scopi della biologia strutturale struttura delle proteine...
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Metodi di determ
inazione della struttura delle proteine
Scopi della biologia strutturale
•A
nalisi del dettaglio atomico delle com
ponenti biologiche di cellule e tessuti
•A
nalisi del dettaglio atomico delle reazioni
biologiche•
Comprensione dei processi biologici in sede
normale, pre-patologica e patologica
•Com
prensione delle relazioni tra struttura e funzione
• D
isegno di farmaci basati sulla struttura
Metodi sperim
entali per determinare la struttura
delle macrom
olecole
Alta risoluzione
cristallografia a raggiX | N
MR | cristallografia elettronica
Media risoluzione
microscopia elettronica | diffrazione di fibre | Spettro-
metria di m
assa | SAX
S | Microscopia a Forza A
tomica
Metodi Spettroscopici
NM
R | dicroismo circolare | A
ssorbanza | Fluorescenza | Fluorescenza anisotropa | diffusione della luce
Metodi C
himici
scambio H
-D | m
utagenesi sito specifica | modificazioni
chimiche | proteom
ica
Metodi term
odinamici
Equilibrio di (un)folding
Metodi com
putazionali predizione della struttura delle Proteine | D
ocking m
olecolare
M
etodologie
•M
icroscopia a forza atomica
•M
icroscopia elettronica
•Risonanza m
agnetica nucleare
•Cristallografia a raggi XCristallografia a raggi X
Microscopia a forza atom
ica•
Tecnica nanoscopica per studiare la morfologia di
macrom
olecole biologiche in condizioni fisiologiche•
Modo d’azione: una punta (m
ax. 50µm), collegata ad un
sistema di leve di precisione, scansiona il cam
pione!
imm
agine topografica•
Misura le proprietà chim
ico-fisiche del campione
! forze interatom
iche, magnetiche o elettrostatiche
•Capace di m
onitorare quantitativamente le reazioni
biochimiche
Microscopia a forza atom
ica•
Un esem
pio: organizzazione delle molecole di
acquaporina umana nel doppio strato fosfolipidico
Denaturazione m
eccanica
Variazione di forza ionica10nm
10nm
Microscopia Elettronica
•Perm
ette lo studio di cellule, strutture subcellulari, particelle virali, m
acromolecole e com
plessi m
acromolecolari con m
assa > 200kDa
•Il cam
pione viene visualizzato direttamente perché i
fasci di elettroni possono essere focalizzati da lenti elettrom
agnetiche•
È la tecnica elettiva per proteine di mem
brana e com
plessi supramolecolari non adatti per analisi N
MR
o raggiX
Microscopia Elettronica
Un esem
pio: acquaporina um
ana a 4Å di
risoluzione
Risonanza Magnetica N
ucleare•
Tecnica spettroscopica per lo studio della struttura di m
acromolecole a risoluzione atom
ica
•È basata sull’interazione dei singoli nuclei atom
ici m
agneticamente attivi ( 1H
, 15N, 13C e 31P) con il cam
po magnetico
esterno e con i campi m
agnetici dei nuclei adiacenti
•Il cam
pione viene analizzato in soluzione e in condizioni fisiologiche
•L’im
magine 3D
non è diretta, ma ricostruita
•Lim
itata a campioni !50kD
a
•Produce inform
azioni sulla dinamica, sulle conform
azioni, sul folding e sulle interazioni interm
olecolari
NM
R: un esperimento tipo
Cristallografia a raggi XCristallografia a raggi X
•A
ttualmente tecnica di elezione per la determ
inazione di strutture 3D
a risoluzione atomica
•Tecnica indiretta: l’im
magine va ricostruita
•N
on ci sono limitazioni nelle dim
ensioni delle macrom
olecole
•Svantaggi:–
cristalli singoli–
altamente ordinati
–ragionevolm
ente grandi (80-100!M
)
Perché i raggi X?
Per poter visualizzare due oggetti come entità separate, la
lunghezza d’onda della radiazione elettromagnetica deve
essere dello stesso ordine di grandezza della distanza tra gli oggettidistanza interatom
ica "1Å!
raggiX = 0.1÷2Å
" con i raggiX
“vedo” gli atomi
Perché cristallografiacristallografia e non
miscroscopia a raggiX
?
