résistance des souches de streptococcus pneumoniae aux
TRANSCRIPT
ii
THESE
Présentée Pour l’obtention du
Doctorat Unique de l’Université de Ouagadougou Spécialité : Sciences Biologiques Appliquées
Option : Biologie Moléculaire
par BERE Charles Léonard
Maître ès Sciences
sur le thème :
Soutenue publiquement le 9 février 2010
Devant la commission d’examen
Président : Pr Alfred S. TRAORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou
Membres : Pr Lassana SANGARE, Professeur Agrégé, Université de Ouagadougou
Pr Nicolas BARRO, Maître de Conférences, Université de Ouagadougou
Dr Virginio PIETRA, Université de Brescia
Pr Jacques K. SIMPORE, Maître de Conférences, Université de Ouagadougou
Résistance des souches de Streptococcus pneumoniae aux antibiotiques à Bobo-Dioulasso :
aspects phénotypiques et génotypiques.
UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU Unité de Formation et de Recherche En Science de la Vie et de la Terre
(UFR/SVT/LABIOGENE)
BURKINA FASO ********** Unité -Progrès -Justice **********
-------------------------------
LABIOGENE/UFR-SVT
iii
DEDICACES A mon Père BERE Yves, à ma Mère NANA Claire tous rappelés auprès de Dieu, mes pensées
vont droit vers vous qui m’avez soutenu depuis mon enfance. ….
A ma femme et surtout à mon enfant qui n’a pas eu la chance d’être à mes cotés dans ce monde,
je vous adresse mes vifs remerciements pour la patience dont vous avez fait preuve durant ces années de
recherches.
A mes Frères, Sœurs, Parents et Amis, je vous remercie pour votre soutien moral inestimable et
pour vos encouragements tout au long de ces dures années de travail. ….
A tous ceux, qui, d’une manière ou d’une autre, ont contribué à l’aboutissement de ce travail, je
réitère ma profonde amitié et mes sincères remerciements.
v
RemeRciements Ce travail a été réalisé au Centre Muraz de Bobo-Dioulasso, au Centre Hospitalier
Universitaire Vaudois de Lausanne en Suisse et dans les laboratoires du Département de
Microbiologie de l’Université de Catania en Italie.
Qu’il me soit permis de remercier le professeur Alfred S.TRAORE, responsable de
la formation doctorale en Sciences Biologiques Appliquées, du Département de Biochimie-
Microbiologie de l’Unité de Formation et de Recherche en Sciences de la Vie et de la Terre
(UFR/SVT) de l’Université de Ouagadougou.
J'exprime ma profonde gratitude au professeur Jacques SIMPORE, Directeur de
cette thèse et membre du jury qui est Directeur de plusieurs institutions: Laboratoire de
Biologie Moléculaire et de Génétique (LABIOGENE de L’UFR/SVT); Centre de
Recherche Biomoléculaire Pierto Annigoni (CERBA); Laboratoire du Centre Médicale
Saint Camille de Ouagadougou et Recteur de l’Université de Saint Thomas d’Aquin
(USTA). Merci pour le support financier et pour m’avoir permis d’effectuer le génotypage
de mes souches bactériennes en Italie (Catania). Merci pour votre encadrement
exceptionnel, votre disponibilité malgré vos multiples fonctions, vos précieux conseils et
vos encouragements. Ce travail n’aurait pas abouti sans vous, soyez grandement remercié.
Je remercie très sincèrement le professeur augustin P. BERE Codirecteur de cette
thèse. Pour avoir accepté de suivre ce travail; soyez en remercié.
Je remercie le Professeur Lassana SANGARE de l’Université de Ouagadougou,
responsable du laboratoire de Bactériologie-Virologie du CHU Yalgado OUEDRAOGO,
pour avoir accepté de lire, critiquer et instruire cette Thèse. Merci pour votre contribution
à l’amélioration de ce document et d’avoir accepté d’être membre du jury. Trouvez ici
l’expression de toute ma gratitude.
Je remercie le au Professeur Nicolas BARRO de l’Université de Ouagadougou,
responsable du laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire (CRSBAN/UFR-SVT),
vi
pour avoir accepté de lire, critiquer et instruire cette Thèse. Merci pour votre contribution
à l’amélioration de ce document et d’avoir accepté d’être membre du jury. Trouvez ici
l’expression de toute ma gratitude.
Je remercie le Professeur Comblam A. de SOUZA (Université de Lomé, Togo),
pour avoir accepté de lire, critiquer et instruire cette Thèse. Merci pour votre contribution
à l’amélioration de ce document. Trouvez ici l’expression de toute ma reconnaissance.
Je remercie également le Professeur Vittorio COLIZZI (Université de Rome Tor
Vergata, Italie), pour avoir accepté de lire, critiquer et instruire cette Thèse. Merci pour
votre contribution à l’amélioration de ce document. Trouvez ici l’expression de toute ma
reconnaissance.
Je voudrais ici témoigner toute ma reconnaissance et mes remerciements au
Professeur DOSSO Mireille pour, son aide, la publication de mes articles, ces précieux
conseils et ces encouragements.
Je remercie le Professeur Jacques BILLE et le Docteur Elizabeth BANNERMAN
pour m’avoir permis d’effectuer le sérotypage de mes souches au CHUV de LAUSANNE.
Je remercie également le Professeur Salvatore MUSUMECI et le Professeur
Stefania STEFANI pour m’avoir permis d’effectuer le génotypage de mes souches dans les
laboratoires du département de microbiologie de l’Université de Catania.
Je remercie tous mes aînés en particulier, les Docteurs Aly SAVADOGO, Simplice
KAROU, pour leur disponibilité à mes sollicitations.
Ma gratitude s’adresse également à tout le personnel du Centre Muraz, des SMI de
Farakan et D'Accart Ville, des Agences Universitaires de la Francophonie de Bobo-
Dioulasso et Ouagadougou pour leur affection et leur soutien.
Enfin, je remercie pour leur contribution, toutes les personnes qui m'ont soutenue et
assistées et dont je n’ai pas pu citer les noms.
vii
TABLES DES MATIERES
REMERCIEMENTS ...................................................................................................... v
LISTE DES FIGURES ................................................................................................... v
LIST DES TABLEAUX ................................................................................................. vi
LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONS ................................................................ vii
RESUMÉ ...................................................................................................................... viii
ABSTRACT .................................................................................................................... x
INTRODUCTION........................................................................................................... 1
PREMIÈRE PARTIE : ................................................................................................... 7
Rappels bibliographiques ............................................................................................... 7
I.1. Epidémiologie ........................................................................................................ 8
I.2. Historique .............................................................................................................. 9
I.3. Habitat..................................................................................................................10
I.4. Caractères bactériologiques ............................................................................... 11
I.4.1. Taxonomie ............................................................................................................. 11
I.4.2. Morphologie ..........................................................................................................12
I.5. Caractères culturaux ...........................................................................................14
I.6. Caractères biochimiques......................................................................................15
I.6.1. Enzymes respiratoires ...........................................................................................15
I.6.2. Métabolisme glucidique .......................................................................................15
I.6.3.Métabolisme protidique .........................................................................................15
I.6.4. Propriétés particulières ........................................................................................15
I.6.4.1. Phénomène de Neufield ..........................................................................16 I.6.4.2. Sensibilité à l’optochine ..........................................................................16
I.7. Caractères antigéniques .......................................................................................16
I.7.1. Antigènes capsulaires ............................................................................................17
I.7.2. Antigènes somatiques ............................................................................................18
I.7.3.La substance C .......................................................................................................18
I.7.4. L’antigène R ..........................................................................................................18
viii
I.7.5. L’antigène M .........................................................................................................18
I.8. Les Substances élaborées .....................................................................................18
I.8.1. Les toxines .............................................................................................................18
I.8.1.1. La pneumolysine .....................................................................................19 I.8.1.2. Le principe producteur de purpura (P.P.P.) ..........................................19
I.8.2. Les enzymes...........................................................................................................19
I.8.2.1.La neuraminidase ....................................................................................19 I.8.2.2. La hyaluronidase ....................................................................................19
I.9. Facteurs de pathogénicité et pouvoir pathogène .................................................20
I.9.1. Les principaux facteurs de pathogénicité ............................................................20
I.9.2. Le pouvoir pathogène ...........................................................................................20
I.10. Immuno/Physiopathologie .................................................................................22
I.11. La réponse immunitaire .....................................................................................24
I.12. Le mode de transmission ...................................................................................25
I.13. Les facteurs favorisant la diffusion du germe ...................................................25
I.14. Les mesures préventives d’hygiène ...................................................................27
I.15. Les traitements des infections à pneumocoques ...............................................27
DEUXIÈME PARTIE : ..................................................................................................29
MATÉRIEL ET MÉTHODES .......................................................................................29
I. CADRE DE L ETUDE ...............................................................................................30
II. MATÉRIEL ET MÉTHODES ..................................................................................32
II.1. Les prélèvements, la culture, l’identification et l’antibiogramme ....................32
II.1.1. Matériel................................................................................................................32
II.1.2. Le matériel et les réactifs. ........................................... Erreur ! Signet non défini.
II.1.3. Méthodes ..............................................................................................................33
II.1.3.1. Données épidémiologiques ....................................................................33 II.1.3.2. Les prélèvements nasopharyngés. .......................................................34 II.1.3.3. Les prélèvements du LCR. ...................................................................36
II.2. Le sérotypage ......................................................................................................37
II.2.1. Matériel........................................................................ Erreur ! Signet non défini.
II.2.2. Méthodes ...................................................................... Erreur ! Signet non défini.
II.2.2.1. Principe .............................................................................................................37
ix
II.2.2.2. Procédure ..........................................................................................................37
II.3. Le génotypage .....................................................................................................38
II.3.1 Principe de la PCR ...............................................................................................39
II.3.2. Procédure de la PCR ...........................................................................................39
II.3.3. PFGE (électrophorèse en champs pulsées) et hybridation du DNA. .................40
TROISIÈME PARTIE : .................................................................................................41
RÉSULTATS ..................................................................................................................41
III.1. RESULTATS DE LA PREMIERE ETUDE ....................................................42
III.1.1. Problématique de la première étude .................................................................42
III.1.2.Principaux résultats ............................................................................................42
III.1.2.1. Données épidémiologiques et cliniques des prélèvements nasopharyngés. ...................................................................................................42 III.1.2.2. Données biologiques des prélèvements nasopharyngés. .....................45
III.1.3. Conclusion de la première étude. ......................................................................48
III.2. RESULTATS DE LA DEUXIEME ETUDE.....................................................49
III.2.1. Problématique de la deuxième étude. ................................................................49
III.2.2.Principaux résultats. ...........................................................................................49
III.2.2.1.Données épidémiologiques. ..................................................................49 III.2.2.2. Données biologiques. ...........................................................................49
III.2.3. Conclusion de la deuxième étude.......................................................................52
III.3. RESULTATS DE LA TROISIEME ETUDE....................................................53
III.3.1. Problématique de la troisième étude .................................................................53
III.3.2.Principaux résultats ............................................................................................53
III.3.2.1. Données biologiques. ...........................................................................53 III.3.2.1.1. La résistance aux antibiotiques. ...................................................53 III.3.2.1.2. Le sérotypage et le Phénotypage. .................................................55
III.3.3. Le Phénotypes et le génotypage. .......................................................................56
III.3.3. Conclusion de la troisième étude. ......................................................................60
DISCUSSION GÉNÉRALE ..........................................................................................61
CONCLUSION GÉNÉRALE ........................................................................................69
x
RÉFÉRENCES ..............................................................................................................73
BIBLIOGRAPHIQUES .................................................................................................73
PUBLICATIONS RÉALISÉES .....................................................................................79
v
LISTE DES FIGURES
Figure 1: S. pneumoniae sous microscope au Gram. .........................................................12
Figure 2: Streptococcus pneumoniae sous microscope à Fluorescence .............................13
Source: Centre pour la prévention et le Contrôle des maladies..........................................13
Figure 3: Streptococcus pneumoniae sous microscope électronique : une paire de
diplocoque. ......................................................................................................................13
Figure 4 : Hémolyse de type α sur gélose au sang. ............................................................14
Figure 5 : Coupe de Streptococcus plaçant les différents antigènes. ..................................17
Figure 6 : Expérience réalisée par Griffith. .......................................................................22
Figure 7: Processus infectieux et lésionnel .......................................................................23
Figure 8: Réponse inflammatoire induite par les cellules du pneumocoque.......................24
Figure 9: Incidence des agents favorisants ou aggravants la diffusion de S.pneumoniae. ..26
Figure 10: Incidence des agents favorisants ou aggravants la diffusion de S.pneumoniae. 27
Figure 11 : Carte du Burkina Faso ....................................................................................31
Figure 12: PFGE des échantillons de S. pneumoniae. .......................................................58
vi
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Algorithme servant à déterminer la majorité des sérotypes/sérogroupes. .........38
Tableau 2 : Répartition des prélèvements effectués par tranche d’âge (Age en mois). .......43
Tableau 3 : Répartition des enfants selon une hospitalisation antérieure. ...........................44
Tableau 4 : Répartition des enfants selon le statut de vaccination .....................................45
Tableau 5 : Nombre et pourcentage des souches sensibles et résistantes 16 antibiotiques .45
Tableau 6 : Nombre et pourcentage des souches sensibles et résistantes aux pénicillines. 46
Tableau 7 : Nombre et pourcentage des résistances à plusieurs antibiotiques sur la même
souche ..............................................................................................................................47
Tableau 8 : Nombre et pourcentage d’enfants correctement vaccinés et non correctement
vaccinés versus Sensibilité à la pénicilline .......................................................................47
Tableau 9 : Nombre et pourcentage des sérotypes/sérogroupes isolés. .............................50
Tableau 10 : Sérotypes/Sérogroupes isolés versus résistance aux antibiotiques ...............51
Tableau 11 : Caractéristiques des pneumocoques isolés par différents groupes d'âges. ....52
Tableau 12 : Sensibilité des souches invasives aux 9 antibiotiques ...................................54
Tableau 13 : Répartition des sérotypes versus Phénotypes. ...............................................55
Tableau 14 : Nombre et pourcentage des phénotypes, des Gènes de résistance et des
Transposons identifiés. ....................................................................................................56
Tableau 15 : Localisation chromosomique des gènes erm (B), tet(M), mef (A/E). ............59
LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONS
AMP : Agence médecine préventive ATCC : Souches de référence Américaine pour les cultures CDC : Centre pour la prévention et le contrôle des maladies CERMES : Centre de recherche sur les méningites et les schistosomes CHR : Centre hospitalier régional CHU : Centre hospitalier universitaire CHUV : Centre hospitalier universitaire Vaudois CMA : Centre médical avec antenne chirurgicale CMI : Concentration minimale inhibitrice CSPS : Centre de santé et de promotion sociale EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid Hib : Haemophilus influenzae b IL : Interleukine INF : Interféron INSD : Institut national des statistiques et du développement LCR : Liquide céphalo rachidien MBA : Méningites bactériennes aiguës MLSB : Macrolide, lincosamide et sreptogramines B NCCLS : National Committee for clinical laboratory standards Nm : Nesseria meningitidis OMS : Organisation Mondiale de la santé PBS-T : Phosphate buffer saline-Tween PCR : Réaction en chaîne par polymérase PIB : Produit intérieur brut PMA : Pays les moins avancés PPP : Principe producteur de purpura S.G.T.s. : Sérotypes/ Sérogroupes S.p. : Streptococcus pneumoniae Sida : Syndrome d’immuno déficience acquise SMI : Santé maternelle et infantile SNC : Système nerveux central TCR : Récepteur des cellules T TNF : Facteurs de nécrose hémorragique de tumeurs UV : Ultra Violet V.I.H. : Virus de l’immunodéficience humaine
viii
RESUMÉ
Le Burkina Faso situé en Afrique de l’Ouest ne dispose pas encore de centre de
référence et de surveillance de la résistance aux antibiotiques. Peu de données existent sur
le portage, le profil de résistance de Streptococcus pneumoniae. Pour évaluer le portage de
Streptococcus pneumoniae, l’incidence de la résistance aux antibiotiques chez les porteurs
asymptomatiques, le laboratoire de microbiologie du centre Muraz à Bobo Dioulasso a
conduit cette étude en 2000. Un total de 109 souches de Streptococcus pneumoniae ont été
isolées chez 215 enfants venant pour la vaccination dans 2 centres de soins maternels et
infantiles de la ville. Les antibiotiques ont été testés selon les normes du « National
Commettee for Clinical and Laboratory Standards » (NCCLS). Le taux de portage trouvé a
été de 50,6%. La majorité des enfants avaient de 2 à 24 mois d’âge (96,30%), 96,3% des
enfants ont eu un antécédent d’Oto-Rhino-laryngologie (ORL) dans les 12 derniers mois,
91,70% des enfants n’avaient jamais été hospitalisés, 99,10% des enfants n’avaient pas pris
des antibiotiques les 15 jours précédents le prélèvement et 73,40% des enfants avaient été
correctement vacciné.
Les souches isolées dans notre étude ont présenté une résistance élevée aux
antibiotiques suivants : Amikacine (95,19%) ; Tetracycline (65,30%) ; Pefloxacine
(54,80%) ; Cotrimoxazole (31,70%) et Oxacilline (25,00%).
Les antibiotiques les plus sensibles aux pneumocoques étaient : Rifampicine
(98,78%) ; Amoxicilline (96,15%) ; Ampicilline (95,19%) ; Ceftriaxone (93,26%) ;
Erythromycine (93,90%) ; Spectinomycine (92,30%) ; Chloramphénicole (91,30%) ;
Vancomycine (87,67%) ; Lincomycine (82,60%) et Ciprofloxacine (77,88%).
Par la suite les sérotypes/sérogroupes ont été investigués (recherchés) sur 860
enfants. Les sérotypes/sérogroupes majeures observés étaient: 6 (20,68%); 23 (15,50%);
17, 18, 19 (5,17%); 7, 9 (3,4%); 4, 11, 14, 15, 20, 24 (1,70%). Les
sérotypes/sérogroupes 19, 23, 6, 7, 18 étaient liées à la résistance à la pénicilline.
ix
Enfin des souches de Streptococcus pneumoniae isolées du Liquide céphalo
rachidien (LCR) ont été évaluées. Les sérotypes majeurs 1, 3, 6, 19 et 23 ont été identifiés.
58,30% des souches étaient résistantes et à la tétracycline et à l’érytromycine. 66,70% des
souches arboraient le phénotype macrolide, lincosamide et streptogramine B (MLSB) avec
le gène erm(B). 16,70% des souches arboraient le phénotype M avec le gène mef(A).
37,50% des souches avaient le transposon Tn 1545 et étaient responsables des résistances
à la tétracycline et à l’érythromycine. 8,30% des souches avaient le transposon Tn 1207 et
étaient responsables des résistances à la tétracycline et à l’érythromycine. Le profile
PFGE des souches était très hétérogène.
L’étude a montré qu’avec la résistance élevée de S. pneumoniae à la pénicilline au
Burkina Faso, il est nécessaire de créer des centres de références pour surveiller la
résistance des pneumocoques à la pénicilline afin d’adapter en conséquence une bonne
thérapie et pour mieux contrôler ces résistances.
