résonance magnétique nucléaire appliquée aux protéines
TRANSCRIPT
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Résonance Magnétique nucléaire
appliquée aux protéines
Introduction à la RMN
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Historique de la RMN
Prix Nobel
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Avancées technologiques
Sensibilité = accès à des composés peu abondants
Résolution = accès à des systèmes plus complexes (m étabolome, grosses protéines…)
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Applications
RMN HR MAS : high resolution magic angle spinning
IRM
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RMN liquide à haute résolution
1. Calcul de structures 3D des protéines à partir des contraintes de distances � Etudes de protéines non structurées
2. Cartographie d’interactions (bio)moléculaires et quantification, criblage bas débit
3. Etudes de modifications post-traductionnelles (identification de sites, cinétiques…)
� protéomique ?
4. ‘Metabolomics’ � identification/quantification de métabolites
5. ‘In cell NMR’ � RMN in vivo
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Données structurales obtenues par RMN déposées
dans la PDB
1997
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Données structurales obtenues par RMN déposées
dans la PDB
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Interprétation de l’information structurale
� Cristallographie par rayons X / RMN : deux techniqu es complémentaires
• RX : les rayons X sont diffractés par le nuage électronique des atomes constituant la protéine (90% des structures de la PDB)
� fournit une carte de densité électronique
� pas de limite en taille de protéine, limite=obtention de cristaux qui diffractent correctement
� données à l’état solide (cristallin) = statique
• RMN : mesure les interactions entre les noyaux des atomes (9% des structure de la PDB)
� fournit un ensemble de distances entre les noyaux atomiques c’est-à-dire les contacts avec ou sans liaisons chimiques
� limitée aux petites protéines (< env. 200 aa)
� données en solution = étude de la flexibilité et de la dynamique sur une large gamme d’échelle de temps, criblage de ligands
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Nature des informations structurales
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Détermination de structures de protéines
par RMN
Ensemble de structures 3D (les 20 conformères de plus
basse énergie)
Données RMN : NOESY � Contraintes de distances
interatomiques
Vérification de la structure (RMSD,
données biologiques, chimiques…)
Spectromètre RMN à haut champ (600, 800, 900 MHz)
Échantillon de protéine enrichi en 15N/13C
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Spectromètre RMN
sonde
Il faut injecter 200A de courant dans la bobine pour créer un champ magnétique de 18,6 tesla.
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Sondes
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Shims : correction des inhomogénéités du champ B0
100 Hz
10 Hz
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Lock : correction des dérives B0/B1 au cours des
expériences RMN
lock interne : on mesure le signal du deutérium du solvant
� un canal correspondant à la résonance du 2D émet en continu pendant toute la durée de l’expérience
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Spin nucléaire et moment magnétique
sans B o avec B o (par exemple : 600 MHz)
noyau des atomes 1H ou 15N ou 13C
Spin nucléaire = 1/2
2 états énergétiques : parallèle (α) et anti-parallèle (β) au champ B0
les spins prennent (2I+1) orientations définies
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B0
B0=0
Fréquence de résonance
différence d’énergie ∆E entre les 2 états� proportionnelle au champ B0
� différence de populations entre les 2 niveaux faibles � sensibilité de la RMN
faible
� proportionnelle à γ
distribution de Boltzman n = e -E/kT
k → constante de Boltzman (1,3805.10-23 J.K-1)
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Remarque
Le champ magnétique d’un aimant s’exprime en Tesla
� parler de spectromètre 500 MHz est un abus de langage, en fait 500 MHz est la fréquence de résonance du proton pour ce spectromètre (= 11,7 T)
� les autres noyaux ont une fréquence de résonance différente de 500 MHz
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Spectre électromagnétique
B0 = 9.4T soit 400 MHz
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Rapport gyromagnétique γ
� valeur propre à chaque noyau : relative à la force de l’aimantation nucléaire
Noyau Spin Net γ / 2π (MHz/T)abondance naturelle
sensibilité relative en abondance naturelle
1H 1/2 42,58 99.98% 1 000 00019F 1/2 40,08 100% 833 05031P 1/2 17,25 100% 66 61013C 1/2 10,71 1.11% 17015N 1/2 -4,31 0.37% 4
