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RESPUESTA ELÉCTRICA DE CÉLULAS ANIMALES A ESTÍMULOS MECÁNICOS
IVAN AMAYA PEÑUELA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA MECÁNICA BOGOTÁ
2006
IM-2006-I-01 2
RESPUESTA ELÉCTRICA DE CÉLULAS ANIMALES A ESTÍMULOS MECÁNICOS
IVAN AMAYA PEÑUELA
PROYECTO DE GRADO
ASESOR
JUAN CARLOS BRICEÑO TRIANA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA MECÁNICA BOGOTÁ
2006
IM-2006-I-01 3
DEDICATORIA
A mis padres, por haber confiado siempre en mí
y brindarme todo su apoyo y su amor.
A mi hermano por darme ánimos para seguir en
los momentos difíciles y apoyarme siempre.
A Sebastián por inspirarme para seguir
adelante en cada cosa que hago.
A Carolina por acompañarme y darme su
apoyo y amor durante toda la carrera.
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AGRADECIMIENTOS
En especial al profesor Juan Carlos Briceño y a Miller Hung por su apoyo en la
realización de este trabajo, al igual que al Grupo de Ingeniería Biomédica de la
Universidad.
A la profesora Alba Ávila por su colaboración en toda la parte eléctrica del proyecto.
A la doctora Sandra Ramírez y a Milena Rondón de la Universidad del Rosario, por su
inmensa colaboración en la parte del cultivo celular, por facilitarme el uso de sus
laboratorios y ayudarme con todos los cultivos realizados.
A los demás profesores de la Universidad de los Andes por haber compartido sus
conocimientos conmigo.
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INDICE
1. Introducción ................................................................................................................ 7 1.1. Motivación .............................................................................................................. 7 1.2. Objetivos ................................................................................................................. 7 1.2.1. General ................................................................................................................ 7 1.2.2. Específicos .......................................................................................................... 8 1.3. Organización del documento .................................................................................. 8 2. Marco Teórico............................................................................................................. 9 2.1. Células animales [3]................................................................................................ 9 2.1.1. Cultivos Celulares [4] ....................................................................................... 11 2.1.2. Fibroblastos [9] ................................................................................................. 13 2.2. Propiedades eléctricas de las células. [5].............................................................. 14 2.2.1. Difusión............................................................................................................. 15 2.2.2. Gravedad ........................................................................................................... 17 2.2.3. Potencial de membrana ..................................................................................... 18 2.2.4. Capacitancia de la membrana ........................................................................... 19 2.3. Estímulos mecánicos [7] ....................................................................................... 20 2.3.1. Fuerza de cuerpo ............................................................................................... 20 2.3.2. Fuerza de superficie .......................................................................................... 20 2.4. Materiales semiconductores [8] ............................................................................ 22 2.4.1. Transistores de efecto de campo ....................................................................... 23 2.4.2. ISFET................................................................................................................ 25 2.5. Métodos para medir el potencial de membrana de fibroblastos: .......................... 26 3. Metodología .............................................................................................................. 27 3.1. Montaje utilizado .................................................................................................. 27 3.2. Procedimiento para cultivo de fibroblastos sobre el ISFET: ................................ 32 4. Resultados ................................................................................................................. 33 5. Conclusiones ............................................................................................................. 38 6. Bibliografía ............................................................................................................... 41
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INDICE DE FIGURAS
Figura 1: Esquema en el que se ilustra una célula hipotética al centro. Adaptado de [3]. 10 Figura 2: Tipos de cultivo celular. Adaptado de [4] ......................................................... 12 Figura 3: Modelo de los compartimentos de una célula. Adaptado de [5] ....................... 14 Figura 4: Membrana selectiva. Adaptado de [5]............................................................... 15 Figura 5: Energía potencial vs. T y N. Adaptado de [5]. .................................................. 16 Figura 6: Balance de energía potencial gravitacional y difusiva. Adaptado de [5]. ......... 17 Figura 7: Balance entre electricidad y difusión. Adoptado de [5] .................................... 18 Figura 8: Fuerzas superficiales. Adoptado de [7] ............................................................. 21 Figura 9: Tipos de cargas resultantes. Adaptado de [7].................................................... 22 Figura 10: Tabla de materiales semiconductores. Adaptado de [8].................................. 23 Figura 11: Creación del canal en un MOSFET. Adaptado de [8]..................................... 24 Figura 12 Curvas características de un ISFET. Adaptado de [6]...................................... 25 Figura 13: Curva I – V y línea de carga. Adaptado de [5]................................................ 26 Figura 14: Montaje utilizado. Adoptado de [1] ................................................................ 28 Figura 15 Soporte del ISFET. Adaptado de [1] ................................................................ 28 Figura 16 Dimensiones físicas del ISFET. La división más pequeña es equivalente a 4,54
µm. ............................................................................................................................ 29 Figura 17: Montaje del microscopio y el microposicionador ........................................... 30 Figura 18: Circuito eléctrico utilizado por Miller Hung. Adaptado de [1] ....................... 31 Figura 19: Circuito eléctrico propuesto. Adaptado de [11] .............................................. 31 Figura 20: Curva de entrada, caracterización 1. ............................................................... 33 Figura 21: Curva de salida, caracterización 1. .................................................................. 34 Figura 22 Curva de entrada, caracterización 2.................................................................. 34 Figura 23: Curva de salida, caracterización 2. .................................................................. 35 Figura 24: Cultivo de fibroblastos sobre el ISFET. La división más pequeña es
equivalente a 4,54 µm. .............................................................................................. 35 Figura 25: Cultivo de fibroblastos sobre el ISFET. La división más pequeña es
equivalente a 4,54 µm. .............................................................................................. 36 Figura 26: Resultado Circuito 1........................................................................................ 36 Figura 27: Resultado Circuito 2........................................................................................ 37
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1. Introducción
1.1. Motivación
Darle continuidad a la investigación realizada por Miller Hung para buscar una relación
entre la respuesta eléctrica del sistema a estímulos mecánicos y el potencial de membrana
de las células involucradas en la medición.