Mots clefs: Streptococcus pneumoniae ; Résistance aux antibiotiques ; Sérotypes/sérogroupes (SGTs) ; Gènes de résistance aux Macrolides et aux Tétraciclines : erm(B), mef(A), tet(M) ; PFGE.
x
ABSTRACT
In Burkina Faso, a West African country, the pneumococci carriage and their
resistance patterns reports are inconsistent. In order to evaluate pneumococci carriage,
incidence of antibiotic resistance, from assymptomic young children; the microbiological
laboratory at Muraz center of Bobo-Dioulasso collected pneumococci from nasopharynx
during 2000. A total of 109 pneumococci isolated from 215 youths attending vaccination
center were analysed. 16 antibiotics susceptibility were carried out as recommended by the
National Comittee for Clinical Laboratory Standard (NCCLS). The carriage rate was
50.6%. The majority of children had 2 to 24 months (96%), 96.3% had Oto Rhino
Laryngology (ORL) antecedent the last 12 months, 99.1% of children did not use
antibiotics 15 days before, 91.7% of children have never been hospitalized and 73.4% of
children were well vaccinated.
We noticed a high incidence of resistance to: Amikacin (95.19%); Tetracyclin
(65.3%); Pefloxacin (54.80%); Cotrimoxazol (31.7%) and Oxacillin (25%).
The most active antibiotics were: Rifampicin (98.78%); Amoxicillin
(96.15%); Ampicillin (95.19%); Ceftriaxon (93.26%); Erythromycin (93.9%);
Spectinomycin (92.30%); Chloramphenicol (91.30%); Vancomycin (87.67%; Lincomycin
(82.6%); Ciprofloxacin (77.88%).
Serotypes/serogroups were after investigated on 860 children coming for
vaccination. The mains serotypes/serogroups were: 6 (20.68%); 23 (15.5%); 7, 9 (3.4%);
4, 11, 14, 15, 20, 24 (1.7%). Serotypes/serogroups 19, 23, 6, 7, 18 were linked to penicillin
resistance.
Finally Streptococcus pneumoniae resistants strains from patients with invasive
diseases were evaluated. The mains serotypes were: [1, 3, 6, 19, and 23]. 58.3% strains
were resistant to tetracycline and erytromycine together. 66.70% of isolates showed
macrolide, lincosamide et streptogramine B (MLSB) phenotypes with erm(B) genes.
xi
16.7% of isolates showed M phenotypes with mef(A) genes. 37.5% of isolates with
Tn 1545 transposon were responsible of resistances to tetracycline and to erythromycine
8.3% of isolates with Tn 1207.1 transposon were responsible of resistances to tetracycline
and to erythromycine. PFGE profile show different susceptibility profiles and did not
appear to be related by PFGE.
The study shows the resistance of pneumococci to penicillin in Burkina Faso. It is
then necessary to create pneumococci resistance surveillance centers in the countrie in
order to adapt an accurate therapy, and to avoid the exportation of antibiotics resistance.
Keys words: Streptococcus pneumoniae; Serotypes/serogroupes (SGTs);
Resistance to antibiotics; Macrolide and Tetracicline resistances genes: erm(B),
mef(A), tet(M) ; PFGE.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 1
INTRODUCTION
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 2
Introduction
Streptococcus pneumoniae ou pneumocoque est une espèce bactérienne qui
appartient au genre Streptococcus de la famille de Streptococcaceae. C’est une bactérie
commensale du rhino-pharynx, pouvant dans certaines circonstances (splénectomies,
asplénies fonctionnelles, malnutritions) être responsable d'infections respiratoires hautes
(sinusites, otites) et basses (pneumonies) ainsi que de méningites purulentes, de
septicémies, chez les enfants et les personnes âgées (Dinubile et al., 1990; Leach et al.,
1994; Patey et al., 1991).
Le pneumocoque transmis par aérosols, colonise la muqueuse du rhinopharynx dès
les premiers jours de la vie. Le taux de portage atteint son maximum autour de 50%
vers l’âge de 2 à 3 ans et décroît ensuite avec l’âge pour atteindre 5 à 10% chez l’adulte
(Hoge et al., 1995). Cette bactérie commensale peut induire un processus infectieux au
contact de la muqueuse respiratoire à la suite d’une infection virale, d’un évènement
intercurrent (refroidissement) ou de l’acquisition d’une nouvelle souche virulente (Bruyn et
al., 1992).
Avant l’ère des antibiotiques, le pneumocoque était l’une des étiologies majeures
des méningites bactériennes (Gaillard et al., 1988). Les infections à pneumocoque
représentaient l’une des principales causes de mortalité et de morbidité infectieuses dans le
monde (Maria et al., 1998 ; Gaillard et al., 1988). Elles sont l’une des premières causes de
décès chez l’enfant et l’adulte dans les pays en voie de développement, on estime à
environ 1,2 millions de morts annuellement chez les enfants en dessous de 5ans (William
et al., 2000 ; Demartini et al., 1993). L’une des difficultés du traitement des infections à
pneumocoque tient au fait de la prévalence de plus en plus élevée de S. pneumoniae
résistants aux pénicillines ; alors que celles-ci sont généralement les antibiotiques de
premier choix pour le traitement des infections à pneumocoques. Ce problème de santé
publique est amplifié à cause du nombre croissant d’immunodéprimés, en particulier
séropositifs pour le VIH, très vulnérables vis à vis de ce micro-organisme.
Des études ont montré qu’il existe une corrélation entre le niveau de résistance des
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 3
souches commensales isolées du portage nasopharyngé et celle des souches responsables
d’infections (Musher et al., 1997 ; Syrogiannopoulos et al., 2001). Une surveillance du
niveau de résistance des souches de S. pneumoniae peut donc être effectuée sur des
souches isolées du nasopharynx. C'est ainsi que nous avons conduit une première étude
afin d’apprécier la sensibilité des souches de pneumocoques de portage aux antibiotiques
couramment utilisées au Burkina Faso.
D’une part, ces pneumocoques résistants aux antibiotiques sont plus fréquemment
rencontrés chez les enfants que chez les adultes (Koornhof et al., 1992 ; Reichler et al.,
1992) ; ils appartiennent à un nombre limité de types capsulaires pédiatriques qui se
recrutent dans un répertoire génétique important de 90 types de structures
polysaccharidiques (Munford et al., 1994 ; Dagan et al., 1994 ; Welby et al., 1994).
D'autre part, il a été constaté que la distribution des sérotypes/sérogroupes (S.G.Ts)
de S. pneumoniae varie énormément en fonction de l'âge, de la population et de la région
géographique (Fenoll et al., 1998). Cela implique que des programmes de vaccination
antipneumococcique tienant compte de l’épidémiologie spécifique de ce pathogène
peuvent réduire les souches de portage et les souches invasives. Ainsi, un programme de
vaccination bien ciblée pourrait réduire la propagation des pneumocoques résistants et la
diminution des infections à S. npeumoniae d'une manière générale.
Une deuxième étude a donc été conduite afin de connaître les
sérotypes/sérogroupes vaccinaux de S. pneunomiae qui circulent au Burkina Faso
(BERE et al., 2009). Cependant, face aux problèmes de réversions capsulaires qui
limitaient la prévention de l’infection liée à la vaccination anti pneumococcique, il était
nécessaire d’effectuer continuellement une évaluation phénotypique et génotypique des
souches afin de mieux appréhender les mécanismes de résistances de ces pneumocoques
(Alexander et al., 1999).
La résistance des pneumocoques aux macrolides est due particulièrement selon
Leclercq et al., 2002, à une méthylation de l’adénine au niveau de l’ARN 23S qui induirait
une réduction de l’affinité entre l’antibiotique et le ribosome
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 4
Cette résistance serait associée aux gènes erm(B) qui induiraient une résistance de
haut niveau aux macrolides, aux lincosamides et aux streptogramines B en conférant le
phénotype MLSb aux souches. Mais, de plus en plus, des résistances aux macrolides dues à
un nouveau système d’efflux sont décrites à travers le monde (Tait-Kamradt et al., 1997).
Cette résistance serait liée aux gènes mef(E) qui induit une résistance de bas niveau aux
macrolides, tout en étant sensibles aux lincosamides et aux streptogramines B, en conférant
le phénotype M aux souches.
Quant à la résistance des pneumocoques aux tétracyclines, elle serait
principalement due à la protection des protéines cytoplasmiques codées par les gènes
tet(M) (Taylor et al., 1996). La résistance due aux gènes tet(K) et tet(L) qui réduiraient la
concentration des tétracyclines à un bas niveau par un mécanisme d'efflux, serait très rare
au niveau des pneumocoques selon la littérature (Chopa et al., 2001). En outre la résistance
des isolats cliniques de S. pneumoniae aux tétracyclines est fréquemment associée à la
résistance à l'érythromycine. Une étude effectuée entre 1999 à 2000, a montré que les
souches de pneumocoques résistants à l'érythromycine étaient également résistantes à la
tétracycline (Doern et al., 2001). En Europe, des associations de l'ordre de 80% étaient
décrites sur des souches de S. pneumoniae isolées en Espagne et en Italie (Marchese et al.,
2000 ; Seral et al., 2001). Ces associations suggèrent que la résistance de ces souches de
S. pneumoniae
serait liée aux transposons conjugatifs.
Au Burkina Faso, peu de données existent sur les mécanismes et/ou les gènes de
résistance de S. pneumoniae. La présente étude a été conduite afin :
d’évaluer le portage de S. pneumoniae chez des enfants de 0 à 5ans,
d’évaluer le niveau de résistance des souches de portage aux antibiotiques,
de déterminer le taux de couverture par les vaccins des souches circulantes,
et enfin, d’évaluer les bases phénotypiques et génotypiques de la résistance aux
tétracyclines et aux macrolides.
Ces résultats permettront d’élaborer des recommandations spécifiques de lutte
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 5
(vaccination, choix des antibiotiques) et d’avoir une base de données qui servirait à un
système de surveillance épidémiologique continue.
La première partie de cette thèse porte sur les généralités relatives aux
pneumocoques. La deuxième partie, expose le matériel et les méthodes ayant permis de
réaliser ce travail, et enfin, la troisième partie présente les résultats et la discussion qui en
découlent.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 6
OBJECTIF PRINCIPAL :
Rechercher les causes de résistances des souches de Streptococcus pneumoniae
isolées du nasopharynx et du liquide céphalo rachidien à Bobo-Dioulasso au
Burkina Faso.
OBJECTIFS SPECIFIQUES :
Evaluer le portage des pneumocoques chez les enfants de 0 à 5 ans de Bobo-
Dioulasso.
Identifier les sérotypes/sérogroupes de S. pneumoniae en circulation à Bobo-
Dioulasso.
Evaluer les profils de résistance des souches des isolats de S. pneumoniae.
Evaluer les liens entre les sérotypes/sérogroupes et la résistance de S. pneumoniae
aux antibiotiques à Bobo-Dioulasso.
Déterminer les gènes de résistance des souches de S. pneumoniae à l’érythromycine
et à la tétracycline à Bobo-Dioulasso.
Evaluer les bases moléculaires des résistances des souches de S. pneumoniae
isolées à Bobo-Dioulasso.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 7
Première Partie :
Rappels bibliographiques
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 8
I. Généralités sur les pneumocoques
I.1. Epidémiologie
La pneumonie à pneumocoque serait responsable de 500 000 à 1 400 000 décès
dans le monde (Mufson et al., 1990). Aux Etats-Unis, la fréquence des cas de pneumonie à
pneumocoque nécessitant une hospitalisation se situe entre 480 000 et 800 000 cas annuels,
avec une mortalité de l’ordre de 40 000 par an. Une bactériémie est observée dans 10 à
20% des cas (multipliant la mortalité par un coefficient de 2 à 5). Les autres infections à
pneumocoque représenteraient 40 000 cas annuels, avec une mortalité de 6 000 à 7 000
cas. (Klugman, 1990). En France, l’incidence annuelle de la pneumonie à pneumocoque
dans la population générale est évaluée à 20 000 cas ; 2 000 patients sont hospitalisés et la
mortalité se situe aux alentours de 3 500 et 11 700 par an (Mufson et al., 1990). En
Afrique, les données sur S. pneumoniae sont rapportées le plus souvent par l’OMS sur les
méningites, données recueillies dans la « ceinture Africaine de la méningite ». Cette
ceinture s’étend du Sénégal à l’Ethiopie et concerne 350 à 400 millions de personnes dans
21 pays.
En effet, en ce qui concerne la saison épidémique des méningites, en 2003-2004,
sur 2074 échantillons de liquide céphalorachidien positifs des semaines (1 à 32), S.
pneumoniae représentait 26% des cas confirmés contre 40% N. méningitidis A, 13,9%
N. méningitidis W135 des cas confirmés et enfin 12,6% H. influenzae B (Rapport OMS,
2004).
Selon le rapport de la première réunion du réseau de la méningite de septembre
2004, 27 355 cas et 3 443 décès de méningites ont été enregistrés dans plusieurs pays aussi
bien dans que hors de la ceinture Africaine de la méningite ont été enregistrés. Selon le
même rapport, au Burkina Faso, 5 513 cas de méningites ont été enregistrés, avec 972
décès soit un taux de létalité de 17,6% ; 13 districts étaient en alerte et 5 districts en
épidémie sur un total de 77 districts rapportés. Selon le même rapport de la semaine (S1-
S21) au Burkina Faso sur 1091 LCR positifs, on notait respectivement : 25 % de N.
méningitidis A; 11 % de N. méningitidis W135; 17 % de N. méningitidis non Groupés;
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 9
36% de S. pneumoniae; 9% de H. influenzae B positifs.
La surveillance renforcée de la méningite en 2003-2004, montre que les plus fortes
concentrations de districts en alerte ou en épidémie se trouvaient au Burkina Faso, au
Niger et dans les districts voisins de ces deux pays. Le Burkina Faso se retrouve ainsi avec
le nombre de cas et de décès dû aux méningites des plus élevés en Afrique de l’ouest avec
également l’un des taux de létalité les plus élevés, S. pneumoniae étant le germe le plus
fréquemment isolé dans les cas de méningites dans le pays.
Du premier janvier au 15 février 2009, 6 676 cas (581 décès, létalité 8,7 %) de
méningite ont été signalés dans 11 pays sur 14 ; au cours de la même période en 2008, 344
cas (54 décès, létalité 15,7%) avaient été notifiés selon du réseau de surveillance renforcée
de la méningite de l’OMS. En ce qui concerne le Burkina le rapport de la même année
mentionnait : 4013 cas de méningites ; 514 décès soit un taux de létalité de 12,8% au
cours de la 1ère à la 25è semaine. Au cours de la même période, sur 119 L.C.R. testés par
PCR, latex et culture, les nombres suivants de pathogènes ont étés identifiés : 36 (30,2%)
N. méningitidis A , 3 (2,5%) N. méningitidis W135, 78 (65,6%) S. pneumoniae et 2(1,7%)
autres pathogènes. Ces chiffres confirment que de nos jours le pneumocoque est le
premier agent causal des méningites bactériennes aiguës.
I.2. Historique Le nom de Streptococcus (streptus: flexible; coccus: grain) a été pour la première
fois attribuée par Bilroch et Erlich (1877) à des cocci formant des chaînettes (Le Minor et
al., 1982). Dès 1881, Pasteur, Chamberland et Roux découvrent le pneumocoque dans la
salive d’un enfant atteint de rage (Dabernat et al., 1992 ; Gaillard et al., 1988). En
inoculant cette salive à des lapins, ils provoquent une septicémie d’où son nom de
« microbe septicémique de la salive » (Audry et al 1989). Cette expérience est considérée
comme la première référence sur S. pneumoniae (Le Minor et al., 1982). La découverte des
différents types sérologiques de S. pneumoniae en 1910, a permis l’emploi d’antisérums
spécifiques qui ont constitué le premier traitement efficace de la pneumonie à
pneumocoque (Dabernat et al., 1992).
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 10
En 1912, la première souche de pneumocoque résistante à l’optochine (Klugman,
1990) est découverte par Mongeroth et Kaufmann et au fil des années, des souches de
pneumocoques ont acquis une résistance vis-à-vis de tous les antibiotiques à l'exception
des glycopeptides. Les premières résistances ont été identifiées en Australie en 1967. En
1977, sont publiées en Afrique du sud les premières observations de pneumonies et de
méningites dues à des pneumocoques multi résistants (Geslin et al., 1991).
I.3. Habitat
S. pneumoniae est un parasite obligatoire qui colonise les muqueuses de l'homme et
de quelques mammifères (Macaca s.p., Cercopithecus s.p., Pan troglodites, des bovins, des
caprins, des ovins, des équins). Son principal habitat est constitué par le rhino-pharynx de
l'homme (Cohen et al., 1991; Pilly et al., 1978).
La colonisation par S. pneumoniae du rhino-pharynx débute dès les premiers mois
de la vie, atteint son maximum en âge préscolaire de 2 à 3 ans, puis décroît
progressivement avec l’âge pour atteindre 5 à 10% chez l’adulte. Des études ont montré
que 30 à 35 % des enfants âgés de 6 à 11 ans sont porteurs du germe; ce taux est de 18 à
19% chez les adultes (Cohen et al., 1991 ; Ross et al., 1991). Dans les communautés
vivant en promiscuité (militaires dans les casernes, cantines,…) ce taux peut atteindre 50 à
60% (Gaillard et al., 1998 ; Ross et al., 1991). Ce taux est également élevé chez les enfants
vivant en collectivité (27% - 58%) dans les jardins d’enfant, les écoles et les orphelinats.
(Gaillard et al., 1998). Le germe est très fragile et il ne survit pas dans l’environnement
(Gaillard et al., 1998 ; Pilet. et al., 1979).
Les pneumocoques sont isolés à partir de différents prélèvements : expectoration,
liquide pleural, sang, liquide céphalo-rachidien (LCR), ou autres suppurations, selon qu'ils
provoquent respectivement une pneumonie, une pleurésie purulente, une septicémie, une
méningite purulente, ou une autre suppuration, telle qu'otite ou sinusite.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 11
I.4. Caractères bactériologiques
I.4.1. Taxonomie L’espèce Streptococcus pneumoniae, de son nom vernaculaire pneumocoque est un
cocci à Gram positif appartenant au genre Streptococcus, à la famille des Streptococcaceae
et à l’ordre des Micrococcales (Le Minor et al., 1982). Dans le « Bergey's Manual of
Systematic Bacteriology », S. pneumoniae est placé dans le groupe des « streptocoques
pyogènes » ce qui peut se justifier compte tenu de la gravité des infections dont il est
responsable. Toutefois, l'analyse de la séquence des gènes codant pour l'ARNr 16S, montre
une parenté (98,5% d'homologie) avec Streptococcus oralis ; ce qui permet de le placer
dans le groupe des "streptocoques oraux". Les homologies ADN - ADN et la composition
chimique de la paroi avaient déjà permis à Kilpper-Bälz et al., 1983 d'arriver à une
conclusion similaire.
Le sérotypage capsulaire des pneumocoques permet de les subdiviser en 90
sérotypes capsulaires établis par la classification Danoise (Audry et al., 1989). Spécifions
qu’une présence inconstante d'antigène extractible par la méthode de Lancefield peut être
identifiée immunologiquement. Cependant, la classification immunologique reposant sur
la présence d’un antigène extractible par la méthode de Lancefield a de sérieuses limites
car des bactéries possédant le même antigène peuvent être très différentes. La classification
biochimique utilisant une batterie de caractères en galerie miniaturisée est assez coûteuse.
