Lidia Ruiz Roldán

María Yolanda Sáenz Domínguez y Carmen Torres Manrique

Facultad de Ciencia y Tecnología

Agricultura y Alimentación

Título

Director/es

Facultad

Titulación

Departamento

TESIS DOCTORAL

Curso Académico

Resistencia a antimicrobianos y virulencia en cepas no-clínicas de Pseudomonas aeruginosa

Autor/es

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2018

publicaciones.unirioja.esE-mail: publicaciones@unirioja.es

Resistencia a antimicrobianos y virulencia en cepas no-clínicas de Pseudomonas aeruginosa, tesis doctoral de Lidia Ruiz Roldán, dirigida por María

Yolanda Sáenz Domínguez y Carmen Torres Manrique (publicada por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-

SinObraDerivada 3.0 Unported. Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los

titulares del copyright.

RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS Y VIRULENCIA EN CEPAS

NO-CLÍNICAS DE Pseudomonas aeruginosa

ANTIMICROBIAL RESISTANCE AND VIRULENCE

IN NON-CLINICAL Pseudomonas aeruginosa STRAINSLIDIA RUIZ ROLDÁN

Tesis con Mención InternacionalLogroño, Septiembre, 2018

Departamento de Agricultura y AlimentaciónÁrea de Bioquímica y Biología Molecular

CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS DE LA RIOJA (CIBIR)

RiojaSaludFUNDACIÓN

Tesis Doctoral

Resistencia a antimicrobianos y virulencia en cepas

no-clínicas de Pseudomonas aeruginosa.

Antimicrobial resistance and virulence in non-clinical

Pseudomonas aeruginosa strains

Memoria presentada por LIDIA RUIZ ROLDÁN para optar al título de Doctor

con la Mención Internacional por la Universidad de La Rioja.

Logroño, septiembre de 2018

Dra. YOLANDA SÁENZ DOMÍNGUEZ, Investigador Principal del Área de

Microbiología Molecular del Centro de Investigación Biomédica de La Rioja

(CIBIR)

Dra CARMEN TORRES MANRIQUE, Catedrática del Área de Bioquímica y

Biología Molecular de la Universidad de La Rioja

Por la presente declaran que,

La memoria titulada “Resistencia a antimicrobianos y virulencia en cepas no-

clínicas de Pseudomonas aeruginosa”, que presenta Dña. LIDIA RUIZ ROLDÁN,

Licenciada en Biología, ha sido realizada en el Área de Microbiología Molecular

del Centro de Investigación Biomédica de La Rioja, bajo su dirección, y reúne las

condiciones exigidas para optar al título de Doctor.

Lo que hacen constar en Logroño, a 3 de septiembre de 2018.

Fdo: Dra. Yolanda Sáenz Domínguez Fdo: Prof. Carmen Torres Manrique

A todos aquellos que me han acompañado en esta aventura.

AGRADECIMIENTOS

ÍNDICE

ABREVIATURAS ................................................................................................................................. i

LISTA DE FIGURAS........................................................................................................................ vii

LISTA DE TABLAS .......................................................................................................................... xv

RESUMEN ........................................................................................................................................ xxi

ABSTRACT .................................................................................................................................... xxiii

INTRODUCCIÓN

1. El género Pseudomonas ........................................................................................................... 3

1.1 Pseudomonas aeruginosa ........................................................................................................... 7

2. Resistencia a los antibióticos ................................................................................................ 9

2.1 Mecanismos de acción a los antibióticos ......................................................................... 13

2.2 Mecanismos de resistencia a los antibióticos ................................................................ 14

2.2.1 Beta-lactámicos y beta-lactamasas .............................................................................. 17

2.2.2 Carbapenémicos ................................................................................................................... 20

2.2.2.1 Carbapenemasas ........................................................................................................... 21

2.2.2.2 Alteraciones en la porina OprD .............................................................................. 25

3. Elementos genéticos de diseminación de resistencia ............................................... 27

3.1 Plásmidos ...................................................................................................................................... 28

3.2 Elementos genéticos transponibles, ICE e islas genómicas ...................................... 29

3.3 Integrones ..................................................................................................................................... 32