pas de marquage isotopique
marquage isotopique nécessaire
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Fréquence de résonance
νννν0 = ω0/2ππππ = γγγγB0/2ππππ
fréquence de précession mesurée par NMR
Boz
x
y
M
équation de Larmor : ω0 = γB0
Pour 1 spin : Pour plusieurs spins :
Σ
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Fréquence de résonance
impulsion B1 (radiofréquences)
90°x
B1 on
temps τ
B1 off
Rotation autour de B 1 (axe x)impulsion 90°
Précession autour de B o (axe z)
Bo
z
x
y
M
M
Bo
z
x
y
MBo
z
x
yB1
ω0
ω0
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ν0 fréquences
FID (signal brut)
détection axe y
FT (transformée de Fourier)
� retour à l’état d’équilibre = relaxation
rotation autour de l’axe de B0 à la fréquence ν0 (précession de Larmor)
Bo
z
x
y
M
B0
FID (Free Induction Decay)
Largeur de raie : proportionnelle à
l'inverse de la durée de l'état excité
Fréquence de résonance
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Notions de spin nucléaire et de fréquence de
résonance
� tous les noyaux (par ex 1H) devraient résonner à la même fréquence ν0
� mais ce n’est (heureusement) pas le cas! � le champ magnétique perçu par un atome donné va subir des variations à cause du mouvement des électrons : chaque noyaux va résonner à une fréquence propre qui va dépendre de son environnement chimique (distribution locale du nuage électronique)
� on parle alors de déplacement chimique δ
δδδδ
FT
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Phénomènes de relaxation : 2 types de relaxation
Mz (t) = M0 (1 - e -t/T1)
� relaxation longitudinale ou relaxation spin-réseau (T1) : retour sur l’axe B0 (axe z)
• proportionnelle au champ magnétique B0
• croissance exponentielle en fonction du temps de la composante Mz
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Mxy (t) = M0 e -t/T2
� relaxation transversale ou relaxation spin-spin (T2) : défocalisation de l’aimantation (dans le plan xOy) ou perte de cohérence de phase des moments magnétiques dans leur mouvement de rotation autour de B0
• indépendante du champ magnétique B0
• décroissance exponentielle en fonction du temps de la composante Mxy
De manière générale, plus une protéine est grande, plus le T2 est court.
Les protéines relaxent plus vite que les petites molécules
Phénomènes de relaxation : 2 types de relaxation
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Elargissement du signal par la relaxation T2 à l’origine
de la limitation de la RMN aux petites protéines
la largeur de raie à mi-hauteur ∆ν1/2 est inversement proportionnelle à T2*
� plus une protéine est grande, plus sa relaxation est rapide et plus les raies sont larges
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Déplacement chimique δ (ppm)
� une fréquence va dépendre du champ magnétique B0
� on va plutôt utiliser une valeur indépendante de B0 : le déplacement chimique (δ) exprimé en ppm (parties par million) � on utilise une référence
� pour un proton donné, on aura une même valeur de déplacement chimique quelque soit la valeur du champ magnétique B0 utilisé
δδδδ
δ = ν – νref
νref
106.
NH, H aromatiques H aliphatiques
référence
H2O
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Références
� blindage fort des méthyles dû au Si
� chimiquement inerte
� 1 résonance unique (protons équivalents)
� cela revient à fixer arbitrairement le déplacement chimique de ces composés à 0 (δ = 0 ppm)
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Evolution d’un spectre en fonction de B0 : résolution
spectrale
@ 200 MHz
@ 600 MHz
ppm0
TMSP (réf)
0 Hz
0 Hz
4008001200
246
120024003600
10
6000
2000
Augmentation de la résolution des résonances
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Evolution d’un spectre en fonction de B0 : résolution
spectrale
� « dilatation » de l’échelle avec l’augmentation du champ B0
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Interprétation d’un spectre RMN : 3 informations
référence = triméthylsilane
Exemple : spectre de l’éthanol CH3-CH2-OH
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1. Fréquences de résonance (en Hz) ou déplacements
chimiques δ (en ppm)
liaisons H, solvant…
• l'environnement électronique modifie la valeur du champ magnétique local Beff expérimenté par le noyau
Beff = B0 (1 - σ) où σ est la constante d'écran
et donc la fréquence de résonance ν du noyau sera
• le déplacement chimique dépend donc de l'environnement local de chaque noyau (groupements fonctionnels…)
ν = γBeff
2π
TMS
δ (ppm) δ0
écran faible
déblindage
écran fort
blindage
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Contribution diamagnétique à la constante d’écran :
effet inductif
Plus X est électronégatif, plus l’effet est important.