Elle est utilisée si l'immunologie n'est pas possible ou donne des résultats douteux (ou
négatifs) ou encore pour une approche épidémiologique.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 12
I.4.2. Morphologie En microscopie ordinaire, le pneumocoque se présente de façon caractéristique
dans les produits pathologiques sous forme de diplocoques immobiles asporulés, capsulés à
Gram positif appariées par leurs extrémités pointues (Figure 1). Chaque coque donne un
aspect de flamme de bougie, et le diplocoque est en forme de « 8 ». Cependant
S. pneumoniae peut se présenter en courtes chaînettes. Cet aspect n’est pas toujours
évocateur, car par exemple si l’environnement est carencé en magnésium on peut observer
des chaînettes relativement longues (Avril et al., 1992). Le même phénomène se produit
en présence d’anticorps dirigés contre le sérotype capsulaire (Avril et al., 1992 ).
Figure 1: Aspect morphologique de S. pneumoniae sous microscope
après coloration de Gram. Source: Université du Texas-Houston / Ecole de Médécine.
Dans certains cas, si le malade est sous traitement, on peut voir les pneumocoques
peuvent avoir des formes pseudobacillaires ou prendre mal le Gram et dans ce cas ils
peuvent apparaître Gram négatif dans les produits pathologiques fibrineux et dans les
cultures anciennes (Avril et al., 1992).
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 13
Dans ces cas où la morphologie des pneumocoques n’est pas évocatrice au Gram, le
microscope à fluorescence (Figure 2) permettra de bien visualiser des diplocoques
capsulés. Le microscope électronique (Figure 3) montre avec précision la paire de
diplocoque évocatrice des pneumocoques.
Figure 2: Streptococcus pneumoniae sous microscope à Fluorescence
Source: Centre pour la prevention et le contrôle des maladies
Figure 3: Streptococcus pneumoniae sous microscope électronique : une paire de
diplocoque.
Source: Centre pour la prevention et le contrôle des maladies
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 14
I.5. Caractères culturaux La culture du pneumocoque est délicate en raison de sa tendance à la lyse spontanée
ou autolyse (Le Minor et al., 1982 ; Pilly et al., 1978). L’intervalle de température optimale
la culture est de 25°C à 42°C. En routine, on cultive le germe entre 35°C et 37°C. Le pH
optimal pour la culture est de 7,8. La présence de 5 à 10% de CO2 est indispensable en
primo culture. Cependant, l’anaérobiose stricte est meilleure pour le développement des
pneumocoques (Avril et al., 1992).
Le pneumocoque exige :
soit des milieux nutritifs enrichis au sang, comme la gélose
au sang de mouton, cheval etc. (5 %), ou de la gélose à l’ascite.
soit des milieux supplémentés de composés thiolés comme le
poly Vitex, ou de glucose à 2 % (milieu de Truche).
Sur une gélose au sang frais de mouton, le pneumocoque développe une hémolyse
de type alpha (Figure 4), grâce à une hémolysine produite par la bactérie.
Figure 4 : Une hémolyse de type α sur gélose au sang.
Source : www.microbes-edu.org/etudiant/streptocoques.html
Cours Professeur Bouvet A., octobre 2000 (Centre National de Référence des
Streptocoques, Hôtel Dieu, Université Paris VI).
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 15
En présence d’antibiotiques modifiant la paroi, il apparaît une hémolyse bêta (Avril
et al., 1992). Les colonies de bactéries virulentes capsulées sont lisses, transparentes et
rondes. Elles sont encore appelées S « smooth ». Une ombilication au centre de la
colonie correspond à un début d’autolyse. La capsule réalise un gel hydrophile à la surface
de la bactérie. En culture, le pneumocoque perd facilement sa capsule donnant des colonies
rugueuses R « rough » qui correspondent à des bactéries ayant perdu leur virulence. Sur
gélose enrichie (excepté la gélose ou sang), on aperçoit de très petites colonies surtout
visibles à la loupe. Elles sont lisses, bombées, limitées par un bord régulier, parfaitement
transparentes et dites « en gouttes de rosée » (Pilet et al., 1979). En bouillon enrichi, on
observe en 24 heures un trouble léger qui a tendance à s’éclaircir car l’autolyse est facile.
I.6. Caractères biochimiques
I.6.1. Enzymes respiratoires
Le pneumocoque est :
- Catalase négative,
- Cytochrome oxydase négative,
- Peroxydase négative, ce qui conduit à l’accumulation
de peroxyde responsable en partie de son autolyse (Avril et al., 1992).
I.6.2. Métabolisme glucidique
Le pneumocoque fermente le glucose, le lactose, le raffinose, et le saccharose, sans
production de gaz.
I.6.3.Métabolisme protidique
Le pneumocoque provoque une acidification et une coagulation du lait.
I.6.4. Propriétés particulières
Deux caractères bactériologiques permettent la différenciation de Streptococcus
pneumoniae des autres streptocoques.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 16
I.6.4.1. Phénomène de Neufield
La lyse des pneumocoques (en phase S) par la bile et les sels biliaires (phénomène
de Neufield). Les pneumocoques possèdent un système inhibiteur d’enzymes autolytiques
qui est détruit par les agents tensioactifs comme la bile, le desoxycholate de sodium (2 -
10%). Ainsi l'addition de bile ou de sels biliaires à une culture neutralisée, active une
autolysine, impliquée dans la division cellulaire, qui clive la liaison entre l'acide N-acétyl-
muramique et l'alanine. Le peptidoglycane est ainsi altéré et la bactérie apparaît soluble
dans la bile. En pratique, la recherche de la lyse par la bile est rarement effectuée car elle
est de réalisation plus complexe que la recherche de la sensibilité à l'optochine.
I.6.4.2. Sensibilité à l’optochine
L’optochine (éthylhydrocupréïne) inhibe la croissance du pneumocoque à des
concentrations qui seraient sans effet (5µg par disque) sur la plupart des autres bactéries du
genre Streptococcus. Cette sensibilité est habituellement recherchée en utilisant un disque
de papier imbibé d'une solution d'optochine à 0,5%. Cette distinction n’est pas toujours
aussi évidente. En effet, 0,5 - 5% des pneumocoques sont résistants à l’optochine et
quelques streptocoques verdissants sont inhibés par l’optochine.
I.7. Caractères antigéniques Nous avons ci-dessous (Figure 5), un schéma d'une coupe de Streptococcus plaçant
les différents antigènes (certains ne possèdent pas de polyoside C, beaucoup n'ont pas de
capsule).
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 17
Figure 5 : Une coupe de Streptococcus plaçant les différents antigènes.
Source : membres.lycos.fr/.../systematique/Strepto.html
I.7.1. Antigènes capsulaires
La plupart des souches de pneumocoques possèdent une épaisse capsule composée
de polysaccharides complexes avec des aminoacides et de la choline associés aux
polymères. La composition de cette capsule varie selon les sérotypes ; elle est connue
seulement pour certains sérotypes comme le sérotype 3, qui est un polymère d’acide
cellobiuronique. Ces polyosides capsulaires forment une couche hydrophile relativement
perméable à la surface du pathogène qui confère aux bactéries une résistance à
l’opsonisation et à la phagocytose. C’est donc un facteur essentiel de virulence des
pneumocoques. Ces polyosides portent une spécificité antigénique, ce qui permet de
distinguer plus de 90 sérotypes capsulaires par des réactions d’agglutination, de
précipitation ou de gonflement de la capsule (Quellung reaction), à l’aide d’anticorps
spécifiques.
Des acides trichoïques sont souvent présents comme chez Staphylococcus
D’autres protéines peuvent être observées en surface
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 18
I.7.2. Antigènes somatiques
Plusieurs protéines sont associées à la paroi du pneumocoque ; il s’agit d’enzymes
synthétisant ou détruisant le peptidoglycane, les penicillin-binding proteins et les
autolysines. Nous avons également des protéines de structure.
I.7.3.La substance C
Elle est spécifique d’espèce, c’est un polysaccharide constitué d’acide téchoïque,
pouvant parfois contaminer les polysaccharides capsulaires et être responsable de réactions
croisées. Sa composition chimique est analogue au polyoside C des streptocoques, mais
elle est différente du point de vue antigénique.
I.7.4. L’antigène R
Il est de nature protéique, commun avec d’autres streptocoques. Il est souvent
inapparent car masqué par l’antigène capsulaire. Il est visible en microscopie électronique
sur les souches R « rough » dépourvues de capsules.
I.7.5. L’antigène M
Il est de nature protéique, spécifique de type, mais sans rapport avec la spécificité
capsulaire. Il n’entraîne pas l’apparition d’anticorps protecteurs.
I.8. Les Substances élaborées
Si le facteur essentiel de la pathogénicité de S. pneumoniae est la résistance à la
phagocytose conférée par la capsule polyosidique, l’invasivité de ces bactéries serait
favorisée par la réaction inflammatoire et par la production de certaines toxines (qui
contribueraient aussi à la réaction inflammatoire et à la gravité de signes cliniques
associés).
I.8.1. Les toxines
A côté de ces antigènes capsulaires et somatiques, le pneumocoque élabore des
toxines dont les plus connues sont la pneumolysine et le principe producteur de purpura
(Avril et al., 1992).
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 19
I.8.1.1. La pneumolysine
La pneumolysine est responsable de l’hémolyse de type alpha, c’est une toxine
oxygène sensible, activée par les groupements thiols, sensible au cholestérol, cytolytique
au même titre que la streptolysine. Elle lyse les hématies de lapin, de cobayes et les
hématies humaines. Elle lyse également les globules blancs. Son effet comme leucocidine
est connu depuis longtemps. Elle détruit également les plaquettes et son effet toxique
s’exerce sur d’autres cellules en particulier celles de l’oeil. Elle présente un seul type
antigénique et est transformable en anatoxine, d’où des applications possible.
I.8.1.2. Le principe producteur de purpura (PPP)
Il est connu depuis 1926, mais en 1981, on a montré qu’une enzyme intervenait,
soit dans la genèse, soit dans la libération de ce principe: il s’agit de la N -
acéthylmuramyl-L- alcinine amidase. Cette substance n’est pas antigénique, mais pourrait
produire soit le purpura, soit des hémorragies internes.
I.8.2. Les enzymes
Le pneumocoque produit également des enzymes qui ont un rôle pathogène
important : ce sont la neuraminidase et la hyaluronidase (Avril et al., 1992).
I.8.2.1.La neuraminidase
De nombreuses souches sont productrices de cette enzyme qui a pour cible les
acides sialiques. Purifiée et injectée par voie intra-péritonéale à la souris, elle provoque des
lésions hépatiques et rénales. Par voie intracérébrale, elle entraîne des symptômes
neurologiques.
I.8.2.2. La hyaluronidase
La hyaluronidase peut jouer un rôle pathogénique. Elle provoque un effet lytique
important sur la substance de base du tissu conjonctif et jouerait un rôle dans la tendance
caractéristique des streptocoques de diffuser dans les tissus des mammifères (facteur de
diffusion). Son rôle est probablement moindre que celui joué par les deux précédentes
toxines.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 20
I.9. Facteurs de pathogénicité et pouvoir pathogène
I.9.1. Les principaux facteurs de pathogénicité
Le pouvoir pathogène des pneumocoques a été attribué à de nombreux facteurs de
pathogénicité et plus de 125 gènes pourraient être impliqués dans la virulence. Toutefois,
les raisons permettant d'expliquer le taux élevé de mortalité sont encore mal comprises.
Les principaux facteurs de virulence peuvent être divisés en deux groupes :
Le premier groupe est constitué par des composants de surface
(capsule, protéine A de surface, protéine liant le facteur H du système
complémentaire, protéase active sur le composé C3 du complément) qui jouent un
rôle important au début de l'infection en inhibant la phagocytose. Cette inhibition
de la phagocytose est, en grande partie, due à une inhibition de l'activation du
système complémentaire.
Le deuxième groupe rassemble des composants (polysaccharide lié
au peptidoglycane, pneumolysine) qui interviennent à un stade plus tardif de
l'infection et qui sont libérés à la suite d'une désintégration des cellules bactériennes
provoquée principalement par l'autolysine. Ces facteurs de virulence provoquent
d'intenses manifestations inflammatoires notamment à la suite de l'activation du
système complémentaire. Les principaux facteurs de virulence figurent dans le
tableau en annexe.
I.9.2. Le pouvoir pathogène
Le pouvoir pathogène des pneumocoques est lié à leur résistance à la phagocytose
du fait d’une capsule protectrice, et à la remarquable aptitude de ces bactéries à induire une
réaction inflammatoire intense qui explique la gravité des symptômes et la fréquence de
leur dissémination tissulaire. Expérimentalement, la souris est un animal de choix. Elle est
sensible à toutes les voies d’inoculation. En effet, l’inoculation intrapéritonéale d'une
souche capsulée « smouth » de S. pneumoniae entraîne la mort de la souris par septicémie
en vingt quatre ou quarante huit heures. À l'autopsie, on retrouve des bactéries dans
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 21
différents organes. Par contre, après inoculation dans les mêmes conditions de bactéries S
« smouth » mortes, ou d'une souche non capsulée R « rough « , la souris survit.
On inocule généralement 0,1 ml de culture de vingt quatre heures. A l’autopsie, on
observe des germes capsulés dans le sang et sur les frottis d’organes (foie, rate
etc.).
Le pouvoir pathogène pour la souris n’est pas constant, certains sérotypes (tel que
le sérotype 14) sont peu pathogènes, de même que les souches en phase R (Le
Minor et al., 1982 ; Pilet et al., 1979)
Le document ci-dessous (Figure 6) présente une expérience réalisée par Griffith
montrant le pouvoir pathogène et génétique de certains pneumocoques. En effet,
l'inoculation d'une souche capsulée S de Streptococcus pneumoniae à une souris provoque
en 24 heures sa mort par septicémie. À l'autopsie, on retrouve des bactéries dans différents
organes. Par contre, après inoculation dans les mêmes conditions de bactéries S mortes, ou
d'une souche non capsulée R, la souris survit (Figure 6, lignes a, b, c). Si on incube la
souche R vivante et la souche S tuée avant de les administrer à une souris, celle-ci meurt
par septicémie (Figure 6, ligne d) et on retrouve dans son sang des bactéries S.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 22
Figure 6 : L’expérience réalisée par Griffith.
Source : http://stl_bjb.ac-dijon.fr/annales/98remM.htm
I.10. Immuno/Physiopathologie
Le processus infectieux et lésionnel s’effectue en plusieurs étapes. Il commence par
l’infection de l’épithélium respiratoire par les pneumocoques qui adhèrent, colonisent,
prolifèrent in situ et effectuent une translocation vers les vaisseaux sanguins (Figure 7).
Ensuite nous avons une bactériémie avec la traversée de l’endothélium vasculaire par
S. pneumoniaequi entraîne une activation des polynucléaires, une prolifération, une
autolyse et un choc endotoxinique.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 23
Par la suite, dans le cas des méningites, le franchissement de la barrière hémato-
méningée entraîne une lyse bactérienne, un influx de PN, une activation des cytokines
inflammatoires (IL-1, TNF, PAF, IL-6) induisant à elles seules les signes de méningite
(Figure 7 ; Figure 8). Finalement la destruction de la barrière hémato-méningée intervient
et on observe un oedème par extravasation et défaut de résorption du LCR et des lésions du
S.N.C.
Figure 7: Le processus infectieux et lésionnel
Source : Alonso J.M.; Centre national de Référence des méningocoques- Unité des
Neisseria.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 24
Figure 8: Réaction inflammatoire induite par les cellules du pneumocoque. Source: The New England Journal of Medicine 332(19):1281
I.11. La réponse immunitaire
L’immunité contre le pneumocoque est essentiellement humorale, et est basée sur la
sécrétion d’anticorps spécifiques, de type opsonines, qui favorisent la phagocytose de ces
microorganismes et leur destruction par des enzymes lysosomiales. Ces anticorps protègent
contre l’infection à pneumocoques et ont été utilisés comme traitement avant l’ère des
antibiotiques (sérothérapie). Il a été montré que les anticorps antipolyosidiques capsulaires
sont décelables quelques jours après le début de l’infection, et persistent pendant des
années. Ce qui explique une forte immunité spécifique de la souche responsable de
l’infection. Des immunoglobulines A (IgA) spécifiques sont également produites dans les
sécrétions des voies respiratoires expliquant la résistance acquise contre les souches
appartenant au même sérotype capsulaire. Ces forts taux d’anticorps sont liés à la
persistance des antigènes polyosidiques dans l’organisme qui les éliminent très lentement.
Ainsi, en raison de la forte réponse immune créée par le pneumocoque, la voie
alterne du complément est activée avant la production de l'anticorps anti-capsulaire
spécifique. Il en résulte que la fixation du complément aux pneumocoques et la clairance
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 25
par le système réticulo-endothélial (RE) (spécifiquement la rate) s’effectuent. Une fois que
les anticorps dirigés contre la capsule sont formés, l’opsonisation rapide s’effectue.
I.12. Le mode de transmission Les bactéries sont transmises par voie aérienne tant que les sécrétions buccales et
nasales contiennent un nombre important de pneumocoques virulents. La transmission
directe se fait par contact avec les sujets hébergeant les germes (propagation de gouttelettes
de salive, de gouttelettes de Pflügge, par contact oral direct, par des objets fraîchement
souillés de sécrétions respiratoires). La pénicilline rend le malade non infectieux en 24 à 48
heures (pour les souches sensibles). Les porteurs sont nombreux mais le risque d'infection
à la suite d'un contact avec un porteur ou un sujet infecté est faible. La période
d’incubation est indéterminée.
I.13. Les facteurs favorisant la diffusion du germe
La notion de terrain joue un rôle important. En effet, les infections
pneumococciques sont beaucoup plus fréquentes :
Aux âges extrêmes de la vie, le groupe vulnérable (jeunes enfants, sujets âgés),
chez l’homme plus que chez la femme (Avril et al., 1992).
Sur des terrains particuliers (Pabst et al., 1979) tels que l’insuffisance respiratoire,
la bronchite chronique (agent de surinfection), l’insuffisance cardiaque, le diabète,
le cancer.
Chez les sujets aspléniques, les sujets drépanocytaires et VIH séropositifs, les sujets
immunodéprimés (hypogammaglobulinémie, le déficit en IgA sécrétoire, le déficit
en complément...), les déficits de l'immunité cellulaire (neutropénie, maladie de
Hodgkin), la corticothérapie, les sujets fragilisés par des infections virales (grippe,
VRS), alcool, etc.
La diffusion d’Octobre à Avril de certains virus et bactéries tels que : les RSV ; les
adénovirus, les Haemophilus influenzae et parainfluenzae (Figure 9, 10).
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 26
Nesseria meningitidis A. et W.135 semblent être des facteurs favorisant ou
aggravant la diffusion des pneumocoques, comme l’atteste la superposition des pics dans
les figures ci-dessous (Figure 9).
Figure 9: Incidence des agents favorisants ou aggravants la diffusion
de S. pneumoniae en Afrique.
Source : Rapport OMS 2002-2003 sur les méningites bactériennes.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 27
Figure 10: Incidence des agents favorisants ou aggravants la diffusion de S. pneumoniae.
Source : Kim et al. Clin.Infect.Dis.1996.
I.14. Les mesures préventives d’hygiène
Elles sont illusoires du fait de la fréquence extrême de portage des pneumocoques
sur les muqueuses des voies aériennes supérieures des sujets sains (Gallard et al., 1988).