4. Patogenicidad .......................................................................................................................... 37

4.1 Generalidades .............................................................................................................................. 37

4.2 Sistema de Secreción de Tipo 3 (T3SS) ............................................................................ 39

4.2.1 Regulación del Sistema de Secreción de Tipo 3 ...................................................... 43

4.3 Quorum sensing (QS) ................................................................................................................ 45

4.3.1 Regulación de Quorum Sensing ...................................................................................... 48

4.4 Pigmentos ..................................................................................................................................... 50

4.4.1 Piocianina ............................................................................................................................... 51

4.4.2 Pioverdina .............................................................................................................................. 52

4.4.3 Piorrubina .............................................................................................................................. 53

4.5 Proteasas ....................................................................................................................................... 53

4.6 Biosurfactantes .......................................................................................................................... 55

4.6.1 Tipos ......................................................................................................................................... 56

4.6.2 Ramnolípidos ........................................................................................................................ 58

4.6.2.1 Síntesis ............................................................................................................................. 59

4.6.2.2 Regulación génica ........................................................................................................ 60

4.7 Biofilm ............................................................................................................................................ 62

4.7.1 Composición, formación y regulación ........................................................................ 63

4.7.2 Papel de los ramnolípidos en biofilm.......................................................................... 65

4.8 Aplicaciones biotecnológicas de Pseudomonas ............................................................. 66

OBJETIVOS ...................................................................................................................................... 71

OBJECTIVES .................................................................................................................................... 73

MATERIAL Y MÉTODOS

1. Muestras analizadas y aislados de Pseudomonas spp. estudiados ....................... 77

1.1 Muestras fecales de animales sanos .................................................................................. 77

1.2 Muestras fecales de niños ...................................................................................................... 78

1.3 Muestras de alimentos vegetales ........................................................................................ 78

2. Medios de cultivo y pruebas de identificación ............................................................ 79

2.1 Medios de cultivo ....................................................................................................................... 79

2.2 Pruebas bioquímicas ................................................................................................................ 80

3. Procesamiento de las muestras para el aislamiento bacteriano .......................... 81

3.1 Animales sanos ........................................................................................................................... 81

3.2 Niños ............................................................................................................................................... 82

3.3 Alimentos vegetales .................................................................................................................. 82

4. Identificación bacteriana por MALDI-TOF .................................................................... 82

5. Determinación de la sensibilidad a antibióticos ......................................................... 83

5.1 Difusión en disco ........................................................................................................................ 83

5.2 Test sinérgico de doble disco ................................................................................................ 84

6. Extracción y cuantificación de DNA ................................................................................. 85

7. Extracción y cuantificación de DNA genómico ............................................................. 86

8. Extracción y cuantificación de RNA ................................................................................. 87

9. Obtención de DNA complementario (cDNA) ................................................................. 88

10. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ............................................................... 89

10.1 Identificación de aislados mediante PCR ......................................................................... 90

10.2 Estudio de mecanismos de resistencia a carbapenémicos ....................................... 90

10.3 Estudio de integrones .............................................................................................................. 93

10.4 Estudio del transposón Tn402-like..................................................................................... 94

10.5 Estudio de factores de virulencia ........................................................................................ 95

11. PCR cuantitativa (qPCR) ..................................................................................................... 98

11.1 Cuantificación de la expresión de genes de virulencia ............................................... 98

12. Secuenciación masiva (Whole Genomen Sequencing, WGS) ................................. 100

13. Electroforesis en gel de agarosa .................................................................................... 102

14. Tipificación molecular ...................................................................................................... 102

14.1 PFGE ............................................................................................................................................. 102

14.2 Multilocus Sequence Typing (MLST) ................................................................................ 104

14.3 Serotipado.................................................................................................................................. 107

15. Secuenciación ....................................................................................................................... 107

16. Estudio de alteraciones en la porina OprD ................................................................ 108

16.1 Mutaciones en el gen oprD .................................................................................................. 108

16.2 Extracción proteica y Electroforesis en Gel de Poliacrilamida con

Dodecilsulfato Sódico (SDS-PAGE) ............................................................................................... 109

