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Brenda Fina

Laboratorio de Biología Ósea y Metabolismo Mineral Facultad Cs. Médicas - UNR - Rosario – Argentina [email protected] www.biologiaosea.com.ar © 2006 - 2009 Todos los derechos reservados

RMN, RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

RMN es una espectroscopia basada en la absorción de radiación electromagnética de la región de la radiofrecuencia

(10MHz-1GHz). El fenómeno de RMN ocurre debido a las propiedades mecanocuánticas de los espines, es decir, a las

propiedades magnéticas de los núcleos atómicos, los cuales cuando se colocan en un campo magnético intenso (B0),

absorben la energía necesaria para que vayan a otro estado energético. Si se aplica energía (E) que obligue a los núcleos a

invertir el sentido de su orientación con respecto al B°, se dice que el sistema está en resonancia. Este fenómeno de

excitación de los espines nucleares se lo conoce como RMN, y la E aplicada, ∆E, corresponde a la radiación

electromagnética de la región de las radiofrecuencias.

Descripción Mecánico Cuántica

• Propiedades magnéticas del núcleo: espín nuclear

Los núcleos atómicos tienen espines que les confieren un momento magnético, es decir, núcleos magnéticamente

activos � I. El espín es intrínseco del núcleo y está determinado por el número desapareado de partículas elementales

(neutrones y protones) que lo forman. El modelo atómico describe al núcleo como un cuerpo esférico con la carga nuclear

uniformemente distribuida alrededor de su superficie.

Np Nn Spin

Par par 0 � Inactivos

Par Impar 1/2 3/2 � Semienteros

Impar Par 1/2 3/2

Impar Impar 1, 2

Un núcleo sin espín, tiene un momento magnético igual a cero porque no tiene carga circulando. Estos núcleos

tienen un valor de espín igual a cero, I=0. Todos los núcleos que poseen un número másico(N) y un número de carga (Z)

par tienen un número de espín igual a cero (ej: 12C y 16 O). Los núcleos que poseen un número impar de neutrones y

protones generalmente tienen un número cuántico de espín entero distinto a cero porque el número total de “nucleons”

(creo que se refiere a los neutrones y protones desapareados) desapareados es par, y cada uno contribuye en ½ al número

cuántico. También están los núcleos que tienen un número par de protones y un número impar de neutrones, o viceversa,

que poseen un número de espín no entero (tienen número fraccionados) porque poseen cantidad de “nucleons”

desapareados impares.

Dentro de este último grupo de núcleos, se encuentran núcleos con importancia biológica como 1H, 13C, 15N, 19F y 31P que tienen número de espín igual a ½, I=1/2. En el modelo, actúan como cuerpos

esféricos con carga uniformemente distribuida en su superficie que giran sobre un eje provocando la

circulación de la carga, y esto genera un campo magnético que da como resultado un momento

magnético nuclear. Que tenga un I=1/2 significa que cualquier carga que se aproxime al núcleo va a

experimentar el mismo campo magnético sin importar la dirección por la cual se acerca. Esto da como

resultado, un momento eléctrico cuadripolar igual a cero (igual que en los núcleos con I=0); este

parámetro describe la forma efectiva que tiene la distribución de la carga del núcleo elíptico.

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Sin embargo, la mayoría de los núcleos magnéticos actúan como cuerpos que

giran sobre un eje con la carga distribuida de forma no esférica, estos son núcleos con

números de espín igual 1 o igual a múltiplos enteros de ½. El modelo, los describe como

elipsoides que giran sobre su eje principal. Estos pueden tener forma de prolato o de

oblato, ambos presentan un campo magnético anisotrópico (diferentes características

según la dirección), es decir, que el trabajo electroestático al traer una carga a una dada

distancia es distinto según la dirección a la cual se aproxime. Por esta razón, tienen momentos eléctricos cuadripolares

distintos a cero, por convención, el prolato tiene un valor mayor a cero (2H y 14N) y el oblato menor a cero (17O, 33S y 35Cl).

• Número Magnético Cuántico

Una propiedad macano-cuántica del espín nuclear es que el valor promedio del vector del momento magnético

sobre una dirección dada toma valores específicos descriptos por un grupo de números cuánticos magnéticos, m=2I+1,

integrado desde +I a –I. (I= valor de spin)

El vector del momento angular del espín, I, tiene magnitud igual a [I(I+1)]1/2

ћ, y su componente en z es m. Tanto la

dirección como la magnitud del vector del momento angular de espín están cuantizados (sólo pueden tomar valores

determinados). En la ausencia de un campo magnético externo, este vector no tiene una dirección preferencial y el eje z

es arbitrario; pero cuando se aplica un campo magnético externo, la dirección de este determina el eje z. El momento

angular de un núcleo con espín ½ dentro de un campo magnético externo, tiene dos direcciones posibles, Iz=+-1/2ћ (m =

2.½+1= 2); mientras que un núcleo con espín igual a 1 tiene tres orientaciones posibles, Iz=0,+-1/2ћ (m = 2.1+1= 3).

• Magnetización Nuclear

Un núcleo cargado que gira sobre un eje crea un campo magnético y el momento magnético (µ) resultante está

orientado sobre el eje del espín y es directamente proporcional al vector del momento angular (I).

µ=γ I

γ es la cte giromagnética. Para un dado B°, determina la diferencia de energía entre los dos estados de espín

El momento magnético de un núcleo es paralelo al momento angular de espín si la cte giromagnética es positiva, y

es antiparalelo si la cte giromagnética es negativa.

En ausencia de un campo externo B0, todas las orientaciones 2I+1 de un núcleo con espín I tienen la misma energía.

Esta situación cambia cuando se aplica un B° externo, donde la energía del momento magnético está dada por,

E= -µ . B0 (producto escalar)

Debido a que el eje z deja de ser arbitrario, y coincide con la dirección z del B°,

E=-µz B0

Por lo mencionado antes, sabemos que:

� Iz=m

� µz=Iz γ

Los núcleos con espín ½ dan lugar a dos posibles estados: m=+1/2, -1/2. La diferencia de energía entre ambos está

dada por,

Energía aplicada

E=µ ћ B0

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Eα= - ½ ћγB° ∆ E= ћγ B0

Eβ= +½ ћγB° ћ = h/2π

γ = es la cte giromagnética, que es característica de c/núcleo

B0 = es el campo magnético externo

h = es la cte de Plank

Según la ley de Plank, la diferencia de E entre los dos estados es: ∆ E= hν, donde ν es la frecuencia de transición,

entonces:

∆ E= hν = γ B0 h/2 π

Si la cte giromagnética es positiva, el estado de menor energía es +1/2; pero si la cte es negativa este es el estado

de mayor energía.

En RMN se trabaja principalmente con núcleos que tienen I=1/2 porque, además de estar presentes en las

moléculas biológicas, son más sencillos debido a que, en presencia de un B° estos espines van a tener sólo dos

orientaciones posibles (a favor y en contra de B°) y por lo tanto dos niveles de E. La situación más favorable, el estado de

menor E (Eα), va a ser a favor del B°; mientras que la situación menos favorable, el estado de mayor E (Eβ), va a ser en

contra del B°.

• Distribución del núcleo entre los distintos estados energéticos

Cuando se aplica un B°, los núcleos tienden a alinearse con el campo adquiriendo el estado energéticamente más

favorable; esta alineación se opone a la agitación térmica de las partículas en general. El porcentaje de núcleos en cada

estado cuántico se puede calcular por la distribución de Boltzmann:

1≈==−

∆−

kT

h

kT

E

eeN

N ν

α

β

Debido a que hν <<kT a la temperatura que se realiza un experimento de RMN, hay solamente un pequeño exceso

de espines en el estado de menor energía, en otras palabras, en las condiciones de experimentación de RMN la diferencia

de energía entre los estados es muy chica, entonces el estado de mayor energía está poblado. Por esta razón, la técnica de

ν= γ B0 /2 π [Hz]

↑ B0 � ↑ sensibilidad

↑ γ � ↑ sensibilidad

Cada núcleo absorbe a una

dada ν

∆ E= γ B0 h/2 π la diferencia de E es muy chica

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RMN no es sensible comparada con otras espectroscopias (la relación señal/ruido en RMN es baja). Para solucionar este

problema se pueden usar campos magnéticos más fuertes y se pueden sumar muchos espectros (sumar scans) de manera

que las señales se van sumando mientras que el ruido aleatorio se va cancelando; además, es preferible usar núcleos con

ctes giromagnéticas altas y que tengan abundancia natural, ej: 1H.

Sustituyendo ν, kT

Bh

eN

Nπ

γ

α

β 2

0−

=

En presencia de un B0, los spines no están orientados totalmente a favor o en contra del campo, sino que están

inclinados un cierto ángulo y están precesando alrededor de la dirección del campo con una velocidad γB0=w0. si el B0 esta

en la dirección z, los spines estarán distribuidos como un abanico. Luego, existe un vector a favor del B0 que va a tener

mayor magnitud porque es mayor la población de spines� Magnetización resultante.

En el equilibrio, un diagrama de energía representando la distribución de Boltzmann para 2n núcleos incluye los

momentos magnéticos individuales distribuidos en dos conos sobre el eje +z y el –z. Dependiendo del signo de la cte

giromagnética uno de los dos ejes va a estar un poco más poblado que el otro dando lugar a una magnetización neta en

esa dirección. Por ejemplo, si γ es positiva, una cantidad mayor de núcleos van a estar alineados con el campo, y la

magnetización resultante tendrá dirección +z. Si escribimos la ecuación anterior como una serie de Maclaurin sólo hasta el

segundo término, obtenemos un importante resultado: Nβ/Nα=1-γhB°/2πkT

La relación entre los núcleos en un estado y en el otro está relacionada linealmente con el campo magnético; esto

demuestra que la intensidad de la señal de RMN incrementa linealmente con la fuerza del campo magnético.

Descripción Mecánica Clásica

Si consideramos un solo espín, es necesario hacer un análisis mecánico cuántico porque los fenómenos atómicos no

se comportan bajo las leyes clásicas (no obedecen la mecánica de Newton). Sin embargo, la señal observada en un

experimento de RMN proviene de un gran conjunto de espines, entonces la señal detectada (el valor de la magnetización

en el eje x o y) sí se comporta de manera clásica. Esto es obvio si tenemos en cuenta que la muestra que utilizamos en un

experimento de RMN es un objeto clásico, entonces se espera que se comporte como tal.

Ahora consideramos una muestra compuesta por muchos núcleos idénticos con un I=1/2. Se puede representar un

momento angular con una longitud igual a [I (I+1)]1/2

ћ y su componente en z es m. El principio de incertidumbre no nos

permite especificar las componentes x e y del momento angular, sólo sabemos que está en algún lugar en el cono

alrededor del eje z. En usencia de un campo magnético B0, la muestra está compuesta por el mismo número de espines de

distinta energía con sus vectores ubicados a ángulos (Ф) al azar sobre el cono. Los ángulos (Ф) son impredecibles, y en este

paso consideramos los vectores de los espines como estacionarios. La magnetización de la muestra (M), su momento

nuclear neto, es cero. (M=0).