I.15. Les traitements des infections à pneumocoques
Le traitement des pneumocoques résistant aux antimicrobiens dépend du site
d'infection et de la nature précise du profil de sensibilité. Les principes suivants devraient
contribuer au choix d'un traitement convenable :
Établir la sensibilité de la souche S. pneumoniae. Si la souche se révèle
pénicillinorésistante, déterminer la sensibilité au céfotaxime, à la ceftriaxone, à la
vancomycine et à la rifampicine.
Si la souche est pénicillinosensible, traiter le patient à la pénicilline.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 28
Si l'infection ne touche pas le système nerveux central (SNC) et que la souche offre
une pénicillinorésistance intermédiaire, on peut utiliser la pénicilline ou un autre
médicament auquel la souche est sensible (céfotaxime, ceftriaxone ou
vancomycine). Ne jamais faire appel à la rifampine comme simple agent, car une
résistance peut se dégager pendant le traitement.
Le traitement empirique recommandé contre une infection pneumococciques du
SNC confirmée ou très présomptive avant l'obtention des résultats des épreuves de
sensibilité est la combinaison de vancomycine et de céfotaxime ou de ceftriaxone.
Le traitement devrait ensuite être rajusté selon les résultats de la CMI.
Si l'infection touche le SNC, ne recourir à la pénicilline que si l'isolat
pneumococcique y est sensible. Si la souche offre une résistance intermédiaire,
sélectionner un autre médicament selon les résultats de l'épreuve de sensibilité
(CMI). N'utiliser le céfotaxime ou la ceftriaxone que si la souche lui est sensible.
En cas d'infection pneumococcique du SNC par une souche pénicillinorésistante,
choisir le céfotaxime ou la ceftriaxone si l'isolat y est sensible. Si la souche résiste à la
pénicilline et aux céphalosporines, on recommande la vancomycine (60 mg/kg/jour)
accompagnée ou non de rifampine orale. La rifampine pénètre bien dans le SNC et
complète la vancomycine, dont la pénétration n'est pas prévisible.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 29
Deuxième partie :
Matériel et Méthodes
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 30
I. CADRE DE L ETUDE Le Burkina Faso, pays enclavé ayant un climat de type soudano sahélien est situé
dans la ceinture méningitique dite de « Lapeyssonnie ». Il possède une frontière commune
avec la Côte d’Ivoire, le Mali, le Niger, le Bénin, le Togo et le Ghana (Figure 11). Le pays
a une population estimée à 11,063 millions d’habitants (INSD, 1999) pour une superficie
de 274.200 km2. Il est parmi les pays les plus peuplés d’Afrique Occidentale et sa
population est majoritairement jeunes (47,5%) et compte 53% de femmes. L’espérance de
vie à la naissance dans le pays est estimée à 41,7 ± ans (PNUD, 2003).
La population s’accroît au rythme de 2,37% par an. Le Produit Intérieur Brut (PIB)
par habitant est estimé, sur la période allant de 1993 à 1998, à 300 $US par an.
Le rapport (INSD, 1994) évalue à 112 FCFA par adulte et par jour soit 41 099
FCFA (82,2$) par adulte et par an dans lesquels 22 000 FCFA sont consacrés aux dépenses
de subsistance.
Ce niveau de revenu situe le Burkina parmi les pays en développement les moins
avancés (PMA). Le rapport sur la pauvreté (INSD, 1996) indique que 44,5% de sa
population vit en deçà du seuil de pauvreté.
L’économie repose principalement sur le secteur primaire (agriculture et élevage),
qui est le plus grand pourvoyeur d’emplois (près de 91% de la population active). Le
secteur secondaire (industrie) qui participe pour 18% au PIB, est faiblement développé.
Le secteur tertiaire qui occupe 4% de la population active, contribue pour 40% au
PIB. Il est composé des filières traditionnelles liées au commerce et aux activités de
service.
Système sanitaire :
Le système sanitaire au Burkina Faso s’articule sur quatre niveaux de soins : les
Centres de Santé et de Promotion Sociale (1000 CSPS), le Centre Médical avec Antenne
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 31
chirurgicale (20 CMA) basé au chef lieu du district sanitaire (55 districts), les Centres
hospitaliers Régionaux (9 CHR) et les Centres Hospitaliers Universitaires (3 CHU).
Figure 11 : La carte du Burkina Faso
Source : www.vacanceo.com/img/cartes 580/185.jpg
Bobo-Dioulasso, capitale économique du Burkina Faso, est la deuxième ville du
pays avec environ 500 000 habitants.
Le Centre Muraz qui est une structure du ministère de la Santé basée à Bobo-Dioulasso, est
un centre de recherche appliquée en santé publique dont la mission principale est de
promouvoir la lutte contre les maladies transmissibles, à travers la recherche, la formation,
l’expertise, et les prestations de service dans le domaine des analyses médicales. Les
travaux de recherche et les activités de laboratoire du centre sont basés sur :
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 32
Le paludisme et les autres maladies parasitaires.
Le VIH/SIDA et les maladies associées (Tuberculose, Infections
sexuellement transmissibles).
La vaccinologie et l’épidémiologie d’intervention (Fièvre jaune,
méningites).
La santé de la reproduction.
La culture, l’identification et l’antibiogramme des souches de portage ont été
effectuées au Centre Muraz et celles des souches invasives à l’hôpital Sourou Sanon, l’un
des 3 CHU du pays.
Le sérotypage des souches isolées (portage et invasives) s’est effectuées au centre
hospitalier cantonal Vaudois (CHUV) de Lausanne en Suisse. Le génotypage des souches
invasives isolées s’est effectuées dans les laboratoires du département de microbiologie de
l’université de Catania en Italie.
II. MATÉRIEL ET MÉTHODES
II.1. Matériel
II.1.1. Les souches bactériennes
Les souches bactériennes proviennent du nasopharynx d’un total de 860 enfants
âgés de 0 à 5 ans venant pour la vaccination. Les prélèvements ont été réalisés dans les
centres de Santé Maternelle et Infantile (S.M.I.) d'Accart-ville (Centre 1, N= 440), de
Farakan (Centre 2, N=420). Les prélèvements de liquide céphalo-rachidien (LCR) se sont
faits chez des malades hospitalisés pour suspicion de méningite au Centre Hospitalier
Universitaire Sourou Sanon de Bobo-Dioulasso. Ces prélèvements ont été effectués de
Septembre 2000 à Décembre 2001 et d’Octobre 2002 à Février 2003.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 33
Des écouvillons stériles en alginate de calcium flexible ont été utilisés pour les
prélèvements nasopharyngés ; et des seringues pour les prélèvements de LCR.
II.1.2. Les réactifs
Pour l’identification des souches nous avons utilisé :
Des milieux gélosés additionnés de sang : gélose Columbia (Sanofi Diagnostic
Pasteur) (Sanofi Diagnostic Pasteur).
Des réactifs d’agglutination pour rechercher la présence d’antigènes solubles :
slidex-pneumo kit (Bio-Merieux).
De la desoxycholate de sodium (Sanofi Diagnostic Pasteur) pour mettre en
évidence la lyse du pneumocoque par la bile.
Pour l’étude de la sensibilité des souches (antibiogramme) nous avons utilisé :
De la gélose Mueller-Hinton (Sanofi Diagnostic Pasteur) additionnée de sang
de mouton.
Des disques d’antibiotiques.
Des souches de référence A.T.C.C pour le contrôle de qualité.
Pour le sérotypage de nos souches nous avons utilisé des antisérums du Statens
Institut de Copenhague (Danemark) et un microscope inversé.
II. 2. Méthodes
II.2.1. Collectes des données sociodémograhiques et des antécédents
vaccinaux et /ou médicaux.
La collecte des données sur les enfants ou sur les souches de portages a été
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 34
effectuée selon un questionnaire de type épi–info6. Ce questionnaire comportait
trois grandes parties :
la première partie était en rapport avec les données socio-économiques de la
famille des enfants.
la deuxième partie avait trait ou était en rapport avec les données vaccinales des
enfants.
la troisième partie avait trait ou était en rapport avec les données de laboratoire
des prélèvements effectués sur les enfantss.
La collecte des données sur les souches invasives a été effectuée selon un
questionnaire plus simple. Ce questionnaire décrivait le nom et prénom du patient,
la nature du prélèvement, l’âge et le sexe du patient, les données biologiques ou de
laboratoire.
Par la suite les données ont été analysées en utilisant le logiciel Epi–info 6. Un
enfant était déclaré correctement vacciné si au vu de son âge, il avait reçu tous les vaccins
du PEV (Programme élargi de Vaccination).
II.2.2. Examen Bactériologiques.
Des prélèvements nasopharyngés effectués à l'aide d'écouvillons stériles en alginate
de calcium flexible ont été immédiatement ensemencés sur une gélose base Columbia +
5% de sang de mouton + 5 mg/L de gentamycine. Les boîtes de Pétri de 90mm
ensemencées ont été incubées à 37°C, sous atmosphère enrichie en 5% de CO2 pendant 20
à 24 heures dans les laboratoires de bactériologie du Centre Muraz. L'identification des
isolats a reposé sur:
l’aspect morphologique des bactéries à l’examen microscopique des frottis
colorés par le Gram,
l'aspect des colonies sur la gélose au sang frais,
l'hémolyse alpha,
la sensibilité à l'optochine,
la lyse du pneumocoque par le désoxycholate de sodium à 10%.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 35
Une subculture des souches pendant 18 à 24 heures sur gélose au sang frais a été
utilisée pour réaliser l’antibiogramme. Une suspension (500 µl) des souches a été effectuée
dans du lait écrémé + glycérol et conservée au congélateur à –70°C dans des micro tubes
de 550µl autoclavables (Milian instrument PAT-22).
L'antibiogramme a été réalisé selon la méthode de Kirby-Bauer modifiée en
utilisant des disques imprégnés aux différents antibiotiques. Seize (16) disques
d'antibiotiques ont été testés :
Oxacilline (de biomérieux S.A. 1 g)
Chloramphénicol(de sanofi diagnostic pasteur 30g)
Vancomycine (de sanofi diagnostic pasteur 30g)
Erythromycine (de biomérieux S.A. 15 g)
Ceftriaxone (de sanofi diagnostic pasteur 30g)
Tétracycline (de sanofi diagnostic pasteur 30)
Rifampicine (de sanofi diagnostic pasteur 30g)
Cotrimoxazole (de biomérieux S.A. 25 g)
Ampicilline (de biomérieux S.A. 10 g)
Lincomycine (de sanofi diagnostic pasteur 15g)
Spectinomycine (de sanofi diagnostic pasteur 100g)
Amoxicilline (de biomérieux S.A. 25 g)
Amoxcilline + Acide clavulanique (de oxoid limited 30g)
Amikacine (de sanofi diagnostic pasteur 30g )
Pefloxacine (de sanofi diagnostic pasteur 5g)
Ciprofloxacine (de biomérieux S.A. 5 g)
La lecture de l'antibiogramme a été faite selon la méthode de Kirby-Bauer et
l'interprétation des résultats selon les normes du National Committee for Clinical
Laboratory Standard (N.C.C.L.S., 1998. 2000. 2003).
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 36
La détection des souches de sensibilité anormale à la pénicilline G a été effectuée à
l’aide de disques d’oxacilline chargés à 5 µg. Lorsque le diamètre d’inhibition observé
était inférieur ou égal à 25 mm selon les normes du N.C.C.L.S., les souches étaient
classées comme ayant une sensibilité anormale à la pénicilline G.
Le contrôle de qualité pour vérifier la validité du procédé de détermination de la
sensibilité aux antibiotiques, a utilisé des disques imprégnés qui ont été éprouvés en
présence de souches de référence. La souche de référence S. pneumoniae A.T.C.C. 49619 a
été utilisée pour le contrôle de qualité de la technique.
II.1.3.3. Les prélèvements du LCR.
Les prélèvements du LCR ont été faits par ponction lombaire dans des tubes stériles
ont été acheminés rapidement au laboratoire oú une centrifugation a été faite à 2000
tours/mn pendant 20mn pour obtenir un inoculum bactérien important dans le culot de
centrifugation. Par la suite des examens macroscopique et microscopique ont été effectués.
Examen macroscopique
Le LCR provenant d’un suget sain est normalement limpide. Il est appelé
classiquement « eau de roche ». Les méningites à pneumocoque sont souvent
accompagnées d’une hypercytose importante. Une observation du liquide de ponction est
effectuée à l’œil nu pour apprécier s’il est trouble et/ou hémorragique.
Examen microscopique
Après l’examen macroscopique, un examen microscopique est fait sur le culot
obtenu après centrifugation pour établir la formule leucocytaire après une coloration au
MGG. La coloration de Gram sur le culot de centrifugation est ensuite effectuée pour
mettre en évidence la présence de diplocoques gram positif capsulés caractéristiques des
pneumocoques et orienter le diagnostic avant le résultat de la culture.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 37
Culture, Identification, Antibiogramme
Par la suite la culture, l’identification des souches, et l’antibiogramme se sont
effectués selon la même procédure que pour les souches de portage.
II.2.3. Le sérotypage
Les souches congelées ont été transportées par air dans les laboratoires de
microbiologie du centre Hospitalier Universitaire cantonale Vaudois de Lausanne en
Suisse en respectant les normes et les conditions de sécurités internationales. Là,
l’identification des souches a été confirmée par la sensibilité à l’optochine et par la lyse
des pneumocoques par la désoxycholate de sodium avant le sérotypage.
II.2.3.1. Principe
Nous avons utilisé la réaction de quellung. Le principe de la méthode s’appuie sur
l’agglutination des particules de Latex sensibilisés par des anticorps anti-pneumococciques
lorsque celles-ci sont en contact avec des antigènes capsulaires.
II.2.3.2. Procédure
Une suspension de cellules de S. pneumoniae a été faite à 0,5 Mac Farland. Une
agglutination sur lame a été faite avec un antiserum. La préparation a été placée par la
suite sur un microscope à contraste de phase et la lecture s’est effectuée en utilisant un
objectif 100. La capsule était visible si la réaction était positive (immunoprécipitation qui
change l’indice de réfraction). Un pool de 9 antisérums (A à I) du Statens Sérum institut
de Copenhague (Danemark) a été utilisé successivement jusqu’à ce qu’on ait une réaction
positive. Si la réaction était positive, un pool d’antisérums (P à T) était par la suite utilisé.
L’interprétation de la lecture s’est faite en utilisant l’algorithme (tableau1)
ci-dessous (Uffe, 1993).
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 38
Tableau 1 : Algorithme servant à déterminer la majorité des sérotypes/sérogroupes.
Pool P Q R S T
Sérotypes/sérogroupes non vaccinaux
A
1 18 4 5 2
B
19 6 3 8
C
7 20
24 ; 31 ; 40
D
9 11
16 ; 36 ; 37
E
12 10 33
21 ; 39
F
17 22
27 ; 32 ; 41
G 29 ; 34 ; 35 ; 42 ; 47
H
14 23 15
13 ; 28
I
25 ; 38 ; 43 ; 44 ; 45 ; 46 ; 48
II.3. Le génotypage
Le génotypage a consisté à l’identification des gènes erm (B), mef (A) et tet (M) de
résistance aux macrolides et aux tétracyclines, à la détermination des transposons et à la
réalisation de l’électrophorèse en champs pulsées sur les souches isolées.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 39
II.3.1 Principe de la PCR
Un thermocycler de type (9600 GENAMP PCR System ; Perkin-Emner) pour la
PCR a été utilisé pour détecter la présence des gènes : tet (M), erm (B), mef (A). Les gènes
erm (B), mef (A) ont été amplifiés en utilisant la paire d’amorce décrite par (Doern et al.,
2001). La paire de d’amorce suivante pour la mise en évidence du gène tet (M) a été
utilisée:
MS 181 (5’ – ATA TGT GTG TGA CGA ACT TTA CC- 3’)
MS 182 (5’ – CAG GTT CAC CGG TAG TAA CAT- 3’).
La détermination de la présence de transposons Tn 1545 a été obtenue en utilisant
des primers spécifiques des gènes de l’intégrase, localisée sur int-Tn décrit dans la
littérature. Pour la détermination des transposons Tn 1207.1, une PCR a été faite en
utilisant les amorces suivantes :
MS34 rew (5’- GAT AGG GTT TAT GCG GCG AAG A-3’) / ME-rev et
MS 146 (5’ – GGT GGG TAA GTA GTA TCA GAG TGA G-“3’) / mef-rev.
II.3.2. Procédure de la PCR
L’ADN a été extrait à l’aide d’un appareil « GenElute bacterial Genomic Miniprep
(Sigma-Aldrich) ». Deux (2) à 4 colonies bactériennes ont été diluées dans 20 µl de
tampon de lyse (0,25% sodium dodecyl sulfate, 0,05 N NaOH) à 94°C pendant 5min). Le
lysat a été dilué avec 180 µl d’eau distillée et centrifugé à 16,000 × g pendant 5 min. Le
surnagent a été par la suite utilisé comme matrice de l’ADN. Une PCR a été faite dans un
volume final de 50 µl de 0,8 × PCR tampon (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl [pH 9,0], 0,1%
Triton X-100, 0,01% [poids/vol] stabilisateurs, 1,5 mM MgCl2) contenant 300 µM de
désoxynucléosides triphosphates, 3,5 mM MgCl2, 2 U Taq polymérase (Invitrogen,
Carlsbad, Calif.), et 10 à 15 ng de DNA. Des concentrations optimales de primers étaient :
0,5 µM; erm (B), 0,5 µM; mef(A/E), 0,2 µM; tet(M), 0,4 µM; et 23 S rRNA, 0,16 µM.
Une PCR de l’ADN a été faite en utilisant un thermocycler DNA (9600 GeneAmp
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 40
PCR System; Perkin-Elmer, Monza, Italie) par les cycles suivants: un cycle initial de 3
min à 93°C, 30 cycles de 1 min avec une dénaturation à 93°C, 1 min d’annealing à 62°C, et
4 min d’extension à 65°C, suivie d’un cycle de 3 min d’élongation à 65°C. Les produits
PCR ont été analysés par électrophorèse dans 1,5% de gel d’agarose à 150 V pendant 1,05
h à 0,5 × TBE (45 mM Tris-HCl, 45 mM acide borique, 1 mM EDTA) contenant 0,05 mg/l
de bromure d’ethidium. Les images ont été faites en utilisant un Gel-Doc-1000 (Bio-Rad
Laboratories); le contrôle positif avait 8 bandes.
II.3.3. PFGE (électrophorèse en champs pulsés) et hybridation du DNA.
La fixation des échantillons a été faite dans un gel d’agarose LMP. La lyse des
échantillons s’est faite in situ et la digestion de L’ADN chromosomique s’est faite en
utilisant des endonucléases de restrictions de type Apa I (New England Biolab, UK)
décrites dans la littérature (Tenover et al., 1995).
La lyse des échantillons s’est faite in situ et les fragments de DNA ont été soumis à
un courant de 200V pendant 21h à 10°C. Un champ alterné a été utilisé et le « pulse
times » était de : 1S pour 3h ; 3S pour 3h ; 5S pour 3h ; 7S pour 4h ; 10S pour 4h ;
15S pour 4hs. Le gel a été révélé par le bromure d’éthidium et photographié sous UV. En
ce qui concerne l’hybridation ; les fragments d’ADN ont été transférés sur une membrane
hybond N+ en nylon ( Amersham international, UK) sous vide en utilisant un appareil de
type Pharmacia biotech, Sweden selon les instructions du fabriquant. L’hybridation a été
effectuée avec les sondes erm (B), tet (M), mef (A) obtenu par PCR.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 41
Troisième parTie :
Résultats
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 42
III.1. RESULTATS DE LA PREMIERE ETUDE
Profil de résistance de Streptococcus pneumoniae chez des enfants
de 0 à 5 ans dans la ville Bobo-Dioulasso au Burkina Faso en 2000. Bio-Africa- vol 2 N°1; pp 77-84, 2005
III.1.1. Problématique de la première étude
S. pneumoniae, deuxième germe responsable des méningites au Burkina Faso et
dans la plupart des pays de la sous région est normalement sensible aux pénicillines.