Así mismo de busca caracterizar un biosensor, con el cual podamos obtener señales que
nos ayuden a entender mejor la respuesta de las células cuando son estimuladas
mecánicamente
1.2. Objetivos
1.2.1. General
• Buscar una relación entre la respuesta eléctrica del sistema implementado en el
Grupo de Ingeniería Biomédica y el potencial de membrana de las células
involucradas en la medición, con el fin de poder discriminar la respuesta del
sistema y tratar de relacionarla con cambios en la célula.
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1.2.2. Específicos
• Documentarse en las respuestas de las células a estímulos mecánicos y sus
formas de medición.
• Familiarizarse con el montaje realizado por Miller Hung en su proyecto de grado
en el 2004 [1].
• Realizar pruebas para verificar los resultados obtenidos por Miller Hung [1].
• Analizar los resultados y buscar correlaciones con fenómenos fisiológicos de las
células.
1.3. Organización del documento
Este documento comienza con una breve introducción al tema, en donde se explica lo que
se quiere hacer, seguido con el marco teórico, en donde se encuentran los conceptos
básicos para el desarrollo del mismo, luego se presenta la metodología utilizada para
realizar las pruebas, finalmente se presentan los resultados obtenidos, su análisis y las
conclusiones a las que se llegaron al desarrollar este proyecto de grado.
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2. Marco Teórico
El objetivo de este capitulo es presentar los conceptos principales, necesarios para
entender el desarrollo del proyecto realizado.
La organización del documento es la siguiente: células animales, propiedades eléctricas
de las células, estímulos mecánicos, materiales semiconductores y métodos para medir el
potencial de membrana de fibroblastos.
2.1. Células animales [3]
Si queremos entender la forma en la que el cuerpo funciona, tenemos que ir de lo macro a
lo micro para ver como esta compuesto. Las células son la unidad funcional del cuerpo,
ya que ellas forman los tejidos, que a su vez vienen a formar los órganos de los cuales
esta compuesto el cuerpo y son los que realizan las funciones básicas para que la vida
pueda existir.
Las células se especializan de diversas formas en los órganos por lo que ninguna de ellas
puede tomarse como ejemplo típico. Aun así tenemos varias estructuras (organelos) que
son comunes en la mayoría de las células.
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Figura 1: Esquema en el que se ilustra una célula hipotética al centro. Adaptado de [3]
Algunos de los organelos más importantes son (Figura 1):
Membrana celular: es la membrana que rodea la célula, la cual es semipermeable, por lo
que permite que ciertas sustancias la atraviesen y otras no, esta permeabilidad puede ser
variada. El espesor de la membrana es de aproximadamente 7.5 nm, consta
primordialmente de lípidos y proteínas, el exterior está cargado positivamente y es
relativamente soluble en agua (polar) mientras que el interior es hidrófobas (no polar).
Mitocondria: la mitocondria es una estructura en forma de salchicha, esta constituida por
dos membranas, una exterior y una interior plegada, formando tabiques (crestas).
Son las unidades generadoras de energía de la célula, son más desarrolladas y abundantes
en las paredes de las células en donde se efectúan procesos que requieren gran cantidad
de energía.
Lisosoma: funciona como aparato digestivo de la célula, encapsulan substancias
exógenas como bacterias o componentes gastados de la célula, para hacer su “digestión”,
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algunos productos de la “digestión” son absorbidos a través de las paredes de las vacuolas
y el resto es expulsado de la célula por exocitósis.
Centríolos: En la mayoría de las células en el citoplasma existen dos cilindros cortos
llamados centríolos, los cuales se encuentran cerca del núcleo. Los centríolos se
encargan del movimiento de los cromosomas que se presenta durante la división celular.
