Roberta  Petrauskaitė  

Invazinė  aspergiliozė  (IA)  išlieka  pagrindinė  mirtingumo  priežastis  imunosupresuotiems  pacientams  iš  dalies  dėl  šios  infekcijos  diagnostikos  sunkumų.  

¡  Metodika  ¡  Atmetimo  kriterijai  ¡  Lakiųjų  organinių  komponentų  profiliai    ¡  Technika  ¡  Pacientų  charakteristika  ¡  Invazinės  grybelinės  infekcijos  klasifikacija  ¡  Rezultatai    

§  Aspergillus  metabolito  žymuo  pagal  etaloną  ir  testo    parametrai  §  A.  fumigatus  priešgrybelinio  gydymo  efektyvumo  įvertinimas  §  Galaktomanano  įvertinimas  

¡  Išvada  ¡  Papildoma  informacija  ¡  Trūkumai  ¡  Papildomi  tyrimai  

 

¡  Naudojama šiluminė desorbcija - dujų chromatografija/masių spektrometrija

¡  Būdingas in vitro Aspergillus fumigatus lakių metabolitų profilis §  dažniausia IA priežastis. §  sintezuoja apie 226 antrinių metabolitų produktus

¡  Prospektyviai surinkti iškvėpto oro mėginiai §  pacientams, kuriems įtariama invazinė grybelinė

pneumonija §  2011 m. – 2013 m. §  tiesioginis grybelinių lakiųjų metabolitų aptikimas šiuose

iškvėpto oro mėginiuose. ▪  patogeninių Aspergillus rūšių.

 Europos  organizacijos  mokslinių  tyrimų  ir  gydymo  nuo  vėžio/mikozėmis  tyrimo  grupės  bendro  sutarimo  apibrėžimai  

¡  Techniškai  negalima  iškvėpti  oro    ¡  Taikoma  mechaninė  ventiliacija  

Retensijos laikas (min)

Abs

oliu

tus j

onų

skaiči

us (T

IC)

(x10

0 00

0)

Aspergilus rūšims būdingi skirtingi lakūs organinių komponentų profiliai q  Konkretus tarprūšinis heterogeniškumas

monoterpeno ir seskviterpeno metabolitų. q  Identifikuoti pikai:

1.  α-pinenas 2.  β-pinenas 3.  kamfenas 4.  limonenas 5.  α-trans-bergamotenas 6.  β-trans-bergamotenas 7.  eliksenas 8.  santalenas 9.  elemenas 10.  akoradienas 11.  1,5,9-trimetil-1,5,9-ciklododekatrienas 12.  chamigrenas 13.  β-seskvifelandrenas

 

!

!Retensijos laikas (min)

•  104  A.  flavus  ir  A.  niger  identifikuotos  po  96  valandų  peptonų  dekstrozės    terpėje.  

   •  Dujų  chromatografija-­‐

masių  spektrometrija    •  Nenustatyta  

seskviterpeno  metabolitų.      

•  Šios  rūšys  produkuoja  gausiai  alkocholius  ir  ketonus  

•  Iš  lakiųjų  antrinių  metabolitų  tik  limoneną  

¡  Programuojamas  kvėpavimo  mėginių  kolektorius  (Gruppo  Loccioni,  Ancona,  Italy)    

¡  Realiu  laiku  buvo  matuojama    anglies  dioksidas  ir  burnos  slėgis    §  Įvertinti  kiekvieno  paciento  kvėpavimo  modelio  produktyvumą  

¡  Lakių  organinių  komponentų  adsorbcija  atlikta    §  naudojant  oro  ėminių  kalibruojamą  900  ml/min  pompą  §  4  minučių  periodu  §  naudoti  2  lygiagretūs  terminės  desorbcijos  vamzdeliai,  pagaminti  pagal    

vienodas  specifikacijas  ¡  Buvo  įtraukti  ambulatoriniai  ir  hospitalizuoti  pacientai    ¡  Pildyta  anketa    

§  Paskutinio  valgymo  laikas,  patiekalai    §  Tabako  vartojimas    §  Vartojami  medikamentai    

