PRODUCCIÓN ANIMAL Marzo-Abril 2012 • N.º 2712 PRODUCCIÓN ANIMALPRODUCCIÓN ANIMALPRODUCCIÓN ANIMAL

A. Jubert1 y M. Lázaro2.

1Director Técnico del Laboratorio Interprofesional Lechero de Cataluña (ALLIC). 2Responsable del Departamento de Diagnostico Veterinario del Laboratorio Interprofesional Lechero de Cataluña (ALLIC).

INTRODUCCIÓN

La implantación de los Progra-mas de Prevención de lamamitis y la Mejora de lacalidad de la leche por parte delos veterinarios son de vitalimportancia para mejorar larentabilidad de las explotacio-nes, el bienestar animal y poderdar mejores garantías de quelos alimentos se están produ-ciendo de una forma segura ysostenible (Pamela Ruegg,2011).

La mamitis o inflamación de laglándula mamaria, principal-mente producida por bacterias,reduce la producción de leche,aumenta la cantidad de lechedescartada y aumenta el sacrifi-cio prematuro, así como los

costes de producción (Fetrow, J.2000). Además, se ha demostra-do que la mamitis clínica comola subclínica reducen la eficien-cia reproductiva (Barker et al.,1998, Santos et al., 2004, ySchrick, 2001). Las lechesmamíticas también son unproblema para la industrialáctea ya que se deteriora lacalidad de la leche pudiendoafectar sobre todo la produc-ción de quesos, yogures ydemás derivados lácteos.

Para controlar la mamitis, esimportante establecer unprograma de control mediantela prevención de nuevas infec-ciones y la eliminación de lasinfecciones existentes. En estalínea, el departamento dediagnóstico veterinario delLaboratorio Interprofesional

Lechero de Cataluña hadesarrollado una nueva estrate-gia de análisis para la deteccióne identificación del agentecausal de la mamitis pormétodos moleculares: diagnós-tico de mamitis por PCR atiempo real: técnica altamentesensible, especifica, rápida yversátil.

Para demostrar internamente lavalidez de la técnica, se realizóun estudio comparativo conmuestras de leche de vaca detanque procedentes de explota-ciones lecheras de Cataluña,mediante el kit PathoProofTM

(kit de diagnóstico de losprincipales patógenos causan-tes de mamitis por la técnica dePCR a tiempo real) y el cultivobacteriano. Los resultadosindicaron una buena correla-

Análisis laboratorial dentro de losAnálisis laboratorial dentro de losprogramas de prevención de la mamitis yprogramas de prevención de la mamitis y

la mejora de la calidad de la leche.la mejora de la calidad de la leche.

Nueva estrategía de diagnóstico por PCR: Ventajas del diagnóstico deNueva estrategía de diagnóstico por PCR: Ventajas del diagnóstico de

mamitis por PCR a tiempo real frente al cultivo bacterianomamitis por PCR a tiempo real frente al cultivo bacteriano

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ción entre ambos análisis ysugirieron que la PCR teníamayor sensibilidad que elcultivo.

ANÁLISIS LABORATO-RIAL DENTRO DE LOSPROGRAMAS DEPREVENCIÓN DEMAMITIS y LA MEJORADE LA CALIDAD DE LALECHE: NUEVA ESTRA-TEGIA DE DIAGNÓSTI-CO POR PCR

En el departamento dediagnóstico veterinario delLaboratorio InterprofesionalLechero de Cataluña (ALLIC)analizamos muestras de lecheindividual de mamitis clínica ysubclínica, de tanque, “pooles”de muestras procedentes deanimales que se van a incorpo-rar en la explotación antes deser adquiridos (compra omovimientos de animales), devacas recién paridas, de vacasantes del periodo de secado yde muestras para el control depatios. Nuestro objetivo es laprevención, el control de lamamitis y la mejora de lacalidad de la leche.

El laboratorio (ALLIC) trasuna larga experiencia en latécnica de cultivo de lechepara la detección e identifica-ción del agente causal de lamamitis (clínica o subclínica),inicia una nueva estrategia deanálisis mediante la técnica dela PCR a tiempo real ofrecien-do así un mejor servicio tantoa veterinarios como a ganade-ros.

