + marrón 179 8,0 + marrón 154 7 8,0 - transparente 8 8,0 - caramelo 156 124 8,0 + negro 125 7,0 + negro 175 182 7,0 + rosado 183 6,0 - caramelo 185 180 4,0 - transparente 181 3,0 - amarillo
* Códigos de los extractos fúngicos extracelulares (EFE), en cada medio de producción.
(+): Variaciones respecto del color inicial del medio; (-): sin variaciones respecto del color
inicial.
58
Tabla 6. Características de los extractos fúngicos extracelulares (EFE) producidos en el medio Czapeck-Dox y YMG, durante 8 días, provenientes de las morfoespecies del Suelo 3.
Código Czapeck-Dox YMG de la cepa EFE* pH final Color EFE* pH final Color
2 9 7,5 - transparente 10 6,0 - amarillo 10 133 4,5 + amarillo 134 7,8-8,0 - amarillo 15 54 4,5 - transparente 55 4,5 - amarillo 18 52 4,5 + amarillo 53 5,5 - amarillo 23 57 2,0 - transparente 58 3,0 + transparente 27 11 6,0 - transparente 12 5,5 - amarillo 28 46 4,5 - transparente 47 4,5 - amarillo 30 112 7,5 - transparente 113 8,0 - café 36 40 4,5 + amarillo 41 4,5 + crema 44 48 4,5 + café 49 4,5 + café 46 13 7,0 + crema 14 5,5 + crema 52 151 7,0 - transparente 152 5,5 - amarillo 62 130 5,5 - transparente 150 7,5-7,6 - amarillo 64 131 7,0 - transparente 132 7,5-8,0 - amarillo 80 162 7,0 - transparente 163 8,0 + negro
113 116 6,5 + rojizo 117 7,0 + rojizo 115 24 8,5-9,0 + rojo 61 8,5 + rojizo 125 50 6,0 - transparente 51 4,5 - amarillo 143 114 8,0 + amarillo 115 7,0 + amarillo 149 118 4,0 + rosado 119 6,0 - amarillo 150 158 8,0 + negro 159 8,5 - café 157 153 4,5 - transparente 154 7,0 + amarillo 167 44 7,0 + negro 45 7,0 - amarillo 169 42 7,0 + café 43 7,0 + negro 179 62 8,0 - transparente 63 7,0 - amarillo 182 174 4,5 - transparente 175 4,5 - amarillo 197 106 4,5 - transparente 107 4,5 - amarillo 210 155 7,0 - transparente 156 7,0 - amarillo 211 26 7,0 + café 27 4,5 - amarillo 212 82 10,0 - transparente 83 7,0 - amarillo 223 23 4,5 - transparente 56 4,5 - amarillo
* Códigos de los extractos fúngicos extracelulares (EFE), en cada medio de producción.
(+): Variaciones respecto del color inicial del medio; (-): sin variaciones respecto del color
inicial.
59
5.2 ENSAYOS In Vitro.
5.2.1 Efecto de los extractos fúngicos (EFE) sobre la inhibición de la
germinación de B. cinerea. La evaluación de la inhibición de la germinación, mediante la observación directa
por microscopia demostró que existe un gran potencial de compuestos con actividad
antifúngica, dado que en presencia de 50 extractos se encontraron porcentajes de
germinación de B. cinerea cepa Bo004 menores o iguales al 50%, después de 16
horas de incubación. Se debe tener en cuenta la gran variabilidad del patógeno, ya
que presentó porcentajes de germinación que oscilaron entre el 59,30% y el
93,75%, por lo que fue necesario emplear un factor de corrección (ecuación
porcentaje de inhibición, numeral 4.2.2.2); los valores de inhibición de la
germinación obtenidos fueron analizados mediante el análisis estadístico de
agrupamiento con el programa STATGRAPHICS versión 4.2.
g , q
0 20 40 60 80 1000
20
40
60
80
100
Figura 9. Agrupamiento del efecto inhibitorio de la germinación de B. cinerea producida por
los extractos EFE producidos en el medio Czapeck-Dox (CD) de acuerdo con el análisis de
Grupos homogéneos (Programa STATGRAPHICS versión 4.2). Grupos de Inhibición: 1(o)
baja; 2( ) media; 3(x) alta, (+) centroides.
% Inhibición de la germinación
% In
hibi
ción
de
la g
erm
inac
ión
60
En el medio Czapeck-Dox (CD), el agrupamiento (Figura 9) mostró que el mayor
número de extractos correspondiente a setenta y nueve se ubicó en el grupo (1) de
inhibición baja abarcando porcentajes de inhibición desde 0 hasta 60%, esto
también se observó para los EFE que provenían del medio YMG, puesto que en el
grupo (1) de inhibición baja también se ubicaron la mayoría de extractos (71). En el
grupo (2) de inhibición media, se encontraron porcentajes de inhibición de la
germinación de B. cinerea que van desde 66,4% hasta 74,8% y desde 59,5% hasta
75,6% para cinco extractos producidos en el medio CD (Figura 9) y trece extractos
producidos en YMG (Figura 10), respectivamente.
0 20 40 60 80 1000
20
40
60
80
100
Figura 10. Agrupamiento del efecto inhibitorio de la germinación de B. cinerea producida por
los extractos EFE producidos en el medio YMG de acuerdo con el análisis de Grupos
homogéneos (Programa STATGRAPHICS versión 4.2). Grupos de Inhibición: 1(o) baja; 2( )
media; 3(x) alta, (+) centroides.
Para ambos medios (CD y YMG) el análisis estadístico discriminó en el grupo (3) de
inhibición alta (Figuras 9 y 10) dos extractos para cada medio de cultivo, con valores
de inhibición de 85,3% con el extracto EFE 158 correspondiente a la cepa 150
producida en el medio Czapeck-Dox, de 85,6% con el extracto EFE 56 producido
% Inhibición de la germinación
% In
hibi
ción
de
la g
erm
inac
ión
61
con la cepa 223 en el medio YMG, del 86,1% con el extracto 49 producido con la
cepa 44 en el medio YMG y de 90,4% con el extracto 66 correspondiente a la cepa
110 producida en Czapeck-Dox. Estos extractos fueron seleccionados para realizar
el ensayo in planta, por su alta actividad frente a B. cinerea Bo004. Se observaron
diferencias marcadas en el efecto de los extractos producidos por un mismo hongo
en diferente medio, si se tiene en cuenta que con las cepas 223 y 44 producidas en
Czapeck-Dox, los porcentajes de inhibición de la germinación fueron de 0% y 15,4%
respectivamente, mientras que para la cepa 110 producida en YMG éste fue de 0%
de inhibición de la germinación de B. cinerea.
En ambos medios se produjeron extractos con potencial para el control de
B. cinerea. Según Thines (2005) la producción de compuestos de este tipo ocurre
principalmente bajo condiciones limitantes de nutrientes (Thines, 2005; Turner,
1971), y depende en gran medida de las vías de síntesis de productos naturales ya
que los metabolitos secundarios no siempre tienen un único origen biosintético y su
producción se puede derivar de diversas rutas metabólicas asociadas con el
desarrollo del hongo, la formación de esporas, pigmentos u otras estructuras, dentro
de las que hay procesos anabólicos del metabolismo de ácidos, proteínas, lípidos,
entre otros compuestos, cuya síntesis es coordinada por un gen o por un grupo de
estos (Calvo et al., 2002; Keller y Hohn, 1997; Marzluf, 1997).
En trabajos previos se ha demostrado la producción de compuestos inhibitorios al
sembrar microorganismos en YMG: ya que Eilbert y colaboradores (2000), con una
cepa de Neobulgaria pura obtuvieron compuestos como la neobulgarona D que
logró inhibir la formación de apresorios del fitopatógeno Magnaporthe grisea cepa
P1. Por otra parte, todos los inhibidores y compuestos antifúngicos obtenidos en el
instituto de biotecnología e investigación en drogas de la Universidad de
Kaiserslautern, Alemania, (Institute of Biotechnology and Drug Research, IBWF),
han sido encontrados en medios estándar como Czapeck-Dox, YMG y PDA. Los
dos primeros medios proporcionan fuentes de C y N como Sacarosa y Nitrato en
Czapeck-Dox y Glucosa y Extracto de levadura en YMG, que al permitir un
desarrollo favorable del microorganismo propician las condiciones para que se
presente tanto el metabolismo primario como el secundario. Turner (1971), realizó
62
bioprospección con los medios Raulin-Thom y Czapeck-Dox que difieren en la
fuente de nitrógeno (amonio y nitrato, respectivamente), observando frecuentemente
la producción de sustancias con actividad biológica, en un medio, pero no en el otro,
o diferencias entre los compuestos producidos en cada uno.