¡  Kartu  rinkti  aplinkos  oro  kontrolės  mėginiai  §  naudojant  identiškus  oro  mėginių  ėmimo  ir  terminės  desorbcijos  parametrus  §  įvertinti  aplinkos  lakias  medžiagas    

Klinikinės  charakteristikos   IA  (n=34)   Kitos  pneumonijos  (n=30)      

p  vertė  

Amžius, m., mediana (IQR; intervalas) 55 (47-62;22-79) 54 (44-63; 28-87) 0.92

Moteriška lytis 17 (50) 8 (27) 0.07

Hematologiniai piktybiniai susirgimai 29 (85) 24 (80) 0.74

Alogeninė kaulų čiulpų transplantacija 18 (53) 7 (27) 0.02

Solidinių organų transplantacija 3 (9) 5 (17) 0.46

Neutropenija 13 (38) 15 (50) 0.45

T ląstelių imunosupresantai 29 (85) 26 (87) 0.58

Ilgalaikis kortikosteroidų poveikis 7 (21) 5 (17) 0.45

Skirti priešgrybeliniai vaistai aktyvūs prieš pelėsinius grybus, kvėpavimo mėginių atlikimo dieną

25 (74) 26 (87) 0.23

Priešgrybelinių vaistų aktyvių prieš pelėsinius grybus trukmė prieš kvėpavimo mėginį (IQR; intervalas)

2 (2-11; 1-205) 2 (1-13; 1-345) 0.52

Duomenys pateikiami kaip Nr. (%), jei nenurodyta kitaip. Interkvartilinis intervalas (IQR). Neutropenija: <500/µL > 10 dienų. T ląstelių imunosupresantai: ciklosporinas, TNF-% blokeriai; specifiniai imunomuduliuojantys antikūnai, nukleozidų analogai pirmas 90 dienų. Ilgalaikis kortikosteroidų poveikis: vidutiniška minimali dozė ekvivalenčiai 0,3 mg/kg/dienai prednizono > 3 savaites. Konkretūs priešgrybeliniai preparatai: vorikonazolis (n = 17), mikafunginas (n = 15), ir liposominis amfotericinas B (n = 11), terbinafinas (n = 1), isavukonazolis (n = 1), vorikonazolis ir mikafunginas (n = 2), vorikonazolis ir terbinafinas (n = 2), pozakonazolis ir liposominis amfotericinas B (n = 1), flukonazolis (n = 1) pacientams, įtariant kriptokokinę pneumoniją. Daugumai pacientų buvo skirta priešgrybeliniai preparatai empiriškai arba profilaktiškai veikiantys prieš pelėsinius grybelius vidutiniškai prieš 2 dienas prieš mėginius.

sesquiterpene production, whereas nitrogen starvation and al-kaline stress enhanced !-trans-bergamotene production (Sup-plementary Figure 2).

Exposure of A. fumigatus hyphae to antifungal drugs modu-lated VOC production, particularly sesquiterpenes: !-trans-bergamotene increased 10-fold from baseline with 12 hours ofmicafungin exposure and 3-fold with 12 hours of amphotericinexposure, followed by near-complete attenuation of all volatilemetabolites 36 hours later. In vitro voriconazole exposure, incontrast, reduced primary metabolite, monoterpene, and ses-quiterpene production at 12 hours, with attenuation of all vola-tile metabolites 36 hours later (Supplementary Figure 3).

Distinct VOC Pro!les in Other AspergilliEach Aspergillus species we assessed had a distinct VOC pro!le,consistent within biological replicates of each species anddistinct between species, with particular interspecies heteroge-neity in monoterpene and sesquiterpene metabolites (Figure 1).Aspergillus terreus had a particularly rich and abundant sesqui-terpene secondary metabolite pro!le, and A. calidoustus consis-tently produced !-sesquiphellandrene. Under these cultureconditions, A. !avus and A. niger produced alcohols and ke-tones in abundance, but no volatile secondary metabolitesother than limonene (Supplementary Figure 4). Beyond limo-nene, there was no terpene overlap between A. fumigatus andany of the other Aspergillus species assessed.