La técnica de identificaciónde patógenos por PCR atiempo real se basa en la detec-ción de una secuencia específi-ca de nucleótidos del ADN(gen diana) para cada patóge-no, y la amplificaciónexponencial por medio de laenzima polimerasa de la

secuencia determinada(reacción en cadena de lapolimerasa (PCR)). De estamanera el gen diana se ampli-fica (copia) múltiples vecesobteniéndose un número decadenas de ADN idénticas quepueden ser detectadas óptica-mente. La técnica a tiempo realmide los niveles de amplifica-ción del ADN a medida queesta va ocurriendo, mediantela incorporación de sondasmarcadas con moléculasfluorescentes. La medición dela amplificación se realiza conun instrumento óptico (fluoró-metro). La cantidad de fluores-cencia emitida es directamenteproporcional al número decopias de ADN específico enla reacción, y por ello, la técni-ca permite la cuantificación delADN amplificado o, indirecta-mente, el número de bacteriaspresentes en la muestra origi-nal.

El kit comercial de diagnósticoutilizado, basado en la identifi-cación de dianas genéticas, delos principales patógenos demamitis mediante la técnicade PCR a tiempo real, ha sidoel PathoProofTM (FinnzymesDiagnostics) (ver tabla 1).

Validación de la técnica

Los kits PathoProofTM , hansido ampliamente validadoscon muestras de leche demamitis clínicas, subclínicas ycon muestras de tanque. Entodas las validaciones yparámetros determinados(especificidad, sensibilidad) sehan encontrado excelentesresultados. Citamos algunasde estas validaciones: Valida-ción de la Especificidad ysensibilidad analítica delensayo PathoProofTM ,: Koski-nen M.T.et al.(2009): ensaya-ron 454 muestras de mamitisclínica bovina con el kit Patho-

ProofTM Mastitis Complete-12y encontraron que presentabauna sensibilidad y especifici-dad del 100%; Friendchip etal., 2010, analizaron 230muestras de control lechero yencontraron una sensibilidaddiagnóstica del 94,1% y unaespecificidad diagnóstica del94,8%. Validaciones conmuestras de leche de mamitisclínicas negativas en cultivo:Taponen y colaboradores(2009): realizaron un estudiocon muestras de mamitis clíni-cas que habían dado resulta-dos negativos en cultivosbacterianos. Ensayaron, con elkit de PCR PathoProofTM , 79muestras de leche de mamitisclínica, que fueron negativas acultivo y de estas 79 muestras,el 43% fueron positivas porPCR. El número de copiasbacterianas en estas muestraspositivas fue del orden de 103a 107copias de genoma pormililitro de leche, cantidadsuficiente de bacterias parahaber sido detectadas en culti-vo. De ello se concluye que latécnica de PCR es una herra-mienta más sensible y por lotanto más útil para el diagnós-tico bacteriológico de talesmuestras. Los cultivos negati-vos en muestras donde lossíntomas clínicos son eviden-tes son un problema para loslaboratorios, los ganaderos yveterinarios. Las razones de lanegatividad de las muestrasde leche de mamitis clínica encultivo no están claras, peropodría deberse a un númeroinsuficiente de bacterias en lamuestra de leche, a la presen-cia de inhibidores de creci-miento en la leche o a queestas bacterias, aunque presen-tes, no sean viables en losmedios de laboratorio(Vacunek, 2010).

Internamente el laboratorioALLIC realizó un estudiocomparativo con muestras

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Análisis laboratorial dentro de los programas de prevención de la mamitis...

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leche de vaca de tanque deexplotaciones lecheras deCataluña, del kit PathoProof

TM

Mastitis Major 3 y el cultivobacteriano.

Sistemática y métodos

Cultivo bacteriano:

Para Streptococcus spp y S.agalactiae se emplea elmedio Edwards que permi-te diferenciar los streptoco-cos en función de sureacción frente a la esculinay su capacidad hemolítica.Para Staphylococcus coagu-lasa negativo y Staphylo-coccus aureus se utiliza elmedio Baird-Parker conRPF que permite visualizarla prueba de la coagulasa insitu. Los Staph. coagulasapositivos son confirmadoscon la prueba de manitol enanaerobiosis. ParaMycoplasma bovis utiliza-mos el medio PPLO conincubación en anaerobiosisdurante 7-10 días. Estatécnica es larga, poco preci-sa y se necesita experienciapor parte del personal dellaboratorio.