Cependant nous assistons depuis quelques moments à des échecs thérapeutiques dues à
l’émergence et à la propagation de souches multi résistantes. Il nous apparait nécessaire
voire impératif de procéder à une évaluation et/ou une réévaluation de la sensibilité de ce
germe aux antibiotiques. Cette surveillance de la résistance du germe qui peut être faite sur
des souches du portage, permettra une utilisation rationnelle (thérapeutique et
prophylactique) des antibiotiques dans notre pays.
La présente étude avait les objectifs suivants : déterminer la sensibilité des souches
isolées chez des enfants de 0 à 5 ans venant dans les SMI pour une vaccinations et
déterminer le potage des pneumocoques chez ces enfants.
L’étude a été menée au Centre Muraz de à Bobo-Dioulasso. Un total de 215
enfants ont été inclus dans l’étude avec le consentement des mères qui ont accepté
librement de répondre à un questionnaire.
III.1.2. Principaux résultats
III.1.2.1. Données épidémiologiques et cliniques des prélèvements
nasopharyngés.
Un total de 215 prélèvements effectués sur des enfants venant pour la vaccination
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 43
dans les deux (2) centres a été effectué au Centre 1 : N = 110 (51,1%) et au Centre 2 : N =
105 (48,9%).
Les vaccins anti pneumococciques sont efficaces chez les enfants qui ont
plus de 6 mois. Chez les enfants en dessous de 6 mois, le système immunitaire immature
ne permet pas d’avoir des anticorps protecteurs. Il était donc nécessaire d’avoir des
informations sur l’age des enfants. Dans la présente étude, la majorité des enfants prélevés
avaient 2 à 24 mois (96,3%) avec une moyenne d'âge de 13 ± 0,2 mois et des extrêmes
allant de 0 à 60 à mois. Les résultats obtenus pourront être utilisés et pour les antibiotiques
et pour les vaccins. Le tableau 2 indique la répartition des prélèvements effectués par
tranche d’âge (Age en mois).
Tableau 2 : Répartition des prélèvements effectués par tranche d’âge (Age en mois).
0 à 2 mois 2 à 24 mois 24 à 60 mois
Nombre
par tranche d’âge
N=2
N=105
N=2
Pourcentage
par tranche d’âge
1,8%
96,3%
1,8%
Une hospitalisation aurait pu augmenter le nombre de souches résistantes et/ou
multi résistantes aux antibiotiques. En effet, l’hygiène défectueuse des hôpitaux aurait pu
favoriser la contraction de germes nosocomiaux qui sont des germes le plus résistants aux
antibiotiques. Le tableau 3 montre la répartition des enfants selon une hospitalisation
antérieure. Spécifions que la majorité (91,7%) des enfants n’avaitent jamais été
hospitalisés.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 44
Tableau 3 : Répartition des enfants selon une hospitalisation antérieure.
Moins de 6 mois Plus de 6 mois Jamais
Nombre d’enfants selon
une hospitalisation antérieure
N=5
N=4
N=100
Pourcentage
4,6 %
3,6 %
91,7 %
Il était nécessaire de savoir si les enfants été traités avec des antibiotiques
dans les 15 jours précédents le prélèvement. La prise d’antibiotique pourrait influencer
négativement l’isolement des pneumocoques. 99,1% (196/215) des enfants n'avaient pas
reçu d'antibiotiques dans ce délai conte seulement 0,9 % (19/215) avaient été traités dans
les 15 jours précédents le prélèvement.
La présence d’infections ORL aurait pu être un facteur de risque du portage
mais nous avons constaté que la majorité N=207 (96,3%) des enfants n’avaient pas eu un
antécédent ORL dans les 12 derniers mois. La présence d’antécédent ORL dans les 12
derniers mois n’avait été constaté que chez 8 enfants (3,7%).
Le tableau 4 indique la répartition des enfants selon le statut de vaccination.
Une bonne couverture vaccinale (vaccin du PEV) nous donne des indications sur une
éventuelle utilisation des vaccins pneumococciques qui peuvent influencer négativement
sur le portage des souches résistantes. Notons que les 73,4% des enfants avaient été
correctement vaccinés.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 45
Tableau 4 : Répartition des enfants selon le statut de vaccination
Enfants
correctemen vaccinés.
Enfants non
correctement vaccinés.
Nombre d’enfants N=158 N=57
Pourcentage 73,8 % 26,2 %
III.1.2.2. Données biologiques des prélèvements nasopharyngés.
Le taux de portage du pneumocoque était de 50,6% (N = 109) dans les 2 centres et
respectivement de : 48,18% (N = 53) au centre 1 et de 51,82% (N = 56) au centre 2.
Le tableau 5 ci-dessous représente le nombre et le pourcentage des souches
sensibles et résistantes aux 16 antibiotiques. Des 109 souches isolées, 2,75% des souches
(N=3) étaient sensibles aux 16 antibiotiques testés. 13 souches se sont révélées sensibles
aux 16 antibiotiques testés et parmi celles-ci 10 présentaient des résistances intermédiaires.
Tableau 5 : Nombre et pourcentage des souches sensibles et résistantes 16 antibiotiques
Souches
sensibles aux 16
antibiotiques
Souches présentant
une résistance
intermédiaire
Souches
résistantes à au moins
un antibiotique
Nombre
N=3 N=10 N=96
Pourcentage
2,75% 9,17% 88,7%
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 46
Le tableau 6 montre le nombre et le pourcentage des souches sensibles et
résistantes aux pénicillines qui est l’antibiotique de choix pour le traitement des affections
causées par les pneumocoques. Nous avons constaté que 41,35% du total des souches (N
= 45) étaient sensibles aux pénicillines avec 33,65% présentant une résistance
intermédiaires et 25% présentant une résistance totale.
Tableau 6 : Nombre et pourcentage des souches sensibles et résistantes aux pénicillines.
Souches sensibles
aux pénicillines
Souches présentant une
résistance intermédiaire
Souches présentant une
résistance totale aux
pénicillines
Nombre
N= 45 N= 36 N= 28
Pourcentage
41,35% 33,65% 25%
Les souches de pneumocoques résistantes aux pénicillines sont le plus
souvent résistantes aux autres antibiotiques. Il était nécessaire de savoir si nous avons un
nombre assez important de souches multi résistantes qui circulent au Burkina Faso. Dans
l’affirmatif des études moléculaires par la suite préciseront les bases de cette résistance. Il
a été constaté que 26,60% (N=29) des souches isolées étaient multi résistantes et que la
majorité 73,40 % (N=80) des souches étaient non multi résistantes.
Le tableau 7 indique le nombre et le pourcentage des résistances à plusieurs
antibiotiques sur la même souche. Ces indications pourraient nous guider sur les
antibiotiques à utiliser dans le contexte du Burkina Faso. Il a été constaté qu’aucune
souche ne présentait une résistance à la vancomycine et à la rifampicine
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 47
Tableau 7 : Multirésistance des isolats de S.pneumoniae aux antibiotiques
Pénicilline+
tétracycline
Pénicilline+
Chloram
phénicol
Pénicilline+
Tétracycline+
Chloram
phénicol
Chloram
Phénicol +
Erythro
Mycine
Pénicilline+
Tétracycline+
Chloram
Phénicol +
Erythro Mycine
Vancomycine+
rifampicine
Nombre
N= 42 N= 4 N= 4 N = 2 N = 0 N = 0
% 38,53% 3,66% 3,66% 1,83 % 0%
0%
Le tableau 8 indique le statut vaccinal des enfants et la sensibilité des à la
pénicilline. Une corrélation entre la sensibilité à l’oxacilline et les enfants correctement
vaccinés a été constatée.
Tableau 8 : Nombre et pourcentage d’enfants correctement vaccinés et non correctement
vaccinés versus Sensibilité à la pénicilline
Sensibilité à la pénicilline Enfants
correctement vaccinés
(Nombre et pourcentage)
Enfants non
correctement vaccinés
(Nombre et pourcentage)
Sensibles
34 (43,58%) 9 (34,61%)
Sensibilité diminuée
(Intermédiaire)
25 (32,05%) 10 (38,46%)
Résistantes 19 (24,35%) 7 (26,92%)
Total 78 %) 26 (100%)
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 48
III.1.3. Conclusion de la première étude.
La présente étude a révélé que :
73,40% des enfants venant dans les SMI avaient été correctement vaccinés ;
Le taux de portage étaient de 50,60%.
Les antibiotiques les plus sensibles sur les souches étaient : Rifampicine
(98,80%) ; Amoxicilline (96,15%) ; Rifampicine (98,78%) ; Amoxicilline
(96,15%) ; Ampicilline (95,19%) Ceftriaxone (93,26%) ; Erythromycine (93,9%) ;
Spectinomycine (92,30%) ; Chloramphénicol (91,30%) ; Vancomycine
(87,67%) ; Lincomycine (82,60%) et Ciprofloxacine (77,88%).
Les souches isolées présentaient une résistance élevée aux antibiotiques
suivants : Amikacine (95,19%) ; Tétracycline (65,30%) ; Pefloxacine (54,80%) ;
Cotrimoxazole (31,70%) et Oxacilline (25,00%).
Les souches isolées dans notre pays présentaient une résistance assez élevée aux
pénicillines.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 49
III.2. RESULTATS DE LA DEUXIEME ETUDE
Résistance aux antimicrobiens et la distribution des
sérotypes/sérogroupes de Streptococcus pneumoniae infectant les enfants
au Burkina Faso. Pakistan journal of Biological science 12(18)1282-1286, 2009.
III.2.1. Problématique de la deuxième étude.
Après avoir effectué une étude sur les profils de résistance des souches isolées, il
était nécessaire d’effectuer cette deuxième étude afin d’identifier les SGTs qui circulent au
Burkina Faso. L’étude a été réalisée de septembre à décembre 2000 et de janvier à juin
2001 sur 860 enfants de 0 à 5 ans venant pour une vaccination dans les SMI.
III.2.2.Principaux résultats.
III.2.2.1.Données épidémiologiques.
Les données épidémiologiques de la présente étude sont les mêmes que celles de la
première étude.
III.2.2.2. Données biologiques.
13 sérotypes majeures par ordre d'importance ont été identifiés sur un total de 58
souches testées: 4, 6, 7, 9, 11, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 23, 24, NT, CNVR.
Les sérotypes 6 et 23 représentaient 58% des sérotypes identifiés et étaient liées à
la multi résistance.
15,50% des souches n’ont pas pu être identifiées (NT= non typables).
15,50% des souches étaient des sérotypes non vaccinaux (SNV = sérotypes non
vaccinaux).
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 50
Le tableau 9 ci-dessous indique le nombre et le pourcentage des
sérotypes/sérogroupes isolés. Plusieurs vaccins pneumocociques existent sur le marché. La
connaissance des SGTs nous donne des informations nécessaires pour un choix
stratégique des vaccins à utiliser dans le pays.
Tableau 9 : Nombre et pourcentage des sérotypes/sérogroupes isolés.
Souches sérotypes/sérogroupes Nombre et Pourcentage
6
23
17, 18, 19
7,9
4, 11, 14, 15, 20, 24
NT, CNVR
12(20,68%)
9(15.58%)
3(5.17%)
2(3.44%)
1(1.7%)
9(15.51%)
Le tableau 10 indique les Sérotypes/ Sérogroupes isolés versus résistance aux
antibiotiques. Une corrélation entre les SGTs et la résistance aux antibiotiques a été
effectuée afin de déterminer le sérotype lié à la résistance de chaque type d’antibiotiques.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 51
Tableau 10 : Sérotypes/Sérogroupes isolés versus résistance aux antibiotiques
Antibiotiques Nombre et
pourcentage de souches
résistantes
Sérogroupes/sérotypes
liés à la résistance
Amoxicilline
+Acide clavulanique
0(0%)
Oxacilline 26(25,00%) 6, 7, 18, 19, 23, 24
Ceftriaxone 1(0,96%)
Tétracycline 68(65,80%) 4, 6, 7, 9, 14, 17, 18, 19, 20, 23
Cotrimoxazole 33(31,70%) 6, 14, 18, 19, 20, 23, 24
Erythromycine 4(4,80%) 6
Lincomycine 7(6,73%) 6, 23
Ciprofloxacine 4(3,84%) --------------
Chloramphénicol 8(7,60%) 4, 6, 19, 23
Rifampicine 1(1,28%) 6
Vancomycine 2(2,73%) --------------
Péni + Tétra 42(40,38%) --------------
Péni + Chlor 4(3,84%) --------------
Péni + Tétra + Chlor 4(3,84%) --------------
Chlor + Erythro 2(2,15%) --------------
Rifamp + Vanco 4(5,29%) --------------
Quant au tableau 11, il présente les caractéristiques des pneumocoques isolés par
différents groupes d'âges. Ces informations nous permettraient de choisir le vaccin
approprié pour chaque tranche d’age.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 52
Tableau 11 : Caractéristiques des pneumocoques isolés par différents groupes d'âges.
Classes d’âges
0 - 2 Mois 2 - 24 Mois 24 - 60 Mois
Nombre et pourcentage de
pneumocoques isolés
2 (1,8%) 105 (96,3%) 2 (1,8% )
Nombre et
Sérotypes isolés
19, 20
(N=1)
4, 11, 14, 15, 24(n=1)
7, 9, 19(n=2) 17, 18(n=3)
SNV (N=7)
23, NT (N=9) 6(n=12)
SNV (N=2)
Pourcentage des 2 sérotypes
majeures (6 et 23)
0,0% 58,0% 0%
Couverture des Sérotypes par
les vaccins à 7 valences
14,28% 53,84% 0%
Couverture des Sérotypes par
les vaccins à 23 valences
8,69% 92,3% 0%
III.2.3. Conclusion de la deuxième étude.
Au cours de cette étude, 13 SGts ont été identifiés. Les SGTs 6, 23 étaient plus
fréquemment liés à la résistance à la pénicilline et à la multi résistance. Le vaccin conjugué
à 7 valences a été couvert à 53,84% par les SGTs isolés. 92,3% des souches isolées au
Burkina Faso appartenaient aux sérotypes/sérogroupes visés par les vaccins polyosidiques
à 23 valences.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 53
III.3. RESULTATS DE LA TROISIEME ETUDE
Caractérisation génotypique et sérotypes des souches invasives de
Streptococcus pneumoniae isolées à Bobo –Dioulasso en 2002 -2003 Bio-Africa- N°3- pp 43-49, 2006
III.3.1. Problématique de la troisième étude
La deuxième étude nous a permis d’identifier quelques SGTs du portage. Mais très
souvent les SGTs des souches invasives sont différents des SGTs du portage. En outre les
reversions capsulaires sont fréquemment rencontrées. C’est pourquoi des études de
biologie moléculaires sont nécessaires.
Cette troisième étude visait à identifier les SGTs rencontrés au niveau des souches
invasives, à déterminer les gènes de résistance aux macrolides, tétracyclines et à
déterminer les transposons responsables de ces résistances. L’étude a été réalisée d’octobre
2002 à février 2003 sur 54 LCR prélevés sur des patients de l’hôpital Sourou Sanou.
III.3.2.Principaux résultats
III.3.2.1. Données biologiques.
III.3.2.1.1. La résistance aux antibiotiques.
Toutes les souches étaient résistantes à au moins une classe d’antibiotique
représentant 45% de toutes les souches isolées et testées dans notre laboratoire.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 54
Sensibilité des souches invasives aux antibiotiques.
Le tableau 12 ci-dessous représente la sensibilité des souches invasives aux 9
antibiotiques. Il nous donne des indications sur la prévalence des souches des
pneumocoques invasives résistantes aux pénicillines et des souches multi résistantes.
Ces résultats nous ont permis de continuer nos investigations sur les mécanismes
de résistance aux tétracyclines et aux macrolides.
Tableau 12 : Sensibilité des souches invasives aux 9 antibiotiques
Susceptibilité
Antibiotiques Susceptible :
Pourcentage
Intermédiaire :
Pourcentage
Résistant :
Pourcentage
lactamines
Oxacilline (38%) (12%) (50%)
Ceftriaxone (85%) (10%) (5%)
Tétracycline
Tétracycline (20%) (4.8%) (75.2%)
Sulfamides et associations
Cotrimoxazole (23%) (7%) (70%)
Macrolides et apparentés
Erythromycine (78%) (8%) (14%)
Lincomycine (70%) (10%) (20%)
Quinolones
Ciprofloxacine (58%) (24%) (18%)
Phénicolés
Chloramphénicol (85%) (5%) (10%)
Glycopepetides
Vancomycine (90%) (3%) (7%)
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 55
III.3.2.1.2. Le sérotypage et le Phénotypage.
Le Tableau 13 ci-dessous indique la répartition des sérotypes des souches invasives
versus Phénotypes. Les SGts de portage étant le plus souvent différents des SGTs
invasives, ce tableau nous permet d’apprécier le phénotype de résistance lié à chaque
sérotype.
Tableau 13 : Répartition des sérotypes versus phénotypes.
Sérotypes/ N (%) N (%) Total
Sérogroupes Phénotypes Phénotypes N (%)
MLSb M
23 7 (31,9%) 0(0,0%) 7(29,1%)
19 2 (9,1%) 1(50,0%) 3(12,6%)
6 4 (18,2%) 0(0,0%) 4(16,6%)
1 2 (9,1%) 0(0,0%) 2(8,3%)
3 4 (18,2%) 1(50,0%) 5(20,8%)
Autres 3 (13,5%) 0 (0,0%) 3(12,6%)
Total 22 2 24
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 56
III.3.3. Le Phénotypes et le génotypage.
Le tableau 14 ci-dessous représente le Nombre et le pourcentage des phénotypes,
des gènes de résistances et des Transposons identifiés. Le gène erm (B) responsable de la
résistance aux macrolides confère le phénotype MLSb aux souches. Le gène mef (E) est
également responsable de la résistance aux macrolides mais confère le phénotype M aux
souches. Quant au gène tet (M), il est responsable de la résistance aux tétracyclines.
Tableau 14 : Nombre et pourcentage des phénotypes, des gènes de résistance et des
Transposons identifiés.
Phénotypes, Gènes et Transposons Nombre / pourcentage
Gène erm (B)
Gène mef (A)
Gène tet (M)
Tn 1207.1
Tn 1545
Phénotype MLSb
Phénotype M
16(66,7%)
4(16,7%)
19(%)
2(8,3%)
9(37,5%)
16(66,7%)
4(16,7%)
5 (20,8%) souches avaient 4 mécanismes de résistance cumulés aux macrolides,
tétracyclines, co-trimoxazole et lactam.
15 (62,5%) souches avaient 2 mécanismes de résistances cumulés aux macrolides,
tétracyclines ou co-trimoxazole.
14 (58,3%) des souches étaient résistantes à la tétracycline et aux macrolides ;
12 (50,0%) des souches avaient les gènes erm (B) + tet (M) ;
2 (8,3%) des souches avaient les gènes mef (A/E) + tet (M).