Núcleo y estructuras relacionadas: El núcleo esta en gran parte constituido por
cromosomas que son estructuras nucleares que llevan un molde de todas las
características hereditarias individuales y de la especie animal, cada cromosoma esta
formado por una molécula gigante de ácido desoxirribonucleico (DNA).
Retículo endoplásmico: Es una estructura compleja de túbulos en el citoplasma de la
célula. En el retículo endoplásmico rugoso o granular, los gránulos llamados ribosomas
están adheridos al lado citoplásmico de la membrana, mientras que en retículo
endoplásmico liso o agranular faltan esos gránulos.
Ribosomas: Están conformados aproximadamente por 65% de RNA y 35% de proteínas.
Son los sitios en donde se hace la síntesis de las proteínas.
Aparato de Golgi: El aparato de Golgi es una agrupación de sacos encerrados en
membranas (cisternas) que se encuentran apilados. Suelen encontrarse cerca de seis sacos
en cada aparato de Golgi, pero a veces hay más. Es una estructura polarizada, con lados
cis y trans. Las vesículas membranosas que contienen proteínas recién sintetizadas se
desprenden del retículo endoplásmico granular y se fusionan con la cisterna, sobre el lado
cis del aparato. Luego las proteínas pasan por medio de otras vesículas hacia las cisternas
mediales y por ultimo hacia la cisterna que se encuentra en el lado trans del aparato. A
partir de ahí las vesículas se ramifican hacia el citoplasma.
2.1.1. Cultivos Celulares [4]
Los cultivos celulares comienzan con un cultivo primario en donde se aísla el tipo de
células que se quieren cultivar, por medio de procedimientos mecánicos o enzimáticos los
cuales están resumidos en la Figura 2.
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Figura 2: Tipos de cultivo celular. Adaptado de [4]
Es muy importante utilizar elementos estériles cuando se trabaja con células, pues si no
se mantienen condiciones de asepsia, es muy probable que el cultivo se contamine y sea
necesario volver a comenzar.
En los cultivos primarios se prefiere trabajar con muestras de pacientes jóvenes
(neonatos) pues éste tipo de células crecen más rápidamente que las células adultas.
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Las células son aisladas en cajas especiales para cultivo celular, en donde se suspenden
en medio de cultivo (MEM de sus siglas en ingles Minimum Essential Medium) el cual
está enriquecido con suero fetal bovino (SFB) el cual le provee a las células el alimento y
los factores de crecimiento necesarios.
Una vez la caja con el cultivo primario esta confluente (con buen crecimiento celular), se
procede a hacer un subcultivo con el que comienza una línea celular, es decir que de ese
subcultivo, se puede seguir extrayendo células.
El mecanismo usado para extraer las células de la caja de cultivo es enzimático,
utilizando tripsina, la cual rompe los enlaces de las células, permitiéndoles quedar
suspendidas en el medio, es muy importante controlar el tiempo de aplicación de la
tripsina, ya que si es excesivo, la tripsina puede llegar a matar las células.
Cuando se hacen cultivos celulares, se controlan factores como el pH, la temperatura, la
presión, el CO, el 2CO , entre otros, logrando mantener las condiciones fisiológicas
relativamente constantes lo cual es ideal cuando se están realizando pruebas sobre las
células, pues esto hace que las células sean muy similares unas con otras.
2.1.2. Fibroblastos [9]
Los fibroblastos hacen parte del tejido conectivo junto con los osteoblastos y los
condrocitos, los cuales se especializan en segregar matriz extracelular de colágeno, la
cual es responsable de la arquitectura del cuerpo.
De las células del tejido conectivo los fibroblastos aparentemente son los menos
especializados, cuando se presenta una herida en el cuerpo, los fibroblastos se presentan y
producen grandes cantidades de colágeno con lo cual se aísla y repara la herida.
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Se hicieron las pruebas con este tipo de células por su facilidad de cultivo.
2.2. Propiedades eléctricas de las células. [5]
Se asume que la célula esta compuesta de dos partes, un compartimiento interno, y la
membrana, adicionalmente que la célula esta suspendida en un medio acuoso el cual
constituye la tercera parte del sistema (Figura 3).
Figura 3: Modelo de los compartimentos de una célula. Adaptado de [5]
La región 1 representa el medio acuoso en donde se encuentra suspendida la célula, el
cual puede ser modelado como solución salina, la región 2 representa el fluido
citoplasmático, el cual puede ser modelado como solución salina, así como la región 1.
La región 3 representa la membrana celular, la cual separa los dos medios.
Viéndolo de esta forma tenemos dos fluidos conductores separados por un aislante, lo
cual es la definición de un capacitor; un capacitor no necesariamente esta compuesto de
conductores o aislantes perfectos. La solución salina no es tan buena conduciendo iones
como lo es un cable de cobre conduciendo electrones, pero es mejor conductora que los
lípidos que conforman la membrana celular.