PCR a tiempo real:

Se utiliza el kit PathoPro-ofTM Mastitis Major 3 quepermite analizar simultáne-amente la presencia de losmicrorganismos patógenos

Staphylococcus aureus, Strep-tococcus agalactiae yMycoplasma bovis.

Realizamos ambos métodos(cultivo bacteriano/PCR)en leche de vaca correspon-diente a tanque de explota-ciones de bovino.

Se utiliza el kit PathoProofTM

Mastitis Major 3 que permiteanalizar simultáneamente lapresencia de los microrganis-mos patógenos Staphylococcusaureus, Streptococcus agalactiaey Mycoplasma bovis.

Realizamos ambos métodos(cultivo bacteriano/PCR) enleche de vaca correspondien-te a tanque de explotacionesde bovino.

Los resultados de los cultivosse han expresado en unida-des formadoras de coloniaspor mililitro (UFC/ml),mientras que los resultadosde la PCR se han expresadoen cuatro categorías enfunción del número de ciclosde replicación (Ct): negativo(-), ligeramente positivo (+),moderadamente positivo(++) o muy positivo (+++).

Resultados:

Resultados para Streptococcusagalactiae

De un total de 64 muestras deleche de tanque analizadas porcultivo (medio Edwards) y porPCR se encontraron 22muestras positivas a PCRfrente a 13 de cultivo. Se reali-zó un seguimiento analítico dela leche de tanque de las explo-taciones correspondientes aestas 9 muestras positivas alPCR y negativas al cultivo,confirmándose el resultado alidentificar los animales positi-vos mediante el cultivo de laleche de cuarterón.

Resultados para Staphylococcusaureus

De un total de 92 muestras deleche de tanque analizadas porcultivo (medio Baird-Parkercon RPF) y por PCR se encon-traron 44 muestras positivas aPCR frente a 46 de cultivo. Losresultados del cultivo de estasdos muestras positivas corres-pondían a un bajo nivel decolonias (50 ufc/ml). El históri-co de resultados del cultivo detanque de ambas explotacionesnos mostraba que éstas explota-ciones eran positivas a S. aureusde una manera intermitente.

Resultados para Mycoplasmabovis

De un total de 50 muestras deleche de tanque analizadaspor cultivo (medio PPLO) ypor PCR se encontraron 8muestras positivas a PCRfrente a 4 de cultivo. Losresultados negativos de culti-vo pueden ser debidos a aque el método es poco preci-so y que en muestras detanque, donde el nivel decontaminación es muy eleva-do, es difícil la identificaciónde M. bovis.

A partir de los datos obteni-dos, observamos que en lostres patógenos los resultadoshan sido satisfactorios eindicaron una buena correla-ción entre ambos análisis. y

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Tabla 1: Kits de diagnóstico

sugirieron que la PCR teníamayor sensibilidad que elcultivo. No obstante, elnúmeros de muestrastodavía no es representati-vo para poder realizar untratamiento estadístico delos datos.

Ventajas e inconvenien-tes del diagnóstico demamitis por PCR atiempo real frente alcultivo bacteriano.

Son muchas las ventajas dela técnica de PCR encomparación con la técnicade cultivo bacteriano están-dar. Cabe destacar: larapidez (resultados en 4-5horas), la mayor sensibili-dad (límite de detecciónmás bajo) y elevada especi-ficidad (sólo detecta elmicroorganismo diana).Además, los resultados sonobjetivos y no dependen dela experiencia del usuario.

La técnica permite lacuantificación del ADNextraído y, por lo tanto, losresultados son, además decualitativos, cuantitativos.

Manejo de muestras: latécnica es aplicable adiferentes tipos de leche:leche de cuarterón, detanque, con conservante,congelada y leche conantimicrobianos.

Facilidades en el envío delas muestras: Las muestraspueden ser enviadas sinrefrigeración, preservadascon bronopol.

La técnica de PCR detectael ADN de bacterias vivas omuertas. Se podríaargumentar que, si estasbacterias están dañadas omuertas, no van a provocarmamitis. Esto podría sercorrecto en el caso dealgunas mamitis ambienta-les, pero el hecho de tenerADN específico de patóge-nos de mamitis contagiosa,aunque la bacteria nocrezca en cultivo, puederecobrar su virulencia opueden estar retenidas enel tejido de la ubre y crearproblemas en un futuropróximo (Vacunek, 2010).