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 57
La figure 12 nous présente le PFGE des échantillons de S. pneumoniae, le profil
des souches en électrophorèse en champs pulsé permet de discriminer les souches.
Nous pouvons ainsi apprécier si les mêmes souches résistantes circulent dans une
région et avoir éventuellement des indications sur la nature clonale et la progression de
la souche résistante.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 58
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Figure 12: PFGE des échantillons de S. pneumoniae.
Bande 1 : marker λ; Bande 2: 3H; Bande 3: 10H; Bande 4: 48H;
Bande 5: 14H; Bande 6: 52H; Bande 7: 62H; Bande 8: 59H; Bande 9: 4H;
Bande 10: 25H; Bande 11: 135.1; Bande 12: controle mef ;
Bande 13: 3H; Bande 14: control erm(B) ; Bande 15: control tet(M) .
Le Tableau 15 montre la localisation chromosomique des gènes erm (B),
tet (M), mef (A/E). La localisation simultanée de ces différents gènes sur la même souche
nous donne des informations sur la nature des transposons responsables de ces multi
résistances
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 59
Tableau 15 : Localisation chromosomique des gènes erm (B), tet (M), mef (A/E).
SOUCHES Erm (B) Tet (M) Mef (A)
10H 339Kb 339Kb - 97Kb _
52H 339Kb 339Kb - 97Kb _
62H 339Kb 339Kb - 97Kb _
4H 339Kb 339Kb - 97Kb _
25H 194Kb 194Kb _
14H _ _ _
59H _ 220Kb - 120Kb _
48H _ _ _
3H _ _ _
135.1 _ 120 Kb 120 Kb
2ST 170Kb 170Kb _
3ST _ 120 Kb 120 Kb
5ST 120Kb 120 Kb _
7ST 170Kb 170Kb _
8ST 291Kb 291Kb _
9ST 194Kb 194Kb _
16ST _ _ 85Kb
17ST _ _ _
18ST _ _ _
22ST _ _ 85Kb
24ST _ _ _
25ST _ _ _
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 60
III.3.3. Conclusion de la troisième étude.
En conclusion, nous avons montré que la majorité des souches de pneumocoques
résistantes isolées en milieu hospitalier à Bobo-Dioulasso / Burkina Faso arboraient le
phénotypes MLSb et exprimaient le gène erm (B). La majorité des souches présentaient
une résistance croisée aux tétracyclines et macrolides 58,3%. Les sérotypes majeures
étaient : 1, 3, 6, 19, 23. La propagation de ces souches résistantes seraient largement due
d’autre part aux transposons Tn1545.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 61
Discussion générale
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 62
DISCUSSSION DE LA PREMIERE ETUDE :
Profil de résistance de Streptococcus pneumoniae chez des enfants
de 0 à 5 ans dans la ville Bobo-Dioulasso au Burkina Faso en 2000. Bio-Africa- vol 2 N°1; pp 77-84, 2005
S. pneumoniae est la majeure cause de mortalité et de morbidité dans le monde
(Maria et al., 1998). Elle est une des causes de décès chez les enfants en dessous de 2 ans
dans les pays en voie de développement, provoquant 1,2 millions de morts dans cette
tranche d’âge (Demartin et al., 1993). L’étude réalisée a montré que le taux de portage de
S. pneumoniae chez les enfants venant pour la vaccination dans les SMI était de 50.6%
dans les 2 centres de la ville de Bobo-Dioulasso.
Ces résultats observés restent relativement élevés, comparativement à certains pays
africains et occidentaux car, il était de 39,9% chez les enfants de Johannesburg (Afrique du
sud) en 2000 (Hubner et al., 2000) et de 41% au sud de l’Italie en 1998 chez les enfants
(Maria et al., 1998). Des paramètres comme l’hospitalisation, la prise d’antibiotiques n’ont
pas constitué de biais car les données de l’étude ont montré que 91,7% des enfants
n’avaient jamais été hospitalisés et que 99,1% des enfants n’avaient pas pris
d’antibiotiques dans les 15 jours précédents le prélèvement. Étant donné la forte liaison
entre le portage et les infections à pneumocoques, des mesures comme les vaccinations
obligatoires et une surveillance régulière dans les jardins d’enfants, les écoles maternelles
et les SMI s’averrent nécessaires. Cela est d’autant plus réalisable au Burkina Faso. Ainsi,
notre étude a montré une bonne couverture vaccinale avec 73,4 % des enfants correctement
vaccinés.
Résistance aux -lactamines
Une baisse de l’activité des -lactamines a été constatée depuis 1987 (Appelbaum
et al., 1987 ; Baquero et al., 1994). Les clones résistants ont été reconnus comme étant la
cause des échecs des traitements dans les otites, les sinusites chroniques et les méningites.
Le choix du meilleur traitement devient difficile d’autant plus qu’un grand nombre de ces
clones sont multi résistants. Dans notre étude 58,65% des souches présentaient une
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 63
résistance totale aux pénicillines. Des taux plus élevés ont été constatés en : Corée
(Séoul)=79,9%, au Japon (Nagasaki)=65,3%, au Vietnam (Ho chi Mihn city)=60,8%, en
Thaïlande (Bankok) = 57,9% de septembre 1996 à juin 1997(Jae-Hoon S. et al., 1997) et à
Tennessee aux USA= 70% en 1999 (Yi-Wei et al., 2001).
La plupart des souches pénicillinorésistantes sont en réalité pénicillino
intermédiaires et la résistance des -lactamines n’est pas absolue. Les -lactamines ayant
de meilleurs paramètres pharmacodynamiques, une bonne disponibilité et qui sont plus
actifs contre les souches pénicillino intermédiaires (l’amoxicilline, la céfuroxime, l’axétile)
peuvent être recommandées en utilisation empirique dans les zones de haute prévalence de
pénicilline intermédiaire et résistant aux pneumocoques.
La céfotaxime, la fosfomycine, l’imipénème (Barakett et al., 1992) sous réserve
d’études complémentaires, paraissent utilisables dans le traitement des méningites à
pneumocoques résistants à la pénicilline G. dans la mesure ou une adaptation des
posologies permet d’obtenir dans le liquide céphalo raphidien ( LCR ) une concentration
suffisante de ces antibiotiques.
La résistance aux -lactamines chez les pneumocoques peut également être résolue
si des associations d’antibiotiques sont faites. L’association céfotaxcime, fosfomycine étant
synergique et bactéricide (Barakett et al., 1992), paraît utilisable. Sur des souches
résistantes, le choix pourra se porter sur un antibiotique d’une autre famille vis à vis
duquel les pneumocoques restent sensibles comme constaté dans notre étude la
rifampicine, les fluoroquinolones, la vancomycine, la pristinamycine.
La pristinamycine n’a pas été testée dans notre étude. Cependant, une étude menée
en 1998 (N’Guyen et al., 1988) a mis en évidence l’activité de la pristinamycine sur la
totalité des souches de pneumocoques résistants aux lactamines que celles-ci soient
sensibles ou résistantes aux macrolides. La vancomycine en particulier en administration
intraveineuse continue et associé à la rifampicine ou à la fosfomycine mériterait d’être
envisagée en première intention dans le traitement des méningites à S. pneumoniae
survenant dans un contexte clinique qui expose à une résistance de la souche à la
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 64
pénicilline G ou pour les pneumocoques de haut niveau de résistance à la pénicilline G.
Les sulfamides et associations
Le taux de résistance aux sulfamides (trimetroprime-sulfamethoxazole) dans notre
étude était de 65%. Cette résistance élevée suggère que les sulfamides ne sont pas
conseillés en utilisation empirique dans nos communautés pour le traitement des affections
à S. pneumoniae. En effet contrairement aux -lactamines, la résistance des
pneumocoques aux sulfamides et associations étant absolue, des doses élevées de
sulfamides ne peuvent être efficaces même si une diminution de la sensibilité aux
sulfamides est constatée (Friedland. et al., 1994).
La résistance aux macrolides
La résistance aux macrolides est aussi absolue. Une faible prévalence (5%) de
souches résistantes aux macrolides a été observée dans notre étude. Cette classe
d’antibiotique peut toujours être utilisée au Burkina Faso en première intention et / ou de
façon empirique dans le traitement des affections à S. pneumoniae.
Ces observations sont contraire à celles des pays occidentaux où une prévalence
élevée de souches résistantes aux macrolides est observée (Geslin et al., 1993) et oú il y a
une remise en cause du principe du traitement en première intention des affections à S.
pneumoniae par les macrolides.
Cependant il faut rester prudent car des données apparues en 1995 Marchese et al.
(1995) ont montré qu’en Europe, les souches de S. pneumoniaepénicillino résistantes sont
le plus souvent résistantes aux macrolides même si cela n’a pas été observé dans la
présente étude.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 65
DISCUSSSION DE LA DEUXIEME ETUDE :
Résistance aux antimicrobiens et la distribution des souches de
Streptococcus pneumoniae infectant les enfants au Burkina Faso Pakistan journal of biological science 12(18)1282-1286, 2009.
Les sérotypes/sérogroupes suivants ont été isolées par ordre d’importance: 6, 23,
17, 18, 19, 7, 9, 4, 11, 14, 15, 20, 24. David et al. (1995) trouvaient des résultats similaires
car selon leur étude les SGTs 6, 14, 8, 5, 1, 19, 9, 23, 18, 15, et 7 sont les plus
fréquemment rencontrés dans les pays en voie de développement et les SGTs 14, 6, 19,
18, 9, 23, 7, 4, 1 dans les pays développés (David et al., 1995). Ces données indiquent que
beaucoup de sérotypes/sérogroupes qui ne causent pas fréquemment des infections dans les
pays développés le font au niveau des enfants dans les pays en voie de développement.
Cette différence est probablement le reflet de l’extrême susceptibilité des enfants dans les
pays en voie de développement. Susceptibilité qui serait liée aux maladies associées
(paludisme etc.) et au manque d’hygiène.
Spécifions que 58,33% des sérotypes /sérogroupes isolées étaient majoritairement
le 6, 23. Le sérotype 6 était lié à la résistance à la vancomycine, rifampicine,
érythromycine et les SGTs 6, 19, 4, 23 étaient liés à la résistance au chloramphénicol et
aux pénicillines (sauf le 4). On constate donc avec l’étude que les SGTs 6, 23 étaient plus
fréquemment liés à la résistance à la pénicilline et à la multi résistance. Ce même constat a
été fait avec une étude espagnole en 1990 (Fenoll et al., 1991). Une étude Suisse de
Bannerman et Wenger (1999) faisait la même remarque et qualifiait ces sérotypes:
14(95%), 23(85%), 6(82%), 9(80%) de redoutables [données non publiées]. Il faudrait
donc des études de biologie moléculaires afin de voir si ce sont les mêmes clones qui
circulent au Burkina Faso et dans les autres pays.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 66
Le sérotypage a permis de constater que 92.3% des souches isolées au BURKINA
FASO appartenaient aux sérotypes / sérogroupes visées par les vaccins polyosidiques à 23
valences. Cependant même si nous avons une assez bonne couverture des SGTs, en raison
de leur faible immunogénicité, ce vaccin n’est pas indiqué pour les enfants en bas âge.
D’autre part, les vaccins polysaccharidiques n’ont aucun effet sur le portage nasopharyngé
et ont une efficacité limitée sur les souches invasives des enfants en dessous de 2ans
(Douglas et al., 1986 ; Ron Dagan et al., 1999). Quant au vaccin conjugué à 7 valences, il
a été couvert à 53.84% par les SGTs isolés. Ce vaccin est immunogène chez les enfants et
a un impact important et sur les souches de portages et sur les souches invasives (David et
al., 1999 ; Obaro et al., 1996). Cela serait bénéfique dans les zones de haute résistance à la
pénicilline. L’inconvénient de ce vaccin est qu’il contient un nombre réduit de SGT (Ron
Dagan et al., 1999) et surtout de SGTs fréquemment isolés en Afrique. Cela a été relevé par
les travaux de William et al., 2000 qui trouvait que le vaccin conjugué à 7 valences
contenait le 7 des sérotypes/sérogroupes les plus fréquemment isolés aux Etats-Unis,
Canada, Océanie ; 6 des 7 sérotypes/sérogroupes les plus fréquemment isolés en Europe ;
5 des 7 sérotypes/sérogroupes les plus fréquemment isolés en Amérique latine ; 4 des 7
sérotypes/sérogroupes les plus fréquemment isolés en Asie et Afrique.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 67
DISCUSSSION DE LA TROISIEME ETUDE :
Caractérisation génotypique et sérotypes des souches invasives de
pneumoniae isolées à Bobo –Dioulasso en 2002 -2003 Bio-Africa- N°3- pp 43-49, 2006
La présente étude a montré que 91,7% des sérotypes isolés [1, 3, 6, 19, 23]
arboraient le phénotype MLSb et étaient donc liées à une résistance de haut niveau aux
macrolides. Seulement 8 ,3% des sérotypes [3, 19] arboraient les phénotypes M et étaient
liées à une résistance de bas niveau aux macrolides.
Le gène erm (B) liée au phénotype MLSb a été identifié au niveau de 16 souches
(66,70%) et le gène mef (A) liée au phénotype M a été identifié au niveau de 4 souches
(16,7%). Des prévalences du phénotype MLSb plus élevée (89%) ont été observé en
Afrique du sud (Carol et al., 1998). Au niveau des souches de pneumocoques isolées en
clinique, la résistance à la tétracycline est très fréquemment associée à la résistance à
l’érythromycine (Montari et al., 2003).
Nos résultats ont montré que 58,3% des souches étaient résistantes aux
tétracyclines et à l’érythromycine. Ces résultats avoisinent ceux trouvés aux Etats-Unis de
1999 à 2000 où plus de 60% des souches multirésistantes présentaient une résistance à la
tétracycline et à l’érythromycine (Doern et al., 2001).
La caractérisation génomique des souches isolées a montré que 50% des souches
avaient le gène erm (B) associé au gène tet (M) sur la mệme souche et 8,3% des souches
avaient le gène mef (A) associé au gène tet (M)
L’association entre la résistance à l’érythromycine et la résistance à la tétracycline
serait due à une famille particulière de transposons (Clewell et al., 1995). Un gène de
l’intrégrase, appelé int-tn caractérise cette famille de transposons Tn 916 et Tn 1545 qui
codent la résistance à l’érythromycine via le gène erm (B) et les résistances à la
tétracycline via le gène tet (M) et également à la résistance à la kanamycine via le gène
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 68
aphA3 (Courvalin et al., 1987).
La forte association entre le gène erm (B) et tet (M) au niveau de 9 souches
et sur les fragments chromosomiques suivants : 339Kb, 194 Kb, 170 Kb, 120 Kb, 291 Kb
a donc suggéré la présence du transposon 1545.
Pour vérifier cette hypothèse, une PCR révélant la présence du gène int–tr a été
effectué et s’est révélé positive pour toutes les souches positives avec les gènes erm (B) et
tet (M). Il s’avère donc que le transposon Tn 1545 est responsable de la propagation de la
plupart (37,5%) des résistances à la tétracycline et à l’érythromycine. Deux souches
avaient sur le mệme fragment chromosomique (120Kb) les gènes mef (A) et tet (M) ; cela
reflète et l’association de ces deux déterminants et la présence du transposon Tn 1207.1 au
niveau de 8.3% des souches typées.
Le profil clonal représentant un groupe de souches a été déterminé par PFGE.
Les souches 10H, 52H, 62H, 4H avaient un mệme profil PFGE avec les gènes
erm (B) localisés à 339Kb et tet (M) localisés à 97Kb et à 339kb. Les souches 9STet 25H
avaient le mệme profil PFGE avec les gènes erm (B) et tet (M) localisés à 194Kb. Deux
souches 2ST et 75ST avaient le mệme profil PFGE avec les gènes erm (B) et tet (M)
localisés à 170Kb.
Ces données sur la localisation chromosomique des gènes tet (M) et erm (B)
effectuée au mệme moment et dans le mệme hộpital montre la présence de trois différents
clones. L’hétérogénéité remarquable du profil PFGE des autres souches suggère qu’ils ne
seraient pas de même nature clonale.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 69
Conclusion générale
Notre étude a montré que la résistance antimicrobienne est réellement présente au
niveau des souches de S. pneumoniae isolées chez les enfants venant dans les SMI à Bobo-
Dioulasso (Burkina Faso). En effet les souches isolées chez les enfants venant en
vaccination présentaient une résistance élevée aux amikacines, tétracyclines, pefloxacines,
cotrimoxazoles, oxacilline et la majorité des souches isolées chez ces enfants présentent
une résistance à une ou plusieurs classes d’antibiotiques. La principale cause de ces multi
résistances au Burkina Faso est due au fait que dans cette zone de l’Afrique sub-
saharienne, nous avons une grande pandémie d’infections bactériennes (Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Shigella flexneri, Yersinia
enterocolitica, Salmonella typhi) impliquant une grande consommation d’antibiotiques
sans souvent faire, au préalable, ni un test d’identification du germe ni d’antibiogramme.
Sans doute, la surconsommation des antibiotiques sans appuie d’examen de laboratoire a
suscité ces multi-résistances.
Pour une meilleure prise en charge thérapeutique des infections bactériennes, il
faudrait donc une surveillance attentive de la sensibilité des pneumocoques aux -
lactamines et autres antibiotiques par la mise en place de centres de références, de réseaux
nationaux de surveillance des infections pneumococciques pour une bonne et sérieuse
observation de l’évolution des résistances.
Il serait également souhaitable que les cliniciens du pays s’accordent pour ne plus
prescrire, pour une période donnée, les antibiotiques qui ne sont plus sensibles aux
bactéries pathogènes afin qu’elles aient le temps de perdre leur résistance.
Au cours de notre étude nous avons identifiés 13 SGts vaccinaux. Les SGTs 6, 23
étaient plus fréquemment liés à la résistance à la pénicilline et à la multi résistance. Le
vaccin conjugué à 7 valences, il a été couvert à 53.84% par les SGTs isolés. 92.3% des
souches isolées au BURKINA FASO appartenaient aux sérotypes / sérogroupes visées par
les vaccins polyosidiques à 23 valences
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 70
Les sérotypes 6 et 23 étaient les SGTs majoritairement rencontrés et étaient liées à
la multirésistance. Le sgts 6 était liée à la résistance à la vancomycine et à l’érythromycine.
Le vaccin plyosidique à 23 valences couvrent 92,3% des sérotypes isolés au Burkina Faso.
Nous avons montré que la majorité des souches de pneumocoques résistantes
isolées en milieu hospitalier à Bobo-Dioulasso / Burkina Faso arboraient le phénotypes
MLSb et exprimaient le gène erm (B). La majorité des souches présentaient une résistance
croisée aux tétracyclines et macrolides 58,3%. Les sérotypes majeures étaient : 1, 3, 6, 19,
23. La propagation de ces souches résistantes seraient largement due d’autre part aux
transposons Tn1545.
La présente étude aura montré que la majorité des souches de
pneumocoques résistantes isolées en milieu hospitalier à Bobo-Dioulasso / Burkina Faso
arboraient le phénotypes MLSb et exprimaient le gène erm (B). La majorité des souches
présentaient une résistance croisée aux tétracyclines et macrolides 58,3%. Les sérotypes
majeures étaient : 1, 3, 6, 19, 23. La propagation de ces souches résistantes seraient
largement due d’autre part aux transposons Tn1545.