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Es conocido que las células tienen una diferencia de potencial entre el interior y el
exterior de la misma, por esto si re-dibujamos la célula haciendo explicita la distribución
de carga de las soluciones salinas (Regiones 1 y 2), vemos que el interior de la célula es
mas negativo que el exterior. (Figura 4)
Asumiendo que la membrana solo deja salir cargas positivas, y que la concentración de
cargas es mas fuerte en el interior de la célula.
Figura 4: Membrana selectiva. Adaptado de [5].
Sabiendo que las moléculas se mueven de regiones de alta concentración, a regiones de
mas baja concentración, tenemos que tanto las cargas (+) como las cargas (-) del interior
de la célula van a tratar de desplazarse hacia el exterior de la célula donde la
concentración de las cargas es menor.
Debido a que la membrana solo deja pasar cargas (+), cuando una carga (+) logra
atravesar, se presenta un desequilibrio de cargas, con lo cual debe haber una diferencia de
potencial entre el interior y el exterior de la célula.
2.2.1. Difusión
En los procesos puramente difusivos no es relevante el tipo de carga de la partícula, es
decir que las partículas (+) y las partículas (-) juegan el mismo papel.
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Las propiedades realmente relevantes en el proceso difusivo son la temperatura y la
cantidad de moléculas a cada lado de la membrana, pues estas son las que gobiernan la
energía potencial de la partícula y las partículas tienden a moverse hacia donde
encuentren menor energía potencial.
Vemos (Figura 5) que la energía potencial es proporcional a la temperatura y es
proporcional al logaritmo natural de la cantidad de partículas N.
Figura 5: Energía potencial vs. T y N. Adaptado de [5].
Esto es:
)ln(NPE
TPE
∝
∝
Que al combinar las dos condiciones se llega a la siguiente expresión:
)ln(NkTPE =
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Donde PE es la energía potencial, por sus siglas en ingles (Potential Energy), k es la
constante de proporcionalidad, que en este caso corresponde a la constante de Boltzman
KJk °=−2310*38.1 y N es el número de partículas.
2.2.2. Gravedad
Otra forma de obtener energía potencial es con la gravedad puesto que entre mas alto se
encuentre un objeto, mayor será su energía potencial, esto esta dado por la expresión:
hgmPR **=
Donde m es la masa, g es la gravedad y h es la altura relativa a un marco de referencia.
Figura 6: Balance de energía potencial gravitacional y difusiva. Adaptado de [5].
Vemos que la energía potencial gravitacional actúa opuesta a la energía potencial difusiva
(Figura 6).
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2.2.3. Potencial de membrana
En la Figura 7 se ilustra como un catión (+) trata de salir de la célula por difusión pero a
su vez trata de entrar debido a fuerzas eléctricas ya que existe mayor concentración de
cargas (-) en el interior.
Cuando una partícula trata de salir de la célula lo hace porque experimenta un potencial
de magnitud:
( )2ln NkT
Así mismo la partícula siente un potencial para regresar al interior de magnitud:
( )1ln NkT
Figura 7: Balance entre electricidad y difusión. Adoptado de [5]
Al salir un catión (+) de la célula, se genera un desbalance de carga ya que al interior
existe mayor concentración de cargas (-) lo cual genera una diferencia de potencial
(voltaje) el cual denominamos potencial de membrana.
La carga (-) que ha quedado sin su par (+), lo atrae hacia ella con una fuerza igual a un
eV, donde e es la carga del Ion y V es el voltaje entre los dos iones, esto es:
12 VVV −= .
Al hacer un balance entre las fuerzas de difusión y de atracción eléctrica, se obtiene:
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( ) 0ln 12 =+ NNkTeV
Si se despeja V se obtiene la siguiente expresión:
( )12ln NNe
kTV −=
2.2.4. Capacitancia de la membrana
El potencial de membrana es de -115 mV en el interior, respecto al exterior de la célula si
la razón de cationes es de 100 a 1 del interior respecto al exterior. Pero el numero de
cargas que realmente salen depende de la capacidad de almacenamiento. Estas cargas son
almacenadas justo debajo de la membrana, ya que el citoplasma (conductor) no quiere
tener cargas extra, por esto las cargas se ubican cerca de la membrana.
Suponiendo que la capacitancia de la membrana es C. se sabe que el voltaje en un
condensador es:
C
QV = ó
C
NeV −=
Donde Ne es el numero de cargas negativas que conformas Q, N es el numero de iones y
e es la carga de un ion.
Podemos hacer uso de las dos ecuaciones que tenemos para V con el fin de saber cuantos
iones negativos se pueden almacenar en la célula, y así poder determinar el potencial de
membrana.