L’effet diminue avec la distance
� circulation des électrons à l’intérieur des orbitales atomiques ou moléculaires
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Contribution paramagnétique à la constante d’écran :
effet mésomère
� circulation des électrons entre les orbitales
accepteur
donneur
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Contribution de l’anisotropie sur le déplacement
chimique
toute liaison chimique est anisotrope dans l’espace
� dans un champ magnétique, elle crée autour d’elle un champ magnétique anisotrope (Blocal)
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Contribution de l’anisotropie sur le déplacement
chimique
blindage déblindage
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Contribution de l’anisotropie sur le déplacement
chimique : courant de cycles
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Deux types de couplage
� Couplage direct ou dipolaire
Le couplage dipolaire est l’interaction directe entre les dipôles magnétiques à travers l’espace. Ce couplage est très élevé : 30 kHz pour 2 noyaux distants de 2Å. Son intensité étant inversement proportionnelle au cube de la distance entre les noyaux.
� moyenné à 0 en RMN liquide du fait de l’agitation moléculaire
Elle devient prépondérante dans les solides et conduit à une distribution large de déplacements chimiques qui élargit les raies.
� paramètre important en RMN solide � largeur importante des raies
� Couplage indirect ou scalaire
Interactions entre les noyaux (moments magnétiques nucléaires) et les électrons (spins électroniques) des liaisons covalentes
Lorsque les spectres RMN sont obtenus avec une résolution suffisante, on observe que certains signaux sont constitués de plusieurs pics.
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Couplages scalaires
On appelle système de spins un ensemble de spins couplés de façon scalaire.
• hétéronucléaires : le système de spins est constitué de noyaux de nature différente (par exemple 1H et 13C). Il s'agit de couplage 1J
• homonucléaires : le système de spins est constitué de noyaux de même nature (par exemple des protons) il s'agit de couplages nJ avec n > 1
Couplage Nombre de liaisons
Nom
2J 2 géminal3J 3 vicinal4J 4 longue
distance
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Structure fine des raies : couplages J (Hz)
Couplage � (2n I + 1) pics
où n est le nombre de noyaux équivalents
Pour I = 1/2 (1H, 13C, 15N)
� (n+1) pics pour ces noyaux Configuration Peak Ratios
A 1
AB 1:1
AB2 1:2:1
AB3 1:3:3:1
AB4 1:4:6:4:1
AB5 1:5:10:10:5:1
AB6…
1:6:15:20:15:6:1…
Couplage � (2n I + 1)x (2n’I+1) pics pour n et n’ noyaux équivalents
ABnXn’ (n+1)(n’+1) pics
JAB (Hz)
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Constantes de couplages 1H-1H représentatives (en Hz)
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Constantes de couplages représentatives (en Hz)
Couplages hétéronucléaires dans les chaînes polypeptidiques
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Intégration des signaux : aspects quantitatifs
• l’intégration relatives des pics permet, dans certains cas, de déterminer le nombre de noyaux contribuant à chaque signal
CH3CH2OH
1/6H2/6H
3/6H
6H
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Intégration des signaux : aspects quantitatifs
• l’intégration relatives des pics permet, dans certains cas, de déterminer le nombre de noyaux contribuant à chaque signal
le temps de relaxation doit être suffisant (retour complet à l’état d’équilibre entre chaque scan)
� Acquisition + D1 > 2 x T1 pour une bonne estimation
� Acquisition + D1 > 5 x T1 pour un résultat précis
• cela pose un problème de durée d’expérience pour les noyaux qui relaxent lentement (13C)
� en RMN 13C : aire des signaux non quantitative (effet NOE, valence)
� intensités relatives : C IV < C III (CH) < CII (CH2) < C I (CH3)
� intégration possible pour les signaux 13C de même substitution
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Aspect quantitatif (intégration des signaux) : délai de
répétition
Conditions quantitatives :
• temps de relaxation long (> 5*T1)
• impulsion < 90°: excitation uniforme sur une gamme de fréquence supérieure
x nsns= nombre de scans