Afin de juguler le problème des résistances aux pneumocoques d’une manière
générale, il faudrait :
1 - Une prévention d’une manière générale au Burkina par la vaccination dans les
centres de santé maternelle, SMI, école et jardins d’enfants pour baisser le portage et éviter
la propagation des souches résistantes et multirésistante s’avère plus que nécessaire.
2 - Dans cette optique, l’automédication et les médicaments de la rue sont à
proscrire. Il faudrait donc décourager la commercialisation d'antimicrobiens en vente libre
tant pour les humains que les animaux.
3 - Suspendre pendant un certain temps les antibiotiques hautement résistants pour
permettre aux souches de perdre leurs résistances.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 71
4 - Il faudrait que les communautés scientifiques et médicales au Burkina et si
possible en Afrique de l’ouest s’organisent afin d’identifier les résistances présentes chez
les bactéries pathogènes, de dénombrer ces résistances, de mieux informer les médecins, et
enfin de tenter d’adapter une stratégie de traitement avec l’antibiotique approprié si
nécessaire.
Des centres de références nationaux et/ou sous-régionaux pour surveiller la
résistance des pneumocoques à la pénicilline mais aussi des autres antibiotiques seraient
donc souhaitables.
.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 72
PERSPECTIVES
En perspectives nous souhaitons :
Etendre les études de profils de résistance des souches de S.p. aux antibiotiques à
Ouagadougou et dans les autres parties du pays afin d’obtenir des bases de données
sur les résistances de cette bactérie pathogène au Burkina Faso.
Effectuer une étude sur un grand échantillonnage et sur une période assez longue
pour mieux préciser la prévalence des SGTs qui fluctuent annuellement au niveau
du portage et au niveau de chaque infection. La couverture vaccinale serait alors
estimée avec plus de rigueur.
Effectuer des études complémentaires sur l’analyse des PBP, et sur les mutations du
gène du dihydrofolate réductase (DHFR) afin d’avoir plus de précisions sur les
mécanismes génétiques de la résistance au niveau de nos souches.
Effectuer le Séquençage des souches pour la surveillance des clones pandémiques
et la détection éventuelle de nouveaux clones.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 73
RéféRences BiBliographiques
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 74
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Thèse Léonard BERE, 2009 Page 79
Annexe: Publications réalisées
et questionnaire
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 80
Revue Bio-Africa - Vol. 2, N°1, pp. 77-84 2005, © Editions Universitaires de Côte d’Ivoire (EDUCI), 2005.
L C. BERE1, A P. BERE2, J K. SIMPORE2,3, A S. TRAORE2, M DOSSO4.
RESUME
Le Burkina Faso situé en Afrique de l’ouest ne dispose pas encore de centre de référence et de surveillance de la résistance aux antibiotiques. Peu de données existent sur le portage, le profil de résistance de Streptococcus pneumoniae (S.p.). Pour évaluer le portage de Streptococcus pneumoniae (S.p.), l’incidence de la résistance aux antibiotiques chez les porteurs asymptomatiques, le laboratoire de microbiologie du centre Muraz à Bobo Dioulasso a conduit cette étude en 2000. Un total de 109 Streptococcus pneumoniae(S.p.) ont été isolés chez 215 nourrissons venant pour la vaccination dans 2 centres de soins maternels et infantiles de la ville. Les antibiotiques ont été testés selon les normes du NCCCLS. Le taux de portage trouvé est de 50,6%. La majorité des nourrissons avaient de 2 à 24 mois (96.3%), 96,3% des nourrissons ont eu un antécédent ORL dans les 12 derniers mois, 91,7% des nourrissons n’avaient jamais été hospitalisés, 99,1% des nourrissons n’avaient pas pris des antibiotiques les 15 jours précédents le prélèvement et 73,4% des
nourrissons avaient été correctement vacciné. Les souches isolées ont présenté une résistance élevée aux antibiotiques suivants : Amikacine (95.19%), Tetracycline (65.3%), Pefloxacine (54.80%), Cotrimoxazole (31.7%) et Oxacilline (25%).
Les antibiotiques les plus sensibles étaient : Rifampicine (98.78%), Amoxicilline (96.15%), Ampicilline (95.19%), Ceftriaxone (93.26%), Erythromycine (93.9%), Spectinomycine (92.30%), Chloramphénicol (91.30%), Vancomycine (87.67%), Lincomycine (82.6%) et Ciprofloxacine (77.88%).
L’étude a montré qu’avec la résistance élevée de Streptococcus pneumoniae (S.p.) à la pénicilline au Burkina Faso, il est nécessaire de créer des centres de références pour surveiller la résistance des pneumocoques à la pénicilline afin d’adapter en conséquence une bonne thérapie et pour mieux contrôler les résistances .
MOTS-CLES : STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE(S.P.), RÉSISTANCE, ANTIBIOTIQUES, β-LACTAMINES.
SUMMARY
In Burkina Faso, an ouest African country , the number of pneumococci carriage and resis-tance patterns reports are inconsistent. In order to evaluate pneumococci carriage, the incidence of antibiotic resistance, from assymptomic youths ; the microbiological laboratory at Muraz center of Bobo-Dioulasso collected pneumococci from nasopharynx during 2000. A total of 109 pneumococci isolated from 215 youths attending vaccination center were analyzed . 16 antibiotics susceptibility were carried out as recommended by the National Comittee for Clinical Laboratory Standard (NCCLS). The carriagerate were 50.6%.
*The majority of children had 2 to 24 months(96%) *96.3% had ortho rhino laryngology (ORL) antecedent the last 12 months *99.1% of children did not use antibiotics 15 days before *91.7% of children have never been hospitalized and *73.4% of children were well vaccinated.
We noticed a high incidence of resistance to : Amika-cin (95.19%) ; Tetracyclin (65.3%) ; Pefloxacin (54.80%) ; Cotrimoxazol (31.7%) and Oxacillin (25%).
The most active antibiotics were : Rifampicin (98.78%), Amoxicillin (96.15%), Ampicillin (95.19%), Ceftriaxon (93.26%), Erythromycin(93.9%), Spectino-mycin (92.30%), Chloramphenicol (91.30%), Vanco-mycin (87.67%), Lincomycin (82.6%), Ciprofloxacin (77.88%).
The study shows the resistance of pneumococci to penicillin in Burkina Faso. It is then necessary to create pneumococci resistance surveillance cen-ters in the countries in order to adapt an accurate therapy, and to avoid the exportation of antibiotics resistance.
KEYS WORDS : S PNEUMONIAE, RESISTANCE, ANTIBIOTICS, β LACTAMINES
PROFIL DE RÉSISTANCE DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE CHEZ DES ENFANTS DE 0 À 5 ANS DANS LA VILLE
BOBO-DIOULASSO AU BURKINA FASO EN 2000.
Thèse Léonard BERE, 2009 Page 81
Revue Bio-Africa - Vol. 2, N°1, pp. 77-84, 2005
INTRODUCTION
Cet état de fait recommande, une sélection d’antibiotiques sensibles, une surveillance épidémiologique, une utilisation rationnelle des antibiotiques, une réévaluation de la sensibilité aux antibiotiques, pour une bonne utilisation thérapeutique et prophylactique des antibiotiques dans notre pays.
Des études menées en 1997 et 200111,12
ayant montré qu’il existe une corrélation entre le niveau de résistance des souches isolées du portage nasopharyngé et celles des souches responsables d’infections. Une surveillance du niveau de résistance des souches de Streptococcus pneumoniae (S.p.) peut donc être effectuée sur des souches isolées du nasopharynx. En l’absence de données épidémiologiques sur Streptococcus pneumoniae (S.p.) au Burkina Faso, pays à climat de type soudano-sahélien, il devient nécessaire de faire une surveillance du niveau de résistance de souches isolées en particulier par rapport à la pénicilline G. etaux autres antibiotiques courants utilisés pour lutter contre les différentes infections bactériennes.
Streptococcus pneumoniae (S.p.) (coques gram positifs) est une bactérie commensale du rhino-pharynx, pouvant dans certaines circonstances (splénectomies, asplénie fonc-tionnelle, malnutrition) être responsable d’infections respiratoires hautes (sinusites, otites) et basses (pneumonies) ainsi que de méningites purulentes chez les enfants et les personnes âgées principalement1,2,3. Le pneumocoque est naturellement sensible à un grand nombre d’antibiotiques mais des résistances acquises sont apparues succes-sivement4,5,6,7,8 pour les sulfamides en 1943, la tétracycline en 1963, l’érythromycine en 1967, la pénicilline en 1967, le chloramphé- nicol en 1970, la pénicilline et le chloramphé- nicol sur la même souche en 19779,10,1,2.
La prévalence des souches de Streptococ-cus pneumoniae (S.p.) résistantes aux anti-biotiques s’est élevée ces dernières années et concernent surtout les -lactamines et macrolides (érythromycine et cotrimoxa-zole). On assiste également à la propagation de souches multi résistantes à travers le monde9,10. La progression des souches de haut niveau de résistance à la pénicilline pourrait poser à moyen terme un problème
I- MATERIEL ET METHODES
1-1 MATERIEL
250 enfants âgés de 0 à 5 ans quelque soit l’âge et le sexe venant pour la vaccination dans les S.M.I. (Santé Maternelle et Infantile) d’Accart-ville (Centre 1) et de Farakan (Centre 2) de Bobo-Dioulasso ont été inclus dans l’étude avec l’accord explicite de leurs parents. Bobo-dioulasso, est une ville située dans l’ouest du Burkina Faso. L’étude de type transversale a été conduite de septembre2000 à décembre 2001.
Les prélèvements nasopharyngés effectués à l’aide d’écouvillons stériles en alginate de calcium ont été immédiatement ensemencéssur une gélose base Columbia + 5% de sang de mouton + 5 g/ml de gentamycine. Les boites ensemencées ont été incubée à 37°c (sous atmosphère enrichie en 5% de CO 2 pendant 20 à 24 heures (dans les laboratoires de bactériologie du centre Muraz).
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Une standardisation de l’inoculum à 0.5 de la gamme de Mac Farland a été effectué et l’inoculation a été faite sur une gélose Muller-Hinton additionnée de 5% de sang frais de mouton.
La méthode de Kirby-Bauer utilisant des disques imprégnés d’antibiotiques a été utilisée. Seize (16) disques d’antibiotiques ont été testés. L’oxacilline vérifie la réponse vis à vis de la pénicilline G. Les noms des antibiotiques et des firmes fournisseurs sont répertoriés en annexe. La lecture de l’anti-biogramme a été faite selon la méthode de Kirby-Bauer et l’interprétation des résultats selon les normes du NCCLS (Committee for Clinical Laboratory Standard)13,14.
1-2 METHODES
L’identification des souches s’est faite pas les méthodes conventionnelles :
• coloration de Gram, • aspect des colonies et l’hémolyse alpha
sur la gélose au sang frais mouton (5%) • sensibilité à l’optochine, • lyse du pneumocoque par le désoxycho-
late de sodium à 10%.
L’étude du profil de résistance s’est faite par l’antibiogramme :
• Il a été réalisé à partir d’un Muller Hinton additionné de sang frais de mouton (5%) avec une incubation à 37°c sous CO2 de 18 à 24 heures.
II- RESULTATS
2-1. DONNÉES ÉPIDÉMIOLOGIQUES ET CLINIQUES
Un total de 215 prélèvements effectués
sur des enfants (nourrissons) venant pour la vaccination dans les deux (2) centres a été effectué (Centre 1 : n = 110 et Centre 2 : n = 105).
Le taux de portage était de 50.6% (n = 109) dans les 2 centres et respectivement de : 48,18% (n = 53) au centre 1 et de 53,33% (n = 56) au centre 2.
La majorité des enfants avaient entre 2 et 24 mois (96.3%) avec une moyenne d’âge de 13 mois.
* 96.3% des enfants avaient eu un antécédent ORL dans les 12 derniers mois.
* 91.7% des enfants n’avaient jamais été hospitalisés.
* 99.1% des enfants n’avaient pas pris d’antibiotiques dans les 15 jours précédents le prélèvement.
* 73.4% des enfants avaient été correcte- ment vaccinées.
Une corrélation entre la sensibilité à l’oxa- cilline et les enfants correctement vaccinés a été constatée. Par la suite l’analyse s’est faite sur les porteurs sains.
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2-2. DONNÉES BIOLOGIQUES
Le tableau I ci-dessous représente la sensibilité des différentes souches isolées à Bobo- Dioulasso (Burkina Faso) aux antibiotiques (ATB).
Nombre et
Le tableau II ci-dessous représente le nombre et le pourcentage des souches sensibles et résistantes aux 16 antibiotiques.
moins un antibiotique
Le tableau III ci-dessous représente le nombre et le pourcentage des souches multirésistantes.
* 41.34% des souches (N = 104) étaient sensibles aux pénicillines avec 33.65% présen- tant une résistance intermédiaires et 25% présentant une résistance totale. 29 souches étaient multi résistantes.
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80
Souches non multirésistantes
Souches multirésistantes
Nombre et Pourcentage
n=29 (26.60%)
n=80 (73.40%)
Souches sensibles aux 16 antibiotiques
Souches présentant une résistance intermédiaire
Souches résistantes à au
Nombre et Pourcentage
n=3 (2.75%)
n=10 (9.17%)
n=96 (88.7%)
Antibiotiques Sensibilité
Susceptible : Nombre et pourcentage
Intermédiaire : Nombre et
pourcentage
Résistant :
pourcentage β lactamines Ampicilline 99 (95.19%) 5 (4.80%) -------- Amoxicilline 100 (96.15%) 4 (3.84%) -------- Amoxicilline +Acide clavulanique
100 (96.15%) 4 (3.84%) --------
Oxacilline 43 (41.34%) 35 (33.65%) 26 (25%) Ceftriaxone 97 (93.26%) 6 (5.76%) 1 (0.96%) Tétracycline Tétracycline 31 (29.8%) 5 (4.8%) 68 (65.8%) Sulfamides et asociations Cotrimoxazole 39 (37.5%) 32 (30.8%) 33 (31.7%) Macrolides et apparentés Erythromycine 77 (93.9%) 1 (1.2%) 4 (4.8%) Lincomycine 86 (82.6%) 11 (10.57%) 7 (6.73%) Aminosides et aminocyclole Amikacine 4 (3.84%) 1 (0.9%) 99 (95.19%) Quinolones Spectinomycine 96 (92.30%) 5 (4.80%) 3 (2.88%) Ciprofloxacine 81 (77.88%) 19 (18.26%) 4 (3.84%) Pefloxacine 12 (11.53%) 35 (33.65%) 57 (54.80%) Phénicolés Chloramphénicole 95 (91.3%) 1 (0.9%) 8 (7.6%)0 Divers Rifampicine 77 (98.71%) --------- 1 (1.28%) Vancomycine 64 (87.67%) 7 (9.58%) 2 (2.73%)
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Le tableau IV ci-dessous représente le nombre et le pourcentage des résistances à plusieurs antibiotiques sur la même souche.
mycine+
cine
IV. DISCUSSION
Streptococcus pneumoniae (S.p.) est la ma- jeure cause de mortalité et de morbidité dans le monde16. Elle est une des causes de décès chez les enfants en dessous de 2 ans dans les pays en voie de développement, causant 1,2 millions de morts dans cette tranche d’âge15. L’étude réalisée a montré que le taux de por- tage de Streptococcus pneumoniae (S.p.) chez les enfants venant pour la vaccination dans les SMI étaient de 50.6% dans les 2 centres de la ville de Bobo-Dioulasso.
Ces résultats observés restent relative-ment élevé, comparativement à certains pays africains et occidentaux car, il était de 39,9% chez les enfants de Johannesburg (Afrique du sud) en 20008 et de 41% au sud de l’Italie en 1998 chez les enfants16. Des paramètres comme l’hospitalisation, la prise d’antibiotiques n’ont pas constitué de biais car les données de l’étude ont montré que 91,7% des enfants n’avaient jamais été hos- pitalisés et que 99,1% des enfants n’avaient pas pris d’antibiotiques dans les 15 jours précédents le prélèvement. Étant donné la forte liaison entre le portage et les infections à pneumocoques, des mesures comme les vaccinations obligatoires et une surveillance
maternelles et les SMI s’averrent nécessaires. Cela est d’autant plus réalisable au BURKINA FASO ;
L’étude ayant montré une bonne cou-verture vaccinale avec 73,4 % des enfants correctement vaccinés.
Résistance aux β-lactamines Une baisse de l’activité des -lactamines
a été constatée depuis 19875,6,9. Les clones résistants ont été reconnus comme étant la cause des échecs des traitements dans les otites, les sinusites chroniques et les ménin-gites. Le choix du meilleur traitement devient difficile d’autant plus qu’un grand nombre de ces clones sont multi résistants. Dans notre étude 58,65% des souches présentaient une résistance totale aux pénicillines. Des taux plus élevés ont été constatés en :
* Corée (Séoul)=79,9%, * au Japon (Na-gasaki)=65,3%, * au Vietnam (Ho chi Mihn city)=60,8%, *en Thaïlande (Bankok) = 57,9% de septembre 1996 à juin 1997 [17] et * à Tennessee aux USA= 70% en 199918.
La plupart des souches pénicillino non sensibles sont en réalité pénicillino inter-médiaires et la résistance des -lactamines n’est pas absolue.
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Pénicilline+ tétracycline
Pénicilline+
Chloram phénicol
Pénicilline+ Tétracycline+
Chloram phénicol
Chloram
Phénicol + Erythro Mycine
Pénicilline+ Tétracy- cline+ Chloram Phénicol + Erythro Mycine
Vanco-
rifampi-
Nombre et Pour- centage (N= 109)
n=42 (38.53%)
n = 4 (3.66%)
n = 4 (3.66%)
n = 2 (1.83 %)
n = 0 ( 0%)
n = 0 (0%)
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Les -lactamines ayant de meilleurs paramètres pharmacodynamiques, une bonne disponibilité et qui sont plus actifs contre les souches pénicillino intermédiaires (l’amoxicilline, la céfuroxime, l’axétile) peuvent être recommandées en utilisation empirique dans les zones de haute prévalence de pénicilline intermédiaire et résistant aux pneumocoques.
La céfotaxime, la fosfomycine, l’imipénème19
sous réserve d’études complémentaires, paraissent utilisables dans le traitement des méningites à pneumocoques résistants à la pénicilline G. dans la mesure ou une adaptation des posologies permet d’obtenir dans le liquide céphalo raphidien (LCR) une concentration suffisante de ces antibiotiques.
La résistance aux -lactamines chez les pneumocoques peut également être résolue si des associations d’antibiotiques sont faites.
L’association céfotaxcime, fosfomycine étant synergique et bactéricide19, paraît utilisables.
Sur des souches résistantes, le choix pourra se porter sur un antibiotique d’une autre famille vis à vis duquel les pneumo- coques restent sensibles comme constaté dans notre étude : * la rifampicine, * les fluoroquinolones, * la Vancomycine *la pris- tinamycine.
La pristinamycine n’a pas été testé dans notre étude cependant une étude menée en 199820 a mis en évidence l’activité de la pristinamycine sur la totalité des souches de pneumocoques résistants aux lactamines que celles-ci soient sensibles ou résistantes aux macrolides. La vancomycine en particulier en administration intraveineuse continue et associé à la rifampicine ou à la fosfomycine mériterait d’être envisagée en 1° intention dans le traitement des méningites à Streptococcus pneumoniae(S.p.) survenant dans un contexte clinique qui expose à une résistance de la souche à la pénicilline G ou pour les pneumocoques de haut niveau de
Les sulfamides et associations
Le taux de résistance aux sulfamides (trimetroprime-sulfamethoxazole) dans notre étude était de 65%. Cette résistance élevée suggère que les sulfamides ne sont pas conseillées en utilisation empirique dans nos communautés pour le traitement des affections à Streptococcus pneumoniae (S.p.). En effet, contrairement aux -lactamines, la résistance des pneumocoques aux sulfami- des et associations étant absolue, des doses élevées de sulfamides ne peuvent être efficace même si une diminution de la sensibilité aux sulfamides est constatée21.