17. Cuantificación de la producción de biofilm en P. aeruginosa ............................. 110

17.1 Cuantificación de la biomasa mediante Cristal Violeta ............................................ 111

17.2 Cuantificación de la actividad metabólica mediante FDA ...................................... 111

18. Producción de pigmentos y actividad elastasa en P. aeruginosa ...................... 112

19. Estudio de la producción, extracción y purificación de biosurfactantes ........ 114

19.1 Identificación de Pseudomonas spp. productoras de biosurfactantes en medio

CTAB-MB ................................................................................................................................................. 114

19.2 Fermentación ............................................................................................................................ 115

19.3 Extracción ................................................................................................................................... 116

19.4 Purificación ................................................................................................................................ 116

19.5 High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (HPLC) ........... 117

19.6 Estudio de la capacidad antimicrobiana ........................................................................ 117

19.6.1 Test de difusión por gota ............................................................................................... 117

19.6.2 Estudio de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) .................................... 118

RESUMEN GRÁFICO .................................................................................................................... 121

GRAPHIC SUMMARY .................................................................................................................. 123

RESULTADOS

1. Prevalencia de Pseudomonas spp. y Pseudomonas aeruginosa en muestras no

clínicas ........................................................................................................................................... 127

1.1 Animales sanos ......................................................................................................................... 127

1.2 Niños ............................................................................................................................................. 129

1.3 Alimentos vegetales ............................................................................................................... 129

2. Análisis de la sensibilidad a antibióticos en Pseudomonas spp. ......................... 130

3. Tipificación molecular ........................................................................................................ 133

3.1 PFGE .............................................................................................................................................. 133

3.1.1 Animales sanos .................................................................................................................. 133

3.1.2 Niños ...................................................................................................................................... 135

3.1.3 Alimentos vegetales ......................................................................................................... 136

3.1.4 Relación clonal entre P. aeruginosa de los distintos orígenes ....................... 139

3.2 MLST ............................................................................................................................................ 141

3.2.1 Animales sanos .................................................................................................................. 141

3.2.2 Niños ...................................................................................................................................... 142

3.2.3 Alimentos vegetales ......................................................................................................... 144

3.2.4 Análisis de MLST de P. aeruginosa de los tres orígenes ................................... 145

3.3 Serotipado.................................................................................................................................. 147

4. Detección de integrones..................................................................................................... 149

5. Análisis de la porina OprD en Pseudomonas aeruginosa ....................................... 150

6. Caracterización de la virulencia en Pseudomonas aeruginosa ............................ 155

6.1 Estudio de factores de virulencia (virulotipo) ............................................................ 155

6.2 Estudio de la expresión de genes de virulencia en cepas de P. aeruginosa del

linaje ST155 ........................................................................................................................................... 160

6.3 Secuenciación masiva en cepas de P. aeruginosa del linaje ST155 .................... 163

6.4 Estudio de la formación de biofilm.................................................................................. 179

6.5 Estudio de la producción de pigmentos ........................................................................ 184

6.6 Estudio de la actividad elastasa ........................................................................................ 189

7. Estudio de la producción de biosurfactantes ............................................................. 193

7.1 Identificación de cepas productoras ............................................................................... 193

7.2 Análisis de los biosurfactantes producidos ................................................................. 195

7.3 Análisis de la actividad antimicrobiana de los biosurfactantes .......................... 200

7.4 Análisis de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración

Mínima Bactericida (CMB) de los biosurfactantes ................................................................ 203

7.5 Caracterización de los genes responsables de la producción de biosurfactantes

en las cepas Ps542, Ps756 y Ps799 ............................................................................................... 204

8. COMPARATIVA: Análisis comparativo de los factores asociados con la

virulencia en las cepas de Pseudomonas aeruginosa de los tres orígenes ............ 205

DISCUSIÓN .................................................................................................................................... 211

CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 239

CONCLUSIONS .............................................................................................................................. 243

REFERENCIAS ............................................................................................................................... 247

ANEXOS .......................................................................................................................................... 297

Anexo I: Tablas y Figuras ........................................................................................................ 299