El éxito y potencial del metabolito, y por ende del medio de producción empleado,
también está relacionado con el modo de acción o target de la sustancia
(Santamarina et al., 2002), por tanto la baja inhibición de la germinación obtenida en
presencia de los extractos del grupo de inhibición baja pudo estar relacionada con
que no se produjeron compuestos antifúngicos o que los metabolitos producidos no
tenían potencial sobre la germinación de B. cinerea.
Las cepas utilizadas en el presente trabajo provinieron del Amazonas (Cabrera,
2000), y demostraron un importante potencial en la producción de extractos
antifúngicos con actividad media y alta, lo cual podría estar relacionado con su
origen, si se tiene en cuenta el trabajo de Bills y colaboradores (2002) (citado por
Strobel y Daisy, 2003) quienes al comparar el número de productos bioactivos
naturales derivados de microorganismos endofíticos de regiones tropicales frente al
número de compuestos aislados de endofíticos de origen templado, encontraron que
los primeros proporcionaron más productos naturales activos.
Además de la inhibición de la germinación producida por los extractos evaluados, se
observaron otros efectos sobre los conidios y sobre las hifas de B. cinerea. Por
ejemplo, tubos germinales cortos con respecto al testigo patógeno al evaluar los
tratamientos con los extractos 88, 96, 104, 106, 114, 124, 145, 170 y 176 producidos
por las morfoespecies codificadas como 100, 67, 124, 197, 143, 156, 243, 5 y 48, en
el medio Czapeck-Dox y por los extractos 58, 103, 129, 136 y 159 producidos por
las morfoespecies codificadas como 23, 76, 91, 169 y 150 en el medio YMG (Figura
11). Estos extractos podrían ser de interés si se tiene en cuenta que existe un grupo
de botrycidas (p.ej. DMIs, hidroxianilidas), que no previenen la germinación de
conidios pero, a bajas concentraciones inhiben la elongación del tubo germinal y el
crecimiento del micelio, debido a que interfieren con la biosíntesis de esterol
(Rosslenbroich y Struebler; 2000; Leroux, 2004).
63
Figura 11. Tubos germinales cortos de los tratamientos con los extractos 88(a), 176(b)
producidas en Czapeck-Dox y 136(c) producida en YMG, correspondientes a las
morfoespecies 100, 48 y 169, en relación con el control (d). Fotografías microscópicas 40X.
Fuente: El Autor.
Adicionalmente, se ha observado en medios suplementados con estos fungicidas,
que los tubos germinales producidos aparecen abultados, distorsionados y el citosol
tiene una apariencia granular (Leroux et al., 1999, citado por Leroux, 2004). Este
último fenómeno se observó en los conidios que estuvieron en contacto con el EFE
82, obtenido con la morfoespecie 212 producida en el medio Czapeck-Dox, donde
se observó una concentración del contenido citoplasmático en relación con los
conidios del control B. cinerea (Figura 12). Probablemente el efecto de este extracto
también puede estar relacionado con su pH básico (pH 10.0) que pudo afectar el
equilibrio celular (Atlas y Bartha, 2002; Manteau et al., 2003), debido que B. cinerea
presenta un crecimiento óptimo a pH 7.0 y en el rango de pH de 4,5 a 6.0 produce
las enzimas relacionadas con la patogénesis del hongo (Manteau et al., 2003).
a b c
d
64
Figura 12. Efectos sobre los conidios y sobre las hifas de B. cinerea, ocasionado por el
extracto 82 (a) producido en Czapeck-Dox, en relación al control (b). Fotografías
microscópicas 40X. Fuente: El Autor.
Así mismo, se desarrollaron tubos germinales secundarios y terciarios de B. cinerea
con los extractos 40, 74 y 84 producidos por las morfoespecies 36, 205 y 17 en el
medio CD y con los extractos 55 y 167 producidos por las morfoespecies 15 y 129
en el medio YMG (Figura 13). Este fenómeno ha sido reportado en Botrytis al
Figura 13. Tubos germinales secundarios y terciarios de B. cinerea, producidos por los
extractos 167 (a) producido en el medio YMG, 84 (b) y 40 (c) producidos en Czapeck-Dox,
en relación con el control (d). Fotografías microscópicas 40X. Fuente: El Autor.
a b
a b c
d
65
evaluar el efecto del resveratrol, que es una fitoalexina que interfiere con la
funcionalidad de las proteínas de membrana, especialmente en la mitocondria,
conduciendo a una disminución inmediata en la toma de oxígeno, manifestado en
cambios citológicos como producción de tubos germinales secundarios o terciarios,
formación de tubos germinales curvos y granulación de los conidios, entre otros
(Holian y Walter, 2001; Pezet y Pont, 1995, citado por Chan, 2002).
En algunos trabajos (Elad y Kapat,1999; Brunner et al., 2005) se obtuvo un alto
porcentaje de germinación de B. cinerea (100%) lo cual contrasta con los datos
derivados de este trabajo en que se observó un comportamiento disímil en cuanto a
la germinación de los conidios del patógeno, ya que los porcentajes oscilaron entre
un 60 y 90% en promedio después de 16h, esta cifra es muy superior a la reportada
en otros trabajos, en los que se presentaron variaciones máximas del 10% en la
germinación de B. cinerea (entre el 72,0% y 82,2%) a las 24h de incubación (Buck,
2004). La variabilidad encontrada en el presente trabajo pudo estar influenciada
principalmente por dos factores que afectaron la cepa utilizada. En primera
instancia, se sabe que este fitopatógeno es un hongo especialmente variable porque
presenta conidios mutinucleados, observándose una tendencia a cambiar
constantemente durante generaciones sucesivas in vitro y en condiciones de campo
(Elad et al., 2004). La segunda fuente de variación pudo estar relacionada con la
variabilidad de la cepa utilizada para adherirse a las placas de poliestireno, ya que
según Filonow, 2001 citado por Dardari et al., 2004 y Slawecki et al., 2002 la
diferencia en los valores de germinación pudo deberse a un retraso en la adhesión,
explicado por las dos etapas que comprende este proceso (Doss et al., 1993; 1995
citado por Doss 1999). La primera etapa ocurre después de la hidratación del
conidio e involucra fuerzas hidrofóbicas (Doss et al., 1993, citado por Doss 1999), la
segunda ocurre después de un período de incubación bajo condiciones que
promuevan la germinación, permitiendo que los tubos germinales puedan unirse
tanto a sustratos hidrofóbicos como hidrofílicos (Doss et al., 1995), además también
se presenta la excreción de carbohidratos y proteínas, coincidiendo con la
germinación (Doss et al., 1995).
66
Para refinar la selección en los grupos de inhibición media y alta de la germinación,
se realizó nuevamente un análisis de agrupamiento con los porcentajes de inhibición
obtenidos en presencia de estos extractos. Como resultado, para el medio CD se
observó el mismo agrupamiento de inhibición media de los porcentajes de inhibición
de la germinación de B. cinerea, mientras que con el grupo 3 de inhibición alta se
constituyeron dos grupos, uno correspondiente al extracto 66 significativamente
mejor con un 90,4% de inhibición y otro al EFE 158 con un 85,3% de inhibición de la
germinación de B. cinerea (Figura 14).
66 71 76 81 86 9166
71
76
81
86
91
Figura 14. Análisis de agrupamiento del efecto inhibitorio (>60% I) de los extractos EFE
producidos en el medio Czapeck-Dox (CD) de acuerdo con el análisis de Grupos
Homogéneos (Programa STATGRAPHICS versión 4,2). Los tratamientos corresponden al
extracto 66 (o; 90.4% I;) y 158 (x; 85.3%I), ( ) indica los demás extractos del grupo 2 y (+)
los centroides.
Con el nuevo agrupamiento de los porcentajes de inhibición media y alta obtenidos
en presencia de los extractos producidos en YMG, el grupo 3 de inhibición alta se
conservó por la cercanía de los porcentajes de inhibición del 85,6% y 86,1%
obtenidos con los EFE 56 y 49, mientras que el grupo 2 de inhibición media se
subdividió en dos grupos, uno con porcentajes de inhibición entre el 59,5 y 61,9% y
otro con porcentajes entre el 64,6% y 75,6% (Figura 15).