( )12ln NNe
kT
C
Ne−=−
( )122ln NN
e
CkTN =
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2.3. Estímulos mecánicos [7]
Un cuerpo se puede someter a distintos tipos de cargas externas, las cuales pueden ser
clasificadas como fuerza de cuerpo o fuerza de superficie.
2.3.1. Fuerza de cuerpo
Una fuerza de cuerpo se desarrolla cuando un cuerpo ejerce una fuerza sobre otro sin
existir un contacto directo entre los dos cuerpos, ejemplos de este tipo de fuerzas son la
fuerza gravitacional y la fuerza electromagnética. Aunque las fuerzas de cuerpo afectan a
cada partícula que conforma el cuerpo, estas se representan con una fuerza concentrada
actuando sobre el cuerpo.
2.3.2. Fuerza de superficie
Como su nombre lo indica, son fuerzas causadas por el contacto directo con la superficie
de otro objeto. En todos los casos estas fuerzas están distribuidas sobre el área de
contacto entre los cuerpos, en particular si esta superficie de contacto es pequeña con
relación al cuerpo. Estas fuerzas se puede modelar como una fuerza concentrada, y si el
área no es lo suficientemente pequeña comparada con el cuerpo, se puede modelar como
una carga linealmente distribuida (Figura 8).
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Figura 8: Fuerzas superficiales. Adoptado de [7]
Existen varios tipos de cargas resultantes al aplicar fuerzas sobre un cuerpo las cuales son
(Figura 9):
• Fuerza normal: Actúa perpendicularmente al área. Existe siempre que las cargas
externas tiendan a comprimir o expandir el cuerpo.
• Fuerza cortante: Actúa sobre el plano del área y se desarrolla cuando las cargas
externas tienden a ocasionar que los dos segmentos del cuerpo se deslicen uno
sobre otro
• Momento de torsión: Se desarrolla cuando las cargas externas tienden a torcer un
segmento del cuerpo con respecto al otro.
• Momento flexionante: El momento flexionante es causado por las cargas
externas que tienden a flexionar el cuerpo respecto a un eje que se encuentra
dentro del plano del área
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Figura 9: Tipos de cargas resultantes. Adaptado de [7]
2.4. Materiales semiconductores [8]
Los materiales semiconductores son materiales que tienen una conductividad eléctrica
entre la de los metales y los aislantes.
Su característica principal es que su conductividad se puede variar en varios órdenes de
magnitud con cambios en la temperatura, excitación óptica y concentración de impurezas.
Materiales semiconductores se encuentran en la columna IV y vecinas en la tabla
periódica, el Si y el Ge son llamados semiconductores elementales ya que están
conformados por una sola especie de átomos, adicional a los semiconductores
elementales, se encuentran los semiconductores compuestos, los cuales están
conformados por varios elementos. Un resumen de los materiales semiconductores se
puede ver en la Figura 10.
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Figura 10: Tabla de materiales semiconductores. Adaptado de [8]
2.4.1. Transistores de efecto de campo
Un transistor de efecto de campo es un dispositivo de tres terminales compuesto por una
combinación de materiales semiconductores, en la cual se controla la corriente que pasa
por dos terminales (Fuente y Sumidero), con el voltaje en la tercera terminal
(Compuerta). Esta característica permite amplificar señales o usar el dispositivo como
interruptor, de tal forma que conduzca o no dependiendo del voltaje aplicado en la
terminal de control (Compuerta).
Entre los transistores más comunes se encuentran los bipolares, NPN y PNP, llamados así
porque la conducción se da por el desplazamiento de portadores de dos polaridades,
electrones y huecos, aunque estos dispositivos presentan una desventaja y es su baja
impedancia de entrada.
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Existen otros dispositivos que no presentan este problema de baja impedancia de entrada
y son los dispositivos en donde se presenta un solo tipo de portador de carga, unipolares,
son los transistores de efecto de campo.
Los transistores de efecto de campo consisten en una barra de material p ó n rodeada en
parte de su longitud del otro tipo de material, de tal forma que se crea una unión p-n.
En cada extremo de la barra se hace una conexión ohmica formando así la fuente y el
sumidero, adicionalmente se hace una conexión que forma la compuerta.
Existen dos tipos de transistores de efecto de campo, de enriquecimiento y de
empobrecimiento.
En los transistores de enriquecimiento el canal por donde se presenta la conducción es
creado por el voltaje que se aplica en la compuerta, mientras que en los transistores de
empobrecimiento, el canal es obstruido por el voltaje que se le aplica a la compuerta
(Figura 11)
Figura 11: Creación del canal en un MOSFET. Adaptado de [8]
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2.4.2. ISFET
Un ISFET es un transistor de efecto de campo que se comporta similar a un MOSFET
que es un transistor de efecto de campo de tipo metal – oxido – semiconductor en la
compuerta.
En el ISFET la compuerta ha sido modificada para que sea sensible a iones, esto quiere
decir que el control de la conductividad del canal va a estar dado por la concentración
iónica presente en la membrana sensible de iones, este tipo de transistores presentan las
curvas características mostradas en la Figura 12.
Figura 12 Curvas características de un ISFET. Adaptado de [6]
Cuando se usa un dispositivo que no presenta características de corriente – voltaje
lineales, es necesario polarizarlo para trabajar sobre una línea de carga que nos permita
conocer como va a ser el comportamiento del mismo (Figura. 13).
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Figura 13: Curva I – V y línea de carga. Adaptado de [5]
2.5. Métodos para medir el potencial de membrana de
fibroblastos:
Existen varios autores que han medido el potencial de membrana de fibroblastos, entre
los cuales se encuentran autores con métodos costosos y complicados como el presentado
por Stockbridge [10] en el cual se usa el método de patch clamp para medir el potencial
de membrana, el cual consiste en introducir un electrodo al interior del fibroblasto para
medir directamente el potencial de membrana. Existen también métodos sencillos y
económicos como el presentado por Miller Hung [1] en el cual se usa un ISFET para
determinar el potencial de membrana de los mismos.
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3. Metodología
Para realizar este proyecto se comenzó por revisar el proyecto de Miller Hung [1 y 2],
incluidas las referencias para poder comprender a lo que se había llegado y buscar tener
una mejor aproximación a lo que en realidad ocurre en el montaje.
Se inició con la caracterización del ISFET, ya que no se había hecho previamente. Para
esto se consiguieron sustancias amortiguadoras con pH conocido para poder sumergir la
membrana sensible a iones y poder obtener las curvas características del ISFET utilizado.
Se obtuvieron los respectivos permisos para poder trabajar en el laboratorio de Biología
Molecular de la Universidad del Rosario, en donde se adquirió el conocimiento de
cultivos celulares y el procedimiento para adherir las células al ISFET.
3.1. Montaje utilizado
Se realizaron las pruebas sobre el montaje desarrollado por Miller Hung [1] de
policarbonato y acrílico. Este montaje consta de dos cámaras, la inferior para mantener la
temperatura por medio de agua que fluye a 37 grados centígrados, con el fin de no
perturbar las células térmicamente al momento de efectuar las pruebas y la superior para
ubicar el ISFET con las células previamente adheridas a el, se llena con solución salina
para generar la presión hidrostática y realizar la prueba como se muestra en la figura 8.
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Figura 14: Montaje utilizado. Adoptado de [1]
Adicionalmente se tiene una entrada de aire en la cámara superior, con el fin aumentar la
presión por medio de éste y poder tener mejor control de la misma, la cámara superior
también cuenta con una salida, la cual puede ser conectada a un transductor de presión si
se quiere llevar un registro de los cambios de presión (transiente). En éste caso no se
utilizo dicho transductor, ya que solo se esta trabajando con el estado estable de la
respuesta.
Área donde se siembran los fibroblastos
Soporte para sellar el montaje
Área donde se siembran los fibroblastos
Soporte para sellar el montaje
Figura 15 Soporte del ISFET. Adaptado de [1]
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El ISFET es montado en un soporte de caucho para sellar el montaje en la cámara
superior del dispositivo de pruebas (Figura 9). Se tiene una “ventana” en donde se ubican
las células al momento de hacer el cultivo, y en esta “ventana” se encuentran dos ISFETs
los cuales tienen las siguientes dimensiones físicas (Figura 10):
ISFET superior (corto)
Ancho 0,3 div = 13,64 µm
Largo es de 3,6 div =163,64 µm
Área de 2231,40 µm 2
ISFET inferior (largo)
Ancho 0,2 div = 9,09 µm
Largo 7,0 div = 318,18 µm
Área =2892,56 µm 2
Figura 16 Dimensiones físicas del ISFET. La división más pequeña es equivalente a 4,54 µm.
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Para la visualización del sensor se utilizo un microscopio LEITZ y un microposicionador
KITE R (Figura 11) con los cuales se ubicaba el sensor en el campo visual del
microscopio, para poder obtener una buena visualización del dispositivo así como de las
células que se adhirieron.
Figura 17: Montaje del microscopio y el microposicionador
Para el manejo de la señal eléctrica se inicio usando el circuito propuesto por Miller
Hung para obtener resultados (Figura 18), luego se uso un segundo circuito (Figura 19) el
cuál se encarga de polarizar el ISFET y mantener una corriente constante en el canal, con
lo que se obtiene una señal de salida que es proporcional a la concentración de iones
presente en la membrana, adicionalmente este segundo circuito cuenta con un electrodo
de referencia para poder interpretar los resultados obtenidos.