La résistance aux macrolides
La résistance aux macrolides est aussi absolue. Une faible prévalence (5%) de souches résistantes aux macrolides a été observée dans notre étude.
Cette classe d’antibiotique peut toujours être utilisée au BURKINA en première intention et / ou de façon empirique dans le traitement des affections à Streptococcus pneumoniae (S.p.).
Ces observations sont contraire à celles des pays occidentaux oú une prévalence élevée de souches résistantes aux macrolides est observée7 et oú il y a une remise en cause du principe du traitement en première intention des affections à Streptococcus pneumoniae (S.p.) par les macrolides.
Cependant il faut rester prudent car des données apparues en 199522 ont montré qu’en Europe, les souches de Streptococcus pneumoniae (S.p.) pénicillino résistants sont le plus souvent résistants aux macrolides même si cela n’a pas été observé dans la présente étude.
Notre étude montre que la résistance antimicrobienne est réellement présente au niveau des souches de Streptococcus pneumoniae (S.p.) isolées chez les enfants venant dans les SMI à Bobo-Dioulasso (Burkina Faso). En effet, la majorité des souches isolées chez les enfants présentent une résistance à une ou plusieurs classes d’antibiotiques. La principale cause de ces
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au fait que dans cette zone de l’Afrique sub- saharienne, nous avons une grande pandémie d’infections bactériennes (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumo-niae, Shigella flexneri, Yersinia enterocolitica, Salmonella typhi,)23 impliquant une grande consommation d’antibiotiques sans souvent faire, au préalable, ni un test d’identification du germe ni d’antibiogramme. Sans doute, la sur-consommation des antibiotiques sans appuie d’examen de laboratoire a suscité ces multi-résistances. Il serait souhaitable que les cliniciens du pays s’accordent pour ne plus prescrire, pour une période donnée, les antibiotiques qui ne sont plus sensibles aux bactéries pathogènes afin qu’elles aient le temps de perdre leur résistance.
Pour ce qui concerne notre recherche sur les pneumocoques, d’autres études épidémio-logiques à grande échelle et de génotypages des souches des Streptococcus pneumoniae résis-tantes aux antibiotiques sont nécessaires afin d’obtenir des bases de données sur les résis-tances de ces bactéries pathogènes au Burkina Faso. Pour une meilleures prises en charge thérapeutiques des infections bactériennes, il faut donc une surveillance attentive de la sen-sibilité des pneumocoques aux -lactamines et autres antibiotiques par la mise en place de centres de références, de réseaux nationaux de surveillance des infections pneumococciques pour une bonne et sérieuse observation de l’évolution des résistances.
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EN ANNEXES : Disques d’antibiotiques testés et firmes :
Oxacilline(de biomérieux S.A. 1 g) Chloramphénicol (de sanofi diagnostic pasteur 30g) Vancomycine(de sanofi diagnostic pasteur 30g) Erythromycine(de biomérieux S.A. 15 g) Ceftriaxone(de sanofi diagnostic pasteur 30g) Tétracycline (de sanofi diagnostic pasteur 30) Rifampicine (de sanofi diagnostic pasteur 30g) Cotrimoxazole(de biomérieux S.A. 25 g) Ampicilline (de biomérieux S.A. 10 g) Lincomycine (de sanofi diagnostic pasteur 15g) Spectinomycine (de sanofi diagnostic pasteur 100g) Amoxicilline(de biomérieux S.A. 25 g)
Amoxcilline + Acide clavulanique(de oxoid limited 30g) Amikacine (de sanofi diagnostic pasteur 30g ) Pefloxacine (de sanofi diagnostic pasteur 5g) Ciprofloxacine(de biomérieux S.A. 5 g)
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CARACTÉRISATION GÉNOTYPIQUE ET SÉROTYPES DES SOUCHES INVASIVES
DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ISOLÉES À BOBO –DIOULASSO EN 2002
BERE1 L C., BERE1 A.P, DOSSO2 M.
RESUME
Des souches de Streptococcus pneumoniae isolées du LCR ont été évaluées. Les sérotypes majeures suivant : [1, 3, 6, 19, 23] ont été identifiées :
- 8.3% des souches avaient le transposon Tn 1207 et étaient responsables des résistances à la tétracy- cline et à l’érythromycine.
- 58,3% des souches étaient résistantes tétracycline et à l’érytromycine ;
et à la Le profile PFGE des souches était très hétérogène.
- 66,70% des souches arboraient le phénotype MLSb avec le gène erm (B) ;
- 16,7% des souches arboraient le phénotype M avec le gène mef (A) ;
- 37,5% des souches avaient le transposon Tn 1545 et étaient responsables des résistances à la tétracy- cline et à l’érythromycine ;
MOTS-CLÉS : S.PNEUMONIAE, GENOTYPE, BURKINA FASO, SEROTYPE ANTIBIORESISTANCE.
SUMMARY
Streptococcus pneumoniae resistants strains from patients with invasive diseases were evaluated. The mains serotypes were : [1, 3, 6, 19, 23] :
- 58,3% strains were resistant to tetracycline and erytromycine together ;
- 66,70%of isolates showed MLSb phenotypes with erm (B) genes ;
- 6,7% of isolates showed M phenotypes with mef (A) genes ;
- 37,5% of isolates with Tn 1545 transposon were responsible of resistances to tetracycline and to erythromycine ;
- 8.3% of isolates with Tn 1207.1 transposon were responsible of resistances to tetracycline and to erythro- mycine.
PFGE profile show different susceptibility profiles and did not appear to be related by PFGE.
KEY WORDS : STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, GENOTYPE, BF, SEROTYPE ANTIBIOTIC RESISTANCE
1- Unité de Formation et de Recherche en Sciences de la Vie et de la Terre (UFR-SVT) Université de Ouagadougou. 03 BP 7021 Ouagadougou 03, Burkina Faso. 2- UFR Sciences Médicales Département de Bactériologie Virologie, Institut Pasteur de Côte -d’Ivoire. 01 BP 490 Abidjan 01, Côte d’Ivoire. Correspondance : BÉRÉ Leonanrd E-mail : [email protected]
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INTRODUCTION
Dans un contexte de prévalence croissante des souches de pneumocoques résistantes aux pénicillines et de souches multirésistantes, il est nécessaire d’effectuer continuellement une évaluation phénotypique et génotypiques des résistances.
Cela permettrait d’évaluer la progression des clones multirésistants et de mieux comprendre les déterminants de la résistance de ces souches aux antibiotiques tout en rendant facile le choix des antibiotiques pour une éventuelle utilisation empirique.
La résistance des pneumocoques aux macrolides est due particulièrement selon Leclercq R. à une méthylation de l’adénine au niveau de l’ARN 23S qui induirait une réduction de l’affinité entre l’antibiotique et le ribosome 1. Cette résistance serait associée aux gènes erm (B) qui induiraient une résistance de haut niveau aux macrolides, lincosamides et streptogramines b, en conférant le phénotype MLSb aux souches. Mais de plus en plus des résistances aux
macrolides dues à un nouveau système d’efflux sont décrites à travers le monde.
Cette résistance serait liée aux gènes mef(E) et induirait une résistance de bas niveau aux macrolides tout en étant sensibles aux lincosamides et streptogramines b, en conférant le phénotype M aux souches.
Quant à la résistance des pneumocoques aux tétracyclines, elle est principalement due à la protection des protéines cytoplasmiques codées par les gènes tet (M) 3.
La résistance due aux gènes tet (K) et tet(L) qui réduiraient la concentration des tétracyclines à un niveau subtoxic par un mécanisme d’efflux serait très rare au niveau des pneumocoques selon la littérature 4.
Cette étude, effectué sur des souches invasives de Streptococcus pneumoniae (SP) isolées au Burkina Faso vise à évaluer les bases phénotypiques et génotypiques de la résistance en identifiant et caractérisant les gènes de résistance aux tétracyclines et aux macrolides.
MATERIELS ET METHODES
Les souches bactériennes 24 souches de S.P. résistantes à au moins
une classe d’antibiotique ont fait l’objet de la présente étude. Ces souches ont été isolées au centre hospitalier universitaire Sourou Sanon de Bobo-Dioulasso/Burkina Faso à partir du LCR d’octobre 2002 à février 2003. Ces souches représentaient 45% du total des souches invasives isolées. L’étude était de type transversale.
Identifications des souches
L’interprétation de l’antibiogramme a été faite selon la méthode de Kirby-Bauer et l’interprétation des résultats selon les normes du CCLS (Comittee for Clinical Laboratory Standard) 5.
Le contrôle de qualité de la technique a été effectué avec la souche de Streptococcus pneumoniae ATCC 49619.
Les sérotypes/sérogroupes capsulaires ont été déterminé par la réaction de Quellung avec les antisérums du Statens Serum Institut de Copenhague (Danemark).
*Détection des gènes de résistance aux macrolides, aux tétracyclines et des Transposons.
La PCR a été utilisée pour détecter la présence des gènes : tet (M), erm (B), mef (A).
Les gènes erm(B), mef (A) ont été amplifié en utilisant la paire de primers décrits dans la littérature [10], et la paire de primers suivante pour la mise en évidence du gène tet (M).
L’identification des souches a reposé sur: la microscopie, l’aspect des colonies sur la gélose au sang frais de mouton avec la présence d’’hémolyse alpha, la sensibilité à l’optochine et la lyse des souches par le désoxycholate de sodium à 10%.
L’antibiogramme a été réalisé selon la méthode diffusion en gélose utilisant des disques imprégnés d’antibiotiques. Neuf (9) disques d’antibiotiques ont été testés. Oxacilline, Ceftriaxone, Tétracycline, Cotrimoxazole, Erythromycine, Lincomycine, Ciprofloxacine, Chloramphénicole, Vancomycine.
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* MS 181 (5’ - ATA TGT GTG TGA CGA ACT TTA CC- 3’)
La lyse des échantillons s’est faite en situ et la digestion de L’ADN chromosomique s’est faite en utilisant des endonucléases de restrictions de type Apa I (New England Biolab, UK) décrites dans la litérature 7.
Les fragments de DNA ont été soumis à un courant de 200V pendant 21h à 10°C.
Un champ alterné a été utilisé et le «pulse times» était de :
1S pour 3h ; 3S pour 3h ; 5S pour 3h; 7S pour 4h ;10S pour 4h ; 15S pour 4h .
Le gel a été révélé par le bromide d’éthidium et photographié sous UV.
En ce qui concerne l’hybridation; les fragments d’ADN ont été transférés sur une membrane hybond N+ en nylon ( Amersham international, UK) sous vide en utilisant un appareil de type Pharmacia biotech, Sweden selon les instructions du fabriquant. L’hybri-dation a été effectué avec les sondes erm (B), tet (M), mef (A) obtenu par PCR .
* MS 182 ( 5’ - CAG TAA CAT- 3’).
GTT CAC CGG TAG
La détermination de la présence de transpsons Tn 1545 a été obtenu en utilisant des primers spécifiques de gènes de l’intégrase, localisées sur int-Tn décrit dans la littérature 6.
Pour la détermination des transposons Tn 1207.1, une PCR a été faite en utilisant les primers suivants :
* MS34 rew ( 5’- GAT AGG GTT TAT GCG GCG AAG A-3’)/ME-rev et
* MS146( 5’ - GGT GGG TAA GTA GTA TCA GAG TGA G-“3’)/ mef-rev PFGE (Electrophorèse en champs pulsées) et hydridation du DNA La fixation des échantillons a dans un gel d’agarose LMP.
été faite
RESULTATS
Sensibilité des souches aux antibiotiques. Toutes les souches étaient résistantes à au moins une classe d’antibiotique représentant
45% de toutes les souches isolées et testées dans notre laboratoire.
Figure 1 : Sensibilité des souches aux 9 antibiotiques.
Série 1 : Sensibilité Série 2 : Résistance Antibiotiques : 1. Oxacilline, 2. Ceftriaxone, 3. Tétracycline, 4. Cotrimoxazole, 5. Erythromycine, 6. Lyncomycine, 7. Ciprofloxacine, 8. Chloramphenicol, 9. Vancomycine.
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Tableau I : Répartition des sérotypes versus Phénotypes
Tableau II : Nombre et pourcentage des phénoptypes , Gènes de résistances Transposons identifiés
et
- 5 (20.8%) souches avaient 4 mécanismes de résistance cumulés aux macrolides, tétracyclines, co-trimoxazole et β lactamines.
- 15 (62.5%) souches avaient 2 mécanismes de résistances cumulés aux macrolides, tétracyclines ou co-trimoxazole.
- 14 (58.3%) des souches étaient résistantes à la tétracycline et aux macrolides - 12 (50%) des souches avaient les gènes erm (B) + tet (M) - 2 (8.3%) des souches avaient les gènes mef (A/E) + tet (M)
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Phénoptypes , Gènes et Transposons Nombre et pourcentage Gène erm B 16 (66.7%) Gène mefA 4 (16.7%) Gène tetM 19 (%) Tn 1207.1 2 (8.3%) Tn 1545 9 (37.5%) Phénotype MLSb 16(66.7%) Phénotype M 4 (16.7%)
Sérotypes/ Sérogroupes
N (%) Phénotypes
MLSb
N (%) Phénotypes
M
Total N (%)
23 7 (31.9%) 0 (0.0%) 7 (29.1%) 1 2 (9.1%) 1 (50.0%) 3 (12.6%) 6 4 (18.2%) 0 (0.0%) 4 (16.6%) 1 2 (9.1%) 0 (0.0%) 2 (8.3%) 3 4 (18.2%) 1 (50.0%) 5 (20.8%)
Autres 3 (13.5%) 0 (0.0%) 3 (12.6%) Total 22 2 24
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Figure 2 : PFGE des échantillons de S.pneumoniae . Bande 1 : marker λ ; Bande 2 : 3H ; Bande 3 : 10H ; Bande 4 : 48H ; Bande 5 : 14H ; Bande 6 : 52H ; Bande 7 : 62H ; Bande 8 : 59H ; Bande 9 : 4H ; Bande 10 : 25H ; Bande 11 : 135.1 ; Bande 12 : controle mef Bande 13 : 3H ; Bande 14 : control erm (B) ; Bande 15 : control tet (M).
Tableau III : Localialisation chromosomique des gènes erm B, tetM, mef A/E.
(suite et fin)
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135.1 _ 120Kb 120Kb
2ST 170Kb 170Kb _
3ST _ 120Kb 120Kb
5ST 120Kb 120Kb _
7ST 170Kb 170Kb _
8ST 291Kb 291Kb _
9ST 194Kb 194Kb _
16ST _ _ 85Kb
17ST _ _ _
18ST _ _ _
22ST _ _ 85Kb
24ST _ _ _
25ST _ _ _
SOUCHES Erm(B) Tet(M) Mef(A)
10H
339Kb
339Kb 97Kb
_
25H
339Kb
339Kb 97Kb
_
62H
339Kb
339Kb 97Kb
_
4H
339Kb
339Kb 97Kb
_
25H 194Kb 194Kb _
14H _ _ _
59H
_
220Kb 120Kb
_
48H _ _ _
3H _ _ _
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DISCUSSION
La présente étude a montré que 91,7% des souches sérotypées [1, 3, 6, 19, 23] arboraient le phénotype MLSb et étaient donc liées à une résistance de haut niveau aux macrolides. Seulement 8 ,3% des sérotypes [3, 19] arboraient le phénotypes M et étaient liées à une résistance de bas niveau aux macrolides.
Le gène erm (B) liée au phénotype MLSb a été identifié au niveau de 16 souches (66,70%) et le gène mef (A) liée au phénotype M a été identifié au niveau de 4 souches (16,7%). Des prévalence du phénotype MLSb plus élevée (89%) ont été observé en Afrique du sud [8].
Au niveau des souches de pneumocoques isolées en clinique, la résistance à la tétra- cycline est très fréquemment associée à la résistance à l’érytromycine [9].
Nos résultats ont montrés que 58,3% des souches étaient résistantes aux tétracyclines et à l’érytromycine. Ces résultats avoisinent ceux rencontrés aux Etats-Unis de 1999 à 2000 o ù plus de 60% des souches multirésistantes présentaient une résistantes à la tétracycline et à l’érythromycine [10].
La caractérisation génomique des souches isolées a montré que 50% des souches avaient le gène erm (B) associée au gène tet(M) sur la même souche et 8,3% des souches avaient le gène mef (A) associé au gène tet (M).
L’association entre la résistance à l’érythromycine et la résistance à la tétracy- cline serait due à une famille particulière de transposons [11].
Un gène de l’intrégrase, appelé int-tn caractérise cette famille de transposons Tn 916 et Tn 1545 qui codent la résistance à l’érytromycine via le gène erm (B) et les résistances à la tétracycline via le gène tet (M) et également à la résistance à la kanamycine
La forte association entre le gène erm (B) et tet (M) au niveau de 9 souches et sur les fragments chromosomiques suivants : 339Kb, 194 Kb,170 Kb, 120 Kb, 291 Kb a donc sug- géré la présence du transposon 1545.
Pour vérifier cette hypothèse, une PCR révélant la présence du gène int–tr a été effectué et s’est révélé positive pour toutes les souches positives avec les gènes erm(B) et tet (M).
Il s’avère donc que le transposon Tn 1545 est responsable de la propagation de la plu- part (37,5%) des résistances à la tétracycline et à l’érythromycine.
Deux (2) souches avaient sur le même fragment chromosomique (120Kb) les gènes mef (A) et tet (M) ; cela reflète et l’association de ces deux déterminants et la présence du transposon Tn 1207.1 au niveau de 8.3% des souches génotypés.
Le profil clonal représentant un groupe de souches a été déterminé par PFGE.
Les souches 10H, 52H, 62H, 4H avaient un même profil PFGE avec les gènes erm(B) localisés à 339Kb et tet (M) localisés à 97Kb et à 339kb.Les souches 9STet 25H avaient le même profil PFGE avec les gènes erm (B) et tet (M) localisés à 194Kb. Deux souches 2ST et 75ST avaient le même profil PFGE avec les gènes erm(B) et tet(M) localisés à 170Kb.
Ces données sur la l ocalisation chromosomique des gènes tet (M) et erm (B) effectuée au même moment et dans le même hôpital montre la présence de trois différents clones.
L’hétérogéicité remarquable du profil PFGE des autres souches suggère qu’ils ne seraient pas de nature clonale.
Des études complémentaires sur sur l’analyse des PBP, et sur les mutations du gène du dihydrofolate réductase DHFR) devraient donner plus de précisions sur les mécanismes génétiques de la résistance au
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CONCLUSION
En conclusion, nous avons montré que la majorité des souches de pneumocoques résistantes isolées en milieu hospitalier à Bobo-Dioulasso/Burkina Faso arboraient le phénotypes MLSb et exprimaient le gène erm (B).
La majorité des souches présentaient une résistance croisée aux tétracyclines et macrolides 58,3%. Les sérotypes majeures étaient : [1, 3, 6, 19, 23].
La propagation de résistante seraient largement due d’autre part aux transposons Tn1545.
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