rna interference in biology and disease carol a. sledz and bryan r. g. williams apresentação:...
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RNA interference in biology and disease
Carol A. Sledz and Bryan R. G. Williams
Apresentação: Francisco André Marques de Oliveira Cariri
Mariana Marques de Sá Coutelo Chagas
Blood, 1º de Agosto de 2005/ volume 106, nº3
Introdução RNA interference (RNAi): Processo pós-transcricional
RNA fita-dupla (dsRNAs)
Silenciamento do gene específico(Degradação do mRNA)
Processo que ocorre naturalmente em diversos organismos
1. Proteger os organismos contra vírus
2. Eliminar produtos de degradação anômalos
Funções:
1928 - Descrito primeiramente em plantas. Planta Tabaco infectada com vírus – Níveis altos de resistência. (Wingard SA, 1928)
1998 - Primeiro trabalho utilizando a técnica de RNAi:
Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.
(Fire A. and Cols., 1998)
Antisense
dsRNA
Introdução
Hibridização do RNA marcado com o mRNA
Micrografia de contraste
2001 – Análises em Drosophilas (RNAi em 2 etapas)
Descoberta da clivagem do mRNA em Drosophila. (Zamore and cols., 2001)
Descoberta da clivagem do dsRNA em Drosophila.Fragmentos de 21 a 23 nt
(siRNAs)
Processo de RNAi provocado experimentalmente – (siRNAs sintéticos)
Síntese química e transcrição in vitro
Kits produzidos por empresas
Introdução
RNAi realizado com plasmídeos – expressão de siRNAs
Grampos de siRNAs (shRNAs) sob o controle de uma RNA pol III
Introdução
Inicia a síntese a uma distância conhecida dos promotoresTermina quando encontra cadeia de 4 a 5 uridinas.
Outros dois tipos de silenciamento de genes:
1. Silenciamento do mRNA por micro RNAs endógenos (miRNAs)
Formação de uma grampo de RNA fita dupla
2. Silenciamento por modificação do empacotamento do DNA celular e Histonas que levando ao silenciamento transcricional da heterocromatina.
Introdução
Degradação de mRNAs anômalos ou produzidos indevidamente
Passo inicial: adição de dsRNA que é reduzido a partes menores conhecidas como siRNA. Estes por sua vez se ligam a complexos enzimáticos endoribonucleases RISC.
Passo efetor: siRNA se conjugam ao RISC e são guiados ao mRNA, onde ocorrem as clivagens
Mecanismo de Ação
Mecanismo de Ação
Enzimas:– DICER– RISC
Eficiente em baixo número de cópias Eficiente em baixo número de cópias e altamente específicoe altamente específico
Manutenção e persistênciaManutenção e persistência
Efeito rápido e eficazEfeito rápido e eficaz
Características da técnica
Experimentos genômicos
Cientistas estão utilizando esta tecnologia para desativar genes humanos ou de agentes transmissores de doenças.
Já foram desenvolvidos instruções para silenciar, de maneira rápida e eficiente, 15.000 genes humanos.
HIV
Silenciamento de células com HIV está sendo feito “in vitro”
Bloqueio da invasão
e replicação do vírus
Câncer Pesquisadores
têm silenciado mais de uma dúzia de genes
Pesquisadores estão trabalhando para decifrar 15.000 genes em uma variedade de Câncer
Hepatite C
Experimentos em ratos obteve sucesso
Produção de vetores virais para tratamento de células humanas
Doença de Huntington
RNAi pode silenciar genes problemáticos
O tratamento também têm silenciado genes saudáveis
Infecções respiratórias Criação de drogas
inalatórias que poderão servir para o tratamento de SARS e influenza.
RNA são inalados e atingem seus alvos intactos e controlam vírus.
Aplicações do RNAi
Aplicações do RNAi
Contruir uma seqüência efetiva de siRNAs que possa ser
reconhecida e amplificada pelas polimerases.
(Limitação vem sendo diminuída)
Limitações da RNAi
Eficácia do RNAi depende:
Estrutura do siRNA
Receptividade do tipo celular
Meia vida do mRNA e/ou proteína
Aumento cada vez maior da estabilidade (“in vivo”)
Avanços estão sendo realizados para fazer os siRNAs
adequados para propostas terapêuticas.
Efeitos não específicos e fora do alvo da RNAi
1. Mecanismo eficiente do siRNA “ in vivo ”.
2. Evitar efeitos não específicos ou fora do alvo do siRNAs.
siRNAs ativando uma resposta celular alternativa, regulando genes associados com a resposta imune.
Alteração da expressão de outros genes em resposta a presença do siRNA.
Interferon – citocinas da primeira linha de defesa contra infecções virais em mamíferos, que induz a ativação transcricional de genes.
Ativação da resposta imune inata é ativada pelos dsRNAs
Produto dos genes ativados – atividade antiviral e antiproliferativa.
2 considerações importantes:
Conclusões
Estratégias para aumentar o nível de eficiência da RNAi e minimizar os efeitos não específicos ou fora do alvo:
1. Utilizar informações disponíveis para sintetizar siRNAs mais específicos e que possam ser usados numa concentração cada vez menor, mas mantendo a sua eficácia.
2. Utilizar os siRNAs contra as sequências alvo sem que eles causem efeitos não específicos;
3. Resgatar fenótipos causados pela expressão de um siRNA ectópico de um gene que não poderia ser silenciado pelo siRNA.
Cada vez mais o RNAi vem sendo utilizado em aplicações médicas e científicas, consolidando-se como uma poderosa ferramenta de silenciamento gênico.
OBRIGADO!!!!!