Microscopio Microposicionador
ISFET
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Figura 18: Circuito eléctrico utilizado por Miller Hung. Adaptado de [1]
Figura 19: Circuito eléctrico propuesto. Adaptado de [11]
Este circuito tiene que cumplir con las siguientes condiciones:
R3 = R4
R5 = R6
R7 = R8
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Las ecuaciones que gobiernan el comportamiento de este circuito son:
11RIVds =
3
036
7
2R
VdsVR
R
Ids
−
=
3.2. Procedimiento para cultivo de fibroblastos sobre
el ISFET:
1. Teniendo ya fibroblastos confluentes en una caja de cultivo de la línea celular que
tienen en la Universidad del Rosario, se procede a retirar el medio de cultivo de la
caja.
2. Se agrega 1 mL de tripsina para desprender las células de la caja y se agita
manualmente por 1 minuto.
3. Se retira la tripsina de la caja y se observa en el microscopio invertido para ver
que las células efectivamente se están despegando.
4. Se resuspende con 3 mL de medio de cultivo y se pipetea para separar
mecánicamente las células que no se han despegado.
5. Se pasa el medio con las células suspendidas en el a un tubo falcon de 10 mL.
6. Se agregan 3 mL de medio de cultivo a la caja de cultivo, para que sigan
creciendo para la siguiente prueba.
7. Se agregan 4 mL de medio de cultivo al tubo falcon para completar 7 mL, se
introduce el ISFET y se tapa.
8. Se introducen el tubo falcon con el sensor y la caja de cultivo a 37 grados
centígrados para que las células crezcan.
9. Se deja el ISFET 2 días en posición horizontal para que las células que están
suspendidas en el medio se adhieran a el.
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4. Resultados
Para la caracterización del ISFET se obtuvieron sustancias amortiguadoras con pH
conocido, en las cuales se sumergieron los dispositivos y se obtuvieron curvas de entrada
y de salida de los mismos, es decir curvas de Ids contra Vgs (de entrada) y curvas de Ids
contra Vds (de salida).
La caracterización y las pruebas se hicieron sobre el ISFET “corto” (Figura 13).
En la primera caracterización se utilizaron sustancias amortiguadoras de pH 5.5 y de pH
7, también se utilizo agua destilada para ver la respuesta del sensor, todo esto sin haber
hecho cultivo de células sobre el sensor.
Curva de entrada
Vds=0,6VVbs=0V
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
Vgs (v)
Ids
(u
A)
Agua destilada
pH 5,5
pH 7,0
Figura 20: Curva de entrada, caracterización 1.
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Curva de salidaVgs=-0,6VVbs=0V
-10
-5
0
5
10
15
20
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Vds (v)
Ids
(uA
)
pH 7,0
pH 5,5
Figura 21: Curva de salida, caracterización 1.
Para la segunda caracterización se utilizaron sustancias amortiguadoras de pH 5,10,
pH 6,70 y pH 8,26, adicionalmente se hicieron 5 mediciones de cada dato para poder
obtener la desviación estándar de la medición, la cual es incluida en las gráficas de la
segunda caracterización.
Curva de entradaVds = 1VVbs = 0V
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
-8 -6 -4 -2 0 2 4 6
Vgs (v)
Ids
(uA
) pH 5,10
pH 6,70
pH 8,26
Figura 22 Curva de entrada, caracterización 2.
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Curva de salidaVgs = -4VVbs = 0V
-50
0
50
100
150
200
250
300
-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7
Vds (v)
Ids
(uA
) pH 5,10
pH 6,70
pH 8,26
Figura 23: Curva de salida, caracterización 2.
Después de haber hecho la caracterización, se procedió a hacer el cultivo sobre el ISFET
con lo que se obtuvieron cultivos como los siguientes:
Figura 24: Cultivo de fibroblastos sobre el ISFET. La división más pequeña es equivalente a 4,54 µm.
IM-2006-I-01 36
Figura 25: Cultivo de fibroblastos sobre el ISFET. La división más pequeña es equivalente a 4,54 µm.
Teniendo ya los fibroblastos adheridos al ISFET se utilizó el circuito propuesto por
Miller Hung con lo cuál se obtuvo el siguiente resultado:
Cambio de Voltage al pasar de 0 a 5 psi
0
20
40
60
80
100
120
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
Tiempo (s)
Vo
ltaj
e (m
V)
Figura 26: Resultado Circuito 1.
IM-2006-I-01 37
Finalmente se hicieron pruebas sobre el circuito propuesto con lo que se obtuvo el
siguiente resultado:
Respuesta de 0 a 5 psiCircuito 2
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
-2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5
Tiempo (s)
Vo
ltaj
e (m
V)
Figura 27: Resultado Circuito 2.
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5. Conclusiones
De la caracterización del dispositivo podemos ver que es un ISFET canal P de
enriquecimiento, lo que quiere decir que el canal por donde va a pasar la corriente se crea
al aplicar un potencial negativo en la compuerta del dispositivo.
Se observa que la desviación en la caracterización 2 va creciendo a medida que se
incremente el voltaje y el pH, lo que sugiere la presencia de capacitancias parásitas
ubicadas entre la fuente y el medio y entre el sumidero y el medio, ya que las
capacitancias almacenan una carga proporcional al voltaje aplicado.
De los resultados obtenidos a partir del circuito 1 podemos ver que al pasar de 0 a 5 psi la
salida del circuito evidencia un salto de 0 a 100 mV, lo cual es proporcional a la cantidad
de iones presentes en el exterior de la membrana de la célula. Pero debido a que no existe
un electrodo de referencia, no se puede saber con certeza, este cambio de voltaje a que
cambio de pH correspondería.
Para los resultados obtenidos con el circuito 2, podemos ver que se presenta un cambio de
aproximadamente 2 mV al cambiar la presión de 0 a 5 psi, lo cual corresponde a un
cambio del orden de centésimas de pH al extrapolar estos resultados a los de la
caracterización (Figura 22).
El cambio de pH en el dispositivo representa un cambio en el potencial de membrana que
resulta del intercambio iónico que hace la célula en los canales de la membrana
producido por el estimulo mecánico aplicado.
Se evidencia la necesidad de caracterizar un sensor antes de utilizarlo para obtener
mediciones, pues si no se sabe en que punto de necesita operar (polarizar) no se puede
saber con certeza que nos dicen los resultados.
IM-2006-I-01 39
Dadas las características de las curvas de entrada del sensor, vemos que es un ISFET
canal P de enriquecimiento, ya que el canal se crea a medida que se hace más negativo el
canal.
Existe un offset en la corriente Ids que seguramente se deba a corrientes de fuga en el
sumidero y en la fuente, las cuales son normales en este tipo de dispositivos y
normalmente son despreciables por su orden de magnitud.
En un sistema de medición de esta naturaleza, es muy importante controlar al máximo
todas las variables que puedan inducir ruido en la medición (luz, iones presentes en el
aire, temperatura, entre otras).
Al hacer el cultivo de células sobre el ISFET los resultados obtenidos son aleatorios ya
que no se puede controlar ni el numero de células ni la ubicación en donde se van a
adherir al sensor.
Es importante caracterizar el sensor con sustancias amortiguadoras que tengan el pH
cercano al que se esta obteniendo como respuesta en el sistema, para poder interpretar los
resultados más acertadamente.
Cuando se mide el potencial de membrana de un fibroblasto por medio del método de
patch clamp, se introduce un electrodo al interior de la célula y se ubica otro electrodo en
el exterior de la misma. Una prueba de este tipo mide directamente el potencial de
membrana existente.
A diferencia del patch clamp, el método utilizado con el ISFET, mide indirectamente el
potencial de membrana al medir la concentración de iones presentes en el exterior de la
membrana de la célula. Esta concentración de iones probablemente aumenta al aplicar un
estímulo mecánico compresivo como el aplicado en las pruebas, lo que genera que el
canal del ISFET se abra y la corriente entre la fuente y el drenador aumente. Por tanto
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este aumento en la corriente se puede interpretar como un aumento en la concentración de
iones y a su vez con un aumento en el potencial de membrana.
Se sugiere continuar el proyecto sembrando células de tejido excitable como nervioso o
muscular. Con lo que se lograría obtener un biosensor que puede ser aplicado
directamente en el cuerpo para medir presiones en el cuerpo (en el caso del músculo) o la
transmisión de potenciales de acción (en el caso de las neuronas).
También se puede hacer el mismo experimento, cambiando los fibroblastos por
cardiomiocitos para medir cambios en la presión del corazón, o esfuerzos en la pared de
este al aplicar el biosensor directamente. Mediciones que resultarían sumamente valiosas
para poder entender mejor los cambios en presión y esfuerzos que se presentan en el
corazón fisiológica y patológicamente.
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6. Bibliografía
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animales. Tesis de pregrado en Ingeniería Mecánica. 2004.
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estímulos mecánicos. Tesis de magíster en Ingeniería Mecánica. 2005.
3. GANONG, William. Fisiología médica. 12 edición. 1990.
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5. DE FELICE LOUIS J. Electrical properties of Cells Patch Clamp for Biologists.
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6. Thirty years of ISFETOLOGY: What happened in the past 30 years and what may
happen in the next 30 years. Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 88, Issue 1,
1 January 2003, Pages 1-20 P. Bergveld
7. HIBBELER R.C. Mecánica de materiales. 3ª Edición. 1998.
8. STREETMAN BEN. Solid State Electronic Devices. 2000.
9. ALBERTS (et all). Molecular Biology of The Cell. Garland Science, fourth
edition, New York 2002.
10. STOCKBRIDGE LL, FRENCH AS. Characterization of a calcium-activated
potassium channel in human fibroblasts.1989
11. Profesora Alba Avila, comunicación personal.