Non esistono lenti in grado di focalizzare i raggiX
"
la matem
atica ci viene in aiuto
Piano del-l’im
magine
Piano focale, contenente l’imm
agine di diffrazione
Imm
agine dell’oggetto
Formazione di un’im
magine otticaL’im
magine dell’oggetto e
l’imm
agine di diffrazione sono in relazione tra di loro tram
ite una trasformata di
Fourier
Ora, separiam
o la lente in due metà:Im
magine
dell’oggetto(diffrazione di una diffrazione)
Piano focale, contenente l’im
magine di diffrazione
Trasformata di
Fourier “fisica”Trasform
ata di Fourier “m
atematica”
L1
L2
L’imm
agine dell’oggetto è una TF della diffrazione La diffrazione è una TF dell’oggetto
… perché un cristallo?
MA
: - è troppo debole (!segnale/rum
ore) - im
possibile separarla dalla radiazione di fondo (aria + soluzione)!
è praticamente im
possibile ricostruire la molecola
ab
c
abc
In un cristallo, miliardi di
molecole sono disposte in
modo ripetuto e ordinato
nelle tre dimensioni
Cristallo " am
plificatore del segnale!
buone imm
agini di diffrazione (#segnale/rumore)
! si può ricostruire la m
olecola
L’imm
agine di diffrazione da una singola molecola si form
a per interazione dei raggi X
con gli elettroni degli atomi della m
olecola,
Come si form
ano i cristalliProcesso di nucleazione:
aggregazione lenta e ordinata delle m
acromolecole in un
reticolo cristallino con esclusione del solvente
Abbiam
o ottenuto cristalli … e poi?
•Raccolta dati di diffrazione
•A
nalisi matem
atico-statistica dei dati•
Costruzione e analisi delle mappe di densità elettronica
•Controllo qualità
Abbiam
o ottenuto cristalli … e poi?
•Raccolta dati di diffrazione
•A
nalisi matem
atico-statistica dei dati•
Costruzione e analisi delle mappe di densità elettronica
•Controllo qualità
QuickTim
eª!and!aSilicon!G
raphics!JPEG!decom
pressorare!needed!to!see!this!picture.
Abbiam
o ottenuto cristalli … e poi?
•Raccolta dati di diffrazione
•A
nalisi matem
atico-statistica dei dati•
Costruzione e analisi delle mappe di densità elettronica
•Controllo qualità+
=
Densità iniziale
InterpretazioneStruttura 3D
finaleStruttura 3D
finale
Abbiam
o ottenuto cristalli … e poi?
•Raccolta dati di diffrazione
•A
nalisi matem
atico-statistica dei dati•
Costruzione e analisi delle mappe di densità elettronica
•Controllo qualità
!Estrazione dell’inform
azione biologica dai dati strutturali
Un esem
pio pratico: la proteasi del virus H
IV
Enzima om
odimerico: ogni m
onomero ha 99 am
mino acidi
Residui catalitici: A
sp 29 e 30
Un esem
pio pratico: la proteasi del virus H
IV
La cavità centrale è ampia e può legare un polipeptide in
conformazione estesa
Residui catalitici: A
sp 29 e 30
Un esem
pio pratico: la proteasi del virus H
IV
QuickTim
eª!and!aJPEG
!2000!decompressor
are!needed!to!see!this!picture.
Com’è stata utilizzata l’inform
azione strutturale?
La tasca è stata “riempita” con analoghi non idrolizzabili del substrato:
! inibitori com
petitivi altamente specifici e selettivi
KN
I577
Com’è stata utilizzata l’inform
azione strutturale?
! inibitori non com
petitivi altamente specifici e selettivi
! nuova generazione di farm
aci “intelligenti” con pochi effetti collaterali
AB-2
Un esem
pio: il complesso
dell’ATP sintasi mitocondriale
Il V com
plesso della catena respiratoria utilizza il gradiente protonico, generato dagli altri com
plessi, per sintetizzare ATP:A
DP + Pi + 1/2 O
2 + 2H+ + 2e
- $ ATP + H2 O
NA
DH
Deidro-
genasi
CytC
- QO
ssidoreduttasi
CytC
ossidasi
ATPsintasi
SuccinatoD
eidro-genasi
Matrice
Spazio interm
embrana
C
Prima della cristallografia: M
icroscopia elettronica dell’ATP sintasi
mitocondriale
matrice
F1
Prima della cristallografia: M
icroscopia elettronica dell’ATP sintasi
mitocondriale
matrice
F1
Ricostruzione a bassa risoluzione del complesso
Cristalli di F1 in presenza e in assenza di A
DP e
ATP hanno chiarito il meccanism
o di azione
T
O
L
Cristalli di F1 in presenza e in assenza di A
DP e
ATP hanno chiarito il meccanism
o di azione