Table 1. Patient Characteristics

Clinical VariableInvasive Aspergillosis

(n = 34)Other Pneumonia

(n = 30) P Value

Age, y, median (IQR; range) 55 (47–62; 22–79) 54 (44–63; 28–87) .92Female sex 17 (50) 8 (27) .07Hematologic malignancy 29 (85) 24 (80) .74Allogeneic hematopoietic stem-cell transplant 18 (53) 7 (27) .02Solid organ transplant 3 (9) 5 (17) .46Recent neutropeniaa 13 (38) 15 (50) .45T-cell immunosuppressantsb 29 (85) 26 (87) .58Prolonged corticosteroid exposurec 7 (21) 5 (17) .45Exposure to mold-active antifungal therapy on date of breathsamplingd

25 (74) 26 (87) .23

Duration of mold-active antifungal exposure prior to breath sampling, d,median (IQR;range)

2 (2–11; 1–205) 2 (1–13; 1–345) .52

Data are presented as No. (%) unless otherwise specified.Abbreviation: IQR, interquartile range.a Less than 500 neutrophils/µL for >10 days [28].b Treatment with recognized T-cell immunosuppressants, such as cyclosporine, tumor necrosis factor–" blockers, specific immunomodulating antibodies, ornucleoside analogues during the prior 90 days [28].c Exposure to corticosteroids at a mean minimum dose of 0.3 mg/kg/day of prednisone equivalent for >3 weeks [28].d Specific antifungal agents included voriconazole (n = 17), micafungin (n = 15), liposomal amphotericin B (n = 11), terbinafine (n = 1), isavuconazole (n = 1),voriconazole and micafungin (n = 2), voriconazole and terbinafine (n = 2), posaconazole and liposomal amphotericin B (n = 1), and fluconazole (n = 1) in a patientwith suspected cryptococcal pneumonia.

Table 2. Invasive Fungal Disease Classi!cation

Invasive aspergillosis (n = 34)5 proven invasive aspergillosisa

29 probable invasive aspergillosisb

• 18 serum galactomannan index !0.5• 4 Aspergillus species in respiratory tract culturesc

• 4 serum galactomannan index !0.5 and Aspergillus speciesin respiratory tract culturesd

• 3 bronchoalveolar lavage fluid galactomannan index !1.0Other pneumonia (n = 30)8 proven invasive fungal disease• 4 Mucorales• 1 Cryptococcus neoformans• 1 Fusarium proliferatum• 1 Pseudallescheria boydii• 1 unidentified invasive dematiaceous mold on lung biopsy

2 probable invasive fungal disease• 1 Paecilomyces variotii• 1 Histoplasma capsulatum

20 possible invasive fungal diseasee

a Aspergillus fumigatuswas identified as the cause of pneumonia in all patientswith proven invasive aspergillosis.b One patient had concurrent probable invasive aspergillosis and Pneumocystisjirovecii pneumonia.c Four A. fumigatus.d Three A. fumigatus, 1 Aspergillus niger.e Streptococcus pneumoniae pneumonia (n = 1), Stenotrophomonas maltophiliapneumonia (n = 1), methicillin-resistant Staphylococcus aureus septic pulmonaryemboli (n = 1), coagulase-negative Staphylococcus septic pulmonary emboli(n = 1), and Enterococcus faecalis septic pulmonary emboli (n = 1). Thespecific underlying cause of pneumonia in the remaining 15 patients was notidentified.

4 • CID • Koo et al

at Vilnius U

niversity on Novem

ber 10, 2014http://cid.oxfordjournals.org/

Dow

nloaded from

Lakūs organiniai komponentai

Pacientai su IA

Pacientai be IA

Santykinis kiekis

classi!ed as having possible IFD during his lifetime, with pul-monary nodules but unrevealing respiratory tract cultures andnegative fungal antigen testing. On autopsy, however, these pul-monary nodules contained invasive septate hyphae, identi!edas Aspergillus by immunohistochemical staining by the CDCInfectious Diseases Pathology Branch.

We found no association between contents of the meal priorto breath sampling, tobacco use, or concurrently administeredinhaled, oral, or topical medications and detection of these sec-ondary metabolites.