El principal inconvenientesería el coste: reactivos,material fungible (puntasde pipeta, eppendorf, …) yequipamiento.

ANALíTICAS DECONTROL DE LECHEDE TANqUE EN ELALLIC: MAMITIS EHIGIENE

Actualmente, el LaboratorioInterprofesional Lechero deCataluña está aplicando deuna manera sistemática latécnica de PCR para laprevención y detección deagentes causantes de mamitiscontagiosa: Mycoplasma bovis,Staphylococcus aureus y Strep-tococcus agalactiae. (nota:próximamente con el nuevokit PathoProofTM MastitisMajor 4 tambien S. uberis).

El análisis de PCR se estáutilizando como una herra-mienta de screening decontagiosos y control debioseguridad de las granjas.Las medidas de bioseguridadson básicas, antes de la intro-ducción de animales en unagranja y, en el caso de lasmamitis, deben de centrarseen el diagnóstico de losmicroorganismos “contagio-sos”, en particular S. aureus,S. agalactiae y Mycoplasmabovis. Por ello se están anali-zando de una manera siste-mática las muestras corres-pondientes al tanque y“pooles” de muestras de laleche procedente de lacompra de animales, de lasvacas recién paridas, de lasvacas antes del periodo desecado, de muestras para elcontrol de patios y “pooles”de muestras de vacas conrecuento de células somáticas(RCS) altos.

- La Analítica SISTEMÁTICAde la leche del tanque: nos

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Análisis laboratorial dentro de los programas de prevención de la mamitis...

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permite mantener bajocontrol la explotaciónganadera y observar suevolución (vigilancia depatógenos). Desde que elparámetro M. bovis se estarealizando de forma rutinariaen la leche de tanque porPCR, nos ha permitido detec-tar explotaciones positivas.Anteriormente dado que elcultivo era largo, laborioso ypoco preciso, este parámetrono se podía realizar de unamanera sistemática.

A nivel de tanque, también seanalizan de manera sistemá-tica los siguientes parámetrosbacteriológicos (ver tabla 2):SPC (Recuento de mesófilos),LPC (Recuento de termodúri-cos), Recuento de coliformes(CC) y no coliformes,Recuento de Prototheca spp. ylevaduras mediante la técnicade cultivo clásica descritaanteriormente. Con la evalua-ción de la tendencia de losresultados, el veterinario decalidad de leche podrá inves-tigar posibles problemasrelacionados con la calidadbacteriológica. de la leche.

El cultivo de la leche de tanquerefleja cambios (buenos omalos) en el manejo y, por lotanto, es una herramienta deseguimiento de los cambios.Una comparación entre losvalores de los recuentos dediagnóstico (SPC, LPC, CC yRCS) nos puede dar pistas

valiosas en cuanto a la probablefuente del problema (Reine-mann, 1999).

- La Analítica de la leche deanimales que se van a incorpo-rar en la explotación antes deser adquiridos (analítica antesde la compra o movimiento deanimales): este punto es de vitalimportancia para asegurarnosque los animales que introduz-camos en nuestra explotaciónpresenten las condicionesóptimas y evitemos así que seproduzca un contagio entrelos animales sanos. La mayorsensibilidad y rapidez en eldiagnóstico por PCR puedeevitar la compra de unanimal con infecciones laten-tes en la ubre.

- La Analítica de la leche delas vacas recién paridas: aligual que en el caso anterior,las recién paridas pueden serportadoras de microorganis-mo contagiosos que, duranteel periodo de secado, no sehan acabado de erradicar.Asegurar el estado de lasrecién paridas nos evitaproblemas posteriores en lagranja. Se puede considerarque, si no hemos entradoanimales nuevos en la granja,las vacas recién paridasestarán en las mismas condi-ciones que al final de la lacta-ción (antes del periodo desecado). Pero, debido a quelas vacas infectadas con M.bovis tienen periodos de alta

y baja eliminación delpatógeno, es necesario reali-zar el análisis de la leche detodas las vacas inmediata-mente después del parto yaque es, en el tiempo delactancia, el periodo demayor probabilidad de elimi-nación de M. bovis (G.A.Contreras, 2011).