Tabla S1. Muestras recogidas de animales sanos. .................................................................. 299

Tabla S2. Muestras de niños ............................................................................................................ 328

Tabla S3. Muestras recogidas de alimentos vegetales .......................................................... 330

Tabla S4. Caracterización de las 178 cepas de Pseudomonas spp. de los tres orígenes

estudiados ............................................................................................................................................... 337

Tabla S5. Caracterización de las 76 cepas de Pseudomonas aeruginosa de los tres

orígenes estudiados ............................................................................................................................ 346

Tabla S6. Caracterización del fenotipo de virulencia de las 76 cepas de Pseudomonas

aeruginosa de los tres orígenes estudiados .............................................................................. 350

Anexo II: Secuencias incluidas en la base de datos GenBank ..................................... 355

Anexo III: Biosurfactantes ...................................................................................................... 369

Tabla S7. Genes responsables de la producción de biosurfactantes, usados para la

base de datos. ........................................................................................................................................ 369

Figura S1. Cromatogramas obtenidos mediante HPLC-MS del biosurfactante

producido por la cepa P. mendocina Ps542............................................................................... 371

Figura S2. Cromatogramas obtenidos mediante HPLC-MS del biosurfactante

producido por la cepa P. mendocina Ps799............................................................................... 372

Anexo IV: Publicaciones científicas ..................................................................................... 373

i

ABREVIATURAS

°C Grados centígrados (Grados Celsius)

ΔQS Deficiente de Quorum Sensing

ΔlasR Deficiente de gen lasR

aa Aminoácido

AMC Amoxicilina – ácido clavulánico (antibiótico + inhibidor)

AMK Amikacina (antibiótico)

AmpC Cefalosporina de tipo AmpC

ATCC Colección americana de cultivos tipo (American Type Culture Collection)

ATM Aztreonam (antibiótico)

BHI Infusión cerebro corazón (Brain Heart Infusion) (medio de cultivo)

BLEE Beta-lactamasa de espectro extendido

BS Biosurfactante

CaCl2 Cloruro de calcio

CaCl2 · 2H2O Cloruro de calcio dihidratado

CAZ Ceftazidima (antibiótico)

CC Complejo Clonal

cDNA DNA complementario

CECT Colección española de cultivos tipo

CH3OH Metanol

CIBIR Centro de Investigación Biomédica de La Rioja

CIP Ciprofloxacino (antibiótico)

CLSI Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (Clinical and Laboratory Standars

Institute)

cm Centímetro

CMB Concentración mínima bactericida (Minimum Bactericidal Concentration)

ii

CMI Concentración mínima inhibitoria (Minimum Inhibitory Concentration)

CST Colistina (antibiótico)

CTAB-MB Bromuro de cetiltrimetilamonio-Azul de metileno

DNA Ácido Desoxirribonucleico

DNasa Desoxirribonucleasa

dNTPs Desoxinucleótidos

DO Densidad óptica

DOR Doripenem (antibiótico)

DR Repeticiones directas (Direct Repeats)

ECDC Centro Europeo para la Prevención y Control de Enfermedades (European Centre

for Disease Prevention and Control)

EDTA Ácido Etilendiaminotetraacético

et al. Y colaboradores

EtOH Etanol

FEP Cefepime (antibiótico)

FeSO4 · 7H2O Sulfato de hierro heptahidratado

FOX Cefoxitina (antibiótico)

g Gramo

g Gravedad (centrifugación)

g/L Gramos por litro

GEN Gentamicina (antibiótico)

h Hora

HCl Ácido clorhídrico

HEPES 4-(2-hidroxietil)-1-ácido piperazineetanesulfónico (tampón orgánico)

I Sensibilidad intermedia

IATS Sistema Internacional de Tipado Antigénico (International Antigenic Typing

System)

iii

IREC Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos

IRL/IRR Secuencias repetidas en orden inverso (Left/Right Repeat Region)

IS Secuencia de inserción (Insertion sequence)

IPM Imipenem (antibiótico)

kB Kilo bases

kDa KiloDaltons

KH2PO4 Fosfato monopotásico

L Litro

LB Luria-Bertani (medio de cultivo)