% Inhibición de la Germinación
% In
hibi
ción
de
la G
erm
inac
ión
67
g , q
59 64 69 74 79 84 8959
64
69
74
79
84
89
Figura 15. Análisis de agrupamiento del efecto inhibitorio (>59% I) de los extractos EFE
producidos en el medio YMG de acuerdo con el análisis de Grupos homogéneos (Programa
STATGRAPHICS versión 4,2). Los tratamientos corresponden al extracto 49 (x; 86,1% I) y
56 (x; 85, 6% I), (o) extractos con 59,5 y 61,9% de inhibición, ( ) extractos con 64,6 y 75,6 %
de Inhibición y (+) los centroides.
Estos análisis de agrupamiento de los EFE de los grupos media y alta confirmaron
el hallazgo de cuatro extractos con potencial para la inhibición de la germinación de
B. cinerea dos con el medio Czapeck-Dox y dos con el medio YMG (Figuras 14 y
15), frente a los otros EFE que presentaron porcentajes de inhibición de la
germinación del fitopatógeno aceptables dentro del grupo (2) de inhibición media.
Para explicar la inhibición de la germinación presentada con estos extractos se
podría sugerir la presencia de metabolitos antifúngicos que pudieron tener varios
posibles efectos sobre el patógeno, como se menciona en la Tabla 7.
% In
hibi
ción
de
la G
erm
inac
ión
% Inhibición de la Germinación
68
Tabla 7. Efectos potenciales de los extractos con actividad antifúngica sobre la germinación de B. cinerea
Posible efecto antifúngico Autores
Supresión de la biosíntesis de
metionina
Jin et al., 2004; Rosslenbroich y
Stuebler, 2000; Leroux, 2004
Interferencia sobre la respiración
mitocondrial
Gullino et al., 2000; Sauter et al.,1995;
citado por Slawecki et al., 2002; Leroux,
2004 ; Thines et al., 2004
Inhibición de tiol-enzimas Corbett et al., 1984, citado por Leroux,
2004
Desacople de la fosforilación oxidativa Leroux, 1996, citado por Leroux, 2004
Interferencia con la osmorregulación Rosslenbroich y Stuebler, 2000
Interferencia de procesos celulares, por
producción de especies activas de
oxígeno (AOS)
Edlich y Lyr, 1992; citado por Leroux,
2004
Inhibición de la lisis del poro para el
desarrollo del tubo germinal
Wolf, 1982, citado por Thines et al.,
2004
Además de los posibles modos de acción atribuidos para los los extractos ubicados
dentro de los grupos de inhibición media y alta de la germinación de B. cinerea,
pueden existir otros nuevos dependiendo de las moléculas productoras del efecto
inhibitorio (Strobel y Daisy, 2003).
En relación con las características de los extractos ubicados en el grupo de
inhibición alta y producidos en ambos medios, dos extractos presentaron
variaciones en la coloración y pigmentación con respecto al color inicial (Figura 16,
Tabla 8), ya que pasaron de transparente y amarillo claro transparente para
Czapeck-Dox y YMG respectivamente, a un color dentro de la gama café y negro.
Esta coloración oscura podría deberse a la presencia de melaninas las cuales están
asociados al desarrollo de estructuras en el hongo (Calvo et al., 2002; Keller y Hohn,
69
1997), u otros compuestos antifúngicos. Sin embargo no se encontró una relación
entre la producción de pigmentos y la actividad antifúngica de los EFE, ya que
varios extractos pigmentados no mostraron habilidad para inhibir la germinación de
B. cinerea.
Figura 16. Características de los extractos del grupo 3 de inhibición alta, 49 (a), 56 (b), 158
(c) y 66 (d). Fuente: El Autor.
Tabla 8. Características de los EFE pertenecientes al grupo 3 de inhibición alta de la germinación de B. cinerea y sus correspondientes extractos producidos en el otro medio de cultivo.
Medio Czapeck-Dox Medio YMG Cepa
EFE
% Inhibición
pH final
Color EFE
% Inhibición
pH final
Color
110 66 90,4 4.5 - 67 0 5.5 -
44 48 15,4 4.5 café 49 86,1 4.5 café
150 158 85,3 8.0 negro 159 72,0 8.5 café
223 23 0 4.5 - 56 85,6 4.5 -
Tres de los cuatro extractos del grupo (3) de inhibición alta presentaron un pH ácido
(< 7.0), es así como los extractos 49, 56 y 66 producidos por las morfoespecies 44 y
a b c d
70
223 en el medio YMG y 110 en CD, respectivamente presentaron pH final de 4,5 y
sólo el extracto 158 producido por la morfoespecie 150 en CD presentó pH 8,0
(Tabla 8), esta misma tendencia se presentó al analizar todos los extractos
especialmente los producidos en YMG, esto se debió probablemente a que las
cepas tienden a acidificar el medio para propiciar el desarrollo óptimo de su
metabolismo, factor que puede estar relacionado con la identidad y metabolismo de
cada cepa, ya que según Cabrera (2000), los tres suelos de donde se aislaron los
hongos eran fuertemente ácidos. Cabe mencionar que no existen muchos reportes
que relacionen la producción de metabolitos antifúngicos con el pH y por tanto no se
puede generalizar el valor del pH con un metabolito en particular, dado que esto
depende de la naturaleza del compuesto y de la composición del medio de
producción, entre otras variables.
Sin embargo, se puede mencionar que Zhang y colaboradores (2001) observaron
que durante la producción de cladospolide (antifúngico frente a Pyricularia oryzae y
Mucor racemous) el pH disminuyó desde el día 3 y al tiempo final de incubación (día
6) el pH fue de 4.8. Turner (1971) menciona que el cambio de pH del medio durante
el curso de la fermentación, depende en parte de la fuente de nitrógeno y en
algunos casos, puede tener un efecto en el metabolismo secundario.
Manteau y colaboradores (2003) observaron que con rangos de pH entre 3,0 y 6,0,
hay desarrollo del fitopatógeno, a pH menor de 4,5 y mayor de 7,0 se puede afectar
la actividad enzimática y la supervivencia de las células de B. cinerea, mientras que
a pH 7,0 se presentó el mejor crecimiento de B. cinerea y a pH 2,0 su desarrollo fue
muy escaso (Manteau et al., 2003). Aunque existen estos reportes en relación con el
pH y la interferencia en el desarrollo de B. cinerea en la actividad inhibitoria como
para el caso de los extractos 49, 56 y 66 (Tabla 9), además del pH debe
considerarse la composición del extracto si se tiene en cuenta que extractos con el
mismo pH producidos por el mismo hongo en diferente medio no tuvieron el mismo
comportamiento en la inhibición de la germinación de B. cinerea (Tabla 9). Estas
diferencias pueden estar relacionadas en gran medida con las vías de síntesis de
productos naturales, que dependiendo del medio se direccionan hacia la producción
de componentes con o sin actividad frente a la inhibición de B. cinerea.
71
Adicionalmente, para algunos extractos la actividad antifúngica sobre la germinación
de los conidios de Botrytis, pudo estar relacionada con un posible sinergismo entre
las diferentes características químicas y físicas de los EFE (Romagnoli et al., 2005).
Además de altos porcentajes de inhibición, en presencia de los EFE 49, 56 y 66 los
conidios de B. cinerea presentaron concentración del contenido citoplasmático
(Figuras 17a, 17b y 17c) en relación con el control (Figura 17e) y con el EFE 158
algunos conidios presentaron pérdida del contenido citoplasmático (Figura 17d).
Figura 17. Efecto de los extractos fúngicos 49 (a), 56 (b), 66 (c) y 158 (d) sobre la inhibición
de la germinación de conidios de B. cinerea en relación con el control (e) después de 16
horas de incubación (26 +/- 2 °C). Fotografías microscópicas 40X. Fuente: El Autor.
a b
c d
e
72
En cuanto a las cepas productoras de los extractos, se estableció que la cepa 44
pertenece al género Penicillium sp. (Figura 18a), la cepa 223 al género
Beauveria sp. (Figura 18b), la cepa 110 al género Aspergillus sp. (Figura 18c) y la
cepa 150 al género Phialophora sp. (Figura 18d), respectivamente. Y fueron
originalmente aisladas de dos (S2 - S3) de los tres suelos muestreados por Cabrera
en el Amazonas (2000). Las cepas 110, 44 y 223 se encontraban conservadas en
tubos con agar, y la cepa 150 en aceite, antes de su utilización en este estudio.
Sin embargo, sólo esta última accesión, demostró actividad antifúngica media o alta
con los dos extractos EFE (158 y 159) producidos en los dos medios de cultivo
Czapeck-Dox y YMG, respectivamente.
Figura 18. Morfoespecies de (a)Penicillium sp., (b)Beauveria sp., (c)Aspergillus sp. y
(d)Phialophora sp., cepas productoras de los extractos 49, 56, 66 y 158, respectivamente,
del grupo de inhibición alta. Fuente: El Autor.
De acuerdo con la actividad metabólica reportada por Cabrera (2000), la cepa de
Penicillium sp., morfoespecie 44, se encontraba en la categoría 2 (intermedia) de
degradación de quitina, de interés por su posible actividad lítica sobre las paredes
de B. cinerea. Esta accesión también presenta el mismo nivel de degradación de
celulosa, sin embargo este parámetro no se relaciona con la inhibición de la
germinación de los conidios de B. cinerea. Adicionalmente, la cepa 110 presentaba
a b
c d
73
actividad débil (1) en la solubilización de fosfatos y las otras 2 morfoespecies, 150 y
223, no presentaron algún nivel de actividad metabólica frente a los procesos
catabólicos evaluados (Cabrera, 2000).
En varios estudios exploratorios se relacionan los géneros Aspergillus sp.(Sugie et
al, 2001; Calvo et al, 2002; Vicente et al., 2003), Penicillium sp. (Nose et al., 2000) y
Beauveria sp. (Pohanka et al., 2004), como fuentes de productos naturales con
potencial antifúngico y de metabolitos inhibitorios, sin embargo no se encontraron
reportes para los géneros Aspergillus sp., Penicillium sp., Beauveria sp. y
Phialophora sp. en relación con la inhibición de la germinación de conidios de
B. cinerea, esto incrementa el interés del hallazgo tanto de los extractos como de las
cepas productoras para el control de B. cinerea reportadas en este trabajo.
74
5.2.2 Cuantificación de la densidad óptica en relación con el efecto de los extractos fúngicos (EFE) sobre la inhibición de la germinación de B. cinerea.
Inicialmente se probaron 4 longitudes de onda (405, 450, 492 y 620 nm) en un lector
de placas de ELISA ASYS® Hitech Expert 96, encontrando que la longitud de onda
de 405 nm presentó el mayor delta de diferencias de densidad óptica (Tabla 9),
entre las dos concentraciones evaluadas (1 x 105 y 1 x 106 conidios.ml-1) de
B. cinerea.
Tabla 9. Delta de las diferencias de la densidad óptica, para cuatro longitudes
de onda.
405 nm 450 nm 492 nm 620 nm Longitud de onda
Delta (DO)*
0,300 0,262 0,236 0,194
*Los valores corresponden al promedio de cuatro repeticiones por concentración de
B. cinerea evaluada.
Al estimar la sensibilidad de la lectura de densidad óptica frente a diferentes
concentraciones de B. cinerea, dentro del rango de 3 x 105 a 1 x 106 conidios.ml-1,
se estableció que existe una relación directamente proporcional en el tiempo 0 entre
la densidad óptica y la germinación, donde: Densidad óptica (DO) = 0.1846 *
Log10 [ ] - 0.9915 con coeficiente de correlación de 0,9417 (Tabla 10, Figura 19).
Desde el tiempo 0, la técnica es sensible a las diferentes concentraciones de
conidios de B. cinerea, como Pelloux-Prayer (et al., 1998) encontró para la variable
de respuesta, fluorescencia frente a las concentraciones de conidios de B. cinerea.
75
Tabla 10. Valores de densidad óptica para diferentes concentraciones de
B. cinerea
Concentración B. cinerea
(conidios.ml-1)
Log 10 Concentración
∆Densidad Óptica
(∆ DO405nm) 3 x 105 5,477 0,028 4 x 105 5,602 0,043 5 x 105 5,699 0,044 6 x 105 5,778 0,069 7 x 105 5,845 0,091 8 x 105 5,903 0,107 9 x 105 5,954 0,110 1 x 106 6,000 0,114
Los valores corresponden al promedio de cuatro repeticiones por concentración de
B. cinerea, corregidos con el blanco (Extracto de malta 0.1%), para obtener el delta de
densidad óptica en el tiempo 0 a 405 nm en un lector de ELISA ASYS® Hitech Expert 96.
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0,140
5,4 5,5 5,6 5,7 5,8 5,9 6 6,1
Log10 Concentración (Conidios/ml)
∆ D
O 40
5 nm
Figura 19. Curva de calibración para Botrytis cinerea, Concentración vs. Delta de densidad
óptica respecto del blanco (Extracto de malta 0.1%) en el tiempo 0 a 405nm en un lector de
ELISA ASYS® Hitech Expert 96. La ecuación de la recta obtenida fue y = 0,1846x - 0,9915,
R2= 94,17%.
76
Para comparar la inhibición de la germinación de B. cinerea con la densidad óptica,
se obtuvo el delta de densidad óptica (∆ DO) al promediar las cuatro repeticiones
por cada extracto EFE evaluado, y después de corregir con el promedio de los
blancos (Ecuación: ∆DO corregido para cada EFE a las 16h = (1DO EFE +
B. cinerea) – (2DO EFE 0h) – (3 DO B. cinerea – 4DO Extracto de Malta 0.1% 0h)
(Figura 20).
Figura 20. Disposición espacial de los tratamientos evaluados en una placa de
microtitulación de 96 pozos; 1EFE + B. cinerea: 2EFE 3B. cinerea: 4Extracto de Malta 0.1%.
De la totalidad de los datos, se retiraron 39 y 42 EFE producidos en CD y YMG
respectivamente, porque algunos presentaron densidades ópticas superiores a 0.9
(DO > 0.9) y para otros extractos el blanco (extracto EFE sin conidios de B. cinerea)
presentó coeficientes de variación superiores al 10% de la densidad óptica entre la
hora 0 respecto de la hora 16, independientemente del medio producción, también
fueron retirados de la correlación. En relación con el valor de DO el rango de
densidad óptica debe estar entre 0.1-0.9 para que la técnica presente sensibilidad y
los coeficientes de variación superiores al 10%, pueden interferir en la corrección de
los datos de la ecuación mencionada anteriormente.
Después de aplicar los criterios definidos en el numeral 4.2.3 se emplearon 47
extractos producidos en el medio Czapeck-Dox y 44 en YMG para determinar la
correlación. Después de aplicar un modelo estadístico de calibración, quedaron 28
2
1
3 4
77
extractos producidos en los medios CD (Tabla 11) y YMG (Tabla 12), indicando un
59,57 y 63,6% del total de los datos en cada medio, respectivamente; para los dos
casos el mejor ajuste se obtuvo con un modelo de calibración lineal
(STATGRAPHICS 4.2).
Para los 28 extractos EFE producidos en el medio CD (Tabla 11), con el modelo de
calibración para las dos variables analizadas, delta de densidad óptica (t 16h- 0h,
405 nm) y porcentaje de germinación de B. cinerea, existió una relación lineal
estadísticamente significativa (p< 0.01), con un 99% de confianza (STATGRAPHICS
4.2, Anexo 2). El modelo de asociación explicó en un 49,83% la variabilidad
experimental observada en el porcentaje de germinación de B. cinerea y una
relación moderadamente fuerte entre las variables, expresada por un coeficiente de
correlación de 0.70. La ecuación del modelo de asociación para los extractos en el
medio CD fue % Germinación = 28,1674 + 300,46* ∆ DO405nm 16 h (Figura 21).
Con los 28 extractos producidos en el medio YMG, también se presentó una
relación estadísticamente significativa (p<0.01) entre las variables porcentaje de
germinación de B. cinerea y el delta de densidad óptica (t 16h- 0h, 405 nm), con un
99% de confianza (STATGRAPHICS 4.2, Anexo 2). Con un modelo de asociación
lineal se explicó en un 49,17% la variabilidad observada experimentalmente en el
porcentaje de germinación de B. cinerea con una relación moderadamente fuerte
entre las variables, expresada con un coeficiente de correlación de 0.73. La
ecuación del modelo de asociación para los extractos del medio YMG fue
% Germinación = 30,5577 + 443,166* ∆ DO405nm 16 h (Figura 22).