Although we did not discern a clear association between rel-ative abundance of Aspergillus breath metabolites and the sizeor number of lung lesions on chest imaging, the smallest IA le-sion detected through breath metabolite analysis was 0.88 cm3.

DISCUSSION

We identi!ed distinctive terpene secondary metabolites in thevolatile metabolome of the most common pathogenic Aspergil-lus species in vitro, and found that !-trans-bergamotene,"-trans-bergamotene, a !-vatirenene–like sesquiterpene, andtrans-geranylacetone comprise an Aspergillus metabolic signa-ture that can accurately discriminate patients with IA frompatients with other pneumonia, in a heterogeneous populationat risk for IA. Our results suggest that direct detection of exog-enous fungal metabolites in breath can be used as a novel,

noninvasive, species-speci!c approach to identify patientswith IA, potentially allowing more precise targeting of antifun-gal therapy and fewer invasive diagnostic procedures.

Although microbial VOC detection in the breath has beensuggested for the diagnosis of pneumonia, including IA [31],these studies have proposed biomarkers that are either primarymetabolites or catabolic products ubiquitous in many species orcompounds that lack biologically plausible synthetic pathways[32]. For example, 2-pentylfuran, a linoleic acid breakdownproduct, was proposed as an IA breath biomarker [23, 33] buthas since been shown to be widely present in food productsand ambient air [33], and not detected in other series [34] orin any breath samples in our study. Other studies have takenhypothesis-free feature classi!cation approaches without iden-tifying the biologic components distinguishing infected andnoninfected patients, increasing the risk of identifying signalin noise and limited reproducibility [31, 35].

In contrast, we took a biologically guided approach to bio-marker identi!cation. We identi!ed terpenes released duringA. fumigatus growth and modulated these metabolites with var-ious stress conditions and antifungal exposures, suggesting a bi-ologic relationship between the metabolically active organismand production of these compounds. Knowledge of theseunique metabolites informed identi!cation of these fungal me-tabolites and closely related sesquiterpenes in breath.

Others have previously described sesquiterpenes in the in vitrovolatome of A. fumigatus [20, 34, 36], and one group identi!ed asesquiterpene in the breath of 8 IA patients [34], although thedominant metabolite, !-trans-bergamotene, was misidenti!edas !-farnesene in these studies, given the similarity in fragmenta-tion patterns and the absence of !-trans-bergamotene from theNIST library. In our study, and in an independent assessmentof the in vitro A. fumigatus volatome [37], the NIST library ini-tially identi!ed !-trans-bergamotene as !-farnesene, but we ob-served perfect retention time and spectral alignment between thisendogenous sesquiterpene and !-trans-bergamotene. !-trans-bergamotene is putatively a precursor of fumagillin, a secondarymeroterpenoid with antibiotic and anti-angiogenic properties[17, 38, 39].

The biologic signi!cance of these sesquiterpenes, whether asend products or as precursors to other secondary metabolites,and their role in fungal pathogenesis are yet unde!ned. Whilenot required for primary growth of the organism, a substantialdiversion of resources from primary metabolism is required tosynthesize these metabolites, and many fungi have evolvedunique terpene cyclases with distinctive suites of sesquiterpeneproducts of great structural and stereochemical diversity [15, 16,40]. These products are believed to have roles in inter- and in-traspecies communication, deterring competing microorgan-isms in the environment and potentially contributing tosurvival of the organism in its hosts [15, 18, 19].

Table 3. Breath Aspergillus Metabolite Signature by the ReferenceStandard and Test Parameters

ParameterInvasive

AspergillosisaOther

PneumoniaTotal

Patients

Aspergillus metabolitesignatureb +

32 2 34

Aspergillus metabolitesignature !

2c 28 30

Total patients 34 30 64Test parametersSensitivity (95% CI) 0.94 (.81–.98)Specificity (95% CI) 0.93 (.79–.98)Positive likelihoodratio (95% CI)

14.1 (3.69–54.0)

Negative likelihoodratio (95% CI)

0.063 (.02–.24)

Abbreviation: CI, confidence interval.a Proven or probable invasive aspergillosis, according to the revised EuropeanOrganization for Research and Treatment of Cancer/Mycoses Study Groupconsensus criteria [28].b Defined as the presence of any of the 4 elements of a metabolite volatilesignature, comprised of !-trans-bergamotene, "-trans-bergamotene, trans-geranylacetone, and a !-vatirenene-like sesquiterpene, in the patient’s breath.c Aspergillus nigerwas identified as the etiology of invasive aspergillosis in 1 ofthese 2 patients.

6 • CID • Koo et al

at Vilnius U

niversity on Novem

ber 10, 2014http://cid.oxfordjournals.org/

Dow

nloaded from

β-­‐trans-­‐bergamotenas,  %-­‐trans-­‐bergamotenas,  β-­‐vatirenenas  -­‐  kaip  seskviterpenas  ir  trans-­‐geranilacetonas  sudaro  Aspergillus  apykaitos  žymenį  .      Pagal  kurį  galima  tiksliai  atskirti  pacientus,  kuriems  yra  IA  nuo  pacientų,  sergančių  kitos  kilmės  pneumonija.  

Galaktomanano imunofermentinis indeksas

Mėginio diena

Tirta 12 val po skirto gydymo. 6. β-trans-bergamotenas

                 

TIC x1e5

TIC x1e5

RT (min)

RT (min)

TIC x1e5

TIC x1e5

RT (min)

RT (min)

6

6

6

6

Gydymas  neskiriamas  

Liposominis  amfotericinas  

Mikafunginas   Vorikonazolis  

¡  Atsiradus  galaktomanano  įvertinimui  patvirtintos  IA  atvejų  ir  Aspergillus  rūšių  identifikavimas  retėja.    

¡  Kvėpavimo  metabolitų  žymuo  leido  identifikuoti  visus  IA  atvejus,  kai  galaktomananai  buvo  teigiami,  tikėtinos  IA  atvejai  

¡  A.  fumigatus  nustatytas  sukėlėjas.    ¡  Aspergillus  flavus,  A.  terreus  arba  A.  calidoustus  nebuvo  identifikuoti  kaip  sukėlėjai  IA  atvejais  tyrimo  laikotarpiu.  

¡  Pacientas,  kurio  iškvėptame  ore  identifikuota  β-­‐trans-­‐bergamotenas  ir    trans-­‐  geranilacetonas    

¡  Diagnozuota  galima  invazinė  grybelinė  infekcija  §  židiniai  plaučiuose  §  kvėpavimo  takų  pasėliai  neigiami  §  grybelio  antigeno  testas  neigiamas    

¡  Atlikus  autopsiją:  plaučių  židiniuose  identifikuota  invaziniai  septuoti  hifai  

¡  Imunohistochemiškai  identifikuota:  Aspergillus  

 

¡  Egzogeninių  grybelių  lakių  metabolitų  matavimas  iškvėptame  ore  –  neinvazinis,  rūšiai  specifiškas,  leidžiantis  diagnozuoti  IA  §  Tikslingas  priešgrybelinis  gydymas    § Mažiau  invazinių  tyrimų    

¡ Mažiausias  IA  pažeidimas  0,88  cm3  atliekant  kvėpavimo  metabolitų  analizę.    

¡  Nenustatyta  asociacijų  su  kvėpavimo  mėginių  rezultatais  §  Paskutinio  valgymo  laikas,  patiekalai    §  Tabako  vartojimas    §  Vartojami  medikamentai    

¡  Šiam  tyrimui  reikalingas  papildomas  patvirtinimas  ir  tobulinimas  prieš  pradedant  naudoti  klinikinėje  praktikoje.  

¡ Mėginiai  nebuvo  sistemiškai  rinkti  skiriant  priešgrybelinį  gydymą  §  Išskyrus  kelis  pacientus,  kuriems  buvo  kartoti  mėginiai  

¡  Identifikuoti  kitų  retesnių  Aspergillus  ir  Mucorales  rūšių,  kurios  kliniškai  reikšmingos  išskiriamus  specifinius  antrinius  lakius  organinius  metabolitus.