- Analítica para el control depatios: en caso de granjas conpresencia de alguno de lostres microorganismospatógenos anteriormentecitados y en las cuales se hanseparados las vacas positivasde las negativas, el controlmediante la analítica conPCR de los patios “limpios”ayuda asegurar que elmanejo de la granja es elcorrecto hasta eliminar laproblemática en la granja.

- Analítica de ”pooles” demuestras de vacas con RCSaltos (RCS> 200.000 cel/ml),chequeo de las vacas antesdel periodo de secado.

- Analítica de muestras deleche de mamitis clínicasnegativas en cultivo: cultivosnegativos en muestras dondelos síntomas clínicos sonevidentes.

- Analítica de muestrasindividuales: con los kitsPathoProofTM Complete -12 o16 nos permiten ampliar lacantidad de patógenos detec-tados. Debemos destacar queel nuevo kit 16 tambiéndetecta Prototheca spp.

CONCLUSIONES

El ensayo por PCR a tiemporeal es una buena herra-mienta para la prevención ydetección de patógenoscausantes de mamitis.

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Tabla 2: Parámetros y técnica para el análisis sistemático dela leche de vaca de tanque en el ALLIC

Es importante resaltar laaplicación de la técnica dePCR en las muestras deleche de tanque; en lasmuestras de leche proce-dente de las vacas antes deser adquiridas(compra/movimiento deanimales); en el chequeo delas vacas antes del periodode secado; en la leche de lasvacas recién paridas; en laleche con recuentos RCS<200.000 cel/ml y enmuestras con cultivosnegativos.

Son muchas las ventajas dela técnica de PCR encomparación con la técnicade cultivo bacteriano están-dar. Primero Cabe destacarla rapidez (resultados en 4-5 horas), la mayor sensibili-dad (límite de detección

más bajo) y elevada especi-ficidad (sólo detecta elmicroorganismo diana).Además, los resultados sonobjetivos y no dependen dela experiencia del usuario.Segundo Hay que conside-rar que bacterias comunesde mamitis pueden apare-cer en grandes cantidadesen muestras de mamitisclínica, pero presentanausencia de crecimiento enla técnica de cultivoconvencional.

BIBLIOGRAFíAPamela Ruegg, 2011: A Practical Look atMonitoring Mastitis Control Programs. Congre-so Internacional ANEMBE de Medicina Bovina.May 11-13, Avila, Spain.

Fetrow, J. 2000. Mastitis: An economic conside-ration. in Proceeding 39th Annual ConferenceNational Mastitis Council, Atlanta GA, Feb 13-16, pp 3-47

Barker, A. R., F. N. Schrick, M. J. Lewis, H. H.Dowlen, S. P. Oliver. 1998. Influence of clinical

mastitis during early lactation on reproductiveperformance of Jersey cows. J. Dairy Sci.81:1285-1290.

Santos, J. E., R. L. Cerri, M. A. Ballou, G. E.Higginbotham, and J. H. Kirk. 2004. Effect oftiming of first clinical mastitis occurrence onlactational and reproductive performance ofHolstein dairy cows. Anim. Repro. Sci. 80:31-45.

Schrick, F. N., M. E. Hockett, A. M. Saxton, M. J.Lewis, H. H. Dowlen, S. P. Oliver. 2001. Influen-ce of subclinical mastitis during early lactationon reproductive parameters. J. Dairy Sci. 84:1407-1412.

Koskinen M. T. et al. Analytical specificity andsensitivity of a real-time polymerase chainreaction assay for identification of bovine masti-tis pathogens. J. Dairy Sci. 2009, 92 (3): 952-9

Friendchip et al., 2010, NMC annual MeetingProceedings 2010.

Taponen y colaboradores (2009) (Journal ofDairy Science, Vol 92, nº6, June 2009),

Vacunek, 2010: Isbene Sanchez, Beatriz Lázaro,Félix Bastida. Ventajas del diagnóstico demamitis por PCR a tiempo real (PathoProofTM )frente al cultivo bacteriano. Tierras, 2010 nº170(www.oviespaña.com)

Reinemann D. J., G.A. Mein, D. R. Bray, D.Reidand J. S. Britt, 1999. Troubleshooting highbacteria counts in farm milk. Univ. WisconsinCoop Ext Pub A3705, Madison WI

G. Andrés Contreras, 2011: Mycoplasma bovisen el ganado lechero, ALBEITAR , marzo del2011 nº 143.

Análisis laboratorial dentro de los programas de prevención de la mamitis...