78
Tabla 11. Extractos fúngicos extracelulares producidos en el medio
Czapeck-Dox, empleados para la correlación entre el porcentaje de germinación para B. cinerea y el delta de densidad óptica (405 nm).
Extracto EFE
% Germinación de B. cinerea1
% Inhibición de la Germinación de B. cinerea DO2 16 h 3∆ DO405nm
82 37,01 52,1 0,284 0,091 114 37,39 30,3 0,204 0,048 86 40 45,3 0,214 0,046 135 43,12 45,9 0,28 0,096 128 46,55 35,2 0,256 0,07 38 53,4 22,2 0,372 0,106 96 53,85 22,3 0,331 0,142 104 54,17 18,3 0,22 0,059 151 56,64 19,5 0,316 0,103 130 60,38 15,2 0,337 0,129 120 60,48 15,1 0,359 0,124 72 61,79 18,1 0,617 0,072 146 61,95 5,7 0,331 0,156 36 63,39 12,2 0,341 0,164 74 63,57 9,8 0,323 0,163 48 64,42 15,4 0,3 0,117 153 65,45 16,3 0,242 0,123 70 67,92 8,2 0,339 0,152 148 69,17 15,1 0,258 0,11 68 71,65 1,7 0,586 0,119 133 73,68 6,2 0,491 0,155 164 74,04 0 0,312 0,14 174 75,89 8,4 0,269 0,104 31 75 2,4 0,414 0,149 116 81,1 0 0,392 0,12 76 94,12 0 0,337 0,148 168 95 0 0,327 0,191 26 95 0 0,477 0,156
1 Germinación de B. cinerea presencia del extracto, 2 Densidad óptica en presencia del
extracto, 3 delta de la diferencia entre el tiempo 0 y 16h, después de corregir con los blancos.
79
0 0,04 0,08 0,12 0,16 0,237
47
57
67
77
87
97
Figura 21. Modelo de calibración lineal entre las variables delta de densidad óptica (405 nm)
y % de germinación de los extractos fúngicos producidos en el medio Czapeck-Dox, p<0.01.
(STATGRAPHICS, 4.2)
0 0,04 0,08 0,12 0,160
20
40
60
80
100
Figura 22. Modelo de calibración lineal entre las variables delta de densidad óptica (405 nm)
y % de germinación de los extractos fúngicos producidos en el medio YMG, p<0.01
(STATGRAPHICS, 4.2)
Delta de Densidad óptica (405 nm) después de 16 h
% d
e G
erm
inac
ión
de B
. cin
erea
Delta de Densidad óptica (405 nm) después de 16 h
% d
e G
erm
inac
ión
de B
. cin
erea
80
Tabla 12. Extractos fúngicos extracelulares producidos en el medio YMG,
empleados para la correlación entre el porcentaje de germinación para B. cinerea y el delta de densidad óptica (405 nm).
Extracto EFE
% Germinación de B. cinerea1
% Inhibición de la Germinación de B. cinerea DO2 16 h 3∆ DO405nm
8 0 75,6 0,286 0 159 3,64 72 0,359 0 56 7,14 85,6 0,314 0,028 37 30,69 59,7 0,591 0
167 50 35,3 0,283 0,047 147 52,42 14 0,419 0,066 27 58,06 26,2 0,419 0,1
157 62,39 15,9 0,675 0,064 149 71,61 0 0,422 0,14 175 71,96 0,5 0,271 0,035 30 75,7 13,4 0,315 0,099 47 78,07 3,7 0,29 0,105 83 78,38 0 0,567 0,043 87 78,64 11,8 0,391 0,103
127 80,53 8,5 0,456 0,15 165 80,65 3,7 0,631 0,135 93 81,13 0,6 0,27 0,027 4 81,52 7,5 0,409 0,073
95 83,33 0 0,437 0,111 117 83,48 0,8 0,427 0,152 107 84,4 0 0,268 0,152 51 86,21 2,8 0,359 0,122
123 87,16 0 0,443 0,05 119 95 0 0,262 0,1 150 95 0 0,578 0,092 81 95,83 0 0,807 0,138 41 97,14 0 0,346 0,112
1 Germinación de B. cinerea presencia del extracto, 2 Densidad óptica en presencia del
extracto, 3 delta de la diferencia entre el tiempo 0 y 16h, después de corregir con los blancos.
81
Cabe resaltar que el valor de la pendiente (443,166) de la ecuación del modelo de
asociación para los extractos producidos en YMG es mayor que la pendiente
(300,46) de la ecuación del modelo de asociación para los extractos producidos en
Czapeck Dox, esto indica que con los extractos producidos en el primer medio la
técnica es más sensible a las variaciones entre los datos de porcentaje de
germinación de B. cinerea y delta de densidad óptica a las 16h.
El modelo de calibración lineal con los extractos producidos en el medio YMG
(Figura 22), permitió inferir que se presentan dos grupos o categorías definidas una
con valores de porcentaje de germinación de B. cinerea de 0 a 40 % y deltas de
densidad óptica entre 0 y 0,04 y otro grupo con valores de porcentaje de
germinación de B. cinerea y deltas de densidad óptica superiores a 40 % y 0,04,
respectivamente (Figura 22), porque a partir de estos valores de germinación y de
densidad óptica los datos se dispersan, probablemente por el número de conidios
germinados e hifas con diferentes longitudes del tubo germinal. Por tanto, bajo las
condiciones del ensayo in vitro en microplacas desarrollado en este trabajo, se
puede considerar que un extracto fúngico extracelular producido en el medio YMG,
ubicado dentro del rango de delta de densidad óptica menor a 0.04 después de 16
horas de incubación con 5 x 105 conidios/ ml de B. cinerea a 26°C, puede tener
potencial para la inhibición de la germinación del fitopatógeno B. cinerea.
Los extractos fúngicos obtenidos con el medio YMG mostraron ser más
convenientes para su evaluación mediante turbidimetría, porque existen menos
variaciones en relación con el color de los mismos, mientras que la producción con
el medio Czapeck-Dox condujo a un mayor número de extractos pigmentados
respecto de YMG (Tablas 4, 5 y 6), incrementando la interferencia originada por el
color de los extractos en la densidad óptica y, por ende afectando la correlación de
los datos de porcentaje de germinación de B. cinerea y delta de densidad óptica
leída, después de 16h a una longitud de 405 nm. Además, el modelo de calibración
con los extractos producidos en CD no relaciona porcentajes de germinación
inferiores al 37% con deltas de densidad óptica (Figura 21). La mejor correlación se
presentó cuando se analizaron extractos dentro de la gama del amarillo,
principalmente producidos con el medio YMG.
82
Para los extractos codificados como EFE 49 y 56, producidos en el medio YMG,
pertenecientes al grupo 3 de inhibición alta (Figura 15), después de corregir con los
controles (extracto de malta 0.1%, extracto EFE sin conidios y testigo 1 x 105
conidios.ml-1 de B. cinerea en extracto de malta 0.1%) después de 16h de
incubación se observaron en el tiempo cero, valores de absorbancia (A405) inferiores
(Tabla 13) a los presentados en los pozos que contenían 5 x 105 conidios/ ml de B.
cinerea en combinación con el extracto de malta 0.1% únicamente.
Tabla 13. Relación entre el porcentaje de Inhibición de la germinación de B. cinerea y el delta de densidad óptica (405 nm), obtenido con los extractos
49 y 56, del grupo 3 de inhibición alta.
A405 Extracto EFE*
% Inhibición B. cinerea1 Extracto2
49 (1) 86,1 0,090 0,045
56 (2) 85,6 0,108 0,028
* Extractos producidos en el medio YMG por las morfoespecies 3-44 (1) y 3-223 (2). 1Promedio del valor de absorbancia (A405) para 5 x 105 conidios/ ml de B. cinerea en combinación con el extracto de malta 0.1% menos el valor en el tiempo cero para los mismos pozos. 2Promedio de 4 repeticiones de los valores de absorbancia (A405) después de 16 horas de incubación, corregidos con los controles y con el promedio de densidad óptica del testigo patógeno, en el tiempo inicial (hora 0) donde ∆ Densidad óptica (DO) en el Extracto = DO Blanco (Extracto de malta 0.1% más Extracto EFE) (0 h) – DO 1 x 105 conidios.ml-1 de en extracto de malta 0.1% (0 h).
Los bajos valores de densidad óptica para los extractos 49 y 56 (Tabla 13), se
relacionan con el porcentaje de inhibición de la germinación de B. cinerea, indicando
que a menores deltas de densidad óptica en comparación con el testigo patógeno,
mayores son los porcentajes de inhibición de la germinación del mismo.
Después de leer la densidad óptica (DO)(λ=405nm) en el tiempo inicial (t 0h), se
observó para el testigo patógeno diferencias entre los valores de densidad óptica,
razón por la que se hizo necesario determinar si existían diferencias en la
concentración inicial inoculada en cada uno de los pozos que llegaran a interferir
con la correlación de los datos en los dos medios de producción (CD y YMG);
83
después de transformar logarítmicamente los datos de concentración de B. cinerea
se encontró, un coeficiente de variación del 2,5% entre todas las repeticiones de los
bloques en el tiempo (>75 datos), indicando que en promedio se inoculó una
concentración de 4,5 x 105 conidios/ml (Log 10 : 5,657, desviación estándar (DS):
0.144, coeficiente de variación (CV): 2.5%) con un rango entre 3,0 x 105 y 7,7 x 105
conidios.ml-1 de B. cinerea y después de reemplazar en la ecuación de la curva de
calibración (Figura 19). En razón a estas variables, derivadas del empleo de hongos
filamentosos cuyo crecimiento no es tan fácil de cuantificar mediante turbidimetría
(Mischke, 1997) en comparación a microorganismos unicelulares (bacterias y
levaduras), no se encontraron reportes que correlacionen los parámetros evaluados
en este trabajo (% germinación y densidad óptica 405nm). Debe considerarse que la
germinación altera la medición de la densidad óptica sólo de forma limitada durante
las primeras 18h, ya que la mayoría de los cambios en la DO ocurren una vez los
conidios de B. cinerea han germinado y comenzado el crecimiento micelial para
experimentar la curva de crecimiento observada en los hongos filamentosos
(Wedge, 2005 comunicación). Por tanto, la densidad óptica correlaciona la fase de
crecimiento micelial, pero sólo hasta un tiempo óptimo cuando existe una sola capa
de micelio fúngico en el fondo de cada pozo, ya que a tiempos superiores las
lecturas que se generen pueden ser inexactas (Abril, 2005 comunicación).
Debido a lo anterior, en este trabajo no se encontró una relación clara entre el
porcentaje de germinación obtenido para el testigo patógeno, que osciló dentro del
rango de 60-90% de germinación en promedio, frente a los delta de densidad óptica
(405nm). No obstante, se evidenció una tendencia hacia el aumento del valor de
densidad óptica de B. cinerea después de 16 horas de incubación.
Además, al comparar la densidad óptica en el tiempo 0 para las lecturas del blanco
extracto de malta 0.1%, se observaron diferencias en los datos (>75) con un valor
promedio densidad óptica de 0.093, con un coeficiente de variación mayor al 15%
(coeficiente de variación (CV): 17,07; desviación estándar (DS): 0,016), estos
resultados de coeficiente de variación son muy altos para una solución de un
reactivo estándar y, probablemente también influyeron en la corrección del testigo
patógeno y por ende en los demás tratamientos (extractos EFE). De acuerdo con
84
Gehrt y colaboradores (1995), para propósitos de estandarización de este tipo de
técnicas turbidimétricas la concentración o tamaño del inóculo es considerado como
una variable crítica, que influye en la interpretación y correlación de los datos. Por lo
tanto, la concentración del inóculo para B. cinerea puede ser ajustada previamente
usando la curva de calibración obtenida, como se menciona en el documento M38-A
para la evaluación de antifúngicos frente a hongos filamentosos (NCCLS, 2002;
Salah et al., 2003).
Sin embargo, cuando se quiere usar la densidad óptica para medir crecimiento
fúngico, se observó mayor dispersión de los datos, lo cual concuerda con lo
obtenido por Paxton (1991) quien encontró un comportamiento disperso en el
crecimiento de muchos hongos filamentosos, lo que hace que la densidad de
conidios germinados no siempre sea uniforme en todas las suspensiones (Hadacek
y Greger, 2000), ya que aunque se presente germinación, no todos los tubos
germinales tienen el mismo tamaño; este fenómeno y el efecto de los extractos
puede interferir en la absorción de la longitud de onda emitida (Paxton, 1991; citado
por Hadacek y Greger, 2000). Además, al corregir los tratamientos EFE (extracto
EFE más 5 x 105 conidios/ml de B. cinerea en extracto de malta 0.1%) con el valor
de densidad óptica del extracto EFE control (sin conidios de B. cinerea) los datos
pueden indicar que no es el resultado de un factor aditivo por la diferencia de
colores y componentes del extracto crudo, haciendo que los deltas de densidad
óptica a las 16h no estén directamente relacionados entre sí, esto último sólo para
los EFE pigmentados.
Aunque en investigaciones previas se han evaluado estos dos parámetros, la
medición del crecimiento de B. cinerea en ocasiones se ha cuantificado por
detección visual de los pozos en la placa de ELISA con la ayuda de un
estereoscopio o espejo invertido (NCCLS, 2002; Pohanka et al., 2004) y aunque
Wilson y colaboradores (1997) realizaron recuento en microscopio, no hay una
correlación establecida reportada que explique la relación entre variables, lo cual es
necesario con miras al desarrollo de protocolos de alta eficiencia para la evaluación
y selección de compuestos antifúngicos.
85
Los resultados derivados de este trabajo en relación con la técnica, son una primera
aproximación de la asociación existente entre el porcentaje de germinación de
B. cinerea y el delta de densidad óptica (405nm), después de 16h, en un formato de
placas de microtitulación; aunque la técnica presentó limitaciones podría ser
utilizada para la evaluación preliminar de compuestos antifúngicos para determinar
su efecto en el control de B. cinerea. Sin embargo, ésta debe ser complementada
por determinación microscópica para detectar anomalías morfológicas por el efecto
de los metabolitos potencialmente inhibitorios.
5.3 ENSAYOS in Planta. 5.3.1 Selección del Bioensayo.
Ambos modelos (Foliolos y tallos), permitieron el desarrollo de la enfermedad,
expresada en valores de incidencia del 100% (Figuras 23 y 24). Sin embargo, la
aplicación puntual del patógeno en el ápice de los foliolos permitió evidenciar el
progreso del moho gris a lo largo de la estructura foliar, permitiendo evaluar el
avance del fitopatógeno. Por lo tanto, se seleccionó el método de aplicación puntual
respecto al de aspersión, ya que en este último no hay una sintomatología constante
y la lectura de los datos podría ser subjetiva sino se tiene un analizador de
imágenes.
Figura 23. Incidencia de B. cinerea en foliolos de tomate vs. modo de aplicación puntual o
por aspersión.
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15Días después de la Inoculación
Inci
denc
ia d
e la
infe
cció
n (%
)
Puntual
Aspersión
86
Figura 24. Incidencia de B. cinerea en tallos de tomate vs. modo de aplicación puntual o por
aspersión.
5.3.2 Evaluación de la actividad antifúngica de los extractos en ensayos in planta. Los extractos 49 y 66, producidos por las morfoespecies 44 (Penicillium sp.) y 110
(Aspergillus sp.), en los medios YMG y Czapeck-Dox, respectivamente y
seleccionados en los análisis estadísticos de agrupamiento (Figuras 12 y 13) dentro
del grupo 3 de inhibición alta de la germinación de B. cinerea, no fueron incluidos
dentro de los análisis de los resultados de fitoprotección contra B. cinerea, ya que
presentaron fitotoxicidad sobre los foliolos de tomate, desde los primeros días de la
inoculación (Figuras 25 y 26).
La inoculación puntual del patógeno sobre el ápice de la hoja, permitió evidenciar el
progreso de la enfermedad moho gris desde el sitio de inoculación (Figura 27). Sin
embargo, algunas hojas presentaron signos y síntomas del patógeno en otros sitios,
indicando que el inóculo de B. cinerea pudo desplazarse desde el punto inicial hasta
otros lugares de la superficie foliar, donde los conidios probablemente encontraron
las condiciones favorables para la colonización del huésped. Lo que en el testigo
patógeno, se tradujo en valores de incidencia del 100% después de 19 días (Figura
28), resultados que contrastan con los obtenidos cuando los foliolos fueron tratados
con los extractos fúngicos extracelulares, EFE 56 y 158 producidos con las
morfoespecies 223 y 150 en los medios YMG y Czapeck-Dox, respectivamente,
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20Días después de la Inoculación
Inci
denc
ia d
e la
Infe
cció
n %
PuntualAspersión
87
Figura 25. Fitotoxicidad sobre los foliolos de tomate en presencia del extracto 49 (a y b)
después de los primeros 8 días de inoculación en relación con el control no tratado (c).
Fuente: El Autor.
Figura 26. Fitotoxicidad sobre los foliolos de tomate en presencia del extracto 49 (a y b)
después de los primeros 8 días de inoculación en relación con el control no tratado (c).
Fuente: El Autor.
a b c
a b c
88
donde se presentaron porcentajes de incidencia de la enfermedad del 43.75 y
87.5% de incidencia (Figura 28), respectivamente.
Figura 27. Progreso del moho gris sobre los foliolos 8(a), 11(b), 13(c) y 19(d) días después
de la inoculación. Fuente: El Autor.
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20
Días después de la Inoculación
% d
e In
cide
ncia
Bo 56 158
Figura 28. Curva de progreso de la incidencia de la enfermedad moho gris en los foliolos de
Tomate.
a b c d
89
0,0010,0020,0030,0040,0050,0060,0070,0080,0090,00
100,00
% In
cide
ncia
56 158 Bo
Figura 29. Porcentaje de incidencia del moho gris, a los 19 d después de la inoculación
B. cinerea, en los foliolos de Tomate. Las columnas con la misma letra no son
significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de Fisher LSD (P< 0,05).
Mediante la prueba de Fisher de diferencia de medias de mínimos significativos, se
observaron diferencias significativas (P< 0.05) en la incidencia del patógeno cuando
los foliolos se trataron con el extracto EFE 56 obtenido a partir de la morfoespecie
223 en YMG, frente al testigo patógeno y el extracto 158 obtenido por la
morfoespecie 150 en Czapeck-Dox en el último día de lectura (Figura 29). Desde el
día 8 hubo diferencias significativas entre los dos extractos, presentándose valores
del 12,5% y 41.67% de incidencia, respectivamente (Figura 28). En el día 19 los
tratamientos EFE 158 y el testigo patógeno no presentaron diferencias
estadísticamente significativas, para este parámetro de evaluación (Figura 29).
Para obtener el porcentaje de severidad se empleó el analizador de imágenes
Image J 1.33 u., de esta manera, se obtuvieron los diferentes datos de porcentaje
de área con signos y síntomas de Botrytis (Figura 30), esto permitió determinar el
incremento del Área bajo la Curva (UABC) para cada uno de los tratamientos
(Figura 31).
Tratamientos
b
a
a
Tratamientos
90
Figura 30. Menores porcentajes de área foliar con moho gris en presencia del extracto 56 (a,
día 13 y b, día 19) en relación con el testigo patógeno (c, día 19) y en presencia del extracto
158 (d, día 19). Fuente: El Autor.
0
100
200
300
400
500
600
700
0 6 8 11 13 19Días después de la Inoculación
Uni
dade
s de
Áre
a B
ajo
la C
urva
(U
ABC
)
56 Bo 158
Figura 31. Progreso de la severidad de la enfermedad moho gris en los foliolos de Tomate,
expresado en unidades de área bajo la curva (UABC).
a b c d
91
En lo que se refiere al porcentaje de severidad, se encontraron resultados
estadísticamente similares a los obtenidos para incidencia, ya que tampoco hubo
diferencias significativas entre la severidad observada en el testigo patógeno
(45,60%) y la observada cuando las hojas se trataron con el extracto (158)
proveniente de la morfoespecie 150 (66,06%) en el día 19 después de la
inoculación, pero sí se observaron diferencias frente al tratamiento con el extracto
56 (11,88%), proveniente de la morfoespecie 223, en el que si se presentaron
porcentajes de área enferma, estadísticamente diferentes P< 0,05 (Figura 33).
Aunque esta tendencia se conservó, con el análisis de varianza para la medias de
las unidades de área bajo la curva (UABC) en este mismo tiempo de lectura (19 d),
el extracto 56 sólo fue significativamente diferente respecto del extracto 158, pero
no frente al testigo patógeno. Para los que se presentaron valores promedio de
75.14 UABC, 354.88 UABC y 206.948 UABC, respectivamente (Figura 31, Anexo 3).
La diferencia de medias entre tratamientos, se observó a partir del día 13, para el
extracto 158 respecto de los otros dos tratamientos.
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
% S
ever
idad
56 Bo 158
Figura 32. Porcentaje de severidad de la enfermedad moho gris, a los 19 d después de la
inoculación de B. cinerea, en foliolos de tomate. Los valores son un promedio de
repeticiones de las áreas de lesión obtenidas con el programa Image J 1.33u. Las columnas
con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de Fisher
LSD (P< 0,05).
a
a
b
Tratamientos
92
El extracto 56 fue seleccionado como el más eficaz por presentar niveles de UABC
significativamente menores al presentado por el extracto 158, resultando en
porcentajes de reducción de la severidad de la enfermedad del moho gris superiores
al 70%, al finalizar el bioensayo (día 19) (Tabla 14).
Tabla 14. Porcentajes de Severidad y Eficacia, para el tratamiento EFE 56, después de 19 días de inoculación de B. cinerea Bo004.
Tratamiento % Severidad % Eficacia
EFE 56 11,83* 74,07
EFE 158 66,06 0
Los datos corresponden al promedio de cuatro repeticiones. *; Difiere significativamente
(P<0,05; F-test) del tratamiento EFE 158 y del testigo patógeno. Elad y Kapat, 1999, con el extracto fúngico de dos cepas de T. harzianum T39 y
NCIM1185 consiguieron una disminución de la severidad entre el 56 y el 100% y
entre el 30 y el 75%, respectivamente, este último valor es muy similar al porcentaje
de eficacia (74,07%) con el extracto EFE 56 con el que se obtuvo una significativa
reducción de la severidad (Tabla 14) especialmente cuando el aumento en la
incidencia se presentó en el último día de lectura (19 días).
Si se tiene en cuenta que la producción de las enzimas de B. cinerea proteasa
ácida, poligalacturonasas y lacasa, importantes en la patogénesis tienen un rango
óptimo de producción de pH de 4 a 6 (Manteau et al., 2003), en el presente trabajo
se presentó inhibición del fitopatógeno aún cuando el pH de el extracto 56 fue de
4.5, donde existen las condiciones propicias para la infección del huésped (Manteau
et al., 2003), lo que sugeriría que el efecto inhibidor se debe a otros factores
diferentes del pH presentes en dicho extracto. Aunque, el extracto EFE 158 pudo
tener un efecto en relación a este parámetro, debido a que presenta un pH de 8,0,
los resultados de incidencia y severidad (Figuras 29 y 32) demuestran que no hubo
inhibición de los síntomas y signos de B. cinerea indicando que puede no
93
correlacionarse la actividad in vitro con la presentada sobre los foliolos de tomate
(Fravel, 1988), infiriéndose que el extracto puede tener un efecto fungistático sobre
los conidios de B. cinerea in vitro, debido a que probablemente retrasó la
germinación in vitro pero permitió la infección sobre los foliolos de tomate (López-
García et al., 2000).
Respecto a los otros tratamientos EFE 49 y 66, que presentaron fitotoxicidad
(Figuras 25 y 26) se puede sugerir en la presencia de toxinas en los extractos 49 y
66 producidas por las morfoespecies de 44 y 110 correspondientes a los géneros
Penicillium sp. y Aspergillus sp. respectivamente, lo cual es concordante con lo
reportado por varios autores con el género Aspergillus sp. que encontraron que
algunos de sus metabolitos son fitotóxicos (Fravel, 1988; Evidente et al., 1996).
Cabe mencionar que es de interés el hallazgo del extracto 56 producido por la cepa
de Beauveria sp. (Figura 33), en relación con el control del moho gris in vitro e in
planta, indicando que puede llegar a convertirse en una alternativa para el
tratamiento del moho gris.
Figura 33. Beauveria sp. cepa 223, productora del extracto 56. Fuente: El Autor.
94
6. CONCLUSIONES
• Varios de los hongos del Amazonas evaluados demostraron ser una fuente
de compuestos con potencial para la inhibición de la germinación de
Botrytis cinerea.
• Se seleccionó un extracto (EFE 56) producido por Beauveria sp. por
presentar alta inhibición de Botrytis cinerea tanto in vitro (85,6%) como
in planta (74,07%), este es el primer reporte para la inhibición de este
fitopatógeno con Beauveria sp.
• La evaluación preliminar de EFE en el formato de placas microtitulación
demostró ser una técnica sencilla, eficiente y con potenciales aplicaciones
para otros procesos exploratorios, sin embargo está sujeta a las propiedades
de los extractos evaluados.
• Se seleccionó el bioensayo de aplicación puntual del patógeno en el ápice
de los foliolos de tomate, por mostrar mayor sensibilidad en relación con el
progreso del moho gris.
95
7. RECOMENDACIONES
• Caracterizar el extracto seleccionado (EFE 56) y evaluar la factibilidad de su
desarrollo como un producto fitoprotectante contra Botrytis cinerea.
• Continuar con estudios de bioprospección para buscar EFE crudos y nuevas
moléculas con alta actividad frente a la inhibición de Botrytis cinerea y de
otros fitopatógenos.
• Desarrollar una curva de crecimiento para Botrytis cinerea en el formato de
placas de microtitulación y cuantificar la longitud de los tubos germinales,
para determinar su efecto en la correlación de la densidad óptica con la
inhibición de la germinación.
• Evaluar in planta la actividad de los extractos fúngicos extracelulares (EFE)
ubicados dentro del grupo de inhibición media de la germinación de
Botrytis cinerea in vitro.
96
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9. ANEXOS
ANEXO 1
Medios de Cultivo
Czapeck-Dox g/L
Sacarosa 30,0
NaNO3 2,0
MgSO4 0,244
KCl 0,5
FeSO4 0,01
K2HPO4 1,0
Tween 80 1,0
YMG g/L
Extracto de Levadura 4,0
Extracto de Malta 10,0
Sacarosa 10,0
Tween 80 1,0
Agar Saboureaud g/L
Peptona Universal 2,0
Sacarosa 3,0
Agar 20,0
110
Agar Papa Dextrosa (PDA) g/L
Papa 200,0
Dextrosa 10,0
Agar 20,0
111
ANEXO 2 Modelo de calibración lineal para los EFE producidos en Czapeck-Dox Calibration Models
Y (measured): GX (actual): Deltaabs16
Linear model: Y = a + b*X----------------------------------------------------------------------------- Standard TParameter Estimate Error Statistic P-Value-----------------------------------------------------------------------------Intercept 28,1674 7,40452 3,80409 0,0008Slope 300,46 59,1177 5,0824 0,0000-----------------------------------------------------------------------------
Analysis of Variance-----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value-----------------------------------------------------------------------------Model 3406,41 1 3406,41 25,83 0,0000Residual 3428,73 26 131,874----------------------------------------------------------------------------- Lack-of-Fit 2882,58 25 115,303 0,21 0,9608 Pure Error 546,151 1 546,151-----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 6835,14 27
Correlation Coefficient = 0,705951R-Squared = 49,8367 percentStandard Error of Est. = 11,4836
Residual Analysis--------------------------------- Estimation Validationn 28 MSE 131,874 MAE 9,106 MAPE 14,7229 ME -7,61296E-15 MPE -3,05431
The StatAdvisor--------------- The output shows the results of fitting a linear model to describethe relationship between G and Deltaabs16. The equation of the fittedmodel is
G = 28,1674 + 300,46*Deltaabs16
Because the P-value in the ANOVA table is less than 0.01, there is astatistically significant relationship between G and Deltaabs16 at the99% confidence level.
The R-Squared statistic indicates that the model as fitted explains49,8367% of the variability in G. The correlation coefficient equals0,705951, indicating a moderately strong relationship between thevariables. The standard error of the estimate shows the standarddeviation of the residuals to be 11,4836. This value can be used toconstruct prediction limits for new observations by selecting theForecasts option from the text menu.
The lack of fit test is designed to determine whether the selectedmodel is adequate to describe the observed data, or whether a morecomplicated model should be used. The test is performed by comparing
112
Modelo de calibración lineal para los EFE producidos en YMG Calibration Models
Y (measured): GX (actual): Deltaabs16h
Linear model: Y = a + b*X----------------------------------------------------------------------------- Standard TParameter Estimate Error Statistic P-Value-----------------------------------------------------------------------------Intercept 30,5577 7,48327 4,08347 0,0004Slope 443,166 79,4658 5,57681 0,0000-----------------------------------------------------------------------------
Analysis of Variance-----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value-----------------------------------------------------------------------------Model 13445,5 1 13445,5 31,10 0,0000Residual 11240,3 26 432,321----------------------------------------------------------------------------- Lack-of-Fit 9897,16 21 471,293 1,75 0,2779 Pure Error 1343,19 5 268,639-----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 24685,9 27
Correlation Coefficient = 0,738014R-Squared = 54,4665 percentStandard Error of Est. = 20,7923
Residual Analysis--------------------------------- Estimation Validationn 28 MSE 432,321 MAE 16,0452 MAPE ME 1,01506E-15 MPE
The StatAdvisor--------------- The output shows the results of fitting a linear model to describethe relationship between G and Deltaabs16h. The equation of thefitted model is
G = 30,5577 + 443,166*Deltaabs16h
Because the P-value in the ANOVA table is less than 0.01, there is astatistically significant relationship between G and Deltaabs16h atthe 99% confidence level.
The R-Squared statistic indicates that the model as fitted explains54,4665% of the variability in G. The correlation coefficient equals0,738014, indicating a moderately strong relationship between thevariables. The standard error of the estimate shows the standarddeviation of the residuals to be 20,7923. This value can be used toconstruct prediction limits for new observations by selecting theForecasts option from the text menu.
The lack of fit test is designed to determine whether the selectedmodel is adequate to describe the observed data, or whether a morecomplicated model should be used. The test is performed by comparing
113
ANEXO 3 Análisis de comparación de medias para los porcentajes de incidencia en el día 19. Prueba de Fisher LSD (α=0.95) Multiple Range Tests for Col_6 by Col_4
--------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSDCol_4 Count Mean Homogeneous Groups--------------------------------------------------------------------------------5619 4 43,75 X 15819 4 87,5 X419 3 100,0 X--------------------------------------------------------------------------------Contrast Difference +/- Limits--------------------------------------------------------------------------------419 - 5619 *56,25 43,3377 419 - 15819 12,5 43,3377 5619 - 15819 *-43,75 40,1229 --------------------------------------------------------------------------------* denotes a statistically significant difference.
The StatAdvisor--------------- This table applies a multiple comparison procedure to determinewhich means are significantly different from which others. The bottomhalf of the output shows the estimated difference between each pair ofmeans. An asterisk has been placed next to 2 pairs, indicating thatthese pairs show statistically significant differences at the 95,0%confidence level. At the top of the page, 2 homogenous groups areidentified using columns of X's. Within each column, the levelscontaining X's form a group of means within which there are nostatistically significant differences. The method currently beingused to discriminate among the means is Fisher's least significantdifference (LSD) procedure. With this method, there is a 5,0% risk ofcalling each pair of means significantly different when the actualdifference equals 0.
114
Análisis de comparación de medias para los porcentajes de severidad en el día 19. Prueba de Fisher LSD (α=0.95) Multiple Range Tests for Col_5 by Col_4
--------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent LSDCol_4 Count Mean Homogeneous Groups--------------------------------------------------------------------------------5619 4 11,8825 X 419 3 45,6067 X15819 4 66,0625 X--------------------------------------------------------------------------------Contrast Difference +/- Limits--------------------------------------------------------------------------------419 - 5619 *33,7242 24,1302 419 - 15819 -20,4558 24,1302 5619 - 15819 *-54,18 22,3402 --------------------------------------------------------------------------------* denotes a statistically significant difference.
The StatAdvisor--------------- This table applies a multiple comparison procedure to determinewhich means are significantly different from which others. The bottomhalf of the output shows the estimated difference between each pair ofmeans. An asterisk has been placed next to 2 pairs, indicating thatthese pairs show statistically significant differences at the 95,0%confidence level. At the top of the page, 2 homogenous groups areidentified using columns of X's. Within each column, the levelscontaining X's form a group of means within which there are nostatistically significant differences. The method currently beingused to discriminate among the means is Fisher's least significantdifference (LSD) procedure. With this method, there is a 5,0% risk ofcalling each pair of means significantly different when the actualdifference equals 0.