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• El efecto del campo estático

Dos cambios ocurren en la magnetización cuando hay un campo magnético presente:

1. Precesión Nuclear: la fuerza aplicada por el campo magnético sobre el eje de rotación causa un movimiento NO

en el plano de la fuerza, sino perpendicular a este plano. De esta forma, el eje de la partícula que está rotando se mueve

en una órbita circular, se dice que “precesa” alrededor del vector del campo magnético aplicado con una velocidad

angular igual a ω°.

ω0= γB0 [rad/s]

La velocidad angular puede ser convertida en la frecuencia de precesión, ν°

ν0= γB0 /2π [Hz] Ecuación de Larmor

Si consideramos al núcleo como un imán que gira, podemos usar la ecuación de

Larmor para explicar el fenómeno de RMN. Esta ecuación puede ser igualada a la ecuación de

la frecuencia de resonancia que se obtuvo teniendo en cuanta las propiedades mecánico

cuánticas de los núcleos. En la descripción clásica, el núcleo experimenta una resonancia con

una frecuencia de precesión (frecuencia de Larmor) que es proporcional al campo magnético

a través de su cte giromagnética. Se puede apreciar a partir de las ecuaciones hasta ahora

descriptas, que la energía del sistema NO depende del momento magnético de núcleo, sino

que sólo depende de la proyección de este vector sobre en eje del B°.

2. Magnetización nuclear � todos precesan con una dirección según la distribución de Boltzman. La población de

espines en los dos estados se altera según esta distribución: aunque la diferencia de poblaciones es pequeña, hay una

magnetización (M) neta representada por un vector con dirección en el eje z y con una longitud proporcional a la

diferencia de población.

Marco Rotatorio de Coordenadas

El modelo clásico describe la resonancia nuclear en términos de la precesión del vector de magnetización

alrededor del campo magnético aplicado con una frecuencia de precesión igual a la de Larmor. Una forma de ver este

sistema, es a través de un marco rotatorio de coordenadas. En esta representación, los ejes cartesianos comunes, x, y y z,

son remplazados por los ejes, x’, y’ y z’, los cuales rotan a la frecuencia de Larmor del espín. En este sistema, el vector de

magnetización aparece estacionario. Es una forma de simplificar el análisis de los resultados cuando se trabaja con

complejas se secuencias de pulsos.

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El efecto del campo de radiofrecuencia

Ahora supongamos que aplicamos un campo magnético oscilante en

el plano xy con una frecuencia igual a la frecuencia Larmor de los espines. El

núcleo va a experimentar un campo magnético estático BI porque el campo

magnético rotatorio está en fase con la precesión de los espines (B1 ┴ B0).

Bajo la influencia de este campo magnético, la magnetización comienza a

precesar alrededor de la dirección de este campo. Si aplicamos BI en un pulso

de cierta duración, la magnetización precesa al plano xy con la frecuencia de

Larmor. El movimiento de la Magnetización Rotatoria (M) induce una señal

en el detector que es amplificada y procesada.

Procesos de Relajación

Hay dos tipos de procesos de relajación en RMN

1. El primero está relacionado con el establecimiento del equilibrio térmico debido a la asociación de imanes

nucleares con diferentes energías. Suponiendo que la frecuencia de Larmor es similar para todos los núcleos, estos se

encuentran en fase y pueden intercambiar energía. El sistema vuelve a su equilibrio térmico de forma exponencial, con

una cte de tiempo denominada tiempo de relajación longitudinal, Tl . Esta cte refleja la eficiencia de acoplamiento entre un

espín nuclear y su entorno (lattice), por eso también se denomina tiempo de relajación spin-lattice. Tl es una medida de la

regeneración de la componente en Mz, la cual es función del intercambio de energía. Este proceso depende de cómo la

muestra le puede ceder energía al medio; por esto es un proceso conservativo. Este proceso de relajación es un efecto

energético, que toma valores entre 10-3 a 102 s para líquidos y un rango mayor para sólidos. Un valor de Tl menor implica

un acoplamiento efectivo, y viceversa.

El T1 dará información acerca de:

� Tiempo de correlación rotacional (τr)

� Acoplamiento dipolar

2. El segundo proceso está relacionado con la perdida de fase de algún núcleo con respecto a todos los núcleos que

están precesando a la misma frecuencia. Si por cualquier proceso los núcleos pierden su coherencia de fase, va a haber

tantos componentes negativos como positivos en el plano xy dando como resultado un vector que se mueve hacia el eje z.

Este proceso que involucra la caída de las componentes xy de la magnetización a cero, ocurre exponencialmente con una

cte de tiempo denominada tiempo de relajación transversal, T2. Esta relajación se debe a procesos no conservativos

porque son procesos que dependen de la entropía del sistema. T2 está relacionada con el ancho de banda espectral: ∆ν1/2=

1/ πT2. Los valores típicos de T2 en RMN de protón son del orden de los segundos, que corresponde a un ancho de banda

de 0.1Hz. Hay que tener en cuenta que en la práctica el campo magnético no es homogéneo, y estás diferencia son las que

más afectan a la frecuencia de Larmor y por ende al ancho de banda.

Se puede dar por:

• Interacciones spin-spin por desfasajes en Mxy

• Imperfecciones en la homogeneidad del magneto

• No puede ser mayor que T1

Brenda Fina


Moléculas grandes, como la proteínas, tiende a relajarse lentamente debido a la gran interacción con el medio,

dando como resultados Tl grandes. Hay que tener en cuenta que distintas regiones pueden tener distintos tiempos de

relajación, lo que indica diferencias en la movilidad de la molécula.

τr: tiempo de correlación rotacional

Según las medidas de τr se pueden dividir a las proteínas en:

� Rotación rápida: τc =τr=10-11s � wH τr=2,5 10-2

wH2 τr

2<<1

T2-1=k. 5 τc

T1-1=k. 5 τc

� Rotación lenta: τr=10-8s � wH τr=250

wH2 τr

2>>1

T2-1=k. 15 τc

T1-1=k. 2/ wH

2 τc

El T1 y el T2 dependen de cada átomo, por lo que nos dan información sobre la movilidad.

Efectos del medio ambiente nuclear en RMN

La frecuencia de Larmor de un dado núcleo está fuertemente afectada por su entorno químico. Como

consecuencia, el espectro de RMN de una proteína da información que permite elucidar su estructura química. El

corrimiento en la frecuencia de absorción de un núcleo debido a su entorno químico se denomina Desplazamiento

Químico (Chemical shift). Otro efecto que tiene el entorno nuclear sobre los núcleos es el Desdoblamiento spin-spin.

Mientras que el primer efecto es dependiente de la fuerza del campo magnético, el segundo efecto no lo es.

T2=T1

T2>>T1

1/π T2=∆ν � ∆ν α τr

↑MM � > τr � >∆ν → nuevo problema

en proteínas (↑MM), mucho ∆ν.

T2 esta relacionado con τr:

T2 α 1/ancho de banda T2 α 1/ τr

Ancho de banda α τr

Para MM de ↑PM, τr ↑ � ↑ancho de banda

� BAJA RESOLUCION

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Parámetros en RMN:

• Desplazamiento químico

• Acoplamiento spin-spin: Escalar y Dipolar

• T1

• T2

� Desplazamiento Químico

Este fenómeno ocurre porque el campo magnético, B, que experimenta el núcleo atómico difiere ligeramente del

campo magnético externo aplicado, B0. B es un poco más pequeño que B0 (B< B0) debido al apantallamiento que producen

los electrones cercanos. El campo externo induce la circulación de los electrones alrededor de las orbitas atómicas, que

genera un pequeño campo magnético B’ opuesto en dirección al B°. B’ es típicamente unas 104-105 veces menor que B°. El

campo que siente el núcleo esta dado por,

B= B° - B’ = B° (1-σ)

Donde σ es la cte de apantallamiento, y es muy sensible al entorno químico, depende del medio.

La frecuencia de resonancia se transforma en,

ν=γ B°(1-σ)/2π �� la frecuencia de resonancia

de un núcleo en su átomo es

menor que la del mismo núcleo desnudo.

El desplazamiento químico no puede compararse con resultados de diferentes equipos porque depende de las

propiedades del campo magnético. Además, la cte de apantallamiento no es una medida conveniente para calcular el

corrimiento. Por estas razones, se define el desplazamiento químico en términos de la diferencia de resonancias entre el

núcleo de interés y un núcleo de referencia (ej: tetrametil silano, TMS):

δ= (νx-νref)/νo [ppm] �� νo es la frecuencia del campo

� δ es independiente del B0

De esta forma, este parámetro es independiente del equipo que se use.

El desplazamiento químico depende de muchos factores, pero el más importante y significativo es la densidad

electrónica del entorno. Una alta densidad electrónica causa un gran efecto de apantallamiento (↑B´), lo que implica que el

campo magnético aplicado debe ser incrementado para obtener resonancia. Esto da lugar a un corrimiento de la señal a

regiones de mayor campo y menor δ.

↑ B´ � se debe ↑ B0 � ↓ δ

Lo contrario sucede si la densidad electrónica es baja. Por ejemplo, si un protón está unido directamente a un

átomo electronegativo como un grupo carbonilo, que tiene una densidad electrónica baja, el desplazamiento químico será

grande y tendrá valores de δ altos.

Brenda Fina


Átomos electronegativos � ↓ densidad electrónica � < apantallamiento � ↑ δ

La intensidad de absorción es estrictamente proporcional a la concentración de núcleos que dan esa señal. Núcleos

idénticos dan la misma señal.

En el caso de compuestos que contienen dobles o triples enlaces,

los δ no pueden explicarse solamente por los efectos locales. Pueden

ser explicados si se tienen en cuenta las propiedades magnéticas

anisotrópicas de estos enlaces.

Teoría de la corriente del anillo: Las propiedades magnéticas de

los compuestos aromáticos cambian significativamente dependiendo de

la orientación del anillo con respecto al campo magnético externo, este

efecto se denomina efecto de la corriente del anillo (ring-current effect).

Cuando el plano del anillo se encuentra perpendicular al campo

magnético externo se induce una corriente de electrones π. El campo

inducido tiene dirección opuesta al campo aplicado arriba y abajo del plano de la molécula, y la misma dirección en los

lados de la molécula. Entonces, un protón que se encuentra cerca de un anillo aromático es apantallado si está arriba o

abajo del centro del anillo plano, mientras que es desapantallado (su δ aumenta) si se encuentra por fuera del plano del

anillo. Este efecto desaparece si el anillo tiene otra orientación con respecto al campo externo. En el caso de dobles o

triples enlaces sucede lo mismo si la corriente de electrones π es perpendicular al campo externo.

� Acoplamiento Espín-Espín

Hay dos tipos de acoplamientos: el acoplamiento escalar y el acoplamiento dipolar. Ambos son propiedades

espectroscópicas fundamentales en la interpretación de espectros complejos de RMN.

Acoplamiento escalar Acoplamiento dipolar

• Se transmite a través de los enlaces

• No depende de la orientación

• Depende del ángulo diedro

• Se transmite a través de una distancia < 5Å

• Depende de la orientación

Protones amídicos � δ=7 y 10 ppm

Protones α � δ= 4 y 6 ppm

Arom ati co

Amina/da

A g u a HCα HCβ,γ

10 7 6 5 4 3 2 1 0

HN backbone

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El acoplamiento escalar se representa como la influencia que ejerce un núcleo

activo en RMN sobre otro núcleo activo. Al tener dos núcleos acoplados, uno de ellos

siente a través de los enlaces químicos un incremento o decremento de campo

magnético debido al espín a favor o en contra del núcleo vecino. Este fenómeno produce señales de RMN más complejas,

por ejemplo, si un núcleo A se acopla a otro núcleo B con I=1/2, la señal de A se verá como dos señales de intensidades

1:1. La distancia entre estas dos señales se conoce como la cte de acoplamiento, J. Esta cte depende de la estructura

nuclear y NO del campo magnético externo. Otro ejemplo, si un núcleo B se acopla con dos núcleos equivalentes con I=1/2

la señal será un triplete con intensidades 1:2:1, la distancia entre las señales con intensidades 1 y 2 es la cte de

acoplamiento, y la distancia total entre las señales con intensidades 1:1 es dos veces esta cte. El acoplamiento escalar se

observa de 1 a 3 enlaces de distancia y no se manifiesta entre núcleos equivalentes. La regla general es que el número de

desdoblamientos de banda en un espectro de primer orden es igual a n + 1, donde n es el número de protones magnéticos

equivalentes. Los valores de J van de 0 a 20 Hz aprox.

Hay un orden de J:

Primer orden: interacción entre 2 núcleos unidos por un enlace. Si este enlace es C—C � J↑ si paso a un enlace

doble o triple.

Segundo orden: núcleos separados entre 2 enlaces. Ej: H—C—H

Tercer orden: Acoplamiento de tres enlaces: es el acoplamiento escalar más útil para analizar estructuras

moleculares. El valor de este acoplamiento esta dado por la ecuación de Karplus:

J (θ) = A cos2 θ+ B cosθ + C

Donde θ es al ángulo diedro entre protones. Los valores de A, B y C son parámetros experimentales. Los valores

típicos son A=2Hz, B=-1Hz y C=10Hz.

Brenda Fina


Esta ecuación muestra como a partir de la constante de acoplamiento entre el NH y el Cα se puede obtener

información conformacional del backbone de la proteína a través de su ángulo diedro. Los dos mayores componentes de la

estructura secundaria de una proteína, hélices y láminas β:

α-hélice tiene un θ=120º → J< 6Hz

β-sheet tiene un θ=180º → J= 7Hz

Técnica de irradiación selectiva

Se utiliza para averiguar que 1H están acoplados con otros.

HA esta acoplado con HM y HX � veo 2 dobletes, uno con JAX y el otro con

JAM.

En un experimento de irradiación selectiva:

1º se realiza un espectro de RMN 1D (normal) de protón para obtener

todas las señales y saber a que frecuencia absorben.

2º se realiza un espectro de protón, en el que además de excitar todas las

bandas, se excita selectivamente al núcleo que absorbe a 8,5 ppm. Excitando

continuamente a la frecuencia de absorción del núcleo x, hago que se igualen las

poblaciones y como resultado la señal desaparece. Se hace que HA tenga

transiciones muy rápidas a favor y en contra del campo B0 de modo que ahora HA ve un promedio y el doblete desaparece.

El acoplamiento dipolar se presenta a través del espacio, es decir, que se requiere proximidad espacial y depende

de la orientación del campo magnético externo. Este acoplamiento se presenta como la influencia que ejerce el campo

magnético de un núcleo activo sobre otro núcleo activo cercano.

El B en 15N en la dirección del B0, puede ↑ o ↓ en relación a B0 dependiendo de la orientación del vector 15N—1H y

del spin 1H.

Solo la componente paralela al campo magnético externo lleva a la interacción. La componente z del campo dipolar

del núcleo I cambia la frecuencia de resonancia del núcleo S por una cantidad que depende en la distancia internuclear r y

en el ángulo θ.

Los acoplamientos dipolares ensanchan el espectro de RMN, en estado solido son muy anchos.

En solución, este acoplamiento no se observa dado que el promedio de los diferentes acoplamientos en moléculas

que se encuentran en movimiento aleatorio con respecto a B° se promedian obteniendo un valor cero, debido a que las

moléculas se reorientan muy rápido. Entonces se ve un promedio en el tiempo, así, se resuelve mejor, pero se pierde

información si hay un poco de alineamiento � Residual Dipolar Coupling (RDC). Pese a esto, este acoplamiento se

manifiesta a través del efecto nuclear Overhauser (NOE). Este efecto es un cambio de intensidad que nace de esta

interacción dipolar. La intensidad de la señal debido al NOE guarda una relación con la distancia entre los núcleos

interactuantes:

I (NOE) = k / (rAB)6

B0

15N

Cα 1H

B0

No se tienen en cuenta porque se

intercambian muy rápido con el solvente

Brenda Fina


La constante de acoplamiento dipolar es un vector:

RjkDD

= µ° γj γk h / 4π<rjk3>

Los acoplamientos dan información:

� Dipolar � NOE y RDC

� Escalar � J

TÉCNICAS EXPERIMENTALES

Transformada de Fourier

Tradicionalmente, se utilizaban espectrómetros de onda continua, lo que implicaba largos experimentos y una

recopilación de datos muy lenta. Luego se utilizaron espectrómetros con muchos canales, lo que permitía la medición

simultánea de numerosos puntos; pero el instrumento tiene como límite la cantidad de canales que puede tener. No fue

hasta que se crearon los instrumentos de pulso de Fourier que se pudo utilizar la técnica de RMN de manera sensible y de

alta resolución. Como se tienen que resolver diferencias de energía muy chicas, se necesitaría mucho tiempo; para cada

valor de frecuencia hay que hacer muchos espectros � se excita a TODAS las frecuencias con un pulso que dure poco

tiempo. La intensidad que corresponde a cada frecuencia se obtiene analizando cómo vuelven al equilibrio los momentos

magnéticos luego del pulso.

En el instrumento de pulso de Fourier, los datos son recolectados en función del tiempo; pero el investigador está

interesado en la respuesta de los sistemas de espín en función de la frecuencia. Por suerte, estos dos dominios están

relacionados y se pueden convertir uno en el otro usando un procedimiento denominado Transformada de Fourier. Esta

transformación, relaciona los datos en función del tiempo f(t) con los datos en función de la frecuencia f(ν):

dtetfftiνν ∫

+∞

∞−= )()(

Bobina de

detección

Brenda Fina


Esta es una transformada continua porque la integración abarca desde infinito positivo a infinito negativo. En la

práctica puede acotarse sobre un rango de tiempo finito:

∑ ∆= tetfftiνν )()(

La existencia de dos dominios relacionados nos permite definir las

Parejas de Fourier. Algunas de éstas son especialmente útiles en RMN. Por

ejemplo, la transformada de Fourier en función del tiempo cayendo

exponencialmente representada por una línea Lorenzana a una frecuencia

cero, es idéntica a la relación entre el FID (free induction decay) y el espectro

de RMN. Otra pareja de Fourier es la transformada de Fourier del pulso de

radiofrecuencia. Un resultado básico de la transformada de Fourier tiempo-frecuencia es que un corto pulso en el tiempo

puede ser considerado como una fuente de multifrecuencia, lo que permite la excitación simultánea de diferentes

frecuencias de resonancia en un experimento de RMN.

Para clarificar este punto, uno examina la magnetización de la muestra bajo la influencia de un campo de

radiofrecuencia estático. En el marco de referencia, la magnetización nuclear, Mj, de un núcleo con frecuencia resonante,

wi, precesa con una velocidad angular igual a w alrededor del campo efectivo:

|Beff| = (1/γ) [(νi – ν)2 + (γBl)

2]

1/2

Bl es elegido de modo que se cumpla: γBl >>2π∆; donde ∆ (Hz) es todo el rango de desplazamiento químico de la

muestra medido con respecto a la radiofrecuencia, entonces para cualquier νi del espectro el término νi – ν puede ser

insignificante, haciendo Beff≈ Bl. Esto significa que el vector de magnetización precesa alrededor de Bl para TODOS los

núcleos con la frecuencia de Larmor en el rango ∆, es decir, se aplica un B de forma que TODOS los núcleos estén

precesando con la ν de Largor en ∆. El ancho del pulso de tiempo para cubrir este rango de frecuencia debe ser << 1/∆.

Denominamos ∆’ al rango de frecuencias a ser examinado. Debido a lo heterogéneo que es el sistema de detección,

no es la frecuencia de resonancia, νi, lo importante sino la diferencia entre esta y el campo de radiofrecuencia aplicado, νi –

ν. Si la ν del B1 es elegida dentro del rango ∆’, algunas de las diferencias van a ser positivas y otras negativas. Durante la

recolección de datos, como el detector mide en función del tiempo, no puede distinguirse entre frecuencias positivas y

negativas. Como las frecuencias negativas y positivas difieren en sus fases, se utilizan dos detectores de fase para revelar

el espectro.

El análisis de Fourier también es esencial para entender el efecto del pulso propiamente dicho. Un pulso

rectangular en el tiempo de radiación monocromática con frecuencia, ν°, puede ser descripto en función de la frecuencia

como una banda centrada en ν°. Esta frecuencia monocromática es producida por un generador de pulso y se denomina

frecuencia de espectrómetro. Siguiendo las reglas de la transformada de Fourier, si la duración del pulso disminuye, el

ancho de la banda de la frecuencia aumenta. Se asume que el largo del pulso es relativamente menor que Tl y T2 para que

no se produzca la relajación durante el tiempo que dura el pulso.

El intervalo entre pulsos se denomina T. Durante este tiempo, una señal de radiofrecuencia en función del tiempo

denominada FID (Free induction Decay) es emitida por los núcleos excitados a medida que se van relajando. FID es

detectado con un espiral recibidor (receiver coil), ubicado perpendicular al campo magnético estático.

Espectrómetro de RMN

La sensibilidad y resolución de espectrómetro dependen de la fuerza y calidad del campo magnético. El campo debe

ser altamente homogéneo y reproducible. Estas características sólo pueden ser alcanzadas con un solenoide

superconductor. Este espiral de radiofrecuencia actúa como detector y como transmisor de la frecuencia de resonancia. La

Brenda Fina


señal medida procesada en una computadora es una línea de baja frecuencia obtenida de la diferencia entre la frecuencia

transmitida y la detectada.

La muestra es ubicada en el centro del imán cilíndrico para asegurarse de que todos los núcleos magnéticos

experimenten el mismo campo. El imán superconductor opera a la temperatura del Helio líquido (4K), pero la muestra

está a temperatura ambiente.

Con el objetivo de perturbar el sistema de espín con energía del orden de las radiofrecuencias, el espectrómetro

posee sofisticados programas de pulso y unidades de transmisión

que permiten la aplicación de complejas secuencias de pulsos.

La fuente de la radiofrecuencia es un cristal oscilador

estable que funciona continuamente, y todas las frecuencias en el

espectrómetro derivan de él. La señal de onda continua

proveniente de esta fuente se controla en amplitud y fase con una

unidad de puerta. La secuencia pulso/adquisición/retardo se repite N veces

para aumentar la relación señal/ruido.

Experimentos de Simple Pulso

Adquisición y procesamiento de datos

Después de un retardo inicial, se le aplica el pulso a la muestra con un espiral de radiofrecuencia. El detector se

enciende y, luego de un tiempo muerto corto, se mide la respuesta del sistema de espín y se almacena en la computadora.

El tiempo de adquisición de datos debe ser largo para asegurarse de que la respuesta del sistema decayó lo suficiente

hasta hacerse insignificante (un par de veces T2). Otro retardo permite que la muestra de espines vuelva completamente

al equilibrio (relajación Tl). Cuando la frecuencia del pulso, ν°, se iguala a la frecuencia de Larmor, el vector de

magnetización nuclear se inclina fuera de la dirección z. Como el pulso es sobre la dirección x’, y el ángulo de inclinación es

hacia y’. Esto puede explicar por que RMN es una técnica de resonancia. Resonancia es una condición en la cual la energía

es trasladada de tal manera que una pequeña perturbación produce un gran cambio en algunos parámetros del sistema

perturbado. RMN es una técnica de resonancia porque una pequeña perturbación periódica, Bl, produce un gran cambio

en la orientación del vector de magnetización de la muestra. El ángulo de inclinación está dado por,

α = γ Bl tp

Free Induction Decay (FID) � Magnetización por un pulso de 90º

En la práctica, el B0 no es completamente homogéneo, lo que causa que los grupos de núcleos en distintas partes

de la muestra experimenten diferentes B0 locales, es decir, que causa divergencias locales en la frecuencia de Larmor

haciendo que los vectores de magnetización nuclear se separen unos de otros. Esto es lo que principalmente afecta a T2,

que representa la relajación de la magnetización en el eje xy, en otras palabras, es el proceso por el cual la componente –

y’ de la magnetización se vuelve cero. Al mismo tiempo, el proceso de relajación Tl provoca que la magnetización vuelva al

equilibrio en la dirección z. Como la no homogeneidad del campo provoca que T2 sea menor a Tl, ocurre una situación

intermedia en la que la componente de la magnetización en –y’ se vuelve cero antes de que la población de espines pueda

llegar al equilibrio de Boltzmann. Después de un tiempo (después de cinco veces Tl) la magnetización alcanza el equilibrio.

A medida que la componente –y’ disminuye, el voltaje oscilante del espiral también decae y alcanza el valor cero, aun

cuando los espines no alcanzaron el equilibrio. El registro del voltaje recibido en función del tiempo se denomina FID,

Brenda Fina


porque los núcleos pueden procesar libremente en la ausencia de Bl. FID es la sumatoria de los voltajes oscilantes

individuales provenientes de los distintos núcleos de la muestra, cada uno con su frecuencia, amplitud y T2 característico.

FID es la pareja de Fourier del espectro de frecuencias de RMN.

Experimentos de Múltiples Pulsos

En un experimento de múltiples pulsos, una secuencia de pulsos de radiofrecuencia específicos es aplicada a la

muestra antes de medir FID. Estos experimentos proveen información que es imposible de obtener con los experimentos

de simple pulso. Una secuencia de pulso está definida por la amplitud y el ancho de cada pulso y el tiempo de demora

entre ellos (T). Hay una gran cantidad de experimentos de pulsos múltiples, pero todos s pueden dividir en tres grandes

grupos:

1. Grupo I: incluye secuencias de pulsos para la medición de los tiempos de relajación. Para medir el tiempo de

relajación longitudinal (Tl) se utiliza el método de inversión-recuperación (inversión-recovery) que se basa en una

secuencia simple de dos pulsos. También incluye el método de espín- eco (spin-echo) para medir el tiempo de relajación

transversal (T2), y se basa en una secuencia de pulsos distintos.

2. Grupo II: incluye técnicas de transferencia de la polarización a través del acoplamiento escalar de heteronúcleos

con el fin de aumentar la sensibilidad. Estas técnicas son importantes para la observación de núcleos raros con una cte

giromagnética baja. El truco básico implica borrar la polarización de los núcleos más sensibles (con cte giromagnéticas

altas) para poder observar la polarización de los menos sensibles. Uno de los métodos más simples es el INEPT, aumento

del núcleo insensible por transferencia de polarización. Hoy en día casi todos los experimentos de RMN heteronucleares y

multidimensionales usan el método INEPT para transferir la magnetización entre distintas especies de espín, pero la gran

desventaja de esta técnica es que su eficiencia se deteriora a medida que aumenta el tiempo de correlación rotacional

(movimiento browniano molecular). Hay otra técnica que supera esta desventaja porque en independiente del tiempo de

correlación rotacional, CRIPT, transferencia de polarización por la polarización inducida de la relajación cruzada. La

combinación de estas dos técnicas nos lleva a otra altamente eficiente para muestras en solución de moléculas de gran

tamaño, CRINEPT.

3. Grupo III: usa el efecto nuclear Overhauser (NOE) basado en la transferencia de polarización a través de

acoplamiento dipolar.

Brenda Fina


Método de inversión recuperación para medir Tl

Durante el intervalo τ, el sistema regresa al equilibrio por el proceso de relajación longitudinal. El proceso de

relajación espín-espín no está involucrado en este caso porque el vector de magnetización, M, se encuentra en el eje z. A

medida que los momentos magnéticos individuales vuelven a sus orientaciones más favorables sobre el eje +z, el vector

de magnetización neto se vuelve cada vez más corto sobre la dirección –z. Dependiendo de la duración del retardo (τ), M

pasa por cero y finalmente alcanza su magnitud original en el eje +z. Con el fin de determinar la extensión de la relajación,

M debe convertirse en una magnetización observable en el plano xy. Esto se logra aplicando un segundo pulso, pero en

este caso de 90°. Dependiendo de cuan negativa sea todavía la magnetización (todavía está en el eje –z), rotará hacia el

eje +y; pero si la relajación ya se completo cuando se aplica este pulso la señal rotará hacia el eje –y. La intensidad I del

pico que resulta de la transformada de Fourier del FID varía con τ desde un valor máximo negativo para τ=0, a un valor

máximo positivo en τ=∞.

I = I∞ [1-2 e(-τ/Tl)

]

Si I=0 �� τ/T1 = ln 2

El efecto del espín-eco para medir T2

Eco de espín: es un pulso de magnetización que se deja dispersar, es reflejado, y después es detectado como otro

pulso un tiempo más tarde.

Se eligen valores pequeños

entre 4-5 veces T1

Brenda Fina


La secuencia de pulsos de esta técnica permite la medición independiente de la componente de no homogeneidad

del campo magnético externo. Se debe tener en cuenta que la magnetización en el plano xy va a ser perdido por procesos

que no afectan a la componente z. la cte de velocidad para esto es la reciproca de la cte de tiempo de FID, T2*.

T2* esta dado por:

• Heterogeneidad de B0

• Tiempo de relajación spin-spin T2*.

•

El pulso inicial de 90° inclina el vector de magnetización sobre el eje –y. Si los ejes estuvieran rotando exactamente

a la frecuencia de Larmor de los núcleos, el efecto de T2 es el gradual acortamiento de M en la dirección –y. Pero como B0

no es perfectamente homogéneo, algunos de los espines de la muestra precesan más rápido (1 y 2) y otros más lento (3 y

4) que el marco de coordenadas rotatorio; los más rápidos se mueven en contra de las agujas del reloj mientras que los

más lentos lo hacen en dirección de las agujas. Como resultado de esta disparidad, los vectores de los espines se dispersan

(se separan) sobre el plano xy durante τ1, después del pulso de 90°. Al final de τ1, se aplica un pulso de 180° que manda los

espines al eje +y. Los vectores dispersados todavía precesan en la misma dirección y a la misma velocidad. Durante el τ2

(misma duración que el anterior), todos los vectores se refocalizan sobre el eje +y para dar la magnetización máxima en el

plano xy (este es el eco). Si se monitorea la señal de RMN durante esta secuencia 90°- τ -180°- τ, la señal desaparece

durante el primer τ y después se recupera para dar el máximo, el eco de espín, cuando los vectores son refocalizados. La

amplitud se reduce por la relajación T2 y por los efectos residuales del sistema espín-lattice. La cte de tiempo por la

disminución de la magnitud del eco es la verdadera T2, porque los efectos de la pérdida de homogeneidad del B0 son

eliminados en el proceso de refocalización.

Nuclear Overhauser Enhancement (NOE) � permite medir interacciones dipolares

El NOE se ilustra como un sistema de 2 spines I y S no equivalentes y sin acoplamiento escalar (J=0). Cuando uno es excitado (S), el dipolo magnético perturba el estado de equilibrio del otro (interacción dipolo-dipolo), produciéndose lo que se conoce como relajación cruzada: un spin transfiere magnetización a través del espacio al otro. Por tanto, la intensidad de la señal del espín I cambia cuando se perturba el estado de equilibrio del espín vecino. La perturbación puede realizarse mediante saturación o inversión con pulsos de radiofrecuencia. El cambio de intensidad que nace de esta interacción dipolar se denomina efecto Overhauser nuclear.

Sin acoplamiento escalar el espectro de RMN consiste en un singlete en cada δ. Luego de la saturación de S, I puede volverse: • Mas fuerte • Mas débil

• invertido

Brenda Fina


Sistema de spin: cuando un núcleo se excita como en RMN, la diferencia de energía entre los estados fundamental

y excitado es muy pequeña, entonces los núcleos permanecen bastante tiempo en el estado excitado y se relajan lentamente. La forma de volver al estado fundamental es transfiriendo la energía a los núcleos vecinos. Así, cuando se satura un spin, este va a volver al estado fundamental transfiriendo la energía a los núcleos vecinos de tal manera que se altera la diferencia de población entre los estados fundamental y excitado de éste último y esto se manifiesta como un cambio en la intensidad de la señal.

El cambio de intensidad del espín I está gobernado por tres probabilidades de transición: de cero, uno y doble cuanto, denominadas W0IS, W1IS y W2IS, respectivamente. Estas describen los mecanismos de relajación cruzada en un sistema ideal de dos espines.

Sin embargo, cuando el sistema vuelve al equilibrio NO hay Reglas de selección (vuelve por donde puede).

Si W2 domina: Si W0 domina: La diferencia entre estas probabilidades (W2 - W0), se denomina constante de velocidad de relajación cruzada (σIS),

y describe la velocidad de las transiciones dipolo-dipolo que dan lugar al NOE. Por tanto, σIS es una medida de cuán rápido crece el NOE entre los spines I y S. El otro término (ρIS), se llama constante de velocidad de relajación dipolar longitudinal (W0 + 2W1 + W2) y define la parte del mecanismo de relajación responsable de restablecer el estado de equilibrio del spin I. Por tanto, incorporando estas definiciones y considerando, por ejemplo, la saturación del spin S, en el estado estacionario debe cumplirse que dIZ/dt = SZ = 0, con lo que:

NOE = (W2 - W0) / (W0 + 2W1 + W2)= σIS / ρIS

¿De que depende si la relajación es por W2 o W0? Depende del tiempo de correlación rotacional de la proteína:

W0 y W2 gobiernan el

regreso al equilibrio

No se ven porque S

esta saturado

Vacío el excitado y lleno el fundamental � ↑intensidad I (↑ señal) � NOE +

Vacío el fundamental y lleno el excitado � ↓intensidad I (↓ señal) � NOE -

Brenda Fina


Moléculas pequeñas: movilidad rápida, τc ≈ 10-11s; τc-1>>ω, ω2 τc

2<<1. Dado que: W0 α 2τc /r6 y W2 α 12τc/r6 � W2 > W0 � NOE >0 Macromoléculas: movilidad lenta, τc≈ 10-8s; τc

-1<< ω, ω2 τc2>>1. Dado que:

� W2 < W0 � NOE <0.

Por supuesto, en la realidad, no existen sistemas de espines ideales y la relajación dipolar entre los espines I y S no

es el único mecanismo por el que tiene lugar la relajación. La interacción dipolar depende de: • tiempo de correlación rotacional porque éste es capaz de modular la velocidad de relajación

• distancia entre los 1H interactuantes Interacción dipolar α τc/ r3

A su vez, el NOE α (interacción dipolar)2 � NOE α τc2/ r6

� NOE ↓ con la distancia y mas allá de los 5 Å la interacción es muy débil y NO se ve.

Esta técnica de transferencia de la polarización se basa en aplicar selectivamente un campo de radiofrecuencia

saturante al espín con mayor cte giromagnética, S. Esto resulta en una redistribución de la población de espines de S que

provoca una magnificación de la polarización de los espines I, suponiendo que los procesos de relajación son favorables. El

campo de radiofrecuencia selectivo se aplica en la posición donde se encuentra el pico de resonancia del espín que quiero

saturar. Cuantitativamente, el NOE se expresa en términos del incremento relativo de la intensidad de la señal:

NOE= (I-I°) / I°

Donde I e I° son las intensidades con y sin la saturacion.

NOE es la consecuencia de la modulación (modulación: modificación de la frecuencia o amplitud de las ondas

eléctricas) del acoplamiento dipolo-dipolo entre dos espines a través del movimiento Browniano. La ecuación que

describe a NOE:

NOE α f(r) f (τC)

� El término f(rIS) es un efecto de relajación cruzada debido a la interacción dipolo-dipolo.

‹1/r3 x 1/r3› = ‹1/r6›

Esta ecuación demuestra porque NOE es aplicable a núcleos acoplados que se encuentran muy cercanos,

aproximadamente a 5Å de distancia. El máximo valor de NOE para el caso de heteronúcleos está dado por,

NOEmax = 0.5 γS/γI +1

Donde γS/γI es el radio de las cte giromagnéticas del núcleo saturado y del núcleo observado.

Una de las principales dificultades que surgen cuando uno quiere correlacionar las intensidades de NOE con las

distancias intramoleculares es la difusión de espín. Los arreglos geométricos de los protones dentro de las estructuras

espaciales de las biomoléculas permiten que la difusión de espín se dé en una variedad de rutas distintas a la relajación

cruzada directa que nos interesa analizar. Estas relajaciones cruzadas subsecuentes afectan significativamente el NOE

resultante.

� El término f(τC) muestra que el fenómeno de NOE está relacionado con la relajación del espín.

Brenda Fina


NOE varía como una función del producto de la frecuencia de Larmor y el tiempo de correlación

rotacional (ωτC). τC es del orden de 10-10-10-12 s para moléculas pequeñas y ω es del orden de 3.6x108-3.6x109

rad/s. Entonces el producto ωτC es aproximadamente 0.1-0.01. Igualmente,

hay que tener en cuenta que τC aumenta con el tamaño de la molécula y la

viscosidad del solvente.

Si el producto ωτC<<0.1, el término ω2τC2 contribuye muy poco y el

NOE está cercano a +0.5. Pero cuando el producto ωτC = 10 o más, el NOE se

acerca al límite de -1, que corresponde a la desaparición de la señal de I.

También se puede irradiar un 1H y observar la relajación de un heteronucleo con spin ½ (13C).

Respecto al equipo lo que se hace es realizar una serie de

experimentos en los cuales alternativamente se adquiere un espectro

saturado y uno sin saturar. El quipo registra el espectro del NOE

diferencial, lo cual es simplemente la resta algebraica de los 2

espectros. En el caso que I>I0 � NOE >0.

Como en una proteína hay muchos 1H, uno tendría que irradiar a

cada uno para ver lo que le sucede al resto � para solucionar este

problema se diseño RMN en 2 dimensiones.

Aproximaciones para identificar NOEs 1H-

1H Homonuclear

15N- o

13C- Heteronuclear

2D 1H↔1H

3D 1H↔1H↔1H 3D 1H↔1H 1H↔1H 15N 13C

RMN en Dos Dimensiones

� Tiempos mayores

� Mayor resolución

El término RMN en una dimensión se refiere a un experimento en el cual la señal transformada se

presenta en función de de una sola frecuencia. Análogamente, en un experimento de dos dimensiones el

espectro de RMN se presenta en función de dos frecuencias.

Un típico experimento en dos

dimensiones consta de cuatro períodos

sucesivos: preparación, evolución, mezclado y

detección. El período de preparación

generalmente consiste en un tiempo de

demora durante el cual se alcanza el equilibrio

térmico, τp. Después de esta etapa, el sistema

de espines está preparado para alcanzar un

estado de no equilibrio inicial, normalmente

debido a un pulso de radiofrecuencia de 90°.

La etapa de evolución define el tiempo t1. Las

señales provenientes de los tiempos del período de evolución y del período de detección, t1 y t2, se mezclan

en el tiempo de mezclado, τm. La adquisición de datos de las señales de RMN se realiza sólo durante el

Pico del 1H saturado invertido

NOE >0

Brenda Fina


período de detección, t2. Variando el tiempo de demora t1 de forma sistemática, y manteniendo los otros

parámetros inalterados, se obtiene una matriz del tipo s(t1, t2). Haciendo una doble transformada de Fourier

obtenemos el espectro en dos dimensiones S(ω1, ω2).

Clasificación de los experimentos en dos dimensiones según Ernst:

1. COSY (correlation spectroscopy), este experimento está diseñado para correlacionar las

transiciones de espines acoplados por transferencia de magnetización transversal desde una transición a

otra en el curso de procesos de mezclado especialmente diseñados. Es un experimento en 2D a partir del

cual se obtiene información de la estructura 2ria y 3ria de una proteína teniendo en cuenta SOLO los

acoplamientos escalares spin-spin.

2. Homonuclear or Heteronuclear Two-dimensional J-resolved Spectroscopy o Spin-echo

Spectroscopy (Espectroscopia de espín eco), estos experimentos fueron diseñados para separar las

diferentes interacciones (corrimiento químico y acoplamiento espín-espín) en dimensiones ortogonales (que

forman ángulo recto) de frecuencia, con el propósito de resolver señales que se superponen en

experimentos de una dimensión. Estás técnicas requieren condiciones particulares para que la información

obtenida en el período de evolución y la obtenida en el período de detección sean distintas.

3. NOESY (Nuclear Overhauser Enhaced Spectroscopy), esta técnica se utiliza para estudiar procesos

dinámicos, como intercambio químico, relajación cruzada o el efecto de Overhauser transitorio.

Espectroscopia de Correlación (COSY)

La secuencia de pulso es 90°-kt1-90°-adquisición de datos, donde k=o,1,2….2n. El experimento se

repite k veces. Las señales de FID se miden y plotean como s(t1, t2), donde t1 y t2 son variables

independientes. Se aplica la transformada de Fourier a

los valores digitales de t1 y t2 para obtener el espectro

S(ω1, ω2) en frecuencia.

Consideremos dos protones, A y B, que están

acoplados escalarmente. Después del primer pulso de

90°, durante el tiempo de demora t1, cada protón

resuena a su frecuencia de Larmor, ωA y ωB; aunque en

realidad dos frecuencias están involucradas para cada

núcleo debido al acoplamiento, ωA ± ½ JAB y ωB ± ½ JAB.

Después del segundo pulso de 90°, podría parecer como

que el pulso no tiene efecto sobre los espines porque siguen precesando a las mismas frecuencias de

Larmor. Alternativamente, una porción de la magnetización asociada al espín A durante el tiempo t1 puede

ser transferida al espín B durante t2. Este resultado viene del proceso conocido como Transferencia

Coherente (Coherence Transfer). Coherencia significa que un grupo de espines parecidos tienen la misma

fase en el plano xy. En otras palabras, una porción de la magnetización que precesaba a ωB durante t1 ahora

precesa a ωA durante t2.

Brenda Fina


En el espectro que se obtiene hay picos que están sobre una diagonal, estos picos son el resultado de

la evolución de la magnetización que tiene frecuencias de transición originadas por la interacción de espines

iguales durante ambas transiciones; NO DAN INFORMACION. Los picos que están fuera de la diagonal son los

importantes porque resultan de la interacción de espines distintos que están acoplados de forma escalar. El

espectro es simétrico respecto a la diagonal. Teniendo en cuenta

que los crosspeaks que se observan corresponden a protones

separados por tres o menos enlaces en la estructura de los

aminoácidos (AA), el espectro de COSY permite identificar los

residuos de los distintos AA que componen la molécula. Hay una

zona del espectro denominada “zona

de la huella dactilar” que resulta de la

intersección del rango 7-10ppm de los

protones amídicos con el rango 4-

6ppm de los protones alfa. En esta

zona va a haber un crosspeak por cada

AA, excepto en el caso de la prolina,

que no tiene protón alfa, y en el caso

de la glicina, que tiene dos protones

alfa. Si quiero asignar tengo que fijarme en las zonas en las

cadenas laterales del espectro, se asignan puntos en la diagonal

empezando por la parte mas resuelta. El tiempo que lleva hacer

un 2D respecto a uno normal es mucho mayor, por lo que solo

es ventajoso usarlo cuando tengo muchos 1H.

Hay veces que existe una superposición de 2 crosspeaks,

que puede deberse a:

• 2 núcleos interaccionando con un tercero

• Núcleos sin relación y los 2 crosspeaks caen

casualmente en el mismo lugar

Para poder discernir entre estas posibilidades se hace un

R-Cosy.

En estos experimentos, se irradia con secuencias de

pulso de tiempos intermedios donde interaccionan los spines:

� COSY � interacción escalar

Brenda Fina


� NOESY � interacción dipolar

En proteínas de gran tamaño, la resolución del 2D no es suficiente, entonces se realiza un 3D, que al

igual que en el 4D, se usan los trazos bidimensionales.

Otra manera de resolver los espectros es con la utilización de Heteronucleos, en los cuales se puede

ver la correlación H—N o H—C.

Relayed COSY (R-COSY): si hay dos señales que caen en la misma zona de frecuencia, esto puede

deberse a núcleos que están interaccionando con un tercero en común o simplemente son núcleos que no

tienen nada que ver. Para diferenciar entre estos dos casos, se realiza este

experimento que produce un espectro en el cual veo crosspeaks entre núcleos

que están interaccionando con un tercero en común. El crosspeak no significa

que están interaccionando entre ellos. De esta forma, si A y C están

acoplados a B de forma independiente, voy a ver un crosspeak formado

por A y C a la altura de B. si vuelvo a tener una superposición de picos �

hago un DR-COSY o un TOCSY.

Total correlation spectroscopy (TOCSY): me permite ver núcleos que están acoplados directamente y

núcleos que están acoplados a un tercero en común, es decir que es la sumatoria del COSY y R-COSY. Sirve

para caracterizar los sistemas de spin completos: hay un sistema de spin para cada AA, pudiendo

reconocerse entre que residuos están involucrados.

RMN Heteronuclear

Se marca la proteína con 15N o 13C y se estudia la interaccion H—N o H—C. Esto tiene la ventaja de

que estos núcleos, por lo general, tienen J de 1er orden, porque solo están separados por un solo enlace y la

interaccion es muy fuerte. Además, una proteína tiene menos cantidad de N y C que de 1H. Estos C y N son

más sensibles al ambiente químico, entonces tienen más rango de desplazamiento químico, por lo que las

señales están más dispersas y menos superpuestas � ↑Resolución.

Para marcar con 15N: se trabaja con proteínas recombinantes, expresadas en una bacteria.

Para marcar con 13C: también se trabaja con proteínas recombinantes.

En general esto posee un problema intrínseco: los heteronucleos activos son menos abundantes en la

naturaleza y tienen ctes giromagneticas γ muy bajas, entonces son muy difíciles de observar �

↓sensibilidad

Brenda Fina


Para resolver el problema de las ↓γ se desarrollo la Detección de Heteronucleos mediante 1H (HSQC).

Es un experimento de detección inversa, se detecta la señal del heteronucleo a través del protón que es más

sensible y más abundante, es decir, se excita al heteronucleo, le pasa la información al 1H y uno lo detecta.

Se aplica un pulso excitando los 1H, lo cual es transferido a los 15N; se deja relajar y se aplica otro pulso a

distintos tiempos, observando así como el N le transfiere la magnetización al H. Así se puede determinar si el

N esta asociado al H. Los 1H que están interactuando con los núcleos marcados van a tener frecuencias

distintas a la frecuencia de Larmor de los que no estén interactuando.

Espectroscopia de Magnificación del Overhauser Nuclear (NOESY)

Secuencia de pulsos que permite ver el acoplamiento dipolar. La secuencia de pulso es 90°-t1-90°-τm-

90°-t2-adquisición de datos. En el delay de equilibrio y el pulso inicial de 90º, se prepara al núcleo llevando el

M al plano xy. Durante t1 los núcleos son marcados por frecuencias por sus valores de desplazamiento

químico. El 2do pulso de 90º rota parte de la magnetización de nuevo al

eje z. Durante el τm la magnetización longitudinal puede relajarse, esto

produce una mezcla de magnetización entre núcleos que están

relacionados por el mecanismo de relajación dipolar. El tercer pulso es

necesario para llevar la magnetización al plano xy y poder detectar la

señal durante el período t2. Los componentes de magnetización que no intercambien con otras

componentes durante τm, mantienen sus frecuencias iguales en t1 y t2. Por esta razón, los picos

correspondientes caen sobre la diagonal en el espectro. Por otro lado, un intercambio de magnetización

entre dos componentes debido al acoplamiento dipolar durante el período de mezclado se manifiesta con el

cruce de picos (crosspeaks).

Fundamentalmente, el espectro en dos dimensiones de NOESY muestra todas las combinaciones

posibles de protones en la molécula. Un cruce de picos (crosspeaks) indica que la pareja de protones está

separada por menos de 5Å, mientras que la ausencia de pico indica una distancia mayor.

15N

1H

Brenda Fina


Espectroscopia de Relajación Transversal Optimizada (TROSY)

Esta técnica fue desarrollada para superar las limitaciones que presentan otras técnicas debido al

aumento de la fuerza del campo magnético externo. En experimentos heteronucleares generales, se

produce un gran aumento en el ancho de banda debido al alto grado de relajación transversal que se

produce en campos magnéticos fuertes.

En la técnica de TROSY, primero se crea la

magnetización del protón. Después, ésta es transferida al

núcleo 15N por un elemento que transfiere la polarización.

Después de la “frecuencia de marcado” de la

magnetización del 15N durante el período de evolución, t1,

la magnetización es transferida nuevamente a 1H por un

elemento que transfiere polarización reversa y detectada en 1H durante el tiempo de adquisición, t2. La

proporción de de relajación transversal nuclear aumenta con la masa molecular de la molécula.

Esta técnica utiliza el desacoplamiento de los núcleos durante los períodos de evolución y adquisición

para tener espectros más simples y mejorar la sensibilidad. No obstante, a campos magnéticos altos, la

anisotropía del corrimiento químico (CSA) de los núcleos de 1H, 15N y 13C pueden ser fuentes importantes de

relajación transversal, además de la relajación del acoplamiento dipolar que está siempre presente. TROSY

explota constructivamente la interferencia entre la relajación del acoplamiento dipolar y la relajación de la

anisotropía del corrimiento químico (CSA), y utiliza la relajación CSA a campos altos para cancelar la

relajación dipolar independiente del campo. Usando esta técnica, la estructura de multiplete se desacopla

pero sólo la línea más angosta y con la relajación más lenta de cada multiplete es retenida.

RMN Multidimensional Homo y Heteronuclear

Al igual que en RMN en dos dimensiones, los ejes en tres y cuatro dimensiones corresponden a tres y

cuatro dominios de frecuencia, respectivamente. Los períodos que constituyen las secuencias de pulsos son

básicamente las mismas, sólo que se van agregando etapas antes de la detección:

2D RMN: Pa→Ea(t1)→ Ma →Da(t2)

3D RMN: Pa→Ea(t1)→ Ma →Eb(t2) →Mb →Db(t3)

4D RMN: Pa→Ea(t1)→ Ma → Eb(t2) →Mb →Ec(t3)→ Mc →Dc(t4)

La aplicabilidad de experimento en tres dimensiones con homonúcleos está limitado a moléculas con

masas iguales o menores que 10KDa. En cambio, el experimento en tres y cuatro dimensiones con

heteronúcleos permite el estudio de moléculas con masas de 25KDa. El principal objetivo de los

experimentos de RMN heteronucleares es obtener la mayor cantidad de picos 1H-1H NOE individuales en el

sistema estudiado.

Alineamiento Estérico Inducido

Se trata de una nueva clase de experimento basado en la anisotropía de las interacciones magnéticas

que normalmente no son observadas en espectros de RMN de alta resolución es estado líquido. Los

experimentos dan restricciones estructurales de largo alcance que están basadas en la orientación, y no en

la distancia. Dependen de la medición del acoplamiento dipolar residual, y, en algunos casos, del CSA bajo

condiciones particulares.

Brenda Fina


Acoplamiento Dipolar Residual

El acoplamiento dipolar es una interacción entre núcleos vecinos que se produce porque la corriente

magnética de uno de los núcleos afecta el campo magnético estático que está experimentando el otro

núcleo. La componente z del campo dipolar del núcleo I cambia la frecuencia de resonancia del núcleo S en

una magnitud que depende de la distancia internuclear, r, y del ángulo entre los vectores internucleares I-S y

la dirección del campo magnético externo, B°.

La interacción dipolar, DIS, está dada por,

DIS = cte (γIγShµ°/4π2r

3IS) ‹(3cos2θ-1)/2)›

Los símbolos ‹› denotan un promedio de tiempo.

En una solución isotrópica, la interacción dipolar internuclear es cero debido al difusión Browniana

rotacional. Como consecuencia, un espectro de RMN de una solución muestra líneas de resonancia finas;

pero no tiene información rotacional valiosa. La mayoría de las biomoléculas presentan algún grado

susceptibilidad anisotrópica magnética que provoca su alineamiento en un campo magnético y lleva a un

movimiento Browniano anisotrópico (tumbar), pero este alineamiento no es muy efectivo.

Se puede conseguir un buen grado de alineamiento en un campo magnético si se utilizan agentes

orientacionales, como ser. Bicelas fosfolípidas planas, virus o fagos con forma de vara, membranas y geles

poliméricos. En el caso de las bicelas, las proteínas y péptidos se alinean por la presencia de superficies

discoidales orientadas. En una solución acuosa la proteína tumba rápidamente, pero de forma anisotrópica,

en el espacio interbicelar. En el caso de fagos, las biomoléculas parecen alinearse debido a un mecanismo

estérico y no por la unión de las macromoléculas con el fago. El alineamiento parece estar inducido por

colisiones entre la molécula asimétrica y el fago alineado magnéticamente. Con estos agentes logro una

mayor resolución el espectro de RMN.

Anisotropía del Corrimiento Químico (CSA)

Los corrimientos químicos también son interacciones de espín anisotrópicas y pueden contribuir con

información estructural. El corrimiento químico surge porque núcleos en distintos grupos funcionales

resuenan a distintas frecuencia dependiendo del apantallamiento electrónico del entorno. Los entornos

electrónicos son rara vez isotrópicos, entonces los apantallamientos son distintos según la orientación que

tengan los grupos funcionales. Por esta razón, el corrimiento químico tiene una dependencia angular que es

similar a la del acoplamiento residual.

Los resultados con macromoléculas orientadas muestran que el acoplamiento dipolar residual y CSA

no tienen más un valor de cero y pueden ser medidos. Los parámetros resultantes dan una valiosa

información estructural.

Brenda Fina


RMN DE PROTEINAS

En RMN se puede elegir lo que quiero ver, se hacen experimentos de secuencias de pulsos (al C, al N

o al H) para ver selectivamente algunas cosas. Los distintos experimentos lo que hacen es mandar al plano

xy lo que quiero ver y dejar perpendicular lo que no quiero ver.

Antes de hacer las asignaciones y ver estructuras por RMN es indispensable conocer la frecuencia de

AA de la proteína.

Como primera medida tenemos que tener en cuenta que no TODOS los núcleos están mutuamente

acoplados. Cada AA da lugar a un sub-espectro diferente (sistema de spin: NH—CH—R) que es más simple

que el espectro completo de la proteína.

Regiones del espectro corresponden a diferentes partes de los AA y la estructura terciaria incrementa

la dispersión de las resonancias, es decir, los α no van a estar todos juntos en una zona sino dispersados por

el espectro.

1) Lo primero que se debe hacer es la asignación de la secuencia, es decir, poner a cada señal

una etiqueta (decir a que residuo pertenece cada C, N o H). Para esto se debe conocer la secuencia de AA.

Estrategia básica para asignar resonancias en una proteína

I. Identificar las resonancias para cada AA � sistema de spin por acoplamiento escalar.

Interacciones del

backbone

(Tener cuidado

con la Gly y Pro)

HN-Hα

Aromáticos

Hα-Hβ Metil (Leu, Val, Ile)

Metil (Ala, Thr)

T G

L S

S R

G

Brenda Fina


II. Poner los AA en orden � acoplamiento dipolar

• Asignación secuencial (R-G-S, T-L-G-S) � se debe poner no solo el nombre del residuo (Cys) sino

también la posición en la secuencia (Cys134)

• Asignación especifica de secuencia R1-G2-S3- T4-L5-G6-S7

I. Lo que primero se hace es analizar la zona de mayor dispersión, es decir, la de los HN (entre 7 y 10

ppm); se mira en la zona de HN-H

α, es decir, veo el enlace peptídico. Es la zona de mayor dispersión porque

hay pocos NH y abarcan mayores desplazamientos químicos.

COSY � el acoplamiento escalar permite identificar cada sistema de spin de cada AA. (2D

HOMONUCLEAR)

Excepciones: la Pro no tiene NH y la Gly tiene 2 Hα.

Cada NH ve su propio Hα porque para observar el Hα del AA siguiente hay 4 enlaces y no se ve

acoplamiento. El Hα entonces se acopla con el NH y con la cadena lateral, es decir, Hβ, Hγ, etc � esta

empaquetado en un sistema de spin NH—CH—R.

Las constantes de acoplamiento 3J están restringidas a cada AA.

Los espectros suelen ser simétricos con respecto a la diagonal. Como cada AA tiene un sistema de

spin característico, se puede ir sabiendo que AAs componen la estructura primaria de la proteína, porque se

conocen los patrones de spin de cada AA. En la huella dactilar (HN-Hα) se cuentan los picos � número de AA.

Así: COSY (1 acoplamiento) → R-COSY (2 acoplam) → DR-COSY (3 acoplam) → TOCSY (todos)

Brenda Fina


Cada NH en cada línea voy a tener el sistema de spin completo. Ventaja: no tengo que mirar la zona

de alifáticos (picos muy juntos) y no se superponen.

También se mira la zona de los Hα entre 4 y 6 ppm para ver que protones están acoplados con que

NH. Pero para poder distinguir en que posición están (por ejemplo 2 Gly) se hace el NOESY.

II. NOESY � se observan los picos de los residuos i a (i+1). Se mira específicamente quien es el que

tiene al lado, acoplamiento interresiduo. Los crosspeaks son para distancias < 5Å. La intensidad de cada pico

se relaciona con la distancia internuclear. En el NOESY no hay regiones selectivas, se ven 4 cuadrantes y las

interacciones de todos con todos. Si con el COSY ya se cuales son los protones y me anoto los

desplazamientos químicos, voy al espectro de NOESY y miro esos protones y veo si están cerca (crosspeak) o

están lejos (no crosspeak), entonces, saco la DISTANCIA. Lo puedo usar cualitativamente (están cerca o lejos)

o cuantitativamente (saco distancia a través de la intensidad del pico).

Los experimentos NOESY pueden utilizarse para detectar acoplamientos dipolares de corto, medio y

largo alcance.

En general, lo que se hace es COSY-NOESY WALK

Brenda Fina


Para evitar esta tarea tan ardua, también se puede hacer un EXPERIMENTO DE DOBLE MARCA CON

HETERONUCLEOS.

2) Asignación de cadenas laterales � COSY

Se utiliza el COSY, pero ahora se trabaja en la zona donde interacciona el Hα con el resto de la cadena

lateral, por ejemplo con el Hβ; uno corrobora con la frecuencia. Existe un diagrama de conectividad para

cada AA: los patrones de acoplamiento entre los protones de un AA van a ser siempre los mismos, van a

cambiar los desplazamientos químicos debido a que el ambiente es distinto.

Se mira en la zona de Hα- H

ββββ.

3) Estructura secundaria

Este es un paso intermedio entre la asignación y la estructura terciaria. Si se quiere ver estructura

secundaria, se puede estudiar solamente asignando el backbone, sin necesidad de las cadenas laterales,

porque toda la información la tengo asignando los NH y los α. En el caso que tengamos proteínas complejas

que no me interesa la estructura, pero quiero ver la interacción dinámica, no necesito asignar cadenas

laterales. Se puede obtener datos de estructura secundaria a partir de: desplazamientos químicos,

acoplamientos dipolares, acoplamientos escalares, cte de acoplamiento J y ángulos de torsión. Se puede

hacer mediante la medición de NOEs o de J-couplings.

Así para estudiar la estructura secundaria se tienen que plantear las restricciones; se puede medir:

� Distancia � NOESY

� Desplazamiento químicos � con HETERONUCLEOS

� Ángulos diedros � se calculan con los J � 1D 1H-1H o COSY

En cada estructura secundaria tengo geometrías que se repiten, voy a tener distancias (acop dipolar)

típicas de cada estructura secundaria y ángulos diedros (acop escalar) que se repiten en α y en β.

Se pueden usar los desplazamientos químicos, sobre todo de heteronucleos, como sensores de la

estructura secundaria. Siempre los heteronucleos son mucho más útiles porque tienen más dispersión

intrínseca que el protón.

Brenda Fina


Otra cosa que se puede utilizar son los NOEs, el acoplamiento dipolar. En el caso de la α-hélice,

después de una vuelta, voy a tener NOEs entre un residuo y el otro que esta 4 mas adelante en la secuencia.

Si hay un NOE entre una Gly de una punta con una Ala de la otra punta, quiere decir que es una α-hélice,

nunca puede ser una hoja-β. Voy a tener distancias características de las hojas-β y voy a poder diferenciar

paralelas de anti-paralelas. Ventaja: voy a poder asignar residuo por residuo en que estructura esta y no solo

hablar de porcentaje como en dicroísmo.

Distancias típicas para distinguir un α-hélice de una hoja-β: además de tener un NOE entre un residuo

y el que esta 3 o 4 posiciones mas adelante, en la α-hélice voy a tener un NOE muy intenso entre los NH de

residuos contiguos, mientras que en una hoja-β voy a tener un NOE muy intenso entre el Hα y el NH de

residuos contiguos.

El otro criterio que tengo es que las constantes de acoplamiento J las puedo correlacionar con los

ángulos diedros. Valores característicos: un α-hélice tiene una J=4hz, las hojas-β J=9-10 Hz e incluso hay

diferencia entre las que son paralelas y antiparalelas.

Brenda Fina


Para calcular las J se pueden hacer 2 experimentos:

1. Espectro común, 1D 1H-

1H, pero como se ve hay mucha superposición de los picos, por lo que se

hace un 2D 1H-1H (COSY).

2. En un COSY con la proteína acoplada, de modo que se pueda ver bien el coplamiento:

4) Estructura terciaria

Para determinarla se miden los NOEs entre residuos que están alejados en la secuencia, pero cercanos en el

espectro. Esto se denomina NOE de largo alcance: se ingresan los datos en una compu y se obtiene una

familia de estructuras posibles (DYANA).

La desviación media estándar (rmsd) es un parámetro que da medida de la confianza que se le puede

tener a la estructura.

Un ↑rmsd indica que hay mucha movilidad, por lo tanto, da incertidumbre. Un rmsd<1 es una buena

aproximación a la estructura.

Brenda Fina


Métodos de marcado

Para introducir 15N o 13C se utilizan, por lo general, métodos biosintéticos utilizando como organismo

huésped a E. Coli, levaduras, etc. En general, los reactivos son: 15NH4Cl, [13C] glucosa y D2O.

En general:

• 1H 1D: hasta 10KDa

• 1H-15N 2D: hasta 15KDa (preferible por su bajo costo)

• 1H-15N-13C 3D: hasta 20KDa (más caro)

• 1H-15N-13C-1H: hasta 20-30KDa

• TROSY: hasta ahora no hay límites

1H-15N HSQC: detecta el acoplamiento escalar de un enlace (1

J). Veo una señal 1H-15N por cada

residuo, así tengo un patrón general de toda la proteína. Sirve para distinguir plegamiento de proteínas.

Aumenta la resolución

Brenda Fina


Estrategia 1H homonuclear extendida: cuando el backbone 1H se superpone � se utiliza la dispersión

con 15N � Heteronuclear 3D aumenta la resolución (15N Dispersed 1H-1H TOCSY)

Experimento de pares, doble marca

Se marca con 15N y con 13C. Se observan residuos consecutivos, no necesita el NOESY. Lo que se hace

es seleccionar los J de primer orden los enlaces que se quieren ver, porque los J de los distintos enlaces son

distintos.

Por ejemplo: HNCA/HN(CO)CA (3D)� en este caso se ve la interacción del HN con el Cα del mismo

AA (intramolecular) o del AA contiguo (intermolecular), pasando por el C=O.

1H↔ 1H ↔15N

TOCSY HSQC

Brenda Fina


1. HNCA �� el HN ve el Cα de su propio AA

2. HN(CO)CA � El HN ve el Cα del AA contiguo.

Brenda Fina


ESTUDIOS ESTRUCTURALES Y DINÁMICOS

Del análisis de los datos obtenidos por RMN, se obtiene aproximadamente un grupo de 50 modelos

estructurales; esto es distinto a lo que sucede con cristalografía de rayo X que genera sólo un set de

coordenadas dando lugar a una estructura. Por esta razón, los modelos obtenidos por RMN deben ser

juzgados por distintos criterios que los obtenidos por de estructuras más rígidas en cristalografía.

Indistintamente del algoritmo utilizado, cualquier estructura determinada por RMN busca un mínimo

de la función Etot, dada por,

Etot = Ecov + Evdw + ERMN

Donde: Ecov: representa la geometría covalente (enlaces, ángulos, planaridad y quiralidad).

Evdw: representa los contactos que regiones que no están enlazadas.

ERMN: representa las restricciones obtenidas por RMN.

Los dos primeros términos tienen asociada mucha incertidumbre, y la mayor determinación de

precisión reside en las restricciones de RMN.

El experimento de RMN que aporta mayor cantidad de información geométrica (o de restricciones

geométricas) es el NOE.

La exactitud de las estructuras obtenidas por RMN se ve afectada por errores en las restricciones de

las distancias interprotónicas, estos errores surgen de tres fuentes: mal asignamiento, errores en las

estimaciones de distancias y restricciones de NOE incompletas. La mejor forma de chequear cuan correctos

son estos datos es verificando que todas las distancias cortas interprotónicas (<3.5Å) estés en el espectro de

NOE. Además de las restricciones aportadas por el NOE, hay otros experimentos de RMN que aportan

información estructural de corto alcance como ser, cte de acoplamiento escalar de tres enlaces, corrimiento

químico secundario 13C, y corrimiento químico de 1H. Hay otros experimentos de RMN que aportan

restricciones que definen información estructural de largo alcance. El primer experimento se basa en la

dependencia de las ctes de tiempo de relajación transversal (T2) y longitudinal (Tl) de los heteronúcleos (15N

o 13C) con la difusión rotacional anisotrópica. El segundo experimento depende del acoplamiento dipolar

residual en macromoléculas orientadas. Estos dos experimentos aportan restricciones que están

relacionadas de manera geométrica a la orientación del vector de un enlace internuclear con respecto a aun

tensor externo. En el caso de T1/T2, el tensor es el tensor de difusión; y en el caso del acoplamiento dipolar

residual, el tensor puede ser el tensor de susceptibilidad magnética o el tensor de alineamiento molecular.

Ambos métodos permiten el posicionamiento relativo de elementos estructurales que no tienen una

distancia interprotónica corta.

Estructura en Tres Dimensiones de Macromoléculas Biológicas

Proteínas:

� Proteínas pequeñas (6-10 KDa): en principio, la estructura de proteínas compactas y pequeñas de

100 AA o menos puede ser determinada con las restricciones de NOE. En la práctica, estas restricciones se

suplementan con restricciones basadas en acoplamiento J y en el corrimiento químico.

� Proteínas medianas (20-60 KDa): se utiliza marcado con isótopos. En la técnica de doble marcado,

un tipo de AA se marca con 13C en la posición del carbonilo y un segundo tipo de AA se marca con 15N.

Fragmentos de dipéptidos en los que un 13C prosigue un 15N, se pueden identificar fácilmente vía el

desdoblamiento de los picos por el acoplamiento J en un espectro de correlación 1H-15N. Para proteínas de

150-200 AA, el enriquecimiento completo de la proteína con isótopos y el desarrollo de RMN tridimensional

Brenda Fina


permite que el análisis estructural sea más fácil. Sin embargo, el estudio de proteínas con más de 200-300

AA todavía resulta dificultoso. Para estos casos, la sensibilidad ha mejorado gracias a la técnica de

deuteración (marcado con deuterio, 2H) al azar. El nivel de deuteración depende de la masa molecular.

� Complejos moleculares grandes: las técnicas de TROSY y CRINEPT fueron desarrolladas para estos

casos y tienen muy buenos resultados.

� Interacción proteína-proteína: se ha desarrollado una técnica de RMN para estudiar residuos de la

interfase. Ésta se basa en que la proteína target no esté marcada mientras que el ligando proteico sí (2H-15N), excepto por sus protones amidas. Si se aplica un campo de radiofrecuencia a los protones alifáticos (1H)

de la proteína target, sus protones aromáticos y amidas se saturan debido a la difusión de espín (este

fenómeno es altamente efectivo si los espines de 1H se encuentran cerca). La saturación puede ser

transferida desde la molécula target a la molécula marcada a través de contactos cercanos entre 1H-1H de la

interface formada por el complejo.

Ácidos Nucléicos:

El NOE arroja restricciones insuficientes para la determinación de la estructura porque los ác

Nucléicos tienen baja densidad de protones (0.35) y no presentan un plegamiento globular. Estas

limitaciones se superaron con el desarrollo de marcado isotrópico selectivo y el alineamiento molecular en

medios ordenados. En moléculas con múltiples dominios, se puede utilizar acoplamiento dipolar para

determinar la orientación relativa de los distintos dominios. Para aplicar esta técnica es necesario saber la

estructura secundaria de los dominios. RMN permite una observación directa de los puentes hidrógeno

entre las pares de bases a través del acoplamiento escalar entre los protones aminos, el dador y el aceptor.

Carbohidratos:

Estos compuestos presentan gran movilidad, tienen dos tipos de movimientos internos: uno consiste

en un movimiento modesto en el que el ángulo diedro se mueve ±15°; y el otro es un movimiento más

pronunciado de los ángulos diedros. En este último caso, el NOE no puede asociarlo a una única

conformación y la molécula se considera como un grupo de conformeros. El avance en RMN de alta

resolución permite medir el acoplamiento dipolar en medios orientados. En algunos casos, se mide el

acoplamiento dipolar residual como la diferencia entre el acoplamiento en un medio orientado y el

acoplamiento en un medio isotrópico.

Dinámica de Macromoléculas Biológicas

Muchos experimentos de RMN permiten monitorear la dinámica de las macromoléculas en un rango

de tiempo amplio. Por ejemplo, la relajación nuclear de espín es sensible a movimientos que ocurren en

tiempos más cortos que la correlación molecular (10-20ns); el intercambio de corrimiento químico entre dos

sitios ocurre en micro o milisegundos; y los efectos de resolución espectral y el ensanchamiento de banda

ocurren en el orden de los segundos. Estas características permiten que RMN sea una técnica única para el

estudio de dinámica.

RMN permite estudiar:

� Funcionalidad de una molécula

� Movilidad

� Contribuciones entrópicas a los fenómenos de unión

� Folding – unfolding

Para los fenómenos biológicos, tenemos distintas escalas de tiempo. Dentro de los mas rápidos se

encuentran la rotación molecular o las reorientaciones de bucles.

Brenda Fina


Intercambio químico

Se encuentra dentro de los fenómenos más lentos.

Un cambio conformacional puede deberse a:

• Unión de un ligando

• Temperatura

• Solvente

Un residuo puede protonarse y desprotonarse, por lo que se esperan 2 señales: una para la forma

protonada y otra para la protonada. Sin embargo, debido a la escala de tiempo, éstas 2 señales no se

observan; se ve un promedio de las señales. Para que pueda ser visto por RMN, le velocidad de

intercambio del fenómeno tiene que ser menor que la diferencia de frecuencia de ambos.

Se observa que k depende de la temperatura � ↑T → ↑intercambio. Para considerar a un proceso

rápido, la velocidad debe ser 3-4 veces mayor que ∆W, esto puede obtenerse con el δ.

Consideremos que tenemos una Y disuelta en agua, la cual tiene 4 1H aromáticos con 2 tipos de 1H

equivalentes � se ven 2 señales. En una proteína, obtendré 4 señales porque dejara de haber 1H

equivalentes; sin embargo, si ↑T, las 4 señales pasan a 2, lo que sugeriría que al ↑T la Y empieza a tener

movilidad.

Brenda Fina


Otra posibilidad es disolver la proteína en D2O y se observa el subespectro de 1H en la zona de 7-10

ppm a distintos tiempos. Cuando ↑T va aumentando el intercambio N-1H que se vuelven N-D � van

desapareciendo progresivamente crosspeaks (porque D2O no tiene señal en RMN). Luego, depende de la

exposición al solvente y la velocidad de intercambio � sirva para el estudio de Folding.

Dinámica de proteínas provenientes de medidas de relajación

Asumimos que los movimientos atómicos internos de una macromolécula son independientes de su

geometría global y provienen de tumbos o de la difusión transversal. Es decir, que el tiempo de correlación

efectivo interno, τe, es mucho menor que el tiempo de correlación rotacional, τc (tiempo de correlación: es el

tiempo característico entre fluctuaciones significantes del campo magnético local que experimenta un espín

debido a la movilidad molecular). Las tres velocidades de relajación medidas por RMN, R1=1/Tl, R2=1/T2 y la

heteronuclear NOE, son sensibles a la movilidad interna en la escala de los nanosegundos.

En un modelo, se obtienen dos parámetros independientes: el parámetro de orden, S2, que es la

medida de las restricciones espaciales del movimiento; y τe.

El parámetro de orden, S2, mide la magnitud de la fluctuación angular del vector de un enlace químico

en la proteína, por lo tanto, refleja la flexibilidad de la cadena en ese sitio. S2 se interpreta como si estuviera

describiendo la cantidad de libertad espacial que tiene el vector µ como resultado de la movilidad interna. Si

el vector µ difunde en forma de cono, S2 decrece rápidamente a medida que el ángulo del cono θc aumenta

de 0° a 75°. Si la movilidad del vector es completamente libre, es decir que todas las orientaciones de µ son

Brenda Fina


igualmente probables, S=0; mientras que si la movilidad está completamente restringida, S=1. Esto se

estudia con marcado de 15N.

Mediante T1 y T2 puede determinarse si es la mayor movilidad la razón para los valores altos de rmsd

en una familia de estructuras.

Interacción con un ligando

Hay experimentos que determinan si una conformación es igual cuando se une un ligando. Se realiza

midiendo transferencia de NOE. Se hace un NOE entre 2 1H cuando el ligando esta libre y dará una distancia,

si cambia la distancia cuando se une el ligando, entonces cambio la conformación.

También puede estudiarse por desplazamientos químicos.

Existe otro NOE especial � NOE editado que se basa en colocar filtros que seleccionan NOEs de 2

moléculas con un patrón de marcado único.

Dinámica de Proteínas provenientes del intercambio del protón amida

El intercambio entre el protón amida en proteínas y el solvente puede ser medido de diferentes

maneras. Los intercambios lentos (de minutos a días) son determinados siguiendo la pérdida de la señal del

protón amida de una proteína disuelta en D2O, y provee información sobre la accesibilidad relativa del

solvente a los distintos compartimentos de la estructura secundaria y terciaria. Los intercambios rápidos (5-

500ms) pueden ser monitoreados siguiendo el intercambio de la magnetización del protón amida con los

protones del agua. A pH altos, el intercambio de protones es muy rápido, y el intercambio de la

magnetización mide directamente la velocidad límite de abertura conformacional que permite el acceso del

solvente.

Parámetros de dinámica de RMN

• Número de señales por átomo: múltiple señales para intercambios lentos entre estados

conformacionales.

• Ancho de banda: angostos para movimientos rápidos, anchos para movimientos lentos; depende

de la masa molecular y del estado conformacional.

• Intercambio de NH con solvente: tiempos lentos. Requiere eventos de unfolding locales o globales,

los NH involucrados en enlaces se intercambian muy lentamente, las regiones flexibles o de superficie tienen

un intercambio rápido.

• Mediciones de relajación: R1, R2 y NOE heteronuclear.

La calidad de las estructuras obtenidas esta dado por rmsd (la desviación media cuadrática, rmsd) es

una medida utilizada con frecuencia de las diferencias entre los valores pronosticados por un modelo o un

Brenda Fina


estimador y los valores observados de la realidad. rmsd es una buena medida de la precisión. Puedo

comparar los resultados de rmsd con los de S2 para saber si los valores altos de rmsd se deben a una alta

flexibilidad de la región (S2 bajos).

RMN en estado sólido

Obtener información de un espectro de RMN en estado sólidos es mucho más complicado que en

estado líquido. Es necesario aplicar secuencias de pulsos más complicados, usar técnicas especiales para las

muestras y aplicar energías de radiofrecuencias superiores un campo magnético externo más fuerte.

La principal diferencia entre RMN en solución y en estado sólido es la movilidad de las moléculas en la

muestra. La principal restricción para muestras en solución es que deben tener un movimiento isotrópico

mientras que para muestras sólidas mientras más rígidas mejor. Esto refleja diferencia entre RMN en estado

sólido, donde observo sistemas anisotrópicos, y RMN en solución, donde veo sistemas isotrópicos. El rango

de masa molecular que puede ser estudiado por RMN en estado sólido no tiene límites. En realidad los

espectros de muestras sólidas ofrecen más información que los otros pero esta información está escondida

debajo de picos anchos y solapados. Para eliminar esta imitación, se coloca a la muestra en un ángulo

característico (“ángulo mágico”) con respecto al campo magnético externo y de esta forma se elimina el

término 3cos2θ-1, que está presente en el corrimiento químico y en el acoplamiento dipolar. Esto resulta en

espectros mejor resueltos con bandas más angostas.

Formación de imágenes por RMN (RMN imaging)

RMI se basa en utilizar un gradiente de campo magnético con el fin de dispersar las frecuencias de

resonancia de elementos con distintos volúmenes. En este experimento, se detecta la sensibilidad de cada

núcleo ante pequeños cambios en el campo magnético aplicado debido a los distintos microambientes.

Como estos cambios son muy pequeños es necesario aplicar un campo magnético homogéneo y fuerte a

través del volumen de la muestra. La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de espines por

unidad de volumen. Para obtener una imagen tridimensional, el objeto o el campo magnético deben rotarse

para producir distintas secciones en distintas direcciones, y luego el objeto es reconstruido usando

reconstrucción de imagen.

Tipos de experimentos:

Homonuclear Heteronuclear

Acoplamiento Escalar COSY HSQC

TOCSY TOCSY-HETERO

Acoplamiento Dipolar NOESY NOESY-HSQC

NOESY-HMQC

Calidad de la estructura obtenida por RMN depende de:

1. N° de restricciones

2. Rmsd del ensamblado estructural

3. Violación de las restricciones

4. Energía de moléculas

5. Comparación con homólogos

6. Calcular otra vez los parámetros experimentales

Brenda Fina


Aspectos prácticos

� B0 homogéneo

� Medio ambiente, temperatura, humedad, precisión

� Concentración:

• 1D � 100µM-10µM

• nD � 400µM-50µM

� volumen: 200-300µl

� pureza >95%

� sensibilidad (γ) →enriquecimiento con 15N y 13C

� mantener baja la fuerza iónica

� NO cristales

rmn, resonancia magnÉtica nuclear - … rmn.pdf · rmn, resonancia magnÉtica nuclear rmn es una...

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