revista fitopatología colombiana

2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2

POLÍTICA EDITORIAL FITOPATOLOGÍA COLOMBIANA

La revista FITOPATOLOGÍA COLOMBIANA es una publicación de la Asociación Colombiana de Fitopatología y Ciencias Afines

“ASCOLFI” con circulación semestral a nivel Nacional e Internacional. Está dirigida a todos los profesionales interesados en el estudio de las

enfermedades de las plantas, su control y manejo (Ingenieros agrónomos, investigadores, fitopatólogos, profesores, técnicos, extensionistas, etc) . También, se incluye a otros profesionales de ciencias afines, tales como biólogos, microbiólogos, botánicos, fitomejoradores, etc, y a

entidades representativas del sector agropecuario, centros educativos y a los centros de investigación nacionales e internacionales.

Está orientada hacia la publicación de artículos originales de carácter científico y técnico de interés fitopatológico. Incluye también notas

científicas de alta calidad, revisiones bibliográficas de naturaleza crítica, cartas al editor sobre información publicada, opiniones e ideas, recomendaciones y resúmenes de congresos.

Los trabajos deben ser inéditos. Aquellos presentados en congresos, simposios, conferencias o reuniones científicas pueden ser aceptados

para su publicación.

Las tesis de pregrado y postgrado, lo mismo que resultados de trabajos divulgados en forma preliminar de manera sucinta, en informes o avances técnicos también pueden ser objeto de publicación.

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mediante su cuerpo de asesores científicos. Los trabajos deben ser remitidos en original y dos copias, además del disquete o disco compacto

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realizados por el grupo de asesores científicos. El artículo corregido deberá enviarse nuevamente en un plazo máximo de 30 días. Una fe de

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Portada

Síntomas del Dasheen mosaic virus en hojas de Zantedeschia aethiopica (Ver más información pag. 64 )

.


CONTENIDO

FITOPATOLOGÍA COLOMBIANA

ISSN 0120-0143

VOLUMEN 35 NÚMERO 2 DICIEMBRE 2011

JUNTA DIRECTIVA ASCOLFI 2011-2013

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Vicepresidencia

Cristian Olaya Benjamín Pineda L.

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Tesorería

Diego Fernando Chávez Rodrigo O. Campo A.

Vocales

Omar Guerrero G. Cristian Noreña

.

Revisoría Fiscal

José Albeiro Arias

Representantes Internacionales

Francisco J. Morales Fernando Correa V.

Gabriel Cadena

Revista

“FITOPATOLOGÍA COLOMBIANA”

ÓRGANO DE DIFUSIÓN DE LA ASOCIACIÓN

COLOMBIANA DE FITOPATOLOGÍA Y CIENCIAS

AFINES- ASCOLFI

ISSN 01120-0143

Licencia de Min. Gobierno No 001808, Cali, Apartado Aéreo

5004, Nit. : 891 –301.725-6

Sociedad sin ánimo de lucro, Personería Jurídica 1097 de abril

1º de 1977

Editor

Benjamín Pineda L, Ing. Agr. M Sc.

[email protected]

COMITÉ EDITORIAL

Benjamín Pineda López Ing .Agr. – M Sc Fitopatología

Elizabeth Álvarez C. Ing. Agr. – Ph D Fitopatología

Francisco J. Morales G. Ing. Agr. – Ph D Virología

Jorge I. Victoria K. Ing. Agr. – Ph D Bacteriología

Rodrigo O. Campo A. Ing. Agr. – Ph D Fitopatología

Representante de publicidad

Gabriel Robayo V., Ing Agr, M.Art

Contacto Revista: Oficina Ascolfi, Km 1 Vía al Penal Granja

Corpoica C.I. Palmira, cel. +57- 3164303079

Palmira - Valle del Cauca – Colombia

Apartado Aéreo 5004- Cali- Valle del Cauca -Colombia

Correos electrónicos: [email protected]

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Página web: http://www.ascolfi.org/

Suscripciones y Canje: [email protected]

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Diseño y Diagramación: Benjamín Pineda L

Impresión: COMPUIMAGEN, Tel 2716528

Fecha de impresión: Diciembre de 2011

Tiraje 300 ejemplares

Publicación Indexada por COLCIENCIAS en la Categoría “C”

del Índice Nacional de Publicaciones Seriadas Científicas y

Tecnológicas de Colombia (Publindex). Referenciada interna-

cionalmente por el Índice Latinoamericano de Publicaciones

Científicas y Tecnológicas (Latindex).

Política Editorial .............................................................................. i

Evaluación in vitro de germoplasma de lulo

(Solanum spp.) bajo la presión de toxinas de

Colletotrichum acutatum Pedro Pablo Parra Giraldo, Rodrigo A. Hoyos, Elizabeth

Álvarez y Alonso González…………………………………….. 37

Identificación de microorganismos asociados

a la pudrición basal del estípite en palma de

aceite en la zona central palmera colombiana

Yuri Adriana Mestizo Garzón y Gerardo Martinez-L ………… 43

Selección de levaduras filosféricas con

potencial para el control biológico de

Botrytis cinerea

Alba Marina Cotes, Jimmy Zapata, Andrés Diaz, Magda García, Claudia Medina, Diana Cristancho,

Sonia Rodríguez, Fernando Rodríguez y Daniel Uribe ……..… 51

Proceso infectivo de la mancha de aceite

causada por Xanthomonas axonopodis en

gulupa (Passiflora edulis Sims) Solange Benítez, Wadith de León, Lina Farfán,

Sandra Castillo y Lilliana Hoyos ………………………..…….. 57

Identificación y caracterización del

Dasheen mosaic virus en Cala (Zantedeschia

aethiopica) en Córdoba, Argentina Eva E. Cafrune, Florencia Asinari, Claudia F. Nome,

María C. Perotto, Mariana Quiroga y Vilma C. Conci ……… 63

Identificación de arvenses como hospederos

naturales de Begomovirus en el Valle del

Cauca, Colombia Juan Carlos Vaca-Vaca, Dorian Otavo Fiscal y Karina

López-López ………………………………………………… 69

Fitopatología Colombiana, normas para la

elaboración de artículos…………....…………..……….…… 73

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mailto:[email protected]

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http://www.ascolfi.org/

Editorial

A propósito de la elección de la nueva Junta Directiva de la Asociación Colombiana de Fitopatología y Ciencias Afines efectuada

durante el xxx Congreso Colombiano y xvi Latinoamaericano de fitopatología vale la pena revivir una leyenda que por mucho

tiempo fue la inspiradora del trabajo en equipo, efectuado para sostener el propósito de mantener vigente a Ascolfi y su revista

Fitopatología Colombiana, a través del tiempo. Algo se ha logrado, no obstante ahora más que nunca, considero que es

importante evocar de nuevo la leyenda y tomarla con todo el fervor y la dedicación necesaria.

Para quienes no la conocen se la comparto y para quienes ya la conocen, les transfiero algunas de las deducciones que han

extraído otras personas que la han leído y analizado en la poderosísima “Web” que hoy hace que nuestro mundo sea realmente

una aldea global, con todas sus consecuencias.

Se trata de La leyenda: El vuelo de los gansos

“La ciencia ha descubierto que los gansos vuelan formando una “V” porque cuando cada ave bate sus alas, produce un

movimiento en el aire que ayuda al ganso que va detrás de ella. Volando en “V”, toda la bandada aumenta por lo menos en

71% más su poder de vuelo, que si cada ave lo hiciera sola. Cada vez que un ganso se sale de la formación y siente la resistencia

del aire, se da cuenta de la dificultad de volar solo y de inmediato se incorpora de nuevo a la fila para beneficiarse del poder del

compañero que va adelante. Los gansos que van detrás, producen un el graznido propio de ellos, y hacen esto con frecuencia, para

estimular a los que van adelante a mantener la velocidad. Cuando el líder de los gansos se cansa, se pasa a uno de los puestos de

atrás y otro ganso toma su lugar. Finalmente, cuando un ganso enferma o cae herido por un disparo, dos de sus compañeros se

salen de la formación y lo siguen para ayudarlo y protegerlo. Se quedan con él hasta que esté nuevamente en condiciones de volar

o hasta que muere, solo entonces los dos acompañantes vuelven a la bandada o se unen a otro grupo”

Deducciones

1ª Cuando compartimos una dirección común y tenemos sentido de comunidad, podemos llegar a donde deseamos, más fácil y más

rápido. Este es el beneficio de apoyo mutuo pues Debemos considerar que la unión hace la fuerza.

2ª Si tuviéramos la lógica de un ganso, nos mantendríamos con aquellos que se dirigen en nuestra misma dirección.

3ª Una palabra de aliento incrementa las fuerzas y produce grandes resultados.

4ª Todos debemos estar dispuestos a asumir responsabilidades. Obtenemos resultados óptimos cuando hacemos turnos para realizar

los trabajos difíciles.

5 ª Si tuviéramos la inteligencia de un ganso, nos mantendríamos siempre uno al lado del otro, ayudándonos y acompañándonos

Esto se llama: trabajo en equipo Unidos vencemos, divididos caemos.

Benjamín Pineda López

Editor Revista Fitopatología Colombiana


37

EVALUACIÓN in vitro DE GERMOPLASMA DE LULO (Solanum spp.) BAJO LA PRESIÓN DE

TOXINAS DE Colletotrichum acutatum*

Pedro Pablo Parra Giraldo1,2, Rodrigo A. Hoyos1, Elizabeth Álvarez2 y Alonso González2.

1Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín, 2Programa Frutas Tropicales Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT)

Autor para correspondencia: [email protected]

*Artículo científico, recibido para publicación el 30/05/2011, aceptado el 17/08/2011; galardonado con “Mención de honor al Premio Nacional de Fitopatología Gonzalo Ochoa,

Categoría estudiante”, otorgada durante el XXX Congreso Colombiano y XVI Latinoamericano de Fitopatología Bogotá (Colombia) Agosto 19 de 2011.

RESUMEN

La antracnosis causada por el hongo (Colletotrichum acutatum) afecta

el fruto tanto en su desarrollo como en su fase de post-cosecha. Hasta

la fecha no se han encontrado fuentes de resistencia genética en la

especie S. quitoense, por lo que el uso de híbridos interespecíficos se

sugiere como una solución. Este estudio tuvo como objetivo desarro-

llar una metodología que permita la evaluación in vitro de germoplas-

ma de lulo para buscar resistencia a C. acutatum basado en la aplica-ción de toxinas obtenidas del hongo. Los experimentos se realizaron

utilizando genotipos de lulo evaluados previamente por resistencia a la

enfermedad en condiciones de campo y laboratorio. El extracto crudo

de C. acutatum se obtuvo incubando discos de 0,5 cm de diámetro de micelio en medio líquido durante una, dos y tres semanas. El extracto

crudo del hongo se esterilizó por filtración y se aplicó al medio de

cultivo en diferentes proporciones (50, 25, 12.5, 8, 5, 3% v/v), sobre el

cual se sembraron ápices de 1,5 cm de longitud. El desarrollo de área foliar y de raíces de materiales con diferentes grados de resistencia se

evaluó cuatro y seis semanas después de siembra. Hubo corresponden-

cia entre el desempeño de los materiales en campo y las evaluaciones

realizadas en laboratorio; los materiales PL-35, PL-24, PL-19, PL-11 y PL-8 (Híbridos producidos por CORPOICA) considerados resistentes

presentaron los menores porcentajes de inhibición del desarrollo foliar,

2,6%, 20,5%, 20,1%, 21,2 y 8,7% respectivamente y los clones castilla

EC-28 y EC-39, susceptibles, expresaron una inhibición del 53,4% y 44,7%. Además el efecto del extracto crudo sobre los explantes estuvo

en función de la concentración y el tiempo de incubación. La metodo-

logía es reproducible y representa una alternativa para la evaluación de

germoplasma bajo condiciones in vitro.

Palabras clave: Extracto crudo, lulo, naranjilla, híbridos interespecífi-

cos, antracnosis, frutales

SUMMARY

In vitro evaluation of Lulo (Solanum sp) germplasm under Colleto-

trichum acutatum toxins pressure

Lulo, S. quitoense is affected by anthracnose (Colletotrichum acuta-

tum), resulting in high production costs and excessive use of pesti-

cides. Anthracnose, reduce crop productivity and increase post harvest losses. To date, no genetic resistance in the S. quitoense species has

been found, so the use of interspecific hybrids appears as a solu-

tion. This study aimed to develop an in vitro methodology to evaluate

lulo germplasm to find resistance against C. acutatum. The method was based on the application of culture extracts to the growing media

containing explants of lulo accessions previously evaluated for resis-

tance in field and laboratory conditions. The crude extracts of C.

acutatum were obtained by incubation of mycelia discs of 0.5 cm in diameter in liquid media for one, two and three weeks. The crude

extracts were sterilized by filtration and applied in several concentra-

tions (50, 25, 12.5, 8, 5, 3% v / v) to the culture media containing

apices of 1.5 cm in length. The development of leaf area and roots in accessions with different degrees of resistance was evaluated four or

six weeks after sowing. A good correspondence between the perfor-

mance of accessions in field and laboratory evaluations was shown,

the materials PL-35, PL-24, PL-19, PL-11 and PL-8 (Hybrids pro-duced by Corpoica) considered resistant had the lowest inhibition

percentages of leaf development, 2.6%, 20.5%, 20.1%, 21.2 and 8.7%

respectively, and the EC-28 and EC-39 “Castilla” accessions, suffered

inhibition of 53, 4% and 44.7%, respectively. Besides, the effect of the culture filtrate on the explants performance was a function of concen-

tration and incubation time, and resistance of the evaluated

germplasm. The methodology is reproducible and represents an alter-

native for evaluating germplasm under in vitro conditions.

Keywords: Crude extracts, interspecific hybrids, antracnose , fruits

INTRODUCCIÓN

El lulo (Solanum quitoense) Lam. es una

especie vegetal que en los últimos años ha cobrado importancia como cultivo y es utili-

zado como materia prima en la agroindustria

para la elaboración de mermeladas, dulces y

bebidas. En los últimos años el área de producción del cultivo se ha incrementado en

nuestro país (Ministerio de agricultura, 2006),

y la presencia de enfermedades y plagas ha

generado un excesivo uso de insumos agro-químicos que aumentan los costos de produc-

ción y adicionalmente generan residualidad

química con posibles efectos deletéreos sobre la salud humana.

La antracnosis representa un riesgo cre-

ciente y puede llegar a ocasionar grandes

pérdidas tanto a nivel de cultivo como de pos

cosecha (Tamayo, 2002), según el MADR, (2007) las pérdidas en pos cosecha en el

departamento del Huila, que es el mayor

productor de lulo en el país, oscilan entre el

18% y 25%. El costo del manejo sanitario de la an-

tracnosis puede variar entre un 2% y 16% de

los costos de producción, disminuyendo así la

rentabilidad del cultivo. Con el objetivo de encontrar una solución

genética, los mejoradores han buscado genes

de resistencia a estos problemas fitosanitarios en especies cercanas a S. quitoense; adicio-

nalmente, la biotecnología ofrece nuevas

herramientas para que los investigadores y

mejoradores seleccionen materiales resisten-

tes para avanzar en la generación de varieda-des que le permitan al agricultor garantizar la

sostenibilidad de la producción de lulo.

Este trabajo tuvo como objetivo dar un

primer paso en la selección de material vege-tal en condiciones in vitro con posible resis-

tencia a la antracnosis. La metodología repre-

senta una herramienta de ayuda para el mejo-

ramiento tradicional facilitando la obtención de materiales con estas características con las

características esperadas ahorrando tiempo y

recursos.

2011 Fitopatología Colombiana /Volumen 35 No 2 38

MATERIALES Y MÉTODOS

Siembra de material vegetal

Se sembraron individualmente ápices de 1,5

cm de longitud de los materiales susceptibles EC-39, EC-28 y del material resistente PL-

35, PL-24, PL-19, PL-11 y PL-8, en frascos

de 135 mL, con 20 mL de medio de cultivo A

de Lulo, que consta de sales Murashige y Skoog (MS), Tiamina HCL 0,5 mg/L, Panto-

tenato de calcio 2,5 mg/L, Pyridoxina HCL 1

mg/L, Ácido Nicotínico 5 mg/L, Azúcar 30

gr/L, Gel Rite 2,5 gr/L y pH 5,9 (Segovia, 2002; CIAT Annual report, 2003 y 2004).

Los materiales utilizados se evaluaron pre-

viamente en condiciones de campo y labora-

torio para determinar su resistencia a enfer-medades.

Para la siembra del material vegetal en

medio de cultivo con las diferentes concen-

traciones del extracto crudo se utilizaron ápices de aproximadamente 1,5 cm de longi-

tud a los cuales se le eliminaron las hojas. Se

sembró un solo ápice por frasco, el cual

constituyó una unidad experimental; esto se realizó con el fin de no generar competencia

entre las vitro plantas. Las unidades experi-

mentales se mantuvieron en cuarto de creci-

miento bajo condiciones controladas de tem-

peratura (28±2oC), con fotoperiodo 12-

horas/día, iluminación (1000 lux), proporcio-

nada por tubos fluorescentes.

Obtención del extracto crudo

Para la obtención del extracto crudo, inicial-

mente se reactivó el patógeno utilizando trocitos de micelio obtenidos a partir de

cultivos monospóricos de C. acutatum de los

aislamientos LM-41C y LM-44B de alta y

baja patogenicidad, respectivamente, conser-vados en tubos eppendorf con agua doble-

mente desionizada estéril. Los fragmentos

seleccionados se sembraron en medio de

cultivo PDA (39 gr/L con acido láctico 10 ml/L). Después de quince días de crecimiento

se tomaron cuatro discos de micelio de 0,5

cm de diámetro del aislamiento seleccionado

para inocular 250 mL del medio líquido MS (Nyange, 1997) contenido en erlenmeyeres.

Los recipientes se sellaron con película

plástica vinilpel® y se incubaron a tempera-

tura ambiente (23±2ºC), en condiciones de reposo y oscuridad durante una, dos y tres

semanas.

Durante la incubación de los cultivos en

el medio MS, se realizaron las observaciones requeridas para determinar los cambios ocu-

rridos.

Esterilización del extracto crudo

Para la esterilización del extracto crudo se

realizaron tres filtraciones con papel filtro

Whatman No. 1, seguidamente, se filtró dos veces con un filtro Whatman de 2,5 µm y

posteriormente con una unidad de filtración

desechable NALGENE® (50 mm de diáme-tro y membrana de nitrocelulosa de 0,22 µm),

para garantizar su completa esterilización. El

pH del extracto se ajustó a 5,9 con KOH 1M

antes de realizar la esterilización final con membrana de 0,22 µm, para no alterar el pH

del medio de cultivo MS al momento de

preparar diferentes concentraciones.

Adición del extracto sobre vitro-plantas

A vitro-plantas de cuatro semanas de edad,

obtenidas en cuarto de crecimiento, se adi-

cionó un mL del extracto del aislamiento

LM-41C obtenido después de una semana de incubación en medio líquido, procurando

aplicarlo directamente sobre la superficie del

medio de cultivo, evitando el contacto directo

con el tejido foliar. Los controles consis-tieron en plantas en medio de cultivo que no

recibieron el extracto.

Cuatro semanas después del tratamiento

se realizaron las observaciones pertinentes para determinar el efecto sobre las plántulas;

teniendo en cuenta la sintomatología expre-

sada y su localización, además del efecto en

el crecimiento

Siembra de materiales de lulo con diferen-

tes concentraciones del extracto crudo

Los extractos crudos obtenidos a partir de dos aislamientos de patogenicidad contrastante,

después de una semana de incubación, se

aplicaron al medio del cultivo en diversas

diluciones (V: V). El volumen total de medio de cultivo A de lulo utilizado se preparó en

un solo recipiente, para disminuir la variación

en la preparación de éste de un tratamiento a

otro; el volumen de medio para cada trata-miento se esterilizó en el autoclave por sepa-

rado y se le adicionó el volumen de extracto

crudo correspondiente a cada concentración,

se homogenizó antes de ser servido en frascos de 135 mL. Cada frasco recibió 20 mL de

medio con filtrado, se dejó enfriar y solidifi-

car por 20 minutos y se selló con Vinilpel

hasta su utilización. Los frascos se mantuvie-ron en observación por tres días para detectar

posible contaminación antes de sembrar el

material vegetal.

Las concentraciones del extracto crudo se establecieron a partir de una serie de experi-

mentos. La evaluación de cada experimento

permitió ir definiendo el efecto del tiempo de

incubación, la concentración del filtrado y las variables de crecimiento de los explantes que

mejor permitieron demostrar el efecto de la

toxina, y las diferencias entre los materiales

de lulo. En un primer experimento, ápices de 1,5

cm de longitud de los materiales PL-19 (re-

sistente), EC-28 y EC-39 (susceptible) se sembraron en el medio de cultivo A con una

concentración del 12,5% v/v de extracto

crudo de una semana de incubación de los

aislamientos LM-41C y LM-44B de alta y

baja patogenicidad, respectivamente (CIAT, 2009).

Los tratamientos control consistieron en

ápices sembrados en medio de cultivo A sin

adición de extracto crudo. El experimento se estableció en un dise-

ño completo al azar y arreglo factorial con

cuatro repeticiones por tratamiento. Las

evaluaciones se realizaron seis semanas después de siembra, teniendo en cuenta las

variables desarrollo de área foliar y peso seco

de raíces.

En experimentos posteriores se sembra-ron ápices de 1,5 cm de longitud sin hojas de

los materiales híbridos interespecíficos PL-

35, PL-24, PL-19, PL-11, PL-8 considerados

resistentes, y de los materiales castilla EC-28, EC-39 susceptibles; adicionalmente se inclu-

yeron materiales de la variedad comercial la

Selva P32, HO+G y HOF+G (híbridos inter-

específicos). Los materiales se expusieron a concentra-

ciones de 50%, 25%, 12,5%, 8%, 5% y 3% de

filtrado obtenido por la incubación en medio

líquido durante una semana del aislamiento LM-41C. Los frascos se mantuvieron en

cuarto de crecimiento en las condiciones ya

descritas.

Cuatro semanas después de siembra se realizó la evaluación basada en la medición

del desarrollo de raíces y tejido foliar, y se

calculó el porcentaje de inhibición del desa-

rrollo de los órganos, comparando el desarro-llo de las unidades experimentales sembradas

en medio con diferentes concentraciones en

relación al desarrollo de los explantes en el

tratamiento control sin adición de extracto crudo.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Cambios ocurridos durante la producción

del extracto crudo

Durante la incubación del aislamiento LM-

41C de alta patogenicidad, el pH del medio

líquido varió desde 6,0 hasta 2,68, 2,98 y

2,86 después de una, dos y tres semanas de

incubación respectivamente.

Plusky et al. (2001), y Yakoby et al.

(2000) sugieren como factor de virulencia

para Colletotrichum spp. la secreción de amonio al medio, con el consecuente incre-

mento en el pH, y está demostrado para el

caso de C. gloeosporioides una relación

directa entre este fenómeno y la activación de enzimas relacionadas con la degradación de

pectinas y en general en otros patosistemas

para la activación de enzimas degradadoras de la pared celular (Yakoby et al. 2000). Así

mismo Fernández et al. (2000) reportó que

dos razas de C. lindemuthianum crecidas en

medio de cultivo papa dextrosa alcanzaron el pico de producción de toxinas cuando el pH

del extracto crudo alcanzó la neutralidad pH

6,8 y 7,0 a los 20 días de incubación.


39

Según Shih et al. (2000) citado por Cerón et al. (2006), el crecimiento micelial in vitro

de Colletotrichum spp. presenta algunas

similitudes con el desarrollo necrótrofo, en lo

que se refiere a la expresión enzimática; así mismo Jayasinghe et al. (2001) reporta que

tanto en el cultivo in vitro como en el proceso

infectivo de C. acutatum in vivo se producen

enzimas con actividad poligalacturonasa, pectin liasa, enzimas celulolíticas (beta glu-

cosidasa y celobiasa) que degradan la pared

celular.

En contraste los resultados antes mencio-nados difieren de los obtenidos en el presente

trabajo donde se observó un descenso en el

pH del medio de cultivo después de una, dos

y tres semanas de incubación. Concuerdan con los resultados obtenidos por Patiño

(2009), quien reporta que 14 días después de

la incubación en medio líquido Murashige -

Skoog, el pH fue 2,86. Igualmente, este autor reporta que para la especie C. acutatum, las

enzimas se expresan y secretan a valores de

pH bajos alrededor de tres, donde se favorece

la producción de poligalacturonasas y liasas teniendo un efecto adverso sobre la estabili-

dad de las membranas y haciendo más sus-

ceptible la planta al ataque del hongo. El pH

inicial del medio líquido fue 5,9 y una sema-na después el pH para el aislamiento LM-41C

fue 2,5, y para el aislamiento LM-44B fue

2,8.

Efecto de la aplicación del extracto crudo

sobre vitro

Cuatro semanas después de la adición del

extracto crudo en los materiales castilla EC-28 y EC-39 se presentó inhibición en el cre-

cimiento, clorosis y necrosis en las hojas más

jóvenes y en el meristemo apical. El material

PL-19 considerado resistente, no presentó este tipo de síntomas a nivel foliar aunque se

presentó necrosis en las raíces en menor

proporción, la cantidad y longitud de raíces

disminuyó respecto al control (Figura 1). Las vitro plantas a las que no se les adicionó

extracto crudo, no presentaron síntomas.

García-Pajón et al. (2003) reporta que ensa-

yos realizados con filtrados crudos y solucio-nes de toxinas extraídos de Colletotrichum

capsici inhiben el crecimiento de raíces y

causan marchitez en plántulas de pimiento.

Estos resultados coinciden con los resultados obtenidos en el presente trabajo donde se

puede observar que la necrosis y clorosis en

los materiales castilla EC-28 y EC-39 son

diferentes a las observadas en el materia

hibrido PL-19.

Seis semanas después de siembra, se ob-

servó inhibición en el desarrollo de raíces y área foliar de ápices de los materiales PL-19,

EC-28 y EC-39 (Figura 2)

El número de hojas, área foliar y desarro-

llo de raíces fueron afectados significativa-mente por efecto del extracto crudo de ambos

aislamientos cuyo efecto sobre los explantes

fue estadísticamente iguales. Se encontraron diferencias significativas

en cuanto al desarrollo de área foliar entre los

materiales. El área foliar desarrolladas bajo la

influencia del filtrado de los dos aislamientos no varió en el material PL-19 pero si en los

dos materiales castilla, EC-28 y EC-39.

Se observó una reducción superior al

90% en el área foliar de los materiales casti-lla, y 40% en PL-19.

En el desarrollo de raíces se observó in-

hibición de aproximadamente 95% en los

materiales castilla, mientras que el material hibrido presentó inhibición del 4% con el

aislamiento LM-41C y 41% con el LM-44B.

Estos resultados coinciden con las evaluacio-

nes realizadas en campo y laboratorio, donde el material PL-19 es considerado resistente a

la antracnosis (CIAT, 2009). No solo se

presenta un grado de resistencia a nivel de

planta y fruto sino de los explantes en condi-ciones in vitro bajo la presión de toxinas.

Fernández et al. (2000) reporta que el

crecimiento de callos de los cultivares de

frijol susceptibles a Colletotrichum lindemut-hianum, ¨Collacia¨, ¨Andecha¨ y ¨Seronda¨ se

inhibió cuando se trataron con solución de

extracto al 12,5% obtenido a partir de una

raza de este hongo, mientras que para otra raza se requirió la adición del 25% de la

solución para inhibir por completo el creci-

miento de los callos. Estos resultados con-

Figura 1. Efecto del extracto crudo del aislamiento de alta patogenicidad LM-41C a vitro plantas de cuatro

semanas de desarrollo de los materiales A. PL-19, B. EC-28 y C. EC-39. Nótese el efecto sobre el desarrollo

de las plántulas, sistema de raíces y síntomas en el follaje.

Tratamiento - Aislamiento

Ctrl LM-41C LM-44B

Pes

o se

co r

aice

s (g

r)

0,000

0,001

0,0020,003

0,006

0,009

0,012

0,015

0,018

Ctrl LM-41C LM-44B

Are

a fo

liar

(cm

2 )

0

2

4

8

12

16

20

Ctrl LM-41C LM-44B

Num

ero

de H

ojas

0

2

4

6

8

10

PL-19

EC-28

EC-39

A B

C

Figura 2. Evaluación seis semanas después de siembra de los materiales PL-19, EC-28 y EC-39 sembrados en medio A con una dilución de 12,5% de extracto crudo obtenido a partir de la incubación durante una

semana en medio líquido de dos aislamientos LM-41C y LM-44B de patogenicidad contrastante de Colleto-

trichum acutatum A. Numero de hojas B. Área foliar C. Peso seco de raíces.


cuerdan con los obtenidos por Anderson, (1980) citado por Fernández et al. (2000)

quien menciona que hay diferencias fisiológi-

cas y bioquímicas en las propiedades de los

extractos de diferentes razas de la especie de este hongo.

Para el caso de C. acutatum en este estu-

dio no se observó una diferencia en cuanto a

la respuesta de los explantes al extracto crudo obtenido de dos aislamientos del hongo aun

cuando se observó una inhibición superior del

aislamiento LM-44B comparado LM-41C en

el material PL-19, al parecer el contenido de toxinas segregadas al medio del cultivo por el

hongo es similar.

Los diez materiales que se sembraron en

medio de cultivo con diferentes concentra-ciones del extracto crudo presentaron una

amplia variación en síntomas a concentracio-

nes de 3%, 5%, 8%, 12,5% y 25%, los mate-

riales castilla EC-28 y EC-39 considerados susceptibles, mostraron mayores porcentajes

de inhibición en el número de hojas que los

híbridos interespecíficos PL-11, PL-19 y PL-

24. A concentraciones de 3% y 5% no hubo

diferencias estadísticamente significativas

entre los híbridos interespecíficos, respecto a

sus correspondientes controles ni para el número de hojas ni para el área foliar.

El área foliar de PL-19 y PL-24 fue es-

tadísticamente diferente de los respectivos

controles a concentraciones de 8%, 12,5% y 25%.

Los clones que conforman el cultivar la

Selva, P-32, HOF+G y HO+G no presentaron

diferencias estadísticamente significativas de los controles a concentraciones 3% y 5% en

cuanto al área foliar; en general todos los

materiales presentaron alta variabilidad. En el

material P-32 se observó que las muestras tratadas con 3% y 5% de extracto crudo

tuvieron un área superior al control equiva-

lente al 26,8% y 6,4%, respectivamente (no

hubo diferencias estadísticamente significati-vas).

El material HOF+G a 3% de extracto

crudo, también presentó crecimiento 3,8%

superior al tratamiento control, mientras que a concentración 5%, se presentó inhibición

igual a 26,5%. Por último el material HO+G,

presentó inhibición a concentraciones 3% y

5% de 16,9% y 32,84%, respectivamente, en comparación al tratamiento control.

Los porcentajes de inhibición de los ma-

teriales la Selva y en general de los híbridos

interespecíficos fueron menores, comparados con los porcentajes de inhibición presentados

por los materiales castilla EC-39 y EC-28 en

las diferentes concentraciones (Tabla 1). Todos los materiales analizados en la pre-

sente investigación se evaluaron previamente

en condiciones de invernadero, campo y en la

susceptibilidad de los frutos a la antracnosis (CIAT, 2009). La incidencia de la antracnosis

en condiciones de campo de los materiales

híbridos PL-8, PL-11, PL-19 y PL-24 fue de

0% en las dos localidades donde se realizó la evaluación, excepto el material PL-35 con

solo 2,1% de incidencia (Muñoz, 2009; Qui-

ñonez, 2009). Sobre fruto, se presentaron

también los menores valores de área bajo la curva del progreso de la enfermedad en los

materiales híbridos (Tabla 2).

Aunque se presenta una gran variabilidad en la respuesta al interior de cada grupo de

materiales, como es el caso de los híbridos

inespecíficos que según las evaluaciones de

campo han sido declarados como resistentes, fue posible bajo esta metodología separarlos

de los materiales “Castilla” que han sido

declarados en condiciones de campo y labora-

torio como susceptibles.

La metodología implementada arrojó re-sultados que concuerdan con los obtenidos en

otras evaluaciones con el hongo in vivo y por

lo tanto, puede ser un apoyo para la identifi-

cación previa de materiales con característi-cas de tolerancia a la antracnosis para ser

incluidos dentro de programas de mejora-

miento.

CONCLUSIONES

La metodología implementada para la purifi-

cación, inoculación e incubación del hongo

en medio líquido permitió obtener filtrados crudos de buena calidad y sin contaminación.

El pH del medio líquido después de una, dos

y tres semanas de incubación con aislamien-

tos de diferente patogenicidad disminuyó respecto al pH en el tiempo cero de incuba-

ción.

La metodología de adición de filtrado so-

bre vitro plantas de cuatro semanas de desa-rrollo tuvo efectos sobre el desarrollo de

raíces, clorosis y necrosis del tejido foliar y

del meristemo apical en los explantes de los

materiales castilla EC-28 y EC-39, mientras que el material PL-19 no presentó este tipo de

afectaciones y en general este comportamien-

to se mantuvo en los materiales híbridos.

Los materiales tipo castilla EC-39 y EC-

28 presentaron la mayor inhibición en el

desarrollo de área foliar que los materiales

híbridos y los conocidos como la selva. Se

hace necesario continuar con experimentos posteriores para identificar las concentracio-

nes del extracto crudo que permitan separar

los híbridos interespecíficos y así diferenciar

su respuesta a la presión del hongo.

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biochemical compositions and toxic ac-tivity of extracellular components produ-

ced by three races of a fungal plant pat-

hogen, Colletotrichum lindemuthianum

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Tabla 1. Porcentaje de inhibición en el desarrollo del área foliar de diez materiales de lulo bajo la presión

de diferentes concentraciones de extracto crudo del aislamiento LM-41C de alta patogenicidad de Colle-

totrichum acutatum

Material Concentración del extracto crudo

3%

5%

8%

12,50%

25%

EC-28

53 a 57 a 65,43 a 88,77 b 96,04 b

EC-39

45 c 51,25 c 52,84 c 85,68 d 97,85 d

PL-8

8,8 g 5,33 g

PL-11

21 h 6,99 h 8,84 h 14,62 h

PL-19

20 i 21,99 i 45,55 j 58,41 j 98,44 k

PL-24

21 l 4,77 l 20,88 l 45,43 m

PL-35

2,6 n 20,4 n

P-32

-27 o -6,42 o

HOF+G

-3,8 p 26,54 p

HO+G 17 q 32,84 q

Prueba de comparación de Duncan, basado en el desarrollo de área foliar de las unidades experimentales

en las diferentes concentraciones de todos los ensayos (p = 0,05). Letras diferentes indican diferencias

estadísticas significativas de los promedios observados dentro de un mismo material.

Tabla 2. Evaluación de los materiales de lulo en

diferentes condiciones, por su tolerancia a an-

tracnosis causada por Colletotrichum acutatum.

Mate

ria

les

In

vitro

Campo (fruto)

Lab

orato

rio

(fru

to)

(Área

Foli

ar)

% I

nh

ibic

ión

1

Pop

ay

án

a

Sta

. R

osa

b

ABCPE

(%)3c

Incidencia (%)2

EC-28 53 22,7 12 3,79

EC-39 44 14,4 11 4,68

PL-8 8,75 0 1,1 0,317

PL-11 21,2 0 4 0

PL-19 20,15 0 0 0,0181

PL-24 20,5 0 0 0,346

PL-35 2,63 0 2,1 1,67

P-32 -26,86 - - -

HOF+G -3,84 - - -

HO+G 16,93 - - -

1 % desarrollo de área foliar sobre frutos en dos

calidades, 3 Área bajo la curva del progreso de la

enfermedad, porcentaje de área total del fruto

afectada por el hongo. (Fuente: a: Muñoz, 2010,

b: Quiñonez, c: CIAT, 2009)


41

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ronmental microbiology 66: 26-1030.

42

ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE FITOPATOLOGIA

Y CIENCIAS AFINES, ASCOLFI

Misión

Contribuir a la creación y utilización del conocimiento científico en la fitosanidad para

facilitar soluciones a los problemas de la producción de cultivos sanos con rentabilidad

social y económica, protegiendo el medio ambiente

Visión

Ser una entidad líder, reconocida nacional e internacionalmente por su excelente labor

en beneficio de la promoción, divulgación y consolidación del conocimiento científico

de personas e instituciones allegadas a la fitosanidad y sus ciencias afines como

elemento esencial de la producción de cultivos de alta calidad

Objetivos

Contribuir a la creación de una conciencia nacional sobre la importancia de la

ciencia y tecnología en la sanidad vegetal como aporte al desarrollo agropecuario

y económico del país

Promover el interés en todos los aspectos de la fitopatología y ciencias afines

Contribuir a la creación y difusión del conocimiento científico de la fitopatología

y ciencias afines

Promover y estimular la publicación de los resultados de los estudios y/o

investigaciones sobre fitopatología y ciencias afines

Promover la cooperación entre entidades del sector público y privado tanto

nacional como internacional que tengan interés en estas disciplinas

Promover el mejoramiento del nivel académico de sus asociados y de quienes

manifiesten interés en las áreas de la fitopatología y ciencias afines

Estrechar los vínculos de solidaridad y compañerismo entre sus afiliados

Informar y motivar a la opinión pública y sus representantes sobre la

problemática de las enfermedades de las plantas y su control


43

IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS ASOCIADOS A LA PUDRICIÓN BASAL DEL

ESTÍPITE EN PALMA DE ACEITE EN LA ZONA CENTRAL PALMERA COLOMBIANA*

Yuri Adriana Mestizo Garzón1 y Gerardo Martinez-L2

1Universidad de Cundinamarca, sede Fusagasugá, 2Programa de plagas y enfermedades Cenipalma

Correo electrónico de contacto: [email protected]

*Artículo científico, recibido para publicación el 27/05/2011, aceptado el 17/08/2011; galardonado con el “Premio Nacional de Fitopatología Gonzalo Ochoa,

Categoría estudiante”, otorgada durante el XXX Congreso Colombiano y XVI Latinoamericano de Fitopatología Bogotá (Colombia) Agosto 19 de 2011

RESUMEN

La pudrición basal del estípite es una de las enfermedades más impor-

tantes de la palma de aceite en todas las zonas productoras. En Colom-

bia la incidencia de la enfermedad ha aumentado lenta pero progresi-vamente sobre todo en las zonas Centro y Norte del país, incrementan-

do costos y control y desafiando con difundirse en toda la región. Los

síntomas más comunes son acumulación de flechas, clorosis, dobla-

miento de las hojas bajeras, acumulación de raíces adventicias y de inflorescencias masculinas. En la base del estípite es posible observar

lesiones características de pudrición seca, a medida que la enfermedad

avanza se presenta enruanamiento y doblamiento de la punta de las

hojas. El propósito de esta investigación fue identificar morfológica y molecularmente los microorganismos asociados a la pudrición basal

del estípite, para ello se realizaron aislamientos a partir de tejido del

área de avance de la enfermedad, los cuales se sembraron en diferen-

tes medios de cultivo, purificados e identificados, comparando las características macroscópicas y microscópicas de cada uno con claves

taxonómicas y mediante métodos moleculares. De los 24 aislamientos

obtenidos se identificaron seis hasta especie (Cladosporium cladospo-

rioides, Curvularia affinis, Curvularia lunata Neonothopanus nambi, Thielaviopsis paradoxa y Coprinopsis cinerea); siete hasta género

(Fusarium, Pythium, Phlebia, Nodulisporium y Penicillium); uno

hasta división (Basidiomycota) y 10 no pudieron ser identificados.

Para hacer observaciones preliminares de patogenicidad se realizaron inoculaciones en pecíolos de palma y se encontró que los hongos

involucrados en las lesiones de mayor tamaño fueron Neonothopanus

nambi, Curvularia affinis, Coprinopsis cinerea, Phlebia sp. Thiela-

viopsis paradoxa, Penicillium sp. y tres de los no identificados. No obstante estos resultados, se requiere profundizar más en la aplicación

de metodologías que conduzcan a la verificación de la patogenicidad

de los microorganismos asociados con la pudrición basal de estípite de

la palma de aceite, observada en la plantación Indupalma Ltda., en el Sur del Cesar.

Palabras Claves: Elaeis guineensis, Ganoderma spp., hongos, aisla-

mientos

SUMMARY

Identification of microorganism associated with basal stem rot in

oil palm at the central region of Colombia

Basal stem rot is one of the most important diseases in oil palm in all

the production areas. In Colombia there are evidences of the slow but

constant increase in incidence in the Central and North regions, with

the effect on the identification costs and the risk to spread to the entire region. The most common initial symptoms are the accumulation of

spear leaves, yellowing, bending of the lower leaves, accumulation of

adventitious roots as well as of male inflorescences. As the disease

advance, there is accumulation of many hanging leaves and bending of the tips of them. The purpose of this research was to identify morpho-

logical and by molecular biology, the microorganisms associated with

the disease. For this, tissue from the front of advance of the lesion was

used for isolation, purification and identification of the microorgan-isms present, using different culture media. The macroscopic and

microscopic characteristics of the colonies were compared with tax-

onomic keys and further identification was done with molecular biolo-

gy protocols. From the 24 isolates obtained, six were identified to species: Cladosporium cladosporioides, Curvularia affinis, Curvularia

lunatus, Neonothopanus nambi, Thielaviopsis paradoxa and Copri-

nopsis cinerea); seven to genera: Fusarium, Pythium, Phlebia, Nodu-

lisporium and Penicillium; one to division: Basidiomycota and ten were not identified. For preliminary pathogenicity observations, oil

palm petioles were inoculated. It was found that fungi microorganisms

involved with the greater sizes lesions were: Neonothopanus nambi,

Curvularia affinis, Coprinopsis cinerea, Phlebia sp. Thielaviopsis paradoxa, Penicillium sp and tree unidentified fungi as well. It is quite

important to investigate and standardize the methodology of pathoge-

nicity tests that has not been completed at the moment. This will help

to identify the microorganisms responsible in the developing of basal stem rot oil palm in Indupalma Ltd. plantation state in the South of

Cesar.

Key Words: Elaeis guineensis, Ganoderma spp., Fungi, Isolates

INTRODUCCIÓN

La pudrición basal del estípite (PBE) es una

de las enfermedades más importantes de la

palma de aceite. La PBE ha causado graves

pérdidas económicas a través del tiempo en países cultivadores comportándose como un

enemigo silencioso pero fatal (Meón, 2005).

Por muchos años se consideró como una enfermedad de las palmas viejas y de poca

importancia económica, debido a que tales

palmas se reemplazaban pronto; sin embargo,

a mediados de la década de 1950 la enferme-dad comenzó a presentarse en palmas mucho

más jóvenes en el Sureste Asiático, particu-

larmente en áreas sembradas después de

cocoteros o en resiembras de palma de aceite (Turner, 1981).

En Malasia e Indonesia, la PBE se consi-

dera como la enfermedad más limitante en

el cultivo de la palma de aceite tanto que algunos autores registran la muerte del 50-

80% de las palmas, en la mitad de su vida

productiva. También se presenta en África y Centroamérica (Chinchilla y Richardson,

1987; Turner y Gillbanks 2003; Franqueville

et al., 2009).

En Colombia los casos de la PBE se han vuelto frecuentes y han alcanzado importan-

cia económica en las zonas Norte y Centro y

aunque existen diferentes tipos de pudricio-

nes de estípite, la PBE es una de las más problemáticas (Sarria, G.A., 2008 datos no

publicados).

En Malasia e Indonesia, la PBE es causa-

da por el hongo Ganoderma boninense Pat., según los resultados de las pruebas de pato-

genicidad, aunque existen otras especies

como G. lucidum, G applanatum, G chal-ceum, G miniatocinctum entre otros que

tienen relación con la palma de aceite (Tur-

ner, 1981; Ho y Nawawi, 1985; Khairudin,

1991; Idris, 1999; Idris et al., 2000). Debido a que la enfermedad ha sido atri-

buida a un Basidiomiceto (parásito facultati-



vo), capaz de vivir como saprofito en tocones o raíces en descomposición que quedan en el

suelo en espera de un huésped adecuado

(Khairudin, 1993, citado por Rodríguez,

2001; Franqueville, 2009), se considera que la presencia de raíces muertas, colonizadas

por el patógeno, y las heridas juegan un papel

clave en la penetración del hongo en el hos-

pedero. Como lo informa Turner (1981), la edad a

la cual se infecta la palma depende del ritmo

de colonización de los tejidos de la población

anterior, de la proximidad de los tejidos colonizados a la palma de aceite, del tiempo

que requieren las raíces para entrar en contac-

to con los tejidos e infectarse, y del desarrollo

del hongo a lo largo de las raíces y su esta-blecimiento dentro de los tejidos del estípite

La infección en las palmas más jóvenes,

comienza en el centro del estípite en creci-

miento y las palmas mueren rápidamente después de contraer la enfermedad.

En palmas adultas, en las cuales el estípi-

te ha alcanzado su máximo desarrollo, las

raíces externas son las responsables de portar el inóculo y generalmente, la infección se

inicia desde afuera y avanza hacia adentro.

Cuando los tejidos de la base del estípite

están completamente endurecidos, el avance de la enfermedad suele ser lento y la muerte

puede tardar algunos años.

La dispersión de la enfermedad en una

plantación, se presenta por el contacto entre las raíces de las plantas sanas y enfermas, las

palmas afectadas normalmente aparecen

agrupadas y el tamaño de estas áreas aumenta

a medida que se vayan contagiando más plantas; en consecuencia una palma infectada

actúa como foco que puede transmitir la

enfermedad a las palmas vecinas (Gurmit,

1990). Además se especula con menor credi-bilidad que la enfermedad se disemina am-

pliamente a través de las basidiosporas

transportadas por el viento o por vectores

(Sanderson et al., 2000). En la descripción de la sintomatología

que causa el patógeno en palmas se mencio-

nan: amarillamiento seguido por secamiento

y necrosis; las hojas nuevas emergentes son mas cortas y cloróticas y a medida que la

palma avanza adquiere una apariencia pálida,

produce flechas sin abrir , el crecimiento se

retrasa y la descomposición de la parte inter-na del estípite se hace evidente mediante la

aparición de un cráter u orificio en la base;

las raíces presentan color pardo con porciones

negras y fáciles de desmenuzar; hojas secas y muertas; presencia de cuerpos fructíferos

entre otros.

En las palmas más viejas, los síntomas típicos son el doblamiento de las hojas baje-

ras, simulando una falda (enruanamiento), la

producción de muchas flechas sin abrir y una

decoloración generalizada del follaje (Fran-queville et al., 2009). Dichos síntomas refle-

jan el deterioro en la absorción de agua y

deficiencia de nutrientes en el follaje de las

palmas afectadas (Gurmit, 1990; Khairudin, 1993; Sánchez 1986; Turner, 1981; Nieto,

1994).

En Colombia la presencia de PBE en las

plantaciones de Palma de aceite es cada vez más frecuente y la información sobre las

causas de la enfermedad no está suficiente-

mente documentada, requiriéndose, por lo

tanto, establecer con exactitud cuál es el agente causante. Hasta el momento, a pesar

que algunos palmicultores la han asociado

con Ganoderma spp., por la presencia de

cuerpos fructíferos visibles en palmas (carac-terísticas más sobresaliente de la enfermedad

en Malasia e Indonesia), no existen estudios

que confirmen que alguna o algunas de las

especies de éste género sean las responsables de la enfermedad en el país.

El propósito de esta investigación fue

identificar morfológica y molecularmente los

microorganismos asociados a la pudrición basal del estípite en la zona de estudio


Ubicación

El estudio se realizó durante el periodo comprendido entre marzo y noviembre de

2009, en la plantación Indupalma Ltda.,

localizada al sur del departamento del Cesar

en la Jurisdicción del municipio de San Al-berto. Altitud de 125 m.s.n.m., temperatura

máxima promedio 34 °C y mínima promedio

22 °C, humedad relativa media de 72,3%,

precipitación anual de 2.497 mm, evapora-ción anual 1.208 mm y 2.130 horas de brillo

solar al año, condiciones agroecológicas

correspondientes a la zona de vida Bosque

Húmedo Tropical.

Seguimiento de síntomas en campo

Se seleccionaron 30 palmas en la parcela F04BP de la subdivisión La Ilusión, con 8,94

hectáreas en las cuales estaban establecidas

1279 palmas y el 12,4% de ellas presentaban

la enfermedad. Los síntomas se seleccionaron de acuerdo a los registros durante los estudios

de la enfermedad y se describieron de acuer-

do al comportamiento presentado en el cam-

po. Una vez seleccionadas las palmas del es-

tudio se realizó la caracterización de los

síntomas durante nueve meses, teniendo en

cuenta la apariencia externa de las palmas con respecto a la descripciones hechas en la

literatura (Nieto, 1994; Darus, 1995; Meon,

2005, Franqueville et al. 2009). Cada diez días se efectuaron las diferentes evaluaciones

comparando el avance de la enfermedad y la

identificación de nuevos casos de la PBE.

Para el estudio de la sintomatología in-terna, se erradicaron 10 palmas que en el

momento de su evaluación, permitieron

caracterizar el daño interno y asociarlo con la

sintomatología externa observada en el mo-

mento de realizar la inspección interna de los tejidos de la palma.

Toma y procesamiento de muestras.

Se tomaron muestras de tejidos, directamente

en campo de plantas que presentaban sínto-

mas de PBE, especialmente en estados inícia-

les e intermedios de daño, usando trozos pequeños de tejido enfermo que contenían

tejido adyacente sano, los cuales se colocaron

inmersos en tubos de vidrio con Tween 20 y

se refrigeraron con el fin de conservarlos hasta ser llevados al laboratorio. El trabajo

posterior se realizó principalmente en la

plantación y en los casos en los que se requi-

rió, se llevaron muestras al laboratorio de fitopatología de Cenipalma en el Campo

Experimental El Palmar de la Vizcaína.

Aislamiento y purificación de microorga-

nismos

Se tomaron trozos de 0,5 cm de longitud,

aproximadamente, los cuales se pusieron en vasos de precipitado con Tween 20 de tal

manera que cubriera todo el tejido; se taparon

con una gasa sostenida por una banda de

caucho y se lavaron con el agua del chorro del grifo durante dos horas como mínimo.

Posteriormente en la cámara de flujo laminar

se lavaron nuevamente con hipoclorito al

1,0% durante un minuto, luego se lavaron con alcohol al 70% durante 30 segundos y, final-

mente con agua destilada estéril dos veces.

Este tejido se colocó a secar sobre papel

toalla estéril durante cinco a 10 minutos y se procedió a sembrar cinco trozos por caja de

Petri en diferentes medios de cultivo: papa-

dextrosa-agar (PDA), agar-agua (Agar), GSM

(Medio selectivo para Ganoderma), BAM (Medio selectivo para Basidiomicetos), agar

extracto de Malta y en el caso de bacterias

todos los aislamientos iníciales se realizaron

en agar-nutritivo. De igual manera se toma-ron carpóforos en campo y se realizaron

siembras directas a partir de muestras de los

tejidos de la fructificación con el fin de obte-

ner el microorganismo en condiciones in vitro.

Después de cinco a siete días se verificó

la aparición de hongos y se realizaron los

subcultivos necesarios, con el fin de iniciar el proceso de purificación de colonias de mane-

ra temprana y evitar posibles contaminacio-

nes, hasta obtener finalmente aislamientos

puros.

Identificación de microorganismos

A partir de los aislamientos puros se realizó

la identificación a nivel de género por carac-

terísticas morfológicas mediante la utilización

de claves específicas para cada uno (Paul et al., 1927, Barnett, 1960; Domsch, 1980).

Las características morfológicas se eva-

luaron mediante comparación y medición de


45

estructuras por toma directa del microorga-nismo, improntas y microcultivos. De igual

manera se tomaron signos de la enfermedad

en palmas afectadas con el fin de hacer mon-

tajes directos que permitieran por morfología realizar la identificación de la especie.

El trabajo de identificación molecular se

realizó en el laboratorio de Biología Molecu-

lar de Cenipalma, en el Campo Experimental Palmar de la Vizcaína, donde se realizó la

amplificación del ADN ribosomal y el pro-

ducto obtenido se envió a secuenciación a

Macrogen Inc. (Seúl Corea). Las secuencias se editaron con el programa SequencherTM

4,8 (Codes Corporation, USA) y se determinó

la homología de la secuenciación de estudio

con las bases de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information), usado

en algoritmo Mega Blast.

Pruebas de patogenicidad in-vitro

Se realizaron inoculaciones de todos los

microorganismos aislados, sobre trozos de

pecíolos con el fin de verificar la patogenici-dad de los mismos.

En campo se seleccionaron dichos pecío-

los provenientes de palmas en condiciones

fitosanitarias adecuadas (libres de enferme-dades), y se llevaron al laboratorio, dónde, se

les retiró los foliolos, se limpiaron con hipo-

clorito de sodio al 5,0%, se cortaron en trozos

de 25 cm y se sellaron con parafina los ex-tremos expuestos, posteriormente se llevaron

a la cámara de flujo laminar donde se les

realizó dos perforaciones con broca calibre

3/8 de 2,0 a 2,5cm de profundidad, en sentido vertical y horizontal respectivamente, cada

una fue ubicada a 8,0cm del borde.

Con un sacabocados se tomó parte del

microorganismo, hongo o bacteria, adherido al medio en el que estaba sembrado y se

depositó en cada una de las perforaciones, se

selló con algodón estéril, y se cubrió todo el

pecíolo con vinipel. Luego los peciolos ino-culados se almacenaron en bandejas a tempe-

ratura ambiente en el laboratorio (26-28°C

aproximadamente).

Diseño Metodológico

Se realizaron observaciones sistemáticas y

organizadas dentro de un diseño de tratamien-tos correspondientes a cada tipo de microor-

ganismo. Como unidad experimental se tomo

un trozo de peciolo de 25cm con dos perfora-

ciones; los microorganismos se asignaron a las unidades experimentales en forma aleato-

ria y sin restricción alguna, bajo el esquema

de un diseño completamente al azar; las unidades experimentales provenían del mis-

mo material, de la misma edad, del mismo

lote y de similar manejo agronómico; cada

tratamiento se repitió tres veces y se hicieron evaluaciones a los 10, 20 y 30 días después

de la inoculación.


Seguimiento de síntomas en campo Síntomas externos. En las observaciones de

las 30 palmas seleccionadas se encontró que ocho presentaban estado de cráter avanzado

(orificio que se observa a simple vista sobre

la base del estípite), 11 en estado leve (orifi-

cio determinado por prueba de varilla o chu-so) y 11 sin cráter, de esta manera el sínto-

ma más claro de la presencia de la enferme-

dad fue el cráter en la base de estípite (Figura

1a, b), el cual corresponde a un estado avan-zado, de la enfermedad siendo hasta ahora la

máxima expresión para diagnosticar plantas

afectadas por la pudrición basal de estípite.

De acuerdo con los resultados obtenidos, el cráter leve es un estado previo al estado de

cráter avanzado. Durante los nueve meses de

evaluación, el porcentaje de palmas que

presentó algún tipo de cráter aumentó en un 20% y esto se debió a la aparición de nuevas

palmas en estado de cráter leve. Acompañado

al incremento de nuevos casos se observó un

aumento de palmas en estado de cráter avan-zado como consecuencia de la evolución de

las palmas reportadas previamente como

casos de cráter leve.

El promedio mensual de palmas que se afectaron fue del 2,2% mientras que la evolu-

ción entre el estado de cráter leve hacia avan-

zado fue del 3,6% (Figura 2).

Síntomas como la presencia de raíces adventicias (Figura 1 c), acumulación de

flechas (Figura 1f), el amarillamiento de

hojas jóvenes (Figura 1j), entre otros, son

síntomas secundarios que reflejan lo que está ocurriendo internamente en la palma afecta-

da por PBE, pero que también pueden ser

ocasionados por otras causas.

En cuanto a síntomas externos asociados a la enfermedad, la acumulación de flechas

(AF), las raíces adventicias (RA) y las hojas

bajeras dobladas (Figura 1k), fueron las que

alcanzaron incidencias superiores al 40%, en los primeros estados de desarrollo de la en-

fermedad (Figura 3).

La acumulación de inflorescencias mas-

culinas (Figura 1h) fue uno de los síntomas observados en los estados iniciales pero a

medida que avanzó la enfermedad se hizo

menos evidente.

En el transcurso de las evaluaciones, síntomas como el enrruanamiento (Figura

1g), y doblamiento de la punta de las hojas

(Figura 1i) se hicieron más evidentes (Figu-

ra 3). El amarillamiento de hojas jóvenes estuvo afectado por las condiciones de preci-

pitación

Síntomas internos. Las 10 palmas utilizadas

en el estudio de la sintomatología interna, al

erradicarlas y evaluarlas cuatro presentaban

cráter leve, cuatro cráter avanzado y dos sin cráter. En los cortes se observaron lesiones

que comenzaban desde el centro del estípite

y avanzaban hacia afuera, aunque en algunos

casos las lesiones iniciaban más cerca a los laterales de la base del estípite, situación

similar a la registrada por Franqueville

(2009).

El tejido del estípite afectado se descom-puso y muchas veces alcanzó un estado de

degradación avanzada hasta formar un mate-

rial semejante a la turba. En la zona de avan-

ce de la enfermedad el tejido del estípite tomó un color café oscuro a negro y en la parte

externa de ésta se observó un área de color

café más claro e inmediatamente contiguo se

observó una zona de color amarillo que sepa-ra el tejido enfermo del sano, que se diferen-

ció por su consistencia corchosa (Figura 4a).

Al realizar un corte transversal en

búsqueda de tejido sano se observaron lesio-nes necróticas aisladas (Figura 4b) indicando

el avance de la pudrición en el estípite y, en

algunas lesiones se observó el crecimiento de

micelio blanco sobre el tejido en descomposi-ción. (Figura 4c)

Las raíces infectadas presentaron consis-

tencia frágil, corteza parda en descomposi-

ción y el cilindro central mostró coloración negra.

Al relacionar la sintomatología con res-

pecto al estado interno se observó que tanto

para cráter leve como para el avanzado, el 90 por ciento de las palmas erradicadas presentó

síntomas de acumulación de flechas (AF), el

100 por ciento raíces adventicias (RA) y en el

80 por ciento hojas bajeras dobladas (HBD). Las cuatro palmas que se encontraron en

estado de cráter avanzado (CA) registraron

síntomas de doblamiento de la punta de las

hojas (DPH) y tres de ellas enruanamiento. En las dos palmas que no registraron cráter se

observó que una mostró pudrición en la parte

interna del estípite.

Identificación de microorganismos asocia-

dos a la pudrición basal de estípite

En las muestras de tejido obtenido en la parte interna y externa de la base del estípite, raíces

y cuerpos fructíferos se aislaron 24 microor-

ganismos entre los que se encontraron hongos

del género Cladosporium, Fusarium, Curvu-laria, Coprinopsis, Phlebia, Thielaviopsis y

Penicillium y algunas especies de Basidio-

mycete (Figura 5).

De las siembras de tejido en Agar-

nutritivo, se aislaron bacterias del género

Pseudomonas y Erwinia, pero no se tuvieron

en cuenta por considerarse saprofitas y con-taminantes. Mediante procedimientos de

biología molecular se identificaron hasta

especie seis microorganismos, ocho hasta género por las características de las estructu-

ras microscópicas que presentaron y 10 no se

pudieron identificar por presentar solo creci-

miento micelial y no ser amplificados correc-tamente en el proceso de PCR con el ADN

obtenido.


Figura 1. Síntomas externos asociados a la pudrición basal del estípite:

a. Cráter leve (CL)

b. Cráter avanzado (CA) c. Raíces adventicias (RA)

d. Basidiocarpos o cuerpos fructíferos (CF)

e. Fruto opaco (FO)

f. Acumulación de flechas (AF) g. Enrruanamiento (E)

h. Acumulación de inflorescencias

masculinas (IM)

i. Doblamiento de la punta de las hojas (DPH)

j. Amarillamiento de hojas jóvenes (A)

k Hojas bajeras dobladas

a b c

d e

k j

i h g

f


47

Lesiones producidas en observaciones

preliminares de patogenicidad

Las inoculaciones fueron realizadas en dos

etapas, la primera desde el código H001 hasta

el H027 con un testigo con solo medio de

cultivo y un testigo absoluto no inoculado y, la segunda desde el código H028 hasta el

H038 con sus respectivos testigos.

En la primera etapa de inoculaciones, el

hongo Thielaviopsis paradoxa generó conta-minación entre los peciolos inoculados con

los otros microorganismos, debido a la cer-

canía entre un tratamiento y otro y la fácil

proliferación del hongo, lo que provocó que

el área total de daño fuese más amplia. En

algunos peciolos fue posible la identificación

del daño producido por el microorganismo inoculado mientras en otras la contaminación

con Thielaviopsis paradoxa creó confusión

en los síntomas producidos por el microorga-

nismo inoculado. Después de realizar el análisis de los

datos se encontró una alta variabilidad intrín-

seca que no permitió realizar análisis estadís-

ticos relacionados con pruebas de patogenici-dad, pero sin embargo se observó que los

hongos involucrados en las lesiones de mayor

tamaño fueron: Neonothopanus nambi

(5304,25 mm2), Curvularia affinis (9960

mm2), Coprinopsis cinérea (4992,5 mm2), Phlebia sp. (4778,5 mm2), Thielaviopsis

paradoxa (9187,5 mm2), Penicillium sp.

(492,5 mm2), y tres de los no identificados

(5135,3, 1038,5 y 4313 mm2) (Figura 6).

CONCLUSIONES Y

RECOMENDACIONES

Se logró avanzar en el reconocimiento de los diferentes microorganismos asociados con la

pudrición basal del estípite, generando nuevas

oportunidades para continuar con el proceso

de investigación. Es necesario profundizar más en la meto-

dología para la realización de pruebas de

patogenicidad las cuales hasta el momento no

han sido completadas, con el fin de buscar otras alternativas que permitan llegar a la

producción de los órganos de reproducción

del (los) patógeno(s) involucrados en este

disturbio, eliminando los riesgos de contami-nación con Thielaviopsis paradoxa.

Algunos de los síntomas internos y exter-

nos, característicos de la pudrición basal de

estípite, que fueron observados en este estu-dio, coinciden con los descritos en la literatu-

ra para aquellos casos en los cuales la enfer-

Figura 2. Comportamiento del síntoma primario de la PBE en las 30 palmas seleccionadas para evalua-

ción.

Figura 3. Comportamiento de los síntomas secundarios de la PBE. A (Amarillamiento); DPH (Doblamien-to de la punta de las hojas); E (Enruanamiento); FF (Foliolos frágiles); AF (Acumulación de flechas); FO

(Fruto opaco); HBD (Hojas bajeras dobladas); RA (Raíces adventicias); IM (Acumulación de inflorescen-

cias masculinas).

Figura 4. Progreso de la lesión de la pudrición

basal en el interior del estípite. a. avance longitu-

dinal. b. avance circular c.crecimiento micelial

sobre lesiones y aspecto turboso, granular de los

tejidos

a

b

c


medad se ha asociado con Ganoderma boni-

nenses, una de las más importantes en la

palma de aceite y especialmente en el Sureste Asiático.

A pesar de que no se ha confirmado sin

lugar a dudas, la presencia de Ganoderma

boninenses, en Colombia, estos resultados

indican que es necesario la implementación

de prácticas de manejo de esta clase de en-

fermedades, en todos los programas de reno-

vación de cultivos de palma de aceite en las diferentes áreas productoras en Colombia,

con el fin de evitar que estas se conviertan en

el futuro, en un nuevo limitante de la produc-

ción. Es muy importante para próximas inves-

tigaciones dedicar más esfuerzos a la identifi-

cación e inoculación de aquellos microorga-

nismos aislados de estructuras fructíferas conocidas como Basidiocarpos o carpóforos,

al igual que de los micelios que crecen sobre

lesiones propias de la enfermedad. Es por

esto que los microorganismos que no han

sido identificados en este estudio deben

generar la mayor atención.

Considerando que aún no se ha logrado

identificar todos los microorganismos asocia-dos con la pudrición basal del estípite en la

plantación Indupalma Ltda., en San Alberto,

Cesar, es necesario que se continúen estas

investigaciones.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen de manera especial a

las personas del Área de Fitopatología de

Cenipalma que contribuyeron para la realiza-ción de este trabajo y, a la Plantación Indu-

palma Ltda., al Fondo de Fomento Palmero y

al Centro de Investigación en Palma de Acei-

te, Cenipalma, por su apoyo en el desarrollo de esta investigación.

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Figura 5. Caracterización macroscópica y microscópica de las colonias aisladas. Aa. Cladosporium

cladosporioides; Bb-Dd. Fusarium sp.; Ee. Neonothopanus nambi; Ff. Pythium sp.; Gg. Curvularia

affinis; Hh. Coprinopsis cinerea; Ii.. Curvularia lunatus; Jj. Phlebia sp.; Kk.. Thielaviosis paradoxa; Ll.

Basidiomycete Mm. Penicillium sp.; Nn. Nodulisporium sp.; Oo-Xx. Colonias no identificadas.


49

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.

a

.

d

.

i

.

h

.

g

.

f

. e

.

c

. b

.

Figura 6. Lesiones producidas en peciolos de palma. a. Neonothopanus nambi; b. Curvularia affinis; c.

Phlebia sp.; d. Thielaviosis paradoxa; e. Coprinopsis cinerea; f. Penicillium sp.; g. Nodulisporium sp.; h.

no identificado; i. Fusarium sp.

50

“FITOPATOLOGÍA COLOMBIANA”

Órgano de difusión de la Asociación Colombiana de Fitopatología y Ciencias

Afines- ASCOLFI

ISSN 01120-0143

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51

SELECCIÓN DE LEVADURAS FILOSFÉRICAS CON POTENCIAL

PARA EL CONTROL BIOLÓGICO DE Botrytis cinerea*

Alba Marina Cotes1, Jimmy Zapata1, Andrés Diaz1, Magda García1, Claudia Medina2,

Diana Cristancho2, Sonia Rodríguez3, Fernando Rodríguez3 y Daniel Uribe2

1Laboratorio de Control Biológico, Centro de Biotecnología y Bioindustria (CBB), CORPOICA. 2Laboratorio de Microbiología Agrícola,

Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia (IBUN). Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. 3 Laboratorio

de Microbiología Molecular, Centro de Biotecnología y Bioindustria (CBB), CORPOICA. *Autor para correspondencia: [email protected]

*Artículo científico, recibido para publicación el 08/04/2011; Aceptado el 18/08/2011, Galardonado con Mención de Honor del Premio Nacional de Fitopatología Rafael Obregón,

categoría profesional, Auspiciado por Bayer Crop Science, Colombia y otorgado durante el XXX Congreso Colombiano y

XVI Latinoamericano de Fitopatología Bogotá (Colombia) 19 de agosto de 2011

RESUMEN

Las levaduras epífitas actúan como colonizadores primarios en las superficies de las plantas constituyendo una barrera natural para las

infecciones producidas por patógenos foliares como Botrytis cinerea,

por lo que la capacidad de adherencia de éstas podría jugar un papel

determinante en su actividad biocontroladora. En el presente trabajo se evaluó en pétalos de rosa variedad Vendela la actividad biocontrolado-

ra contra B. cinerea de 124 aislamientos de levaduras obtenidas de de

hojas de mora. A los aislamientos seleccionados por presentar alta

actividad biocontroladora se les evaluó su adherencia en pétalos estan-darizando una técnica basada en el uso de microgotas. En el tratamien-

to patógeno se obtuvo una incidencia del 100% y un índice de severi-

dad (IS) de cuatro, si se tiene en cuenta que los pétalos se vieron afec-

tados en más de 95% de su área, mientras que en presencia de las levaduras se generaron cuatro grupos de respuesta, seleccionando

preliminarmente 48 aislamientos por presentar los más bajos IS (entre

0 y 0,87); al realizar nuevamente la evaluación con estos aislamientos,

se encontró que 37 de ellos mostraron consistencia de los resultados en el tiempo con un IS similar al obtenido anteriormente. De acuerdo con

los resultados obtenidos, se seleccionaron los aislamientos codificados

como Co3, F11, F14, Gr1, Gr2, Gr3, Gr20 Sb25, Sb27, Si6 y Si29, por

presentar la mayor inhibición del moho gris en los pétalos con un IS de 0 a 0,4. En relación con la adherencia de las levaduras, se generaron

tres grupos de respuesta, permitiendo seleccionar 13 aislamientos por

presentar porcentajes de adherencia superiores al 88%. Considerando

los criterios de actividad biocontroladora, adherencia e identidad molecular, más parámetros de interés generados en la literatura, tales

como su facilidad de producción y su baja o nula patogenicidad, se

seleccionaron los aislamientos Gr1 y Si6, identificados como Rhodoto-

rula glutinis como los más promisorios para futuros desarrollos.

Palabras claves: biocontrol, adherencia, moho gris, enfermedades,

postcosecha

SUMMARY

Selection of phyllosphere yeasts isolates as biocontrol agents

against Botrytis cinerea

Epiphyte yeasts act as primary colonizers on the surface of plants

forming a natural barrier for infections produced by foliar pathogens such as Botrytis cinerea. The adhesive capacity of these yeasts could

play an important role in their biocontrol activity. In this study the

biocontrol activity of 124 yeast strains, previously collected from

blackberry leaves, was evaluated on rose petals (Vendela variety). The isolates which presented a high effectiveness against B. cinerea were

evaluated using a technique based on micro-drops to determine their

adhesion to petals. In the pathogen treatment (without yeasts) an inci-

dence of 100% and a severity index (SI) of four were observed, taken into account that the petals were affected in more than 95% of their

area. Yeast isolates generated four response groups which lead to a

preliminary selection of 48 which showed the lowest SI (between 0

and 0,87) and upon a second evaluation 37 of these showed a consis-tent result in field trials with a SI similar to the one previously deter-

mined. From these results Co3, F11, F14, Gr1, Gr2, Gr3, Gr20 Sb25,

Sb27, Si6 and Si29 isolates were selected for showing the highest

inhibition of grey mold on the petals with a SI between 0 and 0,4. With regards to the adhesion of the yeasts, three response groups were

generated which allowed the selection of 13 isolates which showed

adhesion percentages above 88%. Based on the criteria of bio-

controlling activity, adhesion and molecular identity and additional parameters obtained from literature, such as easy production and their

low or null pathogenicity, isolates Gr1 and Si6, identified as Rhodoto-

rula glutinis were selected as the most promising for future develop-

ments.

Key Words: biological control, adhesion, plant diseases, gray mold,

postharvest

INTRODUCCIÓN

Botrytis cinerea, agente causal del moho gris

es uno de los patógenos foliares más impor-

tante a nivel mundial (Elad et al., 2004). El

control de este patógeno se ha basado en el uso de fungicidas; sin embargo, bajo ciertas

condiciones de presión de inoculo esta medi-

da no ha sido eficaz, sumado a problemas ambientales debido a su uso excesivo.

El uso de levaduras epifíticas ha demos-

trado resultados promisorios de control de

diferentes patógenos en postcosecha, incluido B. cinerea (Arras, 1996, Cheah et al., 1996;

Droby et al., 2009; Friedman et al., 2010;

Lima et al., 1997). Sin embargo, teniendo en cuenta que B. cinerea, también afecta de

forma significativa los cultivos a nivel de

campo y que bajo estas condiciones el efecto

del viento y de la lluvia pueden actuar negati-vamente en la persistencia de dichas levadu-

ras, es importante considerar la colonización

como un factor determinante sobre la capaci-dad de adhesión de las levaduras sobre la

superficie de las plantas, mediada por la

producción de cápsulas de polisacáridos

extracelulares (di Menna, 1959), proteínas glicosiladas con restos de manosa o manopro-

teínas (Buck y Andrews, 1999) y proteínas

denominadas floculinas que promueven la adhesión de la levadura entre las células y la

superficie en la cual se encuentran. Estos

polisacáridos se localizan en los sitios de

gemación y le ayudan a la levadura a tolerar plaguicidas y a metabolizar variedad de

nutrientes (Buck y Andrews, 1999; di Menna,

1959), característica que podría contribuir potencialmente a mejorar la eficacia en el

control biológico.

El presente trabajo tuvo como objetivo

seleccionar aislamientos de levaduras que, además de presentar alta actividad biocontro-


http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WBP-46MJSVB-7&_user=3642416&_coverDate=10%2F31%2F2002&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=gateway&_origin=gateway&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1756464110&_rerunOrigin=google&_acct=C000061052&_version=1&_urlVersion=0&_userid=3642416&md5=feecf40a2bd70252d029e5176d0234ba&searchtype=a#bib2

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WBP-46MJSVB-7&_user=3642416&_coverDate=10%2F31%2F2002&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=gateway&_origin=gateway&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1756464110&_rerunOrigin=google&_acct=C000061052&_version=1&_urlVersion=0&_userid=3642416&md5=feecf40a2bd70252d029e5176d0234ba&searchtype=a#bib6


ladora contra B. cinerea, se adhieran eficien-temente a la superficie vegetal, lo que permi-

tirá en un futuro el desarrollo de productos

biológicos a base de las mismas, que permi-

tan su aplicación en condiciones de campo y de postcosecha.


Microorganismos y medios de cultivo

Se seleccionaron 124 aislamientos de una

colección de levaduras del Laboratorio de

Control Biológico de la Corporación

Colombiana de Investigación Agropecuaria (Corpoica), aisladas en trabajos previos a

partir de hojas mora de castilla. Las levaduras

se cultivaron en agar extracto malta y

levadura (AEM) y se incubaron a 25°C durante 48 horas. El B. cinerea Bo-004,

suministrado por el Laboratorio de Control

Biológico de Corpoica, se cultivó en agar

papa dextrosa (PDA) y se incubó a 23°C durante 14 días.

Evaluación de la actividad biocontroladora

de los aislamientos seleccionados

Este ensayo se llevó a cabo utilizando pétalos

de rosa (Rosa centifolia) de la variedad

Vendela, la cual es susceptible al ataque de B.

cinerea. Las rosas se obtuvieron de un cultivo comercial de la Corporación Unidad

de Desarrollo, Investigación y Tecnología

(DIT) Flores La Conchita (Bogotá-

Colombia). Se trabajó con pétalos jóvenes tomados del interior de la cabeza de la flor,

evitando el uso de pétalos externos, ya que

estos podrían tener residuos superficiales de

fungicidas. Se preparó un inóculo mixto a una

concentración de 1x10 7 células.mL-1 para las

levaduras y de 1x104conidios.mL-1 para B.

cinerea. Posteriormente, los pétalos se inocularon aplicando una gota de 10 µL de la

suspensión de células de levaduras y conidios

del patógeno, colocándose a continuación

sobre una malla plástica en cámaras húmedas, dejándolas en incubación a temperatura

ambiente durante siete días.

Al final del período de incubación se eva-

luó la incidencia y la severidad de la enfer-medad. Para estimar esta última variable se

estandarizó una escala de la lesión producida

por el patógeno descrita en grados con un

rango de 0 a 4, siendo el grado 1 en donde se produjo hasta el 25% de área afectada, en el

grado 2 hasta el 50% , el grado 3 hasta 75% y

el grado 4 hasta el 100%. El índice de severi-

dad (IS) se calculó promediando el nivel obtenido en la escala de severidad para cada

uno de los 15 pétalos por tratamiento, tam-

bién se determinó la incidencia. En este ensayo se evaluaron individual-

mente todas las levaduras y se contó con un

testigo relativo inoculado con agua destilada

estéril y un testigo absoluto. El experimento

se estableció en un diseño experimental completamente al azar por triplicado; la

unidad experimental consistió de una cámara

húmeda con cinco pétalos. Con los resultados

obtenidos en la prueba se seleccionaron aquellos aislamientos que presentaron la

mayor actividad biocontroladora; siguiendo la

metodología descrita anteriormente, se repitió

una vez más la evaluación con el fin de de-terminar la consistencia en el control de B.

cinérea. Los análisis estadísticos consistieron

de una ANOVA y una comparación de me-

dias utilizando la prueba de Tukey (P<0,05).

Determinación de la adherencia de las

levaduras seleccionadas

Esta determinación se realizó con 48 aisla-mientos seleccionados en la etapa anterior por

presentar alta actividad biocontroladora

contra B. cinerea en pétalos de rosa.

Para realizar el análisis se tomaron cinco secciones circulares de pétalo de rosa de 0,75

cm de diámetro por tratamiento, las cuales se

inocularon aplicando una gota de 10 µL de la

suspensión de cada una de las levaduras ajustada a una concentración de 1x107 célu-

las.mL-1. Se colocaron sobre una servilleta

estéril y se sometieron a la corriente de aire

estéril de una cabina de flujo laminar durante 45 minutos.

Los pétalos secos se colocaron en un tubo

de ensayo con nueve mL de agua destilada

estéril. En seguida se agitaron por tres veces en un agitador Vortex a máxima velocidad

durante nueve segundos. Luego se tomaron

10 µL de cada uno de los tubos y se sembra-

ron en una caja con AEM, formando cuatro cuadrantes, y empleando tres microgotas

separadas por cuadrante.

El crecimiento de las levaduras, en uni-

dades formadoras de colonia finales (UFCf), se calculó mediante la siguiente ecuación:

UFCf = P x D x 100

En donde: P es el promedio de UFC por

microgota, D es el inverso de la dilución

realizada, 100 el factor de corrección relacio-

nado con la siembra de 10 µL por microgota. Para el cálculo del porcentaje de adheren-

cia se utilizó la siguiente fórmula:

% Adherencia = {[(UFCsm) – (UFCf)]/

(UFCsm)} x 100

UFCsm corresponde al número de unidades

formadoras de colonia en la suspensión origi-

nal. Con los resultados obtenidos se realizó un

análisis de agrupamiento (análisis de clusters)

utilizando el Programa SAS, versión 9.0. Se utilizó la técnica del vecino más cercano con

distancia métrica Euclidiana limitando los

resultados a tres agrupamientos, en función

de la magnitud de la adherencia presentada experimentalmente para las 48 accesiones de

levaduras. El número óptimo de agrupamien-

tos se determinó previo análisis de la gráfica

de Distancia de Aglomeración. Los agrupa-mientos se conformaron con las accesiones

que presentaban características de adherencia

similares.

Identificación molecular de los aislamien-

tos seleccionados

Se realizó la identificación de 11 aislamientos de levaduras filósféricas seleccionadas en

etapas previas. Éstas se sometieron a creci-

miento, extracción de ADN, y la amplifica-

ción y secuenciación de parte de la Subuni-dad Larga (LSU) del 26S de ADNr, siguiendo

los protocolos previamente estandarizados

por Butinar et al., 2005.

Matriz de decisión para la selección de las

levaduras con potencial para futuros desa-

rrollos

Para determinar las accesiones más promiso-

rias se aplicaron tres tipos de criterios discri-

minados así:

Criterio ecofisiológico, relacionado con la

adherencia. Los resultados experimentales se normalizaron para generar un índice de selec-

ción para el criterio.

Criterios de actividad biocontroladora, se

tuvieron en cuenta los resultados obtenidos

tanto en incidencia como en el índice de severidad; de acuerdo con un análisis previo,

a cada uno de estos dos factores se le asignó

un valor igual. Los resultados experimentales

se normalizaron para generar un índice de selección para este criterio.

Criterio tecnológico, expresado como la

probada capacidad a nivel de laboratorio para

la obtención de biomasa de cada una de las

accesiones identificadas, lo que facilitaría llevar a cabo su producción masiva con base

a la información generada en la literatura.

Para la determinación cuantitativa se realizó

un análisis de la información disponible en la base de datos Science Direct (www.scienc

edirect.com), que posee reconocimiento

mundial y que contiene numerosas publica-ciones en el área de microbiología, ingeniería

y bioprocesos. Las referencias obtenidas se

normalizaron para las especies de levaduras

identificadas hasta especie para generar un índice de selección para este criterio.

Criterio de patogenicidad, dadas las

características patogénicas para mamíferos de

algunos géneros de levaduras, que limitarían

su aplicación para el desarrollo de un biopla-guicida, se realizó un análisis de la informa-

ción disponible en la base de datos Springer

Link (www.springerlink.com) y MedLine

(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/), que pose-en los registros de infecciones o riesgos para

la salud causados por microorganismos. Por

tanto, en función de la patogenicidad se

generó la siguiente escala para cuantificar el índice de selección asociado: 1 para accesio-

nes no patogénicas, 0,5 para accesiones con

http://www.springerlink.com/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/


53

carácter de parásito facultativo y 0 para acce-siones patogénicas o de alto riesgo para

mamíferos.

Paralelamente, un grupo de expertos en

los temas relacionados con los criterios en mención, llegó a un consenso acerca de la

importancia relativa de cada uno de estos

factores y generó, mediante una técnica de

comparación por pares, un índice de peso o importancia para cada uno (Tabla 1).


Evaluación de la actividad biocontroladora

de los aislamientos seleccionados

Se generó una escala de severidad de la

infección causada por B. cinerea en pétalos

de rosa (Figuras 1 y 2). B. cinerea en ausencia de las levaduras, infectó los pétalos

produciendo los primeros síntomas de la

enfermedad (lesiones necróticas) después de

24 h, lo cual es concordante con lo reportado por Salinas et al., 1989 (Figura 1A), a medida

que trascurrió el período de incubación,

aumentó el tamaño de la lesión, alcanzando

entre el quinto y sexto día un tamaño superior al 95% del área del pétalo, además de

presentarse esporulación (Figuras 1b a 1d).

De los 124 aislamientos evaluados, 121

presentaron algún nivel de control del moho gris en los pétalos comparado con el testigo

B. cinerea (a excepción de los aislamientos

F8, Sb9 y Co11 que presentaron una inciden-

cia de 100% y un IS igual o similar al testigo B. cinerea (resultados no mostrados). Consi-

derando que las levaduras son el mayor com-

ponente de la microflora epifítica en las

superficies vegetales, que crecen de forma saprofítica en una gran variedad de sustratos

y que están adaptadas a las condiciones am-

bientales presentes en la filósfera (Andrews y

Back, 2004), podría asumirse que éstas pue-dan establecerse rápidamente sobre los péta-

los, desarrollándose y multiplicándose al

consumir los nutrientes presentes en la super-

ficie de estos, fenómeno que por competencia limitaría la germinación de los conidios de B.

cinerea (Elad, 1996, Elmer y Reglinski,

2006).

Con los resultados obtenidos se generaron cuatro grupos de respuesta de acuerdo con el

nivel en la escala de severidad, correspon-

diendo el grupo 1 a los aislamientos que

presentaron un IS de 0 a 0,99, el grupo 2 a

aislamientos con un IS de 1 a 1,99, el grupo 3 a los aislamientos con un IS de 2 a 2,99 y el

grupo 4 a los aislamientos con un IS de 3 a 4

(Figura 3).

Las levaduras ubicadas en el grupo uno (48 aislamientos) fueron aquellas que presen-

taron mayor actividad biocontroladora, repre-

sentada por un IS de 0 a 0,87. De estos se

destacaron los aislamientos Gr10 y Sb27 que inhibieron al patógeno en un 100%, puesto

que no se presentaron lesiones en los pétalos,

para el resto de los aislamientos de este gru-

po, la incidencia obtenida estuvo entre 0 y

87%. Aunque este rango incluyó cifras altas de incidencia, dado que el IS fue bajo, lo que

significa que el tamaño de la lesión provoca-

da por el patógeno en la mayoría de los péta-

los se ubicó en el grado 1 de la escala de severidad (nunca superó el 25% del área del

pétalo), se mantienen estos aislamientos

como promisorios, si se tiene en cuenta

además que se observaron diferencias signifi-cativas tanto para la incidencia como para la

severidad (Tabla 2).

Tabla 1. Índice de peso relativo por criterio de

selección

Criterio

Índice de

peso

relativo

Ecofisiológico (Adherencia) 0,2

Actividad biocon-

troladora

Incidencia

0,4 Índice de

severidad

Potencial Tecnológico 0,25

Toxicología (Patogenicidad en

mamíferos) 0,15

Total 1

a b

d

Figura 2. Escala de severidad

del moho gris en pétalos de

rosa.

a. Grado 0

b. Grado 1

c. Grado 2

d. Grado 3

e. Grado 4

c

e

Figura 1. Desarrollo del moho gris en pétalos de rosa, B. cinerea se inoculó en una concentración de

1x104conidios.mL-1. a. Primeros síntomas del moho gris después de 24 h de incubación; b. Aumento de la

lesión después de tres días de incubación; c. Lesión después de cinco días; d. Pétalo completamente

necrosado, además se observa esporulación de B. cinerea en la parte superior del pétalo después de seis

días de inoculación.

a b

c d


Al realizar segunda evaluación de la acti-

vidad biocontroladora contra B. cinerea, de

los 48 aislamientos del grupo uno selecciona-dos en la etapa anterior, se observó que sola-

mente 37 de ellos mostraron un efecto repeti-

ble de control del patógeno. Estos presenta-

ron las menores incidencias y severidad, expresados con IS entre 0 y 0,7. En relación

con los aislamientos restantes, con 16 se

observó un IS entre 1 y 1,9 y con 2 se obtuvo

un IS entre 2 y 3. Teniendo en cuenta estos resultados, se seleccionaron los aislamientos

F11, F14, Sb25, Sb27, Co3, Si6, Si 29, Gr1,

Gr2, Gr3 y Gr20 por presentar las menores

diferencias en el tiempo (0,2), y los menores

IS (entre 0 y 0,37) (Tabla 3). La incidencia

presentó un comportamiento similar al obte-nido en el primer bioensayo con porcentajes

de 3% para el aislamiento Gr20 y del 36%

para el aislamiento F14.

Las levaduras evaluadas en este estudio controlaron efectivamente a B. cinerea, indi-

cando que podrían ser utilizadas en campo,

evitando de esta manera la infección quies-

cente y el posterior desarrollo del patógeno en postcosecha. Otros autores encontraron

resultados de control similares en diferentes

especies vegetales, Peng y Sutton (1991)

reportaron la reducción del moho gris en un 53-79% en frutos de fresa, mediante aplica-

ciones de Rhodotorula glutinis, levadura

aislada de foliolos de fresa. En otro estudio

R. glutinis y Cryptococcus sp., aisladas de hojas de trigo también mostraron ser efectivas

en el control de patógenos foliares como

Septoria tritici y Bipolaris sorokiniana, ya

que redujeron la esporulación de estos pató-

genos en 69% y la severidad hasta en un 85%

(Parrello et al., 2002).

Adherencia de las levaduras seleccionadas

a los pétalos de rosa

En el primer agrupamiento, en el que se

ubicaron las levaduras que presentaron alta adherencia a la superficie de los pétalos de

rosa, se ubicaron 13 accesiones de levadura

con magnitudes entre el 88,57% y el 99,47.

(Tabla 4) En el segundo agrupamiento (ad-herencia intermedia) se ubicaron 34 accesio-

nes de levadura con magnitudes entre el

50,40% y el 82,80%, equivalentes a un 70,8%

del total de las accesiones evaluadas, mien-tras que en el tercer agrupamiento se ubicó la

accesión codificada como Gr21 con adheren-

cia de 46,40%.

Los resultados obtenidos se graficaron en forma de dendograma (Figura 4) para ilustrar

la distancia relativa entre las levaduras y la

constitución de cada uno de los agrupamien-

tos. Considerando que la rápida y eficiente

adhesión de los microorganismos a la super-

ficie foliar es el primer paso requerido para la

colonización de ésta (Buck y Andrews, 1999) y que para ejercer un control biológico efec-

tivo se requiere de la persistencia del agente

de biocontrol en el sitio de acción del patóge-

no (Droby et al., 2009), de los resultados obtenidos para el factor adherencia se puede

concluir que las accesiones de levadura ubi-

cadas en el grupo de respuesta alta son las más promisorias para el desarrollo de un

bioplaguicida, teniendo en cuenta la forma de

aplicación y las características del cultivo en

Tabla 2. Eficacia en el control de B. cinerea en pétalos de rosa de los aislamientos de levadura selecciona-

dos

Accesión (%)

Incidencia

Índice de

severidad Accesión

(%)

Incidencia

Índice de

severidad

B. cinerea 100a 3,93a Gr21 33h 0,53b

Co3 13k 0,13b Gr22 13k 0,33b

Co7 40g 0,67b Gr26 20j 0,20b

F11 27i 0,33b Sb11 33h 0,33b

F13 67c 0,93b Sb12 13k 0,21b

F14 33h 0,33b Sb16 20j 0,47b

F16 67c 0,87b Sb25 20j 0,20b

F18 73b 0,87b Sb27 0m 0c

F20 67c 0,80b Sb28 13k 0,13b

F22 60d 0,87b Sb29 67c 0,73b

F32 53e 0,80b Sb30 60d 0,60b

F34 53e 0,53b Sb32 7l 0,07b

F43 33h 0,33b Sb33 33h 0,53b

F44 60d 0,73b Sb34 13k 0,27b

Gr1 20j 0,20b Sb35 13k 0,27b

Gr2 7l 0,07b Si1 40g 0,40b

Gr3 13k 0,27b Si4 67c 0,87b

Gr4 73b 0,93b Si6 27i 0,27b

Gr7 67c 0,87b Si8 67c 0,67b

Gr8 73b 0,93b Si12 60d 0,60b

Gr10 0m 0c Si15 67c 0,73b

Gr11 7l 0,07b Si21 67c 0,87b

Gr15 40g 0,60b Si26 47f 0,80b

Gr17 73b 0,93b Si29 13k 0,33b

Gr20 7l 0,07b

Los valores promedio de incidencia y de severidad seguidos por diferentes letras son significativamente

diferentes de acuerdo con el análisis de comparación de medias aplicando la prueba de Tukey (P < 0,05)

Tabla 3. Levaduras seleccionadas por su consis-

tencia en los bioensayos realizados

Accesión (%)

Incidencia

Índice de

severidad

B. cinerea 100a 3,93a

Co3 16bc 0,17b

F11 36b 0,37b

F14 36b 0,37b

Gr1 16bc 0,17b

Gr2 26bc 0,27b

Gr3 29bc 0,30b

Gr20 3c 0,03b

Sb25 30bc 0,30b

Sb27 13bc 0,13b

Si 6 29bc 0,30b

Si 29 33bc 0,33b

Los valores promedio de incidencia y de severi-

dad seguidos por diferentes letras son significati-

vamente diferentes de acuerdo con el análisis de

comparación de medias aplicando la prueba de

Tukey (P < 0,05).

0

10

20

30

40

50

60

Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 4

Nivel

Nú

me

ro d

e a

isla

mie

nto

s

Figura 3. Grupos de respuesta de actividad biocontroladora de las levaduras de acuerdo con el nivel de

severidad del moho gris observado en pétalos de rosa después de siete días de incubación.


55

el que se presente el moho gris.

Identificación molecular de levaduras

seleccionadas

El ADN de todos los aislamientos se pudo

amplificar y secuenciar usando la pareja de

primers NL1-LR6, obteniendo amplicones

secuenciados de aproximadamente 800pb. Comparando con bases de datos del NCBI y

CBS, se lograron identificar hasta especie 10

accesiones de levadura y una accesión hasta

género (Tabla 5).

Matriz de decisión para la selección de las

levaduras con potencial para futuros desa-

rrollos

En las etapas previas se seleccionaron 13

aislamientos por su alta adherencia a los

pétalos de rosa y 11 aislamientos de levadura por su alta actividad biocontroladora, corres-

pondientes a Rhodotorula spp., Cryptococcus

sp., Pseudozyma tsukubaensis, Pichia ony-

chis, Debaryomyces hansenii y Occultifur externus (Tabla 6). Teniendo en cuenta la

adherencia, la actividad biocontroladora y

los parámetros tecnológicos y de patogenici-

dad mencionados anteriormente, la matriz de decisión utilizada permitió determinar que las

accesiones codificadas como Gr1 y Si6

(Rhodotorula glutinis) fueron las más promi-

sorias para el desarrollo futuro de un biopla-guicida; esto se sustenta en la magnitud del

índice de selección estandarizado que pre-

sentó una diferencia de menos de 3% entre

estas dos accesiones. De otra parte, el resto de accesiones presentó un índice de selección

estandarizado que estuvo entre el 34,04% y

51,39% por debajo del obtenido con la mejor

accesión (Tabla 6). Sin embargo para el desarrollo de un bio-

plaguicida a base de alguna de las levaduras

que presentó altos rendimientos para las

variables evaluadas, es necesario desarrollar estudios de producción masiva, formulación y

evaluación de la eficacia de los prototipos

desarrollados en el control de B. cinerea bajo

condiciones controladas y cultivos comercia-les como flores y mora.

CONCLUSIONES

Once de los trece aislamientos de levadura

seleccionados por presentar alta adherencia a los pétalos de rosa, presentaron alta actividad

biocontroladora.

Teniendo en cuenta los parámetros de ac-tividad biocontroladora, adherencia e identi-

ficación molecular hasta especie, así como

los reportados en la literatura como facilidad

de producción y su baja o nula patogenicidad en mamíferos, se seleccionaron los aislamien-

tos Gr1 y Si6, identificados como R. glutinis

como los más promisorios para futuros desa-

rrollos.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a COLCIENCIAS por

el apoyo financiero otorgado en el marco del

proyecto “Estudio de la diversidad funcional

de levaduras habitantes de la superficies foliar en mora y su relación con el control

biológico de Botrytis cinerea”. Contrato

número 204-2005. También expresan sus

agradecimientos a la Corporación Unidad de Desarrollo, Investigación y Tecnología (DIT)

Flores La Conchita, por suministrar las rosas

con las cuales se desarrolló este trabajo.


Andrews, J. H. y Back, J. W. 2004. Adhesion of yeast to leaf surfaces. Chapter 4 in

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Tabla 4. Adherencia de los aislamientos de levadura seleccionados a pétalos de rosa

Accesión Grupo Adherencia (%) Accesión Grupo Adherencia (%)

F11 Alto 91,35 Gr8 Medio 79,38

F13 Alto 95,61 Gr10 Medio 68





Gr1 Alto 94,2 Gr22 Medio 68,9

Sb11 Alto 99,34 Gr26 Medio 64,6

Sb12 Alto 95,84 Sb16 Medio 82,8

Si1 Alto 94,64 Sb25 Medio 51,14


Si12 Alto 93,85 Sb28 Medio 64


Co3 Medio 55,88 Sb30 Medio 69,8

Co7 Medio 55,88 Sb32 Medio 76,5

F16 Medio 78,02 Sb33 Medio 71,3

F22 Medio 55,88 Sb34 Medio 63,11

F34 Medio 52,7 Sb35 Medio 77

F43 Medio 50,4 Si6 Medio 55,88

F44 Medio 74,7 Si8 Medio 54,54

Gr2 Medio 78,4 Si21 Medio 73,36

Gr3 Medio 78,25 Si26 Medio 69,58

Gr4 Medio 68,4 Si29 Medio 66

Gr7 Medio 71,2 Gr21 Bajo 46,4

Distancia

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

Co

3

Co

7

Sb11

Sb12

Sb16

Sb25

Sb27

Sb28

Sb29

Sb30

Sb32

Sb33

Sb34

Sb35

F11

F13

F14

F16

F18

F20

F22

F32

F34

F43

F44

Si1

Si4

Si6

Si8

Si12

Si15

Si21

Si26

Si29

Gr1

Gr2

Gr3

Gr4

Gr7

Gr8

Gr10

Gr11

Gr15

Gr17

Gr20

Gr21

Gr22

Gr26

Figura 4. Análisis de agrupamiento de las levaduras seleccionadas por su adherencia a los pétalos de rosa.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WBP-46MJSVB-7&_user=3642416&_coverDate=10%2F31%2F2002&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=gateway&_origin=gateway&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1756464110&_rerunOrigin=google&_acct=C000061052&_version=1&_urlVersion=0&_userid=3642416&md5=feecf40a2bd70252d029e5176d0234ba&searchtype=a#bbib2


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Tabla 5. Comparación e identificación de los aislados de levaduras, por medio de BLAST comparados con las bases de datos NCBI y CBS.

Accesión Identificación más

cercana / Cepa

GenBank NCBI CBS Database

Designación de especie,

No. de accesión (%) E

Designación de espe-

cie, No. de accesión (%) E

Co3 Rhodotorula mucilaginosa

CRUB 1027

Rhodotorula mucilaginosa

AY158651.1 100 0,0 Rhodotorula mucilaginosa 100 0,0

F11 Pichia onychis

NRRL Y-7123

Pichia onychis

U75421.1 98 0,0 Pichia onychis 98,26 0,0

F14 Pichia onychis

NRRL Y-7123 Pichia onychis U75421.1 98 0,0 Pichia onychis 99,15 e-155

Gr1 Rhodotorula glutinis Rhodotorula glutinis AF335985 100 0,0 Rhodotorula glutinis 100 0,0

Gr2 Pseudozyma tsukubaensis

Pseudozyma tsukubaensis AJ235297.1 99 0,0

Pseudozyma tsukubaensis

CBS 6389 99,56 0,0

Gr3 Cryptococcus sp.

Cryptococcus sp. AF444699.1 100 0,0 Cryptococcus sp. CBS 8363 100 0,0

Gr20 Rhodotorula mucilaginosa

UWFP-373 Rhodotorula mucilaginosa AF335987

97

0,0 Rhodotorula mucilaginosa 97,16 0,0

Sb25 Rhodotorula mucilaginosa

UWFP-373

Rhodotorula mucilaginosa

AF335987.1

100

0,0 Rhodotorula mucilaginosa 99,6 0,0

Sb27 Occultifur externus Occultifur externus AY745723

100

0,0

Occultifur externus

CBS8732 100 0,0

Si6 Rhodotorula glutinis

ATCC 32765 Rhodotorula glutinis AF335985.1

100

0,0 Rhodotorula glutinis 100 0,0

Si29

Debaryomyces hansenii var.

fabryi

CECT 11957

Debaryomyces hansenii AY167604.1

100

0,0 Debaryomyces hansenii 100 0,0

NI, No Identificado % de similaridad: porcentajes < 97 no se tienen en cuenta Valor E: los valores > 0.0 no se tienen en cuenta (Ej: e-170) ; NRRL – Agricultural Research Service Culture Collection, USA; UWFP – University of Washington Fungal Project; CECT – Colección Española de Cultivos Tipo; CBS – Centraalbure-

au voor Schimmelcultures, Databases.; CRUB – Centro Regional Universitario Bariloche

Tabla 6. Índice de selección obtenido para 11 accesiones de levadura con potencial biocontrolador

Código

cepa Identificación

Índice de

selección

final

Índice de selección

final estandarizado

(%)*

Gr1 Rhodotorula glutinis 0,14189 100

Si6 Rhodotorula glutinis 0,13847 97,59

Gr3 Cryptococcus sp. 0,09359 65,96

Sb25 Rhodotorula mucilaginosa 0,08744 61,62

Co3 Rhodotorula mucilaginosa 0,08248 58,13

Gr2 Pseudozyma tsukubaensis 0,08126 57,27

Gr20 Rhodotorula mucilaginosa 0,0808 56,95

F14 Pichia onychis 0,07897 55,66

F11 Pichia onychis 0,07703 54,29

Si 29 Debaryomyces hansenii var. fabryi 0,06909 48,69

Sb27 Occultifur externus 0,06897 48,61

*La estandarización se realizó con respecto al mejor índice de selección final obtenido


57

PROCESO INFECTIVO DE LA MANCHA DE ACEITE CAUSADA POR

Xanthomonas axonopodis EN GULUPA (Passiflora edulis Sims)*

Solange Benítez, Wadith de León, Lina Farfán, Sandra Castillo y Lilliana Hoyos Carvajal1

1Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá. Laboratorio de fitopatología. Facultad de Agronomía.

Autor para correspondencia: [email protected]

*Artículo científico, recibido para publicación el 08/04/2011; Aceptado el 18/08/2011, Galardonado con el Premio Nacional de Fitopatología Rafael Obregón, categoría profesional,

Auspiciado por Bayer Crop Science, Colombia y otorgado durante el XXX Congreso Colombiano y XVI Latinoamericano de Fitopatología Bogotá (Colombia) 19 de agosto de 2011.

RESUMEN La gulupa (Passiflora edulis), así como muchas otras pasifloras, es

atacada por diferentes grupos de microorganismos, entre los que se

incluyen hongos, bacterias, virus y nematodos, que le ocasionan en-

fermedades; reduciendo, la calidad y volumen de los frutos para expor-

tación; además de afectar su ciclo productivo y en consecuencia au-

mentar los costos de la inversión en manejo y control. Uno de estos

microorganismos es la bacteria Xanthomonas axonopodis, agente

causal de la mancha de aceite o bacteriosis. Para determinar el avance de la bacteria en el tejido de gulupa, se desarrolló una escala visual de

progresión de síntomas, para determinar el periodo de incubación y

dinámica del inóculo, ubicación en tejidos y distribución en órganos.

Se observó que el periodo de incubación es de aproximadamente cinco días (humedad relativa del 80% y temperatura de 20-25°C), pre-

sentándose clorosis en el área de inoculación. En cuanto a dinámica

del microorganismo en el tejido, a los cinco días, la población en el

punto de inoculación es de 2x104 UFC/4cm2 posteriormente, se incre-menta a 1x108 UFC/4cm2, presentándose una clorosis pronunciada. A

los 17 días pos-inoculación el tejido llega a su máximo de células

bacterianas 2x109 UFC/4cm2, y a continuación la bacteria se dispersa

a otros tejidos, observándose síntomas en hojas adyacentes al tejido inoculado, también en tallos y zarcillos, indicando el movimiento del

patógeno a través de los haces vasculares. Esto fue corroborado por

análisis histológicos y tinción de Gram in situ. Por lo anterior, se

considera que la enfermedad es de carácter sistémico y de rápido avance en la planta.

Palabras claves: frutales, bacteriosis, infección

SUMMARY The purple passion fruit (Passiflora edulis), and many other Passiflora,

is attacked by different groups of microorganisms, among which are

including fungi, bacteria, viruses and nematodes which will cause

diseases, reducing the quality and volume of fruit for export , as well

can affect the productive cycle and therefore increase costs in man-

agement and control. One of these organisms is the bacteria Xantho-

monas axonopodis, causal agent of bacterial oil spot. To determine the

advance of the bacterium in gulupa tissue, was developed a visual scale of the progression of symptoms, to determinate the period of

incubation and inoculum dynamics, location and distribution in tissue

organs. Was noted that the incubation period is approximately five

days (relative humidity 80% and temperature of 20-25 ° C), chlorosis appear in the inoculation area. With regard to dynamics of the organ-

ism in tissue, after five days, the population in the inoculation is 2x104

UFC/4cm2 then is increased 1x108 UFC/4cm2, showing a pronounced

chlorosis. At 17 days post-inoculation the tissue reaches its maximum of bacterial cells 2x109UFC/4cm2, and then, the bacteria spreads to

other tissues, noting symptoms in inoculated tissue adjacent leaves,

also stems and tendrils indicating movement pathogen through the

vascular vessels. This was confirmed by histological analysis and Gram stain in situ. Therefore, is considered that the disease is systemic

and rapid progress in the plant.

Keywords: fruits, bacterial disease, infection

INTRODUCCIÓN

La gulupa (Passiflora edulis Sims), en Co-

lombia, se ha ubicado entre las principales

frutas de exportación después del banano y la

uchuva (Jiménez et al., 2009). Se exporta hacia Alemania, España, Bélgica, Francia y

Suiza entre otros y en América a Canadá y

Estados Unidos principalmente (Rubio y

Gómez, 2008, Miranda et al., 2009). La fruta posee características organolép-

ticas y contenido nutricional de interés en el

sector agroindustrial y apta para el consumo

fresco (Pinzón, 2007).

Debido a la expansión del cultivo se ha

incrementado la incidencia de varias enfer-

medades, entre las cuales se encuentra la

mancha de aceite; esta ha disminuido el volumen de producción limitando la oferta de

la fruta para su exportación, pero principal-

mente, demeritando su calidad. El agente

causal, Xanthomonas axonopodis, fue identi-ficado por primera vez por Pereira (1969) en

Brasil; en Colombia se registró en cultivos de

maracuyá en 1995 (Castillo y Granada,1995). La sintomatología característica de la enfer-

medad se observó en el sur de Sumapaz

(Cundinamarca), una de las zonas de alta

producción en donde los niveles de inci-dencia en lotes afectados pueden llegar hasta

el 95% (Mora et al., 2009), reduciendo con-

siderablemente las áreas productivas (Miran-

da et al., 2009). Benítez (2010), confirmó la identidad del agente causal en Colombia

mediante pruebas biológicas, bioquímicas y

moleculares concluyendo que se trata de X.

axonopodis, pero descartando temporalmente que se trate del patovar passiflorae de X.

axonopodis, debido a que en las pruebas

experimentales con marcadores moleculares

específicos diseñados por Munhoz (2009) no se observó el mismo patrón de amplificación

reflejado en tal investigación, tampoco así en

las pruebas biológicas preliminares.

La sintomatología observada en campo de la enfermedad es bastante diversa e incluye

lesiones foliares pequeñas, cloróticas, aceito-

sas, translúcidas y con halos visibles, siendo más prevalentes las manchas foliares de color

amarillo con exudado aceitoso (Benítez y

Hoyos-Carvajal, 2009). Cuando evolucionan,

estas lesiones se tornan necróticas y con bordes difusos en toda la lámina foliar, des-

prendimiento del peciolo y presencia de otras

lesiones en diferentes órganos de la planta

tales como tallos o frutos (Benítez y Hoyos-Carvajal, 2009; Monteiro de Campos, 2001;

Pinto et al., 2003). Benítez, (2010) determinó

el avance de la enfermedad, encontrando que

a partir el día 45 pos-inoculación los órganos afectados presentaban una severidad mayor

del 80% de acuerdo a la escala de Castillo et

al., (2009).

De acuerdo a las observaciones en campo y análisis preliminares de la enfermedad, se

ha considerado que esta podría ser de carácter

sistémico y de rápido avance en la unidad

productiva, lo cual indica que las medidas de control deben ser inmediatas una vez se


observen los síntomas iniciales para evitar la dispersión de la bacteria a otras plantas. El

modo de infección de este agente bacteriano

podría ser similar al de otras especies de

Xanthomonas en aspectos como la dispersión hacia diferentes órganos de la planta; sin

embargo, no se dispone de información al

respecto. Por tanto, el propósito del presente

trabajo fue determinar el proceso infectivo de la enfermedad con pruebas de patogenicidad

y análisis histopatológicos.


Determinación de avance de síntomas en

plantas de gulupa

Las pruebas para determinar el avance de los síntomas de de la enfermedad se realizaron

en plantas de gulupa de dos a cuatro meses de

edad utilizando ocho aislamientos de

Xanthomonas axonopodis (FAB-145,FAB-146,FAB-147, FAB-148,FAB-149, FAB-150,

FAB-151, FAB-152). Cada aislamiento se

inoculó en tres plantas, para el control abso-

luto se inyectó agua destilada estéril. Las plantas se ubicaron en el invernadero de la

Facultad de Agronomía de la Universidad

Nacional de Colombia, sede Bogotá. Para las

inoculaciones se emplearon los métodos de inyección con émbolo y corte de tijeras ino-

culando suspensiones bacterianas de

D.O600nm: 0,2 (1,0 x 108 a 3,8 x 10 8

UFC/mL), realizando el procedimiento en las hojas siguientes a las yemas o puntos de

crecimiento. Las plantas se mantuvieron a

una humedad relativa del 80% y temperatura

de 20-25°C por cinco semanas.

Las evaluaciones de progresión de sínto-

mas se realizaron a partir del día de inocula-

ción y luego cada dos días hasta completar

tres semanas mediante una escala visual diseñada para este propósito (Figura 1).

Evaluación de la dinámica poblacional del

inóculo bacteriano

Para la evaluación de la dinámica poblacional

de la bacteria se usaron dos cepas de X. axo-

nopodis, FAB-147 y FAB-151, seleccionadas por obtener en pruebas anteriores un avance

rápido de síntomas en el hospedero. Se rea-

lizó una inoculación en el envés de la hoja

con suspensiones bacterianas de 1 X 108 UFC/mL cubriendo una zona de 0,5 mm de

diámetro. Para el análisis se tomaron discos

de tejido con un sacabocados de 22 mm de

diámetro cada dos días a partir del día uno hasta 15 días pos-inoculación (Castañeda

2005, Robinson et al., 2006 y Zuleta et al.,

2002). Después de desinfectar los tejidos se maceraron en una caja de Petri estéril con un

mL de agua destilada estéril, tomándose 100

µL para realizar diluciones seriadas hasta

llegar a 10-10, estas soluciones se sembraron en Agar nutritivo y se realizó la lectura de

concentración bacteriana por conteo de uni-dades formadoras de colonias UFC, con esto

luego se efectuaron los cálculos matemáticos

para determinar la concentración de bacterias

en el tejido.

Análisis de cortes histopatológicos

Con lesiones obtenidas de las pruebas de patogenicidad, se realizaron análisis histoló-

gicos mediante la técnica de cortes en parafi-

na de Smith y Dickey (1981) en hojas y

tallos infectados con los aislamientos de X. axonopodis FAB-145, FAB-146 y FAB-149.

Para tal fin, se tomaron fragmentos de cinco mm de cada lesión y se sometieron a un

proceso de fijación (Smith y Dickey, 1981)

en una solución de Formalina- Alcohol-

Acetona (FAA) por 24 h. Luego, se llevó a cabo un proceso de deshidratación con cinco

cambios de alcohol a concentraciones ascen-

dentes cada una por 24 h.

Posteriormente, se realizó una imbibición con cuatro cambios distintos de vol/vol de

tert-butanol: alcohol 96% y una inclusión con

parafina, de la cual se tomaron bloques con el

fin de realizar los cortes a seis micrones en un micrótomo de rotación tipo Minot, Modelo

Figura 1. Escala de evaluación visual utilizada en las pruebas de patogenicidad para el seguimiento de

progresión de síntomas.


59

Spencer 820 en el laboratorio de Fitopatolog-ía de la Facultad de Agronomía de la Univer-

sidad Nacional de Colombia.

Después de la fijación en láminas porta-

objetos de los cortes, se realizó la coloración de Brown-Hopps, la cual es una modificación

de la tinción de Gram en donde se fijan las

bacterias a las superficies con una solución

1:1 ácido pícrico-acetona (Prophet et al., 1995).

RESULTADOS Y DISCUSION

Determinación de avance de síntomas en

plantas de gulupa

De acuerdo con las pruebas de patogenicidad

desarrolladas con X. axonopodis en este

estudio, los métodos de inoculación de infil-

tración y corte de tijeras permitieron una penetración eficiente en los tejidos de las

bacterias utilizadas (Tabla 1).

El método de infiltración asemeja a la pe-

netración que hacen las fitobacterias, que ocurre frecuentemente por la vía estomática o

por los hidátodos (Ploetz, 2003), y que les

facilita entrar en los espacios intracelulares

del mesófilo (Ruz et al., 2008); una vez en el apoplasto pueden iniciar su multiplicación y

expresar factores de patogenicidad. Entre las

estrategias de ataque al hospedero por parte

de Xanthomonas está la secreción de poli-

sacáridos extracelulares (PE) que desempe-

ñan un papel importante en la colonización

del tejido. Estos PE al interactuar con las

células del hospedante, pueden formar un gel

favoreciendo la adhesión a ellas y poder así secretar efectores respectivos de virulencia

(Goodman y Novacky, 1994).

En contraste, la inoculación con corte de

tijeras, permite la entrada fácilmente al tejido y a las nervaduras por el daño invasivo gene-

rado. Las heridas ocasionadas en los tejidos

ayudan a los fitopatógenos a establecer la

enfermedad severa y aún más si la concentra-

ción bacteriana es mayor (Agrios, 2005),

pudiéndose observar síntomas cercanos a las

nervaduras, pudriciones del peciolo y sínto-

mas en tallos adyacentes más rápidamente, en comparación con el anterior método de inocu-

lación, lo que lo hace un método eficiente

para este tipo de evaluaciones (Zuleta et al.,

2002). No obstante, con el método de infil-tración (Figura 2) se inocula una concentra-

ción conocida de bacterias y garantiza la

entrada a las células del mesófilo en una área

de tejido específica y muy pequeña, por ello este método es ideal para evaluaciones de

dinámica poblacional y estudios de dosis

respuesta (Figura 3 y 4).

Las evaluaciones de progresión de sínto-mas, permitieron hacer un registro fotográfi-

co del avance del daño (Figura 2), encontrán-

dose que el periodo de incubación de la en-

fermedad fue aproximadamente entre las 72 y las 96 horas luego de la inoculación, donde se

empezó a observar la aparición de síntomas

tales como halos aceitosos y manchas necró-

ticas (Figura 2) y el aumento en la concentra-ción de bacterias UFC en 4 cm2 de tejido,

correspondiente a un porcentaje de severidad

de 4,75% al 14,3% según la evaluación de

severidad elaborada, consistente con la escala de severidad diseñada por Castillo et al.

(2010), y similar a lo encontrado en otras

investigaciones realizadas en el género de

Xanthomonas en lechuga (Robinson et al., 2006), en plantas perennes como Nepetia

cataria (Koike et al., 2001) y en plantas de

maracuyá (Botero et al., 2006).

Evaluación de la dinámica poblacional del

inóculo bacteriano

Después del periodo de incubación aproxi-

madamente de cinco días, la población en el

punto de inoculación fue de 2X104 UFC/4cm2

posteriormente, se incrementa a 1X108

UFC/4cm2, presentándose una clorosis pro-

nunciada (Figura 4). A los 17 días pos-

inoculación (d.p.i.) el tejido llega a su máxi-mo de carga bacteriana 2X109 UFC/4cm2, y

Tabla 1. Análisis estadístico mediante programa SAS. Análisis de varianza (ANOVA) de Índices de

severidad obtenidos

Fuente gl Suma de Cuadrados Cuadrado de

la media F valor Pr > F

Métodos de

Inoculación 1 2.441.961,158 2.441.961,158 4,31 0,0392

Cepas Bacterianas

8 1.402.624,357 200.374,908 0,35 0,9276

Figura 2. Estados visuales síntomas causados por aislamiento X. axonopodis FAB145 por inocu-

laciones con infiltración del envés.


empieza la dispersión del microorganismo a otros tejidos, observándose síntomas en hojas

adyacentes al tejido inoculado; también en

tallos y zarcillos, indicando el movimiento

del patógeno a través de los haces vasculares. De acuerdo a la evaluación de la progre-

sión de síntomas y al análisis de la progresión

de la enfermedad, se alcanzaron porcentajes

de severidad de hasta el 85% luego de 20 d.p.i. A partir de los 30 d.p.i se presentaron

lesiones aceitosas en tallos, estos síntomas se

extienden hasta las hojas sanas de la misma

planta; 45 d.p.i. aumenta la presencia de síntomas en hojas nuevas. Lo anterior

también ha sido propuesto y caracterizado por

Goncalves (2000), quien desarrolló una in-

vestigación en esta enfermedad en zonas productoras de maracuyá en Brasil.

Análisis de cortes histopatológicos

De acuerdo a las observaciones de los cortes

histológicos (Benítez et al.,2010), X. axono-

podis inicia su penetración a través de la

epidermis por medio de los estomas o hidáto-dos. La posterior colonización está asociada a

tejidos como el parénquima lagunar y luego a

través de todo el mesófilo en el tejido foliar

causando disrupción y en algunos casos invasión de las células del parénquima lagu-

nar. Cuando este agente comienza a movili-

zarse localmente en el tejido, se observa

invasión de los vasos conductores y así puede alcanzar la nervadura central de la hoja

(Kaku et al., 2004: Smith y Dickey, 1981).

En enfermedades como X. malvacearum

en algodón, luego de 30 d.p.i. se empieza a observar lesiones aceitosas en tallo y la colo-

nización de estas bacterias se asocia con el

parénquima cortical, permitiendo que se

movilicen hasta los haces vasculares vía xilema, ya que estas células mantiene una alta

concentración de fuentes de carbono (Kaku et

al., 2004). En un estudio de Wallis et al.,

(1973) se observó en evaluaciones histológi-cos de tejidos foliares de lechuga infectados

con X. campestris, que el movimiento de

masas bacteriales se favorece por la disolu-

ción de la pared de las células, pudiendo estas al final, atravesar los vasos conductores

adyacentes. Esto puede indicar que esta en-

fermedad tiene naturaleza sistémica, origi-

nando sintomatología varios órganos en la planta y causar el colapso de la misma (Cason

et al., 1977).

Con respecto a los cortes histopatológi-

cos, la presencia de halos aceitosos como los

observados en el estado 3, según Kaku et al.

(2004) se relacionan con la degradación de

cloroplastos a consecuencia de la acción de efectores como citotoxinas; los síntomas

prosiguen a manchas pardas y necróticas,

asociadas a la plasmólisis celular presente en

el parénquima en empalizada y lagunar y además, la presencia de esas masas celulares

en el xilema de las nervaduras principales

desembocan a los conductos del peciolo pudiendo causar así desprendimiento de la

hoja. (Benítez et al., 2010). También se ob-

servó en lesiones de tallo principal, necrosis avanzada con contaminación con hongos

oportunistas en la superficie de estas lesiones

(Benítez et al., 2010).

CONCLUSIONES

Mediante los análisis histológicos y evalua-ción de la manifestación de síntomas a través

del tiempo, puede concluirse que la bacterio-

sis en gulupa causada por X. axonopodis es

una enfermedad de carácter sistémico y de rápido avance en la unidad productiva (Figura

5), tomando 45 días en dispersarse a órganos

no inoculados, pero que por la velocidad de

dispersión en la planta y su tasa de multipli-cación, obliga a que las medidas de control

sean rápidas para evitar la dispersión de la

bacteria a plantas sanas, y sobre todo plante-

ando que se deben emplear medidas de carác-ter preventivo principalmente.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la Universidad Na-

cional de Colombia, sede Bogotá, Asohofru-

col y Ministerio de Agricultura y Desarrollo

Rural por la financiación de la presente inves-tigación (Contrato 2007L4348_49-837/07).

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FAB145 en relación con el tiempo.

Figura 4. Dinámica poblacional de los aislamientos X. axonopodis FAB147 y X. axonopodis FAB151 en relación a la concentración celular a través de los días 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15 pos-inoculación.


61

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Figura 6. Proceso infectivo de Xanthomonas axonopodis en gulupa (Passiflora edulis Sims). Se determinan dos fases durante el proceso: Fase de establecimiento

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63

IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL Dasheen mosaic virus

EN CALA (Zantedeschia aethiopica) EN CÓRDOBA, ARGENTINA*

Eva E. Cafrune1, Florencia Asinari2, Claudia F. Nome1, María C. Perotto1, 3, Mariana Quiroga4 y Vilma C. Conci1, 3

1Instituto de Patología Vegetal (IPAVE), Centro de Investigaciones Agropecuarias (CIAP), Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria

INTA) . 2 Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Univ. Nacional de Córdoba en el IPAVE-CIAP INTA. 3 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). 4Agencia Nacional de Promociones

Científicas y Técnicas. Córdoba, Argentina.

Correos electrónicos de contacto [email protected], [email protected]

*Artículo científico, recibido para publicación el 27/05/2011; aceptado el 18/08/2011 Galardonado con el Premio Andinesa, otorgado durante el XXX Congreso

Colombiano y XVI Latinoamericano de Fitopatología Bogotá (Colombia) 19 de agosto de 2011.

RESUMEN

En jardines de la ciudad de Córdoba, Argentina, en donde la cala

común (Zantedeschia aethiopica) se utiliza como ornamental, se de-tectaron plantas cuyas hojas mostraban un marcado mosaico de etio-

logía desconocida. El objetivo de este trabajo fue identificar el agente

causal de los síntomas observados. Inicialmente se realizaron observa-

ciones al microscopio electrónico mediante la técnica “leaf dip” utili-zando extractos de plantas de cala afectadas por el mosaico, que per-

mitieron detectar partículas virales filamentosas y flexuosas. Poste-

riormente, en cortes ultrafinos de lámina foliar se visualizaron inclu-

siones tipo molinete, típicas del género Potyvirus. Los resultados obtenidos se confirmaron mediante la técnica inmuno enzimática

indirecta (PTA-ELISA) utilizando un antisuero (Potyvirus group

complete kit-BIOREBA) específico para este género viral. La clona-

ción y secuenciado de un fragmento genómico de 664 nt correspon-diente a la porción final del gen de la NIb y la primera parte de la

cápside protéica (CP); mostró un 70,2% a 87,3% de identidad de

amino ácidos con secuencias de Dasheen mosaic virus (DsMV). La

comparación de la secuencia completa de la CP con otras secuencias de DsMV publicada en el GenBank, mostró entre 83,6 y 95,2% de

identidad, detectándose los mayores porcentajes con aislamientos

provenientes de Zantedeschia sp. (entre 94,3 y 95,2%). Los resultados

obtenidos confirman la identidad del virus según los criterios de de-marcación de especies del 8vo Reporte del ICTV para Potyvirus (iden-

tidad mayor al 80% de aminoácidos de la CP).

Palabras clave: Araceae, Potyvirus, caracterización molecular,

DsMV.

SUMMARY

In gardens of the city of Cordoba, Argentina, where the Araceae,

(Zantedeschia aethiopica) is used as an ornamental plant is was o served some affected plants with a typical mosaic disease of unknown

ethiology. In order to stablish the causal agent of that disease it was

planned to realize the present investigation. Initially, observations

through the TEM, using leaf dip methodology with disease leaf tissues, some filamentous, flexuous virus particles were observed.

Also, using ultrafine sections the presence of cylindrical inclusions

were observed by transmission electron microscopy. An indirect

enzyme immunoassay (PTA-ELISA) using the Potyvirus group com-plete kit-BIOREBA, confirmed the presence of a potyvirus. A

genomic fragment of 664 nt corresponding to the final portion of the

NIb gene and the first portion of the capsid protein (CP) was cloned

and sequenced, resulting in 70.2% to 87.3% amino acid identities with corresponding sequences of Dasheen mosaic virus (DSMV). Specific

primers for DSMV’s CP were used to produce a fragment of 1000 bp,

showing 83.6 and 95.2% homologies with selected CP sequences of

DSMV. The highest identity was obtained with DSMV in Zantedeschia sp. (94.3 to 95.2%). This confirms the identity of the

virus studied here, according to the ICTV species demarcation criteria

for potyviruses (greater than 80% homology of amino acids in the

CP)..

Keywords: Araceae, Potyvirus, molecular characterization, DsMV.

INTRODUCCIÓN

La Araceae es una familia de plantas mono-

cotiledóneas que incluye especies alimenti-

cias y ornamentales ampliamente utilizadas. Esta familia de plantas incluye 2.950 especies

distribuidas en 106 géneros (Mabberley,

1989;Grayum, 1990), que incluyen Zante-

deschia. La propagación agámica (asexual) de las

especies de aráceas facilita la transmisión de

patógenos sistémicos como los virus. Debido

a esto, es de fundamental importancia realizar un examen de las plantas madres para produ-

cir material propagativo libre de virus. La Z.

aethiopica (cala común) es una planta orna-mental de amplia distribución mundial, y las

virosis son uno de los factores más importan-

tes que limitan la producción (Chen et al.,

2003). Se han citados numerosos virus en

cala, entre los cuales se destacan especies de Tospovirus, como el Tomato spotted wilt

virus y el Watermelon silver mottle virus

(Chen, 2005; Zettler y Hartman, 1995); Poty-

virus, como el Turnip mosaic virus (TuMV), Konjac mosaic virus (KMV) y Dasheen

mosaic virus (DsMV)(Barg et al., 1994; Chen

et al., 2000; Chen et al., 2003; Pham et al.,

2002; Shimoyama et al., 1992a; Shimoyama et al., 1992b; Zettler et al., 1987); Carmovi-

rus como el Carnation mottle virus (Chen et

al., 2002); y Cucumovirus como el Cucumber

mosaic virus (Shimoyama et al., 1990). Los virus encontrados en cala inducen síntomas

de mosaico y distorsión de las hojas en la

mayoría de los cultivares comerciales, pu-diéndose observar además manchas amarillas

y estriados (Chen et al., 2003).

El DsMV es considerado el virus de ma-

yor importancia y prevalencia en el género

Zantedeschia (Zettler & Hartman, 1987). Es un miembro del género Potyvirus, con partí-

culas filamentosas, flexuosas de aproxima-

damente 750 nm de largo, cuyo ácido nuclei-

co es ARN de cadena simple y sentido positi-vo (Abo El-Nil et al., 1977; Shukla et al.,

1994; Zettler et al., 1978a; Zettler et al.,

1978b). Este virus fue reportado por primera

vez en Colocasia esculenta (L) Schott (Zettler et al., 1970) y es el patógeno viral

más importante de las aráceas cultivadas en

todo el mundo (Zettler & Hartman, 1987). El

patógeno está ampliamente distribuido debido a la propagación vegetativa de sus hospedan-

tes y por sus vectores naturales, los áfidos,

entre los que se incluye Myzus persicae y Aphis gossypii que lo transmiten en forma no

persistente (Babu et al., 2011; Zettler et al.,

1978b).

En jardines de la ciudad de Córdoba, Ar-



http://es.wikipedia.org/wiki/Zantedeschia

http://es.wikipedia.org/wiki/Zantedeschia


gentina, en donde la cala común (Zantedes-chia aethiopica) se utiliza como ornamental

se detectaron plantas cuyas hojas mostraban

un marcado mosaico en forma de estrías de

diferentes tonos de verde, ampollas suaves y notables deformaciones foliares que hacían

poco atractivas. En razón de que se desconoc-

ía la causa del disturbio se planteó la presen-

te investigación cuyo objetivo fue identificar y caracterizar el patógeno asociado a los

síntomas observados.


Material vegetal y análisis serológico

En jardines de la ciudad de Córdoba se recogieron hojas de cala común con síntomas

característicos de mosaico y deformaciones

(Figura 1).

Las muestras colectadas de los tejidos se conservaron a 4º C para su estudio. Se toma-

ron porciones de tejido con síntomas y se

analizaron mediante la técnica indirecta PTA-

ELISA (“Plate Trapped Antibody-Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”, por sus

siglas en idioma Inglés), utilizando un anti-

suero monoclonal comercial para la detección

de potyvirus, según las instrucciones del fabricante (Potyvirus group complete kit-

BIOREBA). Se usaron los controles positivos

y negativos del paquete y los valores de

absorbencia a A405 nm se determinaron me-diante un espectrofotómetro Dynatech MR

4000, considerando como positivos muestras

cuyos valores de absorbencia superaron dos

veces a la media de los testigos sanos.

Microscopía electrónica

Con el objeto de verificar si las muestras del tejido afectado contenían partículas virales,

éstas se procesaron mediante la técnica de

preparación rápida con tinción negativa co-

nocida como “leaf dip”. Para el efecto se maceraron muestras de hojas de cala con

síntomas en proporción 1/5 (p/v) en tampón

borato 0,05 M pH 8,1 y teñidas negativamen-

te con acetato de uranilo al 2% (pH 4,2) (Kitajima, 1965). Las preparaciones se obser-

varon al microscopio electrónico de transmi-

sión (MET, JEOL JEM 1200 EX II).

Para evaluar las alteraciones citológicas, se realizaron cortes ultrafinos a partir de la

lámina foliar con mosaico. Las muestras se

fijaron con glutaraldehido 2,5%-

paraformaldehido 2,5% y contrastaron con tetroxido de osmio 1% en tampón cacodilato

0,05M, pH 7.

Los procesos de deshidratación se efec-tuaron usando un gradiente de acetona (50-

100%).

Las muestras se embebieron en resina

“Spur low viscosity” (embedding media kit ®. Data sheet #217 Polysciences, INC.), a

temperatura ambiente, siguiendo la metodo-

logía descrita por Kitajima (1997).

Los cortes ultrafinos se realizaron con cuchilla de diamante y se contrastaron con

acetato de uranilo 2% (Reynolds, 1963).

Posteriormente las preparaciones se observa-

ron al MET.

Detección molecular

Para la detección molecular de los virus

presentes en las muestras de cala con sínto-mas de mosaico, se realizó la extracción de

RNA total de planta con el paquete Qiagen p

(RNeasy Plant Mini Kit)

Las muestras se analizaron mediante

transcripción reversa seguida de reacción en

cadena de polimerasa (RT-PCR), usando

iniciadores degenerados para Potyvirus

(Lunello et al., 2005) que hibridan en la porción final de la NIb y la primera parte de

la cápside proteica, que amplifican un frag-

mento de aproximadamente 630 pb. El tejido

vegetal también se analizó con iniciadores específicos para DsMV (Reyes et al., 2009)

que amplifican un fragmento de 1000 pb;

desarrollados a partir de regiones conservadas

del genoma de DsMV y que amplifican la CP y la región 3´no codificante.

Los RT-PCR se realizaron con el paquete

Access RT PCR System (Promega) de acuer-

do a las instrucciones del fabricante. Los pasos del RT-PCR para los iniciadores que

detectan Potyvirus fueron: transcripción

reversa 48ºC por 45 minutos; programa de

ciclado de 94ºC por dos minutos, desnatura-lización con cinco ciclos de 94ºC por 30

segundos, 40ºC por 30 segundos, 68ºC por un

minuto para la desnaturalización, hibridación

de los iniciadores y extensión del fragmento

respectivamente. Se continuó con 40 ciclos a

94ºC por 30 segundos, 50ºC por 30 segundos,

68ºC por 2,5 minutos para la desnaturaliza-ción, hibridación de los iniciadores y exten-

sión del fragmento respectivamente., comple-

tando con una etapa de extensión final a 68ºC

por siete minutos. Para los iniciadores específicos de DsMV

la transcripción reversa se realizó a 48ºC por

una hora, seguida de un programa de ciclado

de 15 min a 95ºC para la desnaturalización; 40 ciclos de 94ºC por un minuto, 41ºC por un

minuto, 68ºC por un minuto para la desnatu-

ralización, hibridación de los iniciadores y

extensión del fragmento respectivamente, completando con una etapa de extensión final

de 10 min a 68ºC.

Caracterización molecular

Los fragmentos amplificados por RT-PCR se

clonaron en el vector pGEM®- T Easy Vec-

tor (PROMEGA). Las células competentes de Escherichia coli provistas por el paquete, se

transformaron por el método de choque

térmico (incubado a 42ºC por 30 segundos)

de acuerdo a las especificaciones del fabri-cante y se sembraron en medio LB + ampici-

lina (100 µg/ml). Se seleccionaron las colo-

nias recombinantes mediante la técnica de

PCR de colonia. El DNA plasmídico de los clones obteni-

dos se purificó mediante el paquete “Plasmad

Mini Kits for purification of ultrapure, trans-

fection grade plasmid DNA QUIAGEN®.” Los clones se secuenciaron con un secuencia-

dor automático (Unidad de Genómica, Insti-

tuto de Biotecnología, Centro Nacional de

Investigaciones Agropecuarias, INTA Caste-lar, Buenos Aires, Argentina). Las secuencias

de nucleótidos generadas se analizaron con el

A B

Figura 1. Síntoma en hojas de Zantedeschia aethiopica, A, mosaico y ampollas suaves en la lámina foliar ,

B, deformaciones y distorsión de la hoja.


65

paquete de programas LASERGENE (DNASTAR Inc. vers. 5. 2001, Madison, WI,

USA). La comparación de las secuencias

consenso obtenidas con las existentes en el

GeneBank se realizó aplicando el programa BLAST. Se generó un árbol filogenético

utilizando el método “Neighbor-Joining”. La

significancia estadística del orden de las

ramas se estimó realizando 1000 repeticiones del alineamiento múltiple original (boots-

trap).


En las hojas de cala común con mosaico

marcado, se observaron partículas virales

filamentosas y flexuosas. En los cortes ultra-

finos de lámina foliar se detectaron agregados laminares, rollos e inclusiones tipo molinete,

típicas de la subdivisión III (Edwardson &

Christie, 1996) del género Potyvirus (Figura

2).

La presencia de virus perteneciente a este género fue confirmada con suero específico

para el género Potyvirus mediante PTA-

ELISA. En las muestras provenientes de cala

infectadas se detectaron valores de absorban-

cia 14 veces superiores a los de los testigos

sanos.

Aquellas muestras que resultaron positi-vas en la prueba serológica, se usaron para la

extracción de RNA y se logró amplificar un

fragmento del tamaño esperado del genoma

viral mediante la técnica de RT-PCR con los iniciadores degenerados para potyvirus.

La secuencia de 664 nucleótidos del

fragmento obtenido se comparó con secuen-

cias publicadas de los virus mencionados como patógenos de cala, TuMV (GenBank Nº

HQ446217; NC_002509), KMV (GenBank

Nº AB219545; NC_007913) y DsMV (Gen-

Bank Nº AF048981; AJ298034; AY994104; DMU00122; DQ925466; EF199550;

HQ207542; NC-003537). Los mayores por-

centajes de identidad se detectaron con las

secuencias del DsMV, desde un 70,2 a un 87,3%, siendo los porcentajes de identidades

con las del TuMV de 51,5 y 52,7% y con las

del KMV 53%.

Posteriormente las muestras se probaron mediante RT-PCR con iniciadores específicos

para DsMV y se logró amplificar fragmentos

del tamaño esperado (1000 pb) a partir de dos

aislamientos diferentes de cala, los cuales se clonaron y secuenciaron. Para corroborar la

identidad del virus, conforme a lo establecido

por el “International Committee on Taxono-

my of Virus” (Adams et al., 2005; Fauquet et al., 2005), se comparó la secuencia de ami-

noácidos (aa) del gen de la cápside proteica

(CP) de los aislamientos de cala de Argentina

con 22 secuencias de aa de diferentes aisla-mientos de DsMV provenientes de distintas

especies de Araceae publicados en el Gen-

Bank, nueve obtenidas de Xanthosoma spp.

de Nicaragua publicadas por Reyes et al. (2009), tres secuencias de Zantedeschia

aethiopica de China CAC83049, AAM

46863, NP_734112), tres de Amorphophallus paeoniifolius de India (ADN88390,

ACI05261, ADN88389), cuatro de Coloca-

sia sp. de diferentes orígenes (AAA18257,

AAA21392, ABL09440, ADN88400), una de

Caladium sp. (AAC05494) y dos secuencias

provenientes de otras Araceae no identifica-

das (AAD51951, ABM97418). Además se comparó una secuencia de-

nominada “Spathiphyllum potyvirus” de

India (ADK88942); tres secuencias

(CAD23064, CAE83572, CAE83571) de un potyvirus conocido tentativamente como

“Vanilla mosaic virus” (VanMV) obtenida de

vainilla de Tahití (Vanilla tahitensis). Como

extragrupo fue usada una secuencia de Bean common mosaic virus cepa peanut stripe

(BCMV, CAA72439).

Del análisis de la comparación de se-

cuencias de aa de la CP mediante Clustal W, con el paquete de programas LASERGENE

(DNASTAR Inc. vers. 5. 2001, Madison, WI,

USA), se obtuvieron identidades que variaron

entre un 83,6 y un 95,2% con las 22 secuen-cias de DsMV, siendo los mayores porcenta-

jes de identidades con las secuencias de

DsMV obtenidas de Zantedeschia sp. (94,3 al

95,2 %). Esto confirma la identidad del poty-virus investigado según los criterios de de-

marcación de especies del 8vo Reporte del

ICTV para especies del género Potyvirus

(homología mayor al 80% de aminoácidos de la CP) (Adams et al., 2005; Fauquet et al.,

2005). También se observó alta identidad con

tres secuencias publicadas como VanMV

(81,4 al 94,5%) y una como Spathiphyllum potyvirus (81,1%), especies citadas como

tentativas dentro del género Potyvirus.

Estos resultados podrían estar indicando

que las secuencias publicadas como VanMV y Spathiphyllum potyvirus tienen la misma

identidad que lo reportado como DsMV, y

por consiguiente podría tratarse del mismo

virus. Esta identidad también fue reportada por Reyes et al. (2009) y Farreyrol et al.

(2006).

Del análisis filogenético de las secuencias se observan dos grandes grupos (Figura 3), o

clúster, que se separan con un alto valor de

“boostrap” (98,1%). En el clúster I se agru-

pan las secuencias de DsMV provenientes de

especies de diversos géneros de aráceas,

como Colocasia, Amorphophallus, Caladium

y Zantedeschia con una identidad variable entre 87,2 y 95,5%. En este clúster se separan

del resto las secuencias provenientes de

Zantedeschia sp., (dos de Argentina y tres de

China) en lo que podría ser un subgrupo, dentro del mismo.

El clúster II, incluye 11 de las secuencias

comparadas, con una identidad variable entre

83,3 y 88,5%, y comprende DsMV secuen-ciado a partir de todas las Xanthosoma spp.,

una secuencia proveniente de Colocasia sp., y

una de otra arácea no identificada. Separados

de estos grupos quedan las secuencias obteni-das desde orquídea (VanMV) con porcentajes

de identidades que van del 81,1 al 94,5 y de

Spathithyllium sp. con porcentajes de iden-

Figura 2. Cortes ultrafinos de tejido foliar de Zantedeschia aethiopica vistos al microscopio electrónico de transmisión. a: inclusiones tipo molinetes (“pinwheel”),

b: inclusiones tubulares, o rollos (“scroll”) y c: agregados laminares (“laminated agregate”).


tidades que van del 81,1 al 81,5. Los agrupa-

mientos parecieran estar más relacionados al

género del hospedante de donde proviene el virus que al origen geográfico, pero esto

necesita ser confirmado. Los agrupamientos

observados revelan diferencias dentro del

DsMV que probablemente permitan separar razas, o variantes del virus que deberían ser

estudiadas en el futuro.

CONCLUSIONES

Las inclusiones virales observadas en los

cortes ultrafinos de tejido infectado y las pruebas serológicas permitieron concluir que

el virus detectado en cala en Córdoba, Argen-

tina pertenece al género Potyvirus. Las com-

paraciones de secuencias genómicas del gen que codifica para la CP viral del virus detec-

tado reveló alta identidad con el DMV detec-

tado en otros países (entre 83,6 y 95,2%),

corroborando la presencia de este virus según los criterios de demarcación establecidos por

el ICTV para este género viral. El análisis

filogenético de las secuencias publicadas y

las obtenidas en este trabajo sugieren la exis-tencia de 2 razas, o variantes virales.

AGRADECIMIENTOS

Este estudio fue realizado en el IPAVE-

CIAP-INTA y financiado por fondos de

INTA y CONICET.

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Bootstrap Trials = 1000, seed = 111

0

36.5

5101520253035

CAC83049 DsMV Zantedeschia China

NP_734112 DsMV Zantedeschia China

51.7

Zantedeschia ARGENTINA 1

Zantedeschia ARGENTINA 3

100.0

55.5

AAM46863 DsMV Zantedeschia

59.4

AAA21392 DsMV Colocasia

AAD51951 DsMV aroid plants Taiwan

82.0

44.6

ABL09440 DsMV Colocasia Vietnam

34.0

AAC05494 DsMV Caladium

23.9

ACI05261 DsMV Amorphophallus India

ADN88400 DsMV Colocasia India

82.6

ADN88390 DsMV Amorphophallus India

40.2

ADN88389 DsMV Amorphophallus India

NA

25.0

AM910405 DsMV Xanthosoma Masaya-Nicarag


83.9


46.3


77.2


99.4

ABM97418 DsMV Araceae rivieri Durieu Ch

86.5

AM910398 DsMV Xanthosoma N Guinea-Nicar


71.6


79.9

AAA18257 DsMV Colocasia

76.6

96.6


98.9

98.1

CAE83572 VanMV

64.0

CAE83571 VanMV

77.5

ADK88942 Spathiphyllum India

58.7

CAD23064 VanMV

76.0

CAA72439 BCMV

Gru

po I

Gru

po II

Figura 3. Árbol filogenético obtenido por Neighbor-Joining de la CP deducida de la secuencia de nucleótidos del aislamiento argentino del DsMV y las CP de 22 secuencias de DsMV, 1 de Spathiphyllum potyvirus y 3 de VanMV, publicadas en GeneBank. El análisis filogenético se llevó a cabo con CLUSTAL W, las rela-

ciones de las ramas fueron calculadas con un bootstrap de 1000 repeticiones. Se tomó al Bean common mosaic virus como miembro extragrupo.


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68

ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE FITOPATOLOGIA

Y CIENCIAS AFINES, ASCOLFI

XXXI Congreso Colombiano de Fitopatología Pereira Septiembre 18 al 20 de 2013.

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69

IDENTIFICACIÓN DE ARVENSES COMO HOSPEDEROS NATURALES

DE Begomovirus EN EL VALLE DEL CAUCA, COLOMBIA*

Juan Carlos Vaca-Vaca, Doryan Otavo Fiscal y Karina López-López

Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia sede Palmira.

Carrera 32 vía Candelaria, Palmira, Valle del Cauca, Colombia.

Correo electrónico de contacto: [email protected], [email protected].

*Artículo científico, recibido para publicación el 27/05/2011; aceptado el 18/08/201

RESUMEN En la última década, la mayoría de las pérdidas fitosanitarias asociadas

al cultivo del tomate en el Valle del Cauca han sido atribuidas a la

infección por Begomovirus, un virus transmitido por mosca blanca

Bemisia tabaci. Las arvenses son importantes reservorios para los virus que afectan a las plantas y se ha conjeturado que pueden servir

como hospederos temporales para Begomovirus. Por lo anterior, el

objetivo de la presente investigación fue identificar arvenses asociadas

al cultivo de tomate Solanum lycopersicum presentes en el Valle del Cauca (Colombia) que actúen como hospederos naturales de Begomo-

virus. Se colectaron arvenses en cultivos de tomate de Palmira y Can-

delaria, y mediante la metodología de Reacción en Cadena de la Poli-

merasa se detectó la presencia de Begomovirus. Las arvenses identifi-cadas como Desmodium sp, Amaranthus dubius, Laportea aestuans,

Rivina humilis y Lantana camara fueron positivas, siendo este el

primer reporte en Colombia de la presencia de Begomovirus en estas

arvenses. De acuerdo a la literatura reportada a la fecha, este es el primer reporte de la presencia de Begomovirus en Rivina humilis y

Lantana camara, a nivel mundial. Estos resultados indican que es

esencial que se reconozcan estas arvenses en campo con el fin de

realizar un control cultural eficiente y reducir las virosis en tomate.

Palabras claves: Solanum lycopersicum L., Desmodium sp, Amarant-

hus dubius, Lantana camara, Rivina humilis, Geminivirus

SUMMARY

Identification of weeds as natural host of Begomovirus in Valle del

Cauca, Colombia

In the last decade, most of the phytosanitary yield losses associated

with tomato crops in Valle of Cauca has been attributed to the Bego-

movirus infection, a virus transmitted by whitefly Bemisia tabaci.

Weeds are important reservoirs for the virus that affect plants and has been hypothesized that may serve as temporary hosts Begomovirus.

Therefore, the objective of this research was to determine the presence

of Begomovirus in weeds associated with tomato crops at the Valle of

Cauca. Weeds were collected from tomato crops in Palmira and Can-delaria, and using the methodology of the Polymerase Chain Reaction

(PCR) was detected the presence of Begomovirus. Weeds identified as

Desmodium sp, Amaranthus dubius, Laportea aestuans, Rivina humilis

and Lantana camara were positive, and this is the first report on Colombia for the presence of Begomovirus in these weeds. According

to the literature reported to date, this is the first report of the presence

of Begomovirus in Rivina humilis and Lantana camara, of worldwide.

These results indicate that it is essential to recognize these weeds in the field to conduct an effective cultural management of them and

reduce the severity of viral diseases in tomato.

Key words: Solanum lycopersicum L., Desmodium sp, Amaranthus

dubius, Lantana camara, Rivina humilis, Geminivirus

INTRODUCCIÓN

El tomate (Solanum lycopersicum) es la

hortaliza de mayor importancia en el mundo.

Este cultivo es afectado por varios patóge-

nos (hongos, bacterias y virus) que disminu-

yen su producción, lo que ha hecho necesario

desarrollar métodos de control químico,

biológico y genético para reducir y/o eliminar

las pérdidas económicas provocadas por algunas de ellos.

En el caso de las enfermedades virales su

control constituye un caso especial, ya que

éstas no se pueden combatir por medio de estrategias convencionales usualmente em-

pleadas para erradicar otros tipos de patóge-

nos de plantas (Jones et al., 1991). En tomate, las enfermedades causadas por

los virus se encuentran entre las de mayor

importancia económica por los daños que

generan, en especial aquellas causadas por la Familia Geminiviridae. De esta familia, los

pertenecientes al género Begomovirus han

surgido como una amenaza seria para la

producción de los principales cultivos de importancia económica a nivel mundial en

zonas tropicales y subtropicales del planeta

(Mansoor et al., 2003; Morales y Anderson, 2001; Varma y Malathi, 2003, Seal et al.,

2006). Los Begomovirus son transmitidos de

manera circulativa no propagativa por la

mosca blanca (Bemisia tabaci Genn.), insec-to polífago con una amplia gama de plantas

hospedantes (Lazarowitz, 1992; Czoneck et

al., 2002; Varma y Malathi, 2003, Strange, y

Scott, 2005). En la última década, la mayoría de las

pérdidas fitosanitarias asociadas al cultivo del

tomate en el Valle del Cauca se han atribui-

das a la infección por Begomovirus, patóge-nos transmitidos por la mosca blanca Bemisia

tabaci (Vaca-Vaca et al., 2011; Morales et

al., 2002). Las arvenses son reservorios importantes

para los virus que afectan a las plantas y se ha

conjeturado que pueden servir como hospede-

ros temporales para Begomovirus. Esto debi-do a que las arvenses figuran entre aquellas

plantas de las cuáles las moscas blancas se

alimentan, convirtiéndose eventualmente en

reservorio de Begomovirus. Desde este punto de vista las arvenses pueden cumplir tres

roles no excluyentes en la epidemiología de

las enfermedades virales al servir como re-servorio del virus, ser reservorio de los vecto-

res o de ambos a la vez (Duffus, 1971; Rist y

Lorbeer, 1989; Ochoa et al., 1999).

Desde las arvenses, su vector natural, B. tabaci, puede adquirir y transmitir los Bego-

movirus a los cultivos de tomate, en donde se

pueden adaptar rápidamente y eventualmente

dar lugar a nuevas variantes virales, justifi-cando la realización de estudios que permitan

identificar las arvenses potencialmente peli-

grosas para el cultivo de tomate. Por lo ante-

rior, el objetivo de la presente investigación fue identificar arvenses asociadas al cultivo

de tomate Solanum lycopersicum presentes en

el Valle del Cauca (Colombia) que actúen como hospederos naturales de Begomovirus.

Los resultados de la investigación pueden

ser empleados en la formulación de medidas

culturales de control eficaces que conduzcan a la reducción de la incidencia de la enferme-

dad geminiviral en los cultivos de tomate

localizados en este departamento.





Colecta de las muestras

Los muestreos se realizaron durante el año

2010-2011 en cultivos de tomate localizados

en los municipios de Palmira y Candelaria, en

el Valle del Cauca, Colombia. Las muestras vegetales consistentes en hojas y brotes

jóvenes con sintomatología viral típica se

colectaron en el campo y posteriormente se

transportaron para su análisis al Laboratorio de Fitopatología y Biología Molecular de la

Universidad Nacional de Colombia sede

Palmira. El criterio de selección de las arven-

ses en campo se fundamentó en la presencia de sintomatología geminiviral típica caracte-

rizada por clorosis, mosaico, arrugamiento,

deformación de hojas y enanismo; así como a

la presencia del insecto vector B. tabaci.

Clasificación taxonómica de las arvenses

recolectadas

Las muestras recolectadas en campo se iden-

tificaron y clasificaron en el Herbario "Josep

Cuatrecasas Arumí" de la Universidad Na-

cional de Colombia sede Palmira. La identifi-cación se realizó por medio de comparación

de los especímenes colectados en campo con

otros presentes en la colección del Herbario.

Extracción del ADN

La extracción del ADN genómico de cada

una de las muestras vegetales colectadas en campo se realizó utilizando el método modi-

ficado de extracción con bromuro de cetil-

trimetil-amonio, CTAB, por sus siglas en

idioma Inglés, (Doyle y Doyle, 1987). El ADN total obtenido se almaceno a -20°C

para su análisis posterior.

Reacción en Cadena de la Polimerasa

Para detectar la presencia de cada componen-

te viral en el ADN genómico previamente

extraído a cada una de las arvenses recolecta-das en campo, se uso la técnica de Reacción

en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus

siglas en idioma Inglés). En razón de que un

Begomovirus bipartita está compuesto por dos componentes genéticos: un ADN- A, que

porta los genes involucrados en replicación y

encapsidación; y un ADN-B, que porta los

genes involucrados en el movimiento del virus (Seal, 2006); se utilizaron los cebadores

degenerados PAR1c496/ PAL1v1978 y

PBL1v2040/ PCRc1 (Rojas et al., 1993) que amplifican un fragmento de ~ 1200pb y 600

pb correspondientes a los componentes ADN-

A y ADN-B, respectivamente, de un Bego-

movirus bipartita típico. Las condiciones de la PCR para de am-

bos pares de cebadores se realizó siguiendo

los protocolos descritos según Rojas et al.

(1993).

Los productos de PCR obtenidos se ana-lizaron por electroforesis en geles de agarosa

al 1,0%, en cámaras de electroforesis “Hori-

zon 58” (Invitrogen®) y utilizando una fuente

de poder Thermo EC135-90. Para obtener una buena separación de los productos de

PCR se corrieron durante una hora a 65

voltios.

Para la visualización de los productos de la PCR los geles se colorearon con bromuro

de etidio al 1% y luego se fotografiaron con

un Fotodocumentador (Molecular Imager Gel

DocXR+ Systems BIORAD ®).


Identificación taxonómica de las arvenses

Se colectaron en campo 27 muestras de especies de arvenses, 15 de las cuales se

obtuvieron en el Municipio de Candelaria

Tabla 1) y 12 en el de Palmira (Tabla 2)

Taxonómicamente, se identificaron 19

especies y no fue posible hacerlo con ocho,

mencionadas como NN (Tablas 1 y 2).

De otra parte, en 21 muestras de las es-pecies colectadas se observaron los síntomas

típicos de la enfermedad geminiviral, consis-tentes en clorosis, mosaico, arrugamiento y

deformación de las hojas, además del ena-

nismo o achaparramiento de las plantas (Ta-

blas 1 y 2). En las especies Lagacea mollis, Ipomoea

congesta, Emilia sonchifolia, Poligonum

persicaria, Portulaca oleracea y Commelina

diffusa no se observaron síntomas (Tablas 1 y 2).

En las especies Amaranthus dubius,

Desmodium sp. y Lantana camara se ob-

servó la presencia de moscas blancas (Tablas 1 y 2) .

Obtención del DNA genómico total de las

arvenses recolectadas en cultivos de tomate

A las muestras de las arvenses recolectadas se

les realizo la extracción de ADN genómico

total. El método de CTAB modificado per-mitió obtener ADN de buena calidad a partir

de la mayoría de las muestras recolectadas en

campo. Sin embargo, hubo algunas arvenses

como Corchorus orinocensis, Parthenium

hysterophorus, Ipomoea congesta, Poligonum persicaria, Portulaca oleracea y Momordica

Tabla 1. Arvenses recolectadas en un cultivo de tomate ubicado en el Municipio de Candelaria, Valle del

Cauca.

Nombre común Nombre Científico Ab* Síntomas observados

Espadita Corchorus orinocensis Ct Hojas jóvenes cloróticas

Pimpinela Euphorbis hirta Eh clorosis en hojas jóvenes, y

deformación de hojas

Marihuana macho Parthenium hysterophorus Ph Hojas jóvenes cloróticas, enanismo,

mosaico y deformaciones

Barquito Lagacea mollis Lm Asintomática

Desconocido Cand1 N.N Clorosis y rugosidades en hojas jóvenes

Batatilla Ipomoea congesta Ic-a Asintomática

Bledo Amaranthus dubius1 Ad Clorosis en hojas, y enanismo

Pincel Emilia sonchifolia Em Asintomática

Pega- Pega Desmodium sp1 Dm Mosaico, enanismo

Batatilla Ipomoea congesta Ic-b Clorosis

Desconocido Cand 2 Poligonum persicaria Pp Asintomática

Verdolaga Portulaca oleracea Pt Asintomática

Falso racimo Laportea aestuan Lp Hojas cloróticas

Llantén Plantago meajor Pm Hojas jóvenes cloróticas y rugosas

Deconocido Cand 3 N.N Clorosis hojas, rugosidad en hojas jóvenes

Tomate (Control positivo) Solanum lycopersicum L. Sl Clorosis y mosaicos

* Abreviatura. N.N, maleza no identificada 1Además de síntomas de Geminivirus se observo en las plantas

La presencia de “moscas blancas”

Tabla 2. Arvenses recolectadas en un cultivo de tomate ubicado en el Municipio de Palmira, Valle del

Cauca

Nombre común Nombre Científico Ab* Síntomas observados

Desconocido Palm 1 N.N - Rugosidad en hojas jóvenes

Siempre viva Commelina diffusa Cd Asintomática

Marihuana macho Parthenium hysterophorus Ph Enanismo, deformaciones y clorosis en

hojas

Desconocido Palm 2 N.N - Enanismo , clorosis

Pepa de culebra Momordica charantia Mc Clorosis

Coralillo Rivina humilis Rh Clorosis en toda la plata

Desconocido Palm 3 N.N Deformación, clorosis

Falso ramio Laportea aestuans La Clorosis y embombamientos (deformación)

Venturosa Lantana cámara1 Lc Clorosis, deformación en hojas jóvenes.

Desconocido Palm 4 N.N - Clorosis



Tomate (Control positivo) Solanum lycopersicum L. Sl Clorosis y mosaicos

* Abreviatura. N.N, maleza no identificada. 1Además de síntomas de Geminivirus se observo en las plan-

tas la presencia de “moscas blancas”


71

charantia en donde el ADN extraído fue de baja calidad, puesto que no se disolvía ade-

cuadamente y estuvo acompañada de precipi-

tados de color oscuro, indicio de la presencia

de metabolitos secundarios tales como poli-fenoles. Se ha reportado que estos productos

pueden interferir la aplicación de técnicas

moleculares como el PCR (Echevarría-

Machado et al. 2005), por lo que estas mues-tras se descartaron y no se utilizaron en análi-

sis posteriores.

Detección de Begomovirus bipartitas en las

arvenses

En las muestras colectadas en el Municipio

de Candelaria se obtuvieron resultados posi-tivos para Begomovirus bipartitas en las

arvenses Amaranthus dubius y Desmodium

sp, las cuales amplificaron un fragmento

aproximadamente de 1200 pb que correspon-de al componente ADN-A (Figura 1A), indi-

cador de la presencia del patógeno.

En el municipio de Palmira, se detectó la

presencia de Begomovirus bipartitas en Rivi-na humilis, Laportea aestuans y Lantana

cámara (Figura 1B),

Como control positivo en el ensayo de

PCR se utilizó una muestra de ADN de toma-te Solanum lycopersicum infectada por bioba-

listica con el Begomovirus Potato yellow

mosaic virus (PYMV), el cuál amplifico

ambos componentes ADN-A y ADN-B, (Figuras 1A y 1B). No se detectó por la PCR

el componente ADN- B en las arvenses co-

lectadas que dieron positivo para el compo-

nente ADN-A. La no detección del componente ADN-B

por PCR puede estar relacionado con la baja

concentración de este componente en la

muestra analizada a tal punto que el método de PCR tradicional no pudo detectarlo o a la

ausencia del mismo en la maleza hospedera.

Arvenses identificadas como reservorio de

Begomovirus bipartitas

Los resultados de este trabajo muestran que

las arvenses Amaranthus dubius (Figura 2A), Laportea aestuans (Figura 2B), Desmodium

sp (Figura 3C), Lantana camara (Figura 2D

y 2E) y Rivina humilis (Figura 2F) son reser-

vorios de Begomovirus bipartitas. Estos resultados coinciden con trabajos previos

reportados en otros países, donde también se

estudiaron arvenses como posibles reservo-

rios de Begomovirus: Garzón-Tiznado et al. (2001) reportaron en Mexico a Amaranthus

dubius, como reservorio de Begomovirus en

estudios realizados en arvenses asociadas al cultivo de tomate; Lima et al. (2010) reporta-

ron en Brasil que una maleza relacionada

taxonómicamente con Desmodium sp. era

reservorio del Begomovirus Desmodium yellow spot virus (DesYSV) y Fauquet et al.

(2003) identificaron en Tanzania a la maleza

Laportea como hospedera del Begomovirus

African cassava mosaic virus (ACMV), un

begomovirus bipartita, considerado como la

principal enfermedad viral en el cultivo de la

yuca en el África.

Figura 2. Arvenses identificadas como hospederas de Begomovirus bipartitas. A, Amaranthus dubius presenta poca clorosis y es hospedera de mosca blanca; B, Laportea aestuans presenta poca clorosis hojas

jóvenes y protuberancias en hojas jóvenes; C, Desmodium sp presenta mosaico en hojas; D, Lantana cama-

ra presenta clorosis y protuberancias en hojas jóvenes; E, Lantana camara mostrando mosca blanca; F,

Rivina humilis presenta clorosis en toda las hojas.

Figura 1. Detección por PCR de Begomovirus bipartitas en arvenses recolectas en cultivos de tomate en el

Valle del Cauca. (A) Arvenses recolectadas en el Municipio de Candelaria. Gel de agarosa al 1%. M,

marcador de peso molecular hyperLadder II; 1, Euphorbis hirta; 2, Lagacea mollis; 4, Amaranthus dubius;

5, Emilia sonchifolia; 6, Desmodium sp; 7, Laportea aestum; 8, Plantago mejor; +, Solanum lycopersicum

control positivo; -, control negativo. Las muestras 3 y 9, corresponden a arvenses que no se logró identificar

taxonómicamente. (B) Arvenses recolectadas en el Municipio de Palmira. Gel de agarosa al 1%. M, marca-

dor de peso molecular hyperLadder II; 2, Commelina diffussa; 3, Parthenium hysterophorus; 4, Rivina

humilis; 6, Laportea aestuans; 7, Lantana camara. Las muestras 1, 5, 8, 9 y 10 corresponden a arvenses

que no se lograron identificar taxonómicamente.


Los resultados de este estudio constituyen el primer reporte en Colombia de las arvenses

Amaranthus dubius, Desmodium sp., Rivina

humilis y Laportea aestuans, como reservo-

rios de Begomovirus bipartitas. Así mismo, este es el primer reporte en el ámbito mundial

de Lantana cámara y R. humilis como

reservorios del mismo tipo de virus.

Al analizar los resultados de detección de Begomovirus con la presencia de síntomas, se

puede observar una correlación positiva entre

ambos. Es decir, la observación visual de

algunos síntomas virales permite establecer la relación entre la presencia del virus y los

daños detectados en las arvenses. Por ejem-

plo: Amaranthus dubius presentaba clorosis

en hojas jóvenes y enanismo (Figura 2A), mientras que Desmodium sp presentó mosai-

cos y enanismo (Figura 2C).

Es importante resaltar que ambas arven-

ses fueron colectadas en sitios cercanos entre si y en ambos casos al momento de la colecta

se evidenció alta presencia de poblaciones de

mosca blanca, hecho que fundamenta aún

más el papel del hospedante alterno de Be-gomovirus que en un momento determinado

puede ser desempeñado por estas.

Una situación de relación síntoma y pre-

sencia de Begomovirus se evidenció para el caso de Rivina humilis la cual presento cloro-

sis en toda la planta mientras que Laportea

aestuans y Lantana camara presentaron

moderada clorosis, epinastia y pequeñas deformaciones en las hojas jóvenes (Figura

2B, 2D y 2F). Es importante mencionar que

Lantana camara presentó alta población de

mosca blanca en la planta (Figura 2E). Todas las observaciones y descripciones

de esta investigación constituyen un aporte

importante para el reconocimiento de los

virus en las arvenses aquí descritas; aunque siempre es recomendable para determinar la

presencia de los Begomovirus el uso del

diagnóstico molecular

CONCLUSIONES

Los resultados de este trabajo muestran que las arvenses Amaranthus dubius, Desmodium

sp., Lantana camara, Rivina humilis y La-

portea aestuans resultaron positivas para

Begomovirus bipartitas, por lo tanto, podrían servir como fuente de inoculo de Begomovi-

rus en el cultivo de tomate.

Este es el primer reporte en Colombia de

Amaranthus dubius, Desmodium sp. y Lapor-tea aestuans como reservorios de Begomovi-

rus bipartitas y a la fecha consideramos que

este es el primer reporte de Lantana camara y Rivina humilis como reservorio de Bego-

movirus bipartitas a nivel mundial.

Finalmente, la identificación y control de estas arvenses pretende contribuir al manejo

cultural del cultivo de tomate, que sin duda

permitirá reducir la diseminación de las

enfermedades causadas por Begomovirus en campo.

AGRADECIMIENTOS

Este proyecto fue financiado por el Ministerio

de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR) y por la Dirección de Investigación de la Uni-

versidad Nacional de Colombia sede Palmira

(DIPAL), a quienes los autores expresan sus

agradecimientos.


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"Leyendas" o pies de las figuras.

Estructura general, secciones

El artículo científico incluirá las secciones que se indican más adelante; en la nota científica se podrán unir algunas de las secciones y la revisión

bibliográfica es de estructura libre. Los tres tipos de colaboraciones deben incluir siempre el resumen y el “summary”.

La estructura del artículo científico debe contener lo siguiente:

1. Título

Deberá reflejar adecuadamente el contenido de la publicación con el menor número posible de palabras; estas no deben ser más de veinte. El

título no debe incluir abreviaturas ni fórmulas químicas (salvo para los isótopos).

2. Autor(es)

Se describirán su nombre y apellidos debajo del título, seguidos del nombre de la entidad donde se generó la investigación y la dirección y la del

autor. Enseguida se coloca, si es el caso, toda la información correspondiente al personal técnico que haya colaborado en la investigación.

3. Resumen y “Summary”

El resumen debe hablar de la naturaleza e importancia del trabajo, la metodología usada y los resultados sobresalientes. Debe tener un máximo de una

página (200 a 300 palabras) si corresponde a un artículo científico, o de media página si corresponde a una nota técnica o científica.

4. El “summary”

Es la traducción al portugués o al inglés del resumen, incluido el título. Si se desea, se pueden adicionar resúmenes en Portugués, Francés, o Alemán.

5. Palabras claves

Deberá seleccionarse la palabra o palabras claves más importantes, preferiblemente no contenidas en el título, y colocarlas en un listado lo más

breve posible.

6. Introducción

Deberá destacar la necesidad e importancia de la investigación, mencionar las limitaciones del trabajo, y los resultados de otros trabajos similares o

relacionados (revisión de literatura breve referida a la información más relevante).

7. Materiales y métodos


Se deben escribir en forma ordenada, clara y precisa, con detalles suficientes para que el lector pueda, si lo desea, repetir el experimento.

8. Resultados y discusión:

Ambos temas se pueden incluir preferiblemente en una sola sección. Los resultados se deben escribir en forma precisa y ordenada. En la discusión se

explican los hechos y se relacionan con los resultados de otras investigaciones, debidamente sustentados con citas bibliográficas entre paréntesis,

utilizando el Sistema Autor, Año.

9. Conclusiones

Deben ser breves y claras y basarse estrictamente en los resultados (no en conjeturas).

10. Agradecimientos

(Si se desea).

11. Referencias Bibliográficas

Se debe limitar a la estrictamente necesaria y en relación directa con la investigación realizada. Todas las referencias citadas en esta sección

deben ser citadas en el texto. Las referencias se deben colocar en la lista en orden alfabético por los apellidos de los autores.

Cuando hay varias referencias encabezadas por un mismo autor, se escriben primero aquellas en las cuales éste aparece sólo, y luego aquellas

en las que está seguido por coautores; dentro de cada grupo se sigue en orden cronológico. No use la palabra ¨Anónimo¨ para asignar autores

desconocidos; en su lugar, escriba el nombre del editor (seguido de un paréntesis con la abreviatura ed. o eds.) o el de la editorial o, si no hay

ninguno comience con el título de la obra.

No incluya en la bibliografía las referencias de informaciones personales, ni de trabajos sin publicar aunque estén aceptados. Estas fuentes se

pueden citar en el texto, entre paréntesis. La referencia de una publicación periódica se hará en el siguiente orden: autor, año, título del artículo,

nombre abreviado de la revista, volumen, número (entre paréntesis) y páginas.

Ejemplo:

Bowman, J.M., Delwiche, P.A., Brabiebson, R.L. y Williams, P.H. 1980. Lepthosphaeria maculans on cabbage in Wisconsin. Plant. Dis. 64(3):326-

328.

En los libros y folletos el orden general es: autor, año, título, número de la edición, casa editora, lugar de la publicación y número de páginas.

En caso de incluir referencias consultadas electrónicamente en Internet estas se pueden presentar en el siguiente orden:

Autor(es). Año de publicación. Título del documento. Subtítulo. El medio, en línea [entre corchetes]. Número de la edición (sólo a partir de la

segunda). Editorial o entidad que publica en web. Lugar de publicación. Fecha en que se consultó el material, para los documentos en línea [entre

corchetes].Serie, si la tiene (entre paréntesis). Disponible en:

Ejemplos:

Dollar, D. y Kraay, A. 2000. Growth is good for the poor [en línea]. World Bank. Washington, DC. [consultado 15 Septiembre 2001]. Disponible

en : http://www.worldbank.org/research/growth/pdfiles/growthgoodforpoor.pdf

Jiménez, C. (s.f.). Intervención del hombre en los ecosistemas naturales [en línea]. [citado 16 octubre 2001]. Disponible en:

http://www.monografias.com/trabajos7/ecna/ecna.shtml

Gottret, M.V. y Raymond, M. 1999. An analysis of a cassava integrated research and development approach: Has it really contributed to poverty

alleviation? [on line]. In: International Workshop Assessing the Impact of Agricultural Research on Poverty Alleviation (1999, San José,

Costa Rica). Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Cali, CO. [consultado 21 Septiembre 2001]. Disponible en : http://ciat-

library.ciat.cgiar.org/paper_pobreza/038.pdf

http://www.worldbank.org/research/growth/pdfiles/growthgoodforpoor.pdf

http://www.monografias.com/trabajos7/ecna/ecna.shtml

http://ciat-library.ciat.cgiar.org/paper_pobreza/038.pdf

http://ciat-library.ciat.cgiar.org/paper_pobreza/038.pdf


Myers, M.P., Yang, J. y Stampe, P. 1999. Visualization and functional analysis of a maxi-K-channel (mSlo) fused to green fluorescent protein

(GFP). Electronic Journal of Biotechnology 2(3) [en línea ]. [consultado 21 Marzo 2000]. Disponible en :

http://www.ejb.org/content/vol2/issue3/full/3/index/html

Dávila, M. y Coyne, D. 2000. Detección de genes de letalidad en caraota mediante el uso de la técnica de análisis de segregantes en grupos.

Agronomía Tropical 50(3):323-335 [en línea]. [citado 12 octubre 2001]. Disponible en: http://www.redpav-fpolar.info.ve/agrotrop/index.html

Extensión y formato para los trabajos

La extensión máxima del artículo completo (Resumen, “summary” cuerpo, agradecimientos, referencias, tablas y figuras ) escrito con un tipo de letra de

12 cpi (caracteres por 2,5 cm o una pulgada) será de 16 páginas a doble espacio si se trata de un "artículo científico" o una "revisión bibliográfica"; 6

páginas si es una "nota científica" y una página si es una "carta al editor”

Cualquier colaboración para la revista debe estar mecanografiada o mecanotipiada en papel tamaño carta, por una sola cara, a doble espacio y con

letra grande (no más de 12 caracteres por pulgada). Los márgenes superior, inferior, izquierdo y derecho tendrán 2,5 cm. Cada página se numerará en la

esquina inferior derecha.

Se prefieren los trabajos elaborados en computador utilizando el procesador de palabra "Word". A la copias del escrito impresas en texto de alta

calidad se anexará el disquete o el Disco compacto respectivo conteniendo exactamente lo presentado en el escrito..

Los títulos de primer orden deben ser en mayúsculas; los títulos de segundo orden deben ir en minúsculas; los títulos de tercer orden son en

minúscula, dos puntos y seguido de texto, así:

TITULO DE PRIMER ORDEN

Título de segundo orden

Título de tercer orden: Seguido de texto como en este ejemplo.

Redacción general y estilo

El trabajo se debe redactar en pasado impersonal y debe ser claro, conciso, coherente y exacto. Los nombres científicos se deben escribir en itálicas y

completos la primera vez que se nombren; después se pueden abreviar, escribiendo sólo la inicial del género, pero dejando la especie completa.

Las referencias deben ser citadas en el texto utilizando el Sistema Autor, Año, colocados en paréntesis, por ejemplo (Arbeláez, 1988). Cuando son

varios (más de dos) los autores de la publicación citada, debe colocarse el primer autor seguido del latín et al. y luego el año respectivo, pero en el

listado de Referencias Bibliográficas deben figurar todos los autores.

Al referirse a productos se deben preferir los nombres comunes a los comerciales. En el caso de nombres de marcas registradas, se deben escribir

seguidos de la letra R (mayúscula) y de la dirección del fabricante.

Para las unidades de medida se debe usar el Sistema Internacional de Unidades (SI).

Tanto las tablas como las figuras se deben numerar en forma consecutiva con números arábigos. Todos ellos, al igual que todas las referencias

bibliográficas se deben citar en el texto.

En la medida de lo posible se deben evitar las notas de pie de página. Es preferible reemplazarlas por paréntesis dentro del texto.

Elaboración de tablas

Cada tabla o figura se debe presentar en una hoja aparte, al final del texto, pero debe estar nombrada dentro de éste.

http://www.ejb.org/content/vol2/issue3/full/3/index/html

http://www.redpav-fpolar.info.ve/agrotrop/index.html


Las tablas deben ser sencillas y contener sólo la información

indispensable para claridad del trabajo. Su formato puede o no llevar

líneas verticales; se recomienda dejar solamente las horizontales

necesarias para destacar el encabezamiento (títulos y subtítulos de las

columnas) y para cerrar los datos, al final de la misma. La tabla debe estar

identificada por un número y por un título, el cual debe ser claro y auto-

explicativo. Los datos no deben ser una repetición de los del texto o de

alguna figura y deberán limitarse a aquellos indispensables para claridad

del artículo científico.

Ejemplo:

Los valores contenidos en las tablas deben usar el punto (.) para

separar los miles y la coma (,) para los decimales, ejemplo 1.545,20.

La tabla puede incluir abreviaturas y llamadas, las cuales se identificarán con letras minúsculas (usadas a manera de exponentes para que no se

confundan con los correspondientes a diferencias estadísticas). Las llamadas se aclararán en las notas de pie. Cuando hay niveles de significación

estadística, se indican con asteriscos (uno a tres) y se explican en las notas del pie de la tabla.

El número de tablas a incluir en el artículo deben ser las estrictamente necesarias

Figuras

Por figuras se entienden diferentes ilustraciones como fotografías, gráficas, mapas, dibujos, etc. Al igual que las tablas, deben tener un título claro, y

estar numeradas en el orden en que se citan en el texto. Deben ser muy nítidas y de buen tamaño, teniendo en cuenta que su calidad disminuye en el

proceso de impresión, y que en dicho proceso ellas no se ampliarán sino que muy probablemente se reducirán.

Las fotografías deben ser en papel brillante y con buen contraste, y estar bien enfocadas sin elementos distractores (etiquetas elaboradas a mano

con letras más grandes que el sujeto a destacar); también se aceptan transparencias a color de buena calidad o imágenes electrónicas en formato JPG

entre 500 y 1000KB en su respectivo diskette o CD.

En cuanto al número de fotografías a incluir deben ser las estrictamente necesarias y preferiblemente en una composición.

Las gráficas deben ser sencillas en la medida que lo permita el trabajo y todos sus elementos deben estar identificados claramente. Cuando se

elaboren mediante el uso de computador debe incluirse los archivos en el disquete o un disco compacto, indicado en la etiqueta el programa y la

versión del mismo. Utilizar tramas y tonos de gris contrastantes. Se prefiere que las gráficas no sean a color.

Las l̈eyendas ̈de las figuras y las convenciones, si las hay, deben quedar dentro del área del gráfico colocadas en una posición conveniente de

manera que faciliten la interpretación.

Los pies de figuras o títulos de estas deben elaborarse en una página aparte y no dentro del área de la gráfica del archivo electrónico, el texto debe

ser lo suficientemente descriptivo como para que se pueda entender sin recurrir al texto.

Cada figura debe estar identificada al respaldo con su número correspondiente y con el nombre del autor del artículo. Figuras desalineadas, con

líneas borrosas o fotocopias no serán aceptadas.

Solamente incluir las estrictamente necesarias (los costos de separación de color e impresión son muy altos). Nota: Para mayor ilustración respecto a

estas normas se pueden consultar las guías para preparación de artículos de “Plant Disease”, “Phytopathology” y especialmente las instrucciones para

los autores de la Revista Corpoica 2(1): 64-70, 1997

Tabla 5. Incidencia y severidad de la Antracnosis en mango cultivar Haden-

ICA, bajo diferentes medidas de manejo de la enfermedad, durante 1993.

Tratamientos Incidencia

(%)

Severidad

(%)

1 Aspersión floración 81,7 AB 50 A

2 Aspersión frutos alfileres 80,33 AB 50 A

3 Aspersión frutos con 50% de

maduración

73,33 B 40 AB

4 Aspersiones floración y frutos

alfileres

74,33 B 40 AB

5 Aspersiones floración y frutos con

50% maduración

72,66 B 38 AB

6 Aspersiones floración a cosecha (8

aspersiones)

50,50 C 20 C

9 Podas floración a cosecha 66,67 B 45 A

12 Aspersiones floración a cosecha y

podas

25,34 D 10 D

13 Testigo absoluto 90,0 A 55 A

ARBITROS

Ana Cecilia Velasco Fernández Bacterióloga

Bernardo Villegas Estrada Ing. Agr. – M Sc Fitopatología

Bertha Lucia Castro C Ing. Agr. M Sc.Fitopatología

Diana Marcela Vanegas Villa Adm. C Agr. – M Sc. Biotecnología

José Maria Hernández Murillo Ing. Agr. – Espec. En Fitopatología

Maria Luisa Guzmán Bacterióloga y Laboratorista Clínica

Mauricio Castaño Jaramillo Ing. Agr.

Nelson Bravo Otero Ing. Agr. – M Sc Sistemas de Semilla

Octavio Montoya Estrada Ing. Agr.

COMITÉ CIENTIFICO

Alberto Páez Redondo Ing. Agr. – M Sc Fitopatología

Benjamín Pineda López Ing. Agr. – M Sc Fitopatología

Bernardo Villegas Estrada Ing. Agr. – M Sc Fitopatología

Carlos Germán Muñoz Perea Ing. Agr. – Ph D in Plant Sciences

Diana Marcela Vanegas Villa Adm.CAgr. M Sc. Biotecnología

Edwinson Alberto Rojas Triviño Microbiólogo – M Sc Fitopatología

Elizabeth Álvarez Cabrera Ing. Agr. – Ph D Fitopatología

Francia Varón de Agudelo Ing. Agr. – M Sc Fitopatología

Francisco José Morales Garzón Ing. Agr. – Ph D Virología

Gerardo Martínez López Ing. Agr. – Ph D Virología

Gloria María Mosquera Cifuentes Bacterióloga – Ph D Fitopatología

Gustavo Adolfo Prado Ing. Agr. – M Sc Ciencias Agrícolas

Iván Lozano Potes Biólogo Genetista – M Sc Ciencias

Jairo Castaño Zapata Ing. Agr. – Ph D Fitopatología

Jesús Eliecer Larrahondo Aguilar Químico – Ph D Fitoquímica

Jesús Humberto Gil Gonzales Quimico- Ph D Ciencias Químicas

Jhon Jairo Méndez Arteaga Lic. Bio-Química, - Ph D Ciencias Químicas

Jorge Enrique Gómez Hurtado Ing. Agr. – M Sc. Fitopatología

Jorge Ignacio Victoria Kafure Ing. Agr. – Ph D Bacteriología

José María Hernández Murillo Ing. Agr. – Espec. Fitopatología

Juan Carlos Ángel Sánchez Ing. Agr. – M Sc Fitopatología

Juan Gonzalo Morales Osorio Ing. Agr, - Ph D

Liliana María Hoyos Carvajal Ing. Agr. – Ph D Biología

Marina Sánchez de Prager Ing. Agr. – Ph D Suelos y Aguas

Maritza Cuervo Ibañez Ing. Agr. - M Sc Rec. Fitogenéticos

Mónica Betancourth Vásquez Ing. Agr. – Ph D Biotecnología

Oscar Adrián Guzmán Piedrahita Ing. Agr.– M Sc Fitopatología

Pedro Alfonso Alarcón Gómez Ing. Agr. – M Sc Fitopatología

Rodrigo Orlando Campo Arana Ing. Agr. – Ph D Fitopatología

revista fitopatología colombiana

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