中国组织工程研究与临床康复 第 15卷 第 24期 2011–06–11出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research June 11, 2011 Vol.15, No.24

ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 4415

Department of Orthopedics, the Affiliated Zhongda Hospital of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China Zhou Hai-yang★, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, the Affiliated Zhongda Hospital of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China haiyangzhou2008@ 163.com Correspondence to: Wang Chen, Professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, the Affiliated Zhongda Hospital of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China wangchen@ medmail.com.cn Received: 2011-02-09 Accepted: 2011-05-12

东南大学附属中大医院骨科，江苏省 南 京 市 ，210009 周海洋★，1979年生，山东省苍山县人，汉族，东南大学在读硕士，主要从事骨与关节损伤的研究。 haiyangzhou 2008@163.com 通讯作者：王宸，教授，硕士生导师，东南大学附属中大医院骨科，江苏省南京市 210009 wangchen@ medmail.com.cn 中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2011)24-04415-04 收稿日期：2011-02-09 修回日期：2011-05-12 (20101025016/WJ •Y)

自体富含血小板血浆对兔骨折愈合的影响★

周海洋，王 宸，耿 震

Role of autologous platelet-rich plasma on fracture healing in rabbits

Zhou Hai-yang, Wang Chen, Geng Zhen

Abstract BACKGROUND: Platelet-rich plasma (PRP) is often prepared with autalloploid and can be used to promote the fracture healing of flat bone and cancellous bone. OBJECTIVE: To prepare PRP with Landsberger’s method and to analyzes the therapeutic role of PRP on the fracture healing of radius in rabbits. METHODS: New Zealand rabbits were randomly divided into a control group and a PRP treated group. Unilateral open femoral fracture models were established in the lower 1/3 radius bone. PRP group received was treated with autologous PRP gel, while control group was only sutured after fracture modeling. Autologous PRP was prepared by Landsberger’s method and then implanted to the fracture site, followed by plaster immobilization of the fracture fragments. RESULTS AND CONCLUSION: The fracture specimens exhibited varying degrees of callus formation at 1, 2, 4, 6 weeks. X-ray score in the PRP group was significantly higher than that in control group at 4 weeks (P < 0.05). Immunohistochemistry showed that, type I collagen content in the PRP treatment group was significantly higher than that in the control groups for 4 weeks (P < 0.05). PRP accelerates bone fracture healing of rat femurs by increasing expression of type I collagen and the number of bone island. Zhou HY, Wang C, Geng Z. Role of autologous platelet-rich plasma on fracture healing in rabbits. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(24): 4415-4418. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com]

摘要 背景：研究表明富含血小板血浆常通过同源异体制备，可应用于促进扁骨和松质骨的骨折愈合。 目的：用Landsbergs法制备自体富含血小板血浆，观察其对兔桡骨骨折愈合影响。 方法：将新西兰兔随机分成富含血小板血浆组和对照组，分别建立桡骨中下1/3处骨折模型，富含血小板血浆组中加入制备的自体富含血小板血浆凝胶，对照组建立骨折模型后直接缝合。采用Landsbergs法制备自体富含血小板血浆，并植入富含血小板血浆组的骨折端，并行骨折断端石膏外固定。 结果与结论：兔骨折标本在建模后1，2，4，6周均有不同程度骨痂形成。富含血小板血浆组在建模后第4周X射线进行影像学评分明显高于对照组(P < 0.05)。免疫组织化学检测显示：富含血小板血浆组Ⅰ型胶原量明显的高于对照组(P < 0.05)，可持续4周左右。结果证实，富含血小板血浆可通过增加骨痂中骨岛量和加速Ⅰ型胶原合成而明显促进长骨骨折愈合。 关键词：富含血小板血浆；长骨；骨折愈合；成骨细胞；血小板源性细胞因子；Ⅰ型胶原；纤维蛋白；组织构建 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.24.011

周海洋，王宸，耿震.自体富含血小板血浆对兔骨折愈合的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(24):4415-4418. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]

0 引言

研究发现血小板是天然的细胞因子和生长

因子的储存库，在一定的条件下被激活、释放，

促进血液凝固、组织修复和骨的矿化过程[1]。

富含血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)是少量的血浆内包含大量的血小板成分的血制

品，PRP通过生长因子例如血小板衍生生长因子，胰岛素样生长因子和转化生长因子β等起促进骨再生作用

[1-2]，已经被成功应用于下颌骨和

脊柱的骨移植手术、心血管手术和相关的代谢

性骨疾病等[3]。以往研究中PRP通过同源异体

制备，应用于促进扁骨和松质骨骨折愈合。实

验以此观察自体PRP对长骨折愈合的作用及影响。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。 时间及地点：于2009-03/2010-07在东南

大学临床医学院实验室完成。 材料： 实验动物：健康成年新西兰大白兔32只，体

质量为2.5~3.0 kg，雌雄不限，均购自江苏省农科院实验动物中心，动物许可证号：SYXK(苏) 2010-0005。

主要试剂：

试剂 来源

抗凝剂枸橼酸钠 东南大学附属中大医院检验中心 Ⅰ型胶原抗体 武汉博士德生物技术有限公司 凝血酶 美国 Sigma公司

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实验方法：

分组：将32只兔随机分成PRP组和对照组，每组16只。

采血取样：取PRP组兔耳缘静脉血约5 mL，分别加入含有枸橼酸钠溶液的试管中，采用Landsberg法[4]

制

备PRP，采用二次离心方法制备PRP。第1次以200 g离心力作用下离心10 min后去除部分红细胞和上层部分血清后摇匀；将摇匀的第1次离心液以200 g 离心力作用下离心10 min后去除部分血清和一部分红细胞后摇匀离心液。将第2次制备好的离心液加入配制好的凝血酶激活血小板，使离心液成凝胶状后置入冰箱中备

用，每次制备的富含血小板凝胶约0.5 mL。 建模及干预：取血后，新西兰大白兔32只应用体积分

数2%戊巴比妥钠溶液1 mL/kg进行耳缘静脉全身麻醉，待动物麻醉彻底后，取右前肢常规方法脱毛灭菌，于桡

骨中下1/3处行长约3 cm纵行切口，沿肌间隙游离桡骨切开骨间膜及骨膜，锯断桡骨，直视下间两断端完全分

离，将高速离心制备的血小板浓缩液约0.5 mL在无菌条件下注入PRP组骨折端，缝合各层并行石膏外固定[5]

。

对照组行断端处理后直接缝合后行石膏外固定。 X射线检测及标本制作：将两组实验动物分别在建模

后1，2，4，6周行X射线检测，每个时间点取4只，进行X射线评分[6]

。将检测后实验兔行体积分数2%戊巴比妥钠溶液1 mL/kg进行耳缘静脉全身麻醉后，以骨折断端为中心取长2.0~3.0 cm的骨组织标本。

免疫组织化学检测：将标本置入配置好的多聚甲醛溶

液中固定24 h，利用0.2 mol/L EDTA脱钙，经过乙醇脱水、石蜡包埋等步骤后，纵行组织切片，每组取2张切片进行苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色。 免疫组织化学染色步骤按试剂盒操作说明进行，滴

加工作浓度(1∶100)Ⅰ型胶原抗体(兔源性)，放入4 ℃恒温箱中孵育过夜后PBS洗涤3次，3 min/次。滴加第二抗体(羊抗小鼠IgG)，室温下放置30 min后用PBS液洗涤3次，3 min/次。滴加试剂SP，室温下孵育30 min后用PBS洗4次，5 min/次，显色染色。

Ⅰ型胶原表达结果判定：细胞浆或间质出现棕色或棕

黄色染色者为阳性反应，每个标本做6张免疫组化切片，每张切片随机选取3个不重叠视野(10×40倍)，经计算机系统进行图像采集，然后应用Image-Pro Plus 6.0(美国Media Cybernetics 公司)软件处理系统对图像进行定量分析图像分析系统对阳性染色进行半定量测定，记录

Ⅰ型胶原阳性表达的积分吸光度(A)，A=平均吸光度×阳性面积(相对值)，把所得数据取平均值，即得每个标本的测定值。 主要观察指标：各组成骨细胞及骨痂中软骨岛形

态，Ⅰ型胶原的含量。 统计学分析：计量资料用x

_

±s表示，采用SPSS 17.0

统计学软件进行数据处理，同一指标的组间及组内的两

两比较采用单因素方差分析。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 32只兔均进入结果分析，无脱落。 2.2 各组骨痂大体形态 局部伤口的观察结果显示：建模后1只(对照组)出现感染，感染率为3%，3只(对照组2只和PRP组1只)伤口局部出现轻度的红肿，应用抗生素和伤口换药处理后愈合良好，其余未发现伤口局

部异常情况。 PRP组和对照组骨折标本在建模后2，4，6周时，

均有不同程度骨痂形成，以第6周骨痂为最多。在第1，2周兔骨折部位以纤维连接为主，PRP组的纤维连接明显的强于对照组，两组骨折线清晰，无明显的骨痂生

成。建模后4周，两组骨折线模糊，仅少量骨折部位骨折线清晰，骨折部位存在不等量的骨痂，PRP组多于对照组。建模后第6周，骨折部位被大量骨痂包绕，PRP组出现了骨的重塑和改建。 2.3 苏木精-伊红染色结果

建模后第1周：两组骨折部位骨架出现的肉芽组织增

生，肉芽组织向原始骨痂转化，骨折端发现软骨下成骨

和骨膜下成骨，在第2周PRP组较明显。 建模后第4周：两组均出现了新生编织骨，以PRP组

为明显，对照组部分出现少量编织骨，并且这些骨痂中

单个视野内的骨岛的数量相比于第2周明显增加，PRP组高于对照组，见图1。

建模后第6周：PRP组部分出现板层骨，部分出现了不等量的编织骨向板层骨转化，对照组仍以编织骨为

主，未出现板层骨。 2.4 X射线检测结果 建模后第1周两组均无明显的骨痂形成，两骨折断面清晰。在建模后2，4，6周连续检测发现骨折断端逐渐模糊，骨痂影逐渐的增大，骨

Figure 1 Hematoxylin-eosin staining in two groups at 4 wk after modeling (×400)

图 1 建模后 4周两组苏木精-伊红染色结果(×400)

a: PRP group b: Control group

Type I protein expression was stronger in PRP group; PRP: platelet-rich plasma

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折部位出现了硬性骨痂，PRP组的变化尤为明显。PRP组X射线评分明显高于对照组(P < 0.05)。建模后第6周，PRP组部分出现骨折部位愈合改建和重塑，髓腔再通。对照组骨折部位出现大量骨痂，未发现骨折部

位重塑和髓腔再通。见表1，图2。

3 讨论

3.1 PRP的制备 实验采用Landsberg[4]

方法制备，这种

制备方法简便、易于操作，要求在尽可能无菌条件下完

成。在制备的过程中尽可能减少不必要操作。制备血小

板浓度明显增加，是正常全血中血小板浓度的2.5~3.0倍，血小板浓度平均为(1 171.00± 249.83)×109

，白细胞的浓

度为(18.27±5.61)×109，很多实验显示这个倍数血小板浓

度对骨折和局部伤口愈合作用强大[7]。

3.2 有关本实验的动物骨折模型 这种骨折模型是以接近临床应用条件为目的。取兔前肢桡骨中下1/3处，造开放性桡骨骨折模型，这种骨折模型操作难度相对较大，

但优势是易于在直视下将PRP植入骨折部位并可以观察植入情况。骨折模型建立后行石膏外固定，这在解剖基

础上能够加强骨折部位稳定性。 3.3 Ⅰ型胶原 Ⅰ型胶原是含量最丰富的胶原，广泛分布除透明软骨以外所有结缔组织中。在骨组织、皮肤、

肌腱、巩膜、眼角膜和血管等组织中，Ⅰ型胶原是一个

重要的基质蛋白。在骨组织中，Ⅰ型胶原大约占骨胶原

总量95%，约占总蛋白含量80%[8]。其他类型胶原，例如

Ⅲ和Ⅴ型胶原在骨组织中水平很低，它们主要是调节纤

维直径大小[9]。不像其他组织，骨基质具有很强钙化能力。

羟基磷灰石结晶被发现在胶原表面和胶原的内部或胶原

与胶原之间，而这些胶原纤维都是同一方向的纤维并且

具有同一极性。 Ⅰ型胶原是骨形成过程中最基本骨基质蛋白，在组织中它形成了细胞迁移和附着的支架并且通过调节化学

和机械刺激流量而调节细胞分化和形态发生[10]。在骨结

构重塑过程中，再生细胞迁移发生在胶原基质上，并且

通过细胞骨架和基质合成与降解以及后续的组织改建重

塑基质[11]。Ⅰ型胶原表达在早期被发现，但在骨形成最

初阶段并没有十分特异性指标。实验结果显示，骨折愈

合过程中，特别是在早期阶段Ⅰ型胶原量增加，PRP组高于对照组；建模后第4周时两组骨痂中的胶原含量均达到高峰，但PRP组中的胶原含量要明显高于对照组。在建模后第6周时，两组胶原含量均出现减少，但是PRP组减低不明显。自体PRP可以明显增加骨痂中的胶原含量，促进骨折愈合，这可能与制备的PRP中纤维蛋白包裹大量细胞因子及PRP中大量高浓度白细胞具有相关性。 3.4 成骨细胞 有研究在对成骨细胞的培养中发现，为了明确加入PRP释放细胞因子的作用，于培养液中加入了抗PDGF抗体和抗TGF-β抗体，结果加入抗体的PRP 组成骨细胞的增殖明显受到抑制，而未加入抗体组成骨

细胞则增殖明显，这说明PRP 具有明显的促进成骨细胞增殖作用

[12]。本次实验结果发现两组骨痂中成骨细胞数

量相比于正常骨则明显增加，这可能于局部骨再生和重

塑具有相关性，对照组相比PRP组中骨痂软骨岛密度和数量相对增加，这说明PRP对成骨细胞具有明显刺激作用，这于骨痂部位骨岛数量的多少具有明显相关性。 3.5 PRP中纤维蛋白的作用 由于PRP中含有大量的纤维蛋白原，加入凝血酶和氯化钙后被激活形成纤维蛋

白并聚合成网状，并且在制备的过程中由于离心力的作

用，PRP中的纤维蛋白原相对浓度增加。纤维蛋白和纤维蛋白原的降解产物刺激中性粒细胞迁移；增加细胞膜

表达CD11c/CD18受体，这些受体使中性粒细胞黏附到内皮细胞和纤维蛋白原表面。纤维蛋白原的降解产物可以

调控中性粒细胞的嗜菌作用和酶的降解过程。纤维蛋白

化学和物理特性及纤维蛋白网孔中包裹了大量的化学性

单核细胞驱动剂控制着单核细胞在伤口聚集[13]。富含血

小板中的大量的纤维蛋白可以增加伤口覆盖范围，作为

内皮细胞等细胞临时基质促进成纤维细胞增殖分化及细

胞向伤口内部迁移及伤口局部的胶原蛋白合成[14]。

3.6 PRP应用前景和展望 本实验结果显示：PRP明显的促进骨折的愈合，这显示PRP作为自体生物材料优势。首先，取材特别广泛，价格低廉；其次，具有很强安全

Figure 2 X-ray score of fracture healing 图 2 建模后 6周两组骨折部位 X射线检测结果

表 1 骨折愈合大鼠 X射线评分变化 Table 1 X-ray score of fracture healing (x

_

±s, n=4, scores)

Time (wk) PRP group Control group t

1 2 4 6

1.00±0.81 1.50±0.57 3.50±0.57 4.00±0.81

0.50±0.57a 0.75±0.50a 2.00±0.81a 3.00±0.81a

1.0 1.5 3.0 2.4

aP < 0.05, vs. PRP group; PRP: platelet-rich plasma

a: PRP group (fracture site reconstruction and pulp cavity recanalization)

b: Control group (massive callus in fracture site)

PRP: Platelet-rich plasma

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CRTER杂志对“引言、设计、材料/对象”写作的规范要求：中文部

性，能够减少植入材料引起的一系列并发症如疾病传播

和免疫反应等；另外，其制备过程简单、易于操作。这

些独特优势决定了PRP应用前景，但由于当前备PRP制备方法不同而导致了不同结果，这就对PRP作用产生很大争议，限制了PRP应用前景。很多专家学者仅对单一细胞因子或2种细胞因子对骨折愈合或软组织愈合作用影响进行研究，但少量但种类众多细胞因子对骨折局部

共同作用机制仍不清楚，目前需要进一步完善PRP中细胞因子种类检测及相关作用以及对骨折愈合过程作用(协同效应或抑制效应)。需进一步明确PRP应用于临床后，在骨折局部持续具体时间，以及局部产生反应及如何反

应等。伴随着上述一系列问题解决，PRP将进一步应用于临床并取得良好效果。

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[15] The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals. 2006-09-30.

引言：引言中需要提供研究背景，也就是

研究的本质及其意义。简单回顾一下相关文献。

在以往研究的基础上，阐明本研究的创新性，

陈述本研究目的或提出假设。无论是主要和次

要目的均应阐明，设定的亚组分析应加以说明。

只给出与研究直接相关的引文，不涉及研究中

的数据及得出的结论。

设计：用研究对象、研究时限、研究指标、

研究目的、研究形式的具体用语表示。对临床

研究、基础研究、调查研究稿件采用不同的组

合形式，以求最大限度说明科研设计思路。

研究对象的选择与描述：明确说明观察或

实验对象(包括干预组和对照组的患者的选择，

包括纳入标准，排除标准，和研究对象的来源。

纳入对象的年龄，性别等变量和研究目的关联

不总是十分明确，因此若涉及研究对象的年龄

和性别时，应给予说明，如为什么只选择某年

龄段的研究对象，或为什么排除女性参与。总

的原则就是要阐明如何以及为什么要用这样的

方法来开展此研究。当作者使用如种族或民族

等变量时，应说明测评的方法，并证明这些变

量间的相关性。

材料描述：①动物：应体现实验动物种属、

性别、只数、级别（普通级、清洁级、SPF级）、

动物饲养环境光照、温度、湿度。实验过程是

否符合相关动物伦理学要求。②仪器、试剂、

设备、药物、产品等：要有名称、量，厂家，

产地及材料的性能参数。实验重点用到的“药

品、试剂、仪器”以表格形式排版体现，其他实

验材料可在方法中用到时用“（）”体现生产厂家、

厂家所在地、批号等。③涉及质粒来源，仅描

述由×××惠赠是不够的，应引用文献说明该质粒

曾经在哪个实验中应用过，以说明本次实验应

用该质粒的合理性。另外，如果是“XX质粒由

XX大学的XX教授惠赠”这里的“XX教授”应移至

“致谢”中体现。④涉及中药文章，在此处应给出

中药来源和制剂类型。如是中药组方应明确各

个单味药的比例含量及制备过程，如是单味中

药应给出其主要成分的化学结构式。

来自本文课题的更多信息--

作者贡献：文章全部作者均参与了实验的设计，实施，

和评估，均受过正规培训。

利益冲突：本课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经

济组织直接或间接的经济赞助。

伦理批准：实验对动物的处理方法符合中华人民共和国

科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》[15]。

文章创新性：文章探讨了富含血小板血浆对骨折愈合的

作用机制：①富含血小板血浆中的细胞因子促进成骨细胞的增

殖与分化，促进骨折愈合。②细胞因子与纤维蛋白能够促进骨

折部位的血管的形成，从而间接的促进骨折愈合。③促进骨折

部位的胶原合成而促进骨折愈合。总之，富含血小板血浆，通

过促进成骨细胞作用，增加骨折部位胶原量而促进骨折愈合。

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