LEV Levofloxacino (antibiótico)

M Concentración molar (mol soluto/litro disolución)

mA Miliamperios

MALDI-TOF Espectrometría de masas (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization

Time-Of-Flight)

MBL Metalo-beta-lactamasa

MDR Multirresistente (Multidrug-Resistant)

MEM Meropenem (antibiótico)

mg Miligramo (10-3 gramos)

mg/L Miligramo por litro

mg/mL Miligramo por mililitro

MgCl2 Cloruro de Magnesio

MgSO4 · 7H2O Sulfato de magnesio heptahidratado

MH Müeller-Hinton (medio de cultivo)

min Minuto

mL Mililitro (10-3 litros)

MLST Multilocus Sequence Typing

mm Milímetro (10-3 metros)

iv

mM Concentración milimolar (M/1000)

MnSO4 · H2O Sulfato de manganeso monohidratado

mN/m Mili Newton por metro

MOPS 3-(n-morfolino) ácido propanesulfónico (tampón)

MSM Medio de cultivo mínimo

N Normal

n° Número

NaCl Cloruro de sodio

Na2HPO4 Fosfato de disodio

NaNO3 Nitrato de sodio

NET Netilmicina (antibiótico)

NGS Secuenciación masiva (Next Generation Sequencing)

ng/µL Nanogramos por microlitro

NH4+ Amonio

(NH4)6Mo7O24 · 4H2O Molibdato de amonio tetrahidratado

nM Nanómetros (10-9 metros)

NOR Norfloxacino (antibiótico)

nt Nucleótido

OF Ofloxacino (antibiótico)

OMP Proteína de membrana externa (Outer membrane protein)

OMS/WHO Organización Mundial de la Salud (World Health Organization)

O/N Toda la noche (Overnight)

orf Pauta de lectura abierta (Open reading frame)

PAβN Phenylalanine-Arginine Beta-Naphthylamide (inhibidor de bombas de expulsión

activa)

pb pares de bases

PBS Tampón fosfato salino (Phosphate buffered saline)

v

PCR Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)

PDR Panrresistente (Pandrug-Resistant)

PFGE Electroforesis en campo pulsante (Pulsed Field Gel Electrophoresis)

pH log 1 / (H+) = -log [H+]

PhOH Fenol

PIP Piperacilina (antibiótico)

R Resistente

RNA Ácido ribonucleico

rRNA Ácido ribonucleico ribosomal

RNasa Ribonucleasa

rpm Revoluciones por minuto

RT-qPCR Retrotranscriptasa de PCR cuantitativa a tiempo real

SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (Sodium

dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

S Sensible

s Segundos

spp. Especies

ST Secuencia tipo (Sequence Type) (MLST)

SXT Trimetoprim-sulfametoxazol (antibiótico)

Tª Temperatura

TBE Tris-Bórico-EDTA (tampón para electroforesis)

TE Tris-EDTA (tampón para electroforesis)

Tn Transposón

Tnp Transposasa

TOB Tobramicina (antibiótico)

Tris Tris(hidroximetil)aminometano (solución)

TSB Caldo de soja tríptica (Tryptic Soy Broth) (medio de cultivo)

vi

TSI Agar triple azúcar y hierro (Triple sugar iron agar)

TZP Piperacilina-tazobactam (antibiótico)

U Unidades de enzima

U/mL Unidades por mililitro

UFC Unidades formadoras de colonias

UFC/mL Unidades formadoras de colonias por mililitro

UV Ultravioleta

V Voltios

V/cm Voltios por centímetro

v/v Volumen por volumen

W Vatio

XDR Extensivamente resistente (Extensively Drug-Resistant)

µg Microgramo (10-6 gramos)

µL Microlitro (10-6 litros)

vii

LISTA DE FIGURAS

INTRODUCCIÓN

Figura 1. Árbol filogenético de máxima verosimilitud de las últimas especies del género

Pseudomonas descritas, basado en el análisis de los genes 16S rRNA, gyrB, rpoB y rpoD

(Peix et al., 2018).

Figura 2. Rango funcional y ambiental del género Pseudomonas spp. (Silby et al., 2011).

Figura 3. Distribución de resistencia a distintas familias de antimicrobianos en

P. aeruginosa en 2016. A, carbapenémicos; B, ceftazidima; C, piperacilina-tazobactam; D,

aminoglucósidos; E, fluoroquinolonas (ECDC, 2016).

Figura 4. Mecanismos de acción de los antibióticos en la célula bacteriana.

Figura 5. Tipos de mecanismos de resistencia en P. aeruginosa, intrínsecos, adquiridos

o adaptativos. Leyenda de símbolos: Car. (carbapenémicos); Ceph. (cefalosporinas); Pen.

(penicilinas); Ami. (aminoglucósidos); Flu. (fluoroquinolonas); Mac. (macrólidos); Pol.

(polimixinas); EPS (sustancias poliméricas extracelulares); , antibiótico (Moradali et

al., 2017).

Figura 6. Estructura química de los antibióticos beta-lactámicos (Suárez & Gudiol,

2009).

Figura 7. Estructura de la proteína OprD en la membrana externa. Los loops se nombran

del L1 al L8, mientras que las láminas beta transmembrana se muestran en un recuadro.

(adaptada de Huang et al., 1995).

Figura 8. Estructura de la proteína OprD vista de lado (foto izquierda) y desde el medio

extracelular (foto derecha). (Chevalier et al., 2017).

Figura 9. Estructura básica de los elementos genéticos transponibles. A, Secuencia de

inserción; B, Transposón. DR, repetición directa; IRR e IRL, secuencias inversas

repetidas.

Figura 10. Estructura general de las islas genómicas (Juhas et al., 2008).

Figura 11. Estructura común de los integrones.

Figura 12. Modelo de integración y escisión de casetes génicos en un integrón (adaptada

de Gillings, 2014).

viii

Figura 13. Estructura de los integrones de: A, clase 1; B, clase 2; y C, clase 3. Los genes

en azul representan hipotéticos casetes génicos. (Jones-Dias et al., 2016).

Figura 14. Modelo hipotético de evolución de los integrones de clase 1 a partir del

transposón Tn402-like (adaptada de Toleman et al., 2007).

Figura 15. Mecanismos de virulencia empleados por P. aeruginosa durante el proceso de

infección (adaptada de Lee & Zhang, 2015).

Figura 16. Sistemas de secreción descritos en P. aeruginosa (adaptada de Alhazmi,

2015).

Figura 17. Estructura del Sistema de Secreción de Tipo 3 en P. aeruginosa, junto con las

proteínas efectoras (ExoU, ExoS, ExoY y ExoT) (Naito et al., 2017).

Figura 18. Regulación del Sistema de Secreción de Tipo 3 en P. aeruginosa, en el regulón

exoenzima S mediante el activador transcripcional ExsA (Naito et al., 2017).

Figura 19. Regulación de la secreción en el Sistema de Secreción de Tipo 3 a través de

ExsA (adaptada de Hauser, 2009).

Figura 20. Red jerárquica de QS en P. aeruginosa y regulación de factores de virulencia.

En respuesta a un estímulo ambiental, cada mecanismo sintetiza su propio autoinductor

[HSL (3-oxo-C12-HSL), BHL (C4-HSL), PQS e IQS]. Simbología: AprA, proteasa alcalina;

PLC, fosfolipasa C; Tox, toxina A; LasA, elastasa; LasB, elastasa; HCN, cianuro de

hidrógeno; Pyo, piocianina; Rhld, ramnolipidos; LecA, lectina A; CM, membrana

citoplasmática; OM, membrana externa (Moradali et al., 2017).

Figura 21. Regulación de los mecanismos de Quorum Sensing y relación con las bombas

de expulsión activa, en P. aeruginosa (Alcalde-Rico et al., 2016).

Figura 22. Colonias de aislamientos hospitalarios de P. aeruginosa, donde se distinguen

los distintos pigmentos sintetizados (Merino, 2007).

Figura 23. Estructura del pigmento piocianina, producido por P. aeruginosa (Lau et al.,

2004).

Figura 24. Estructura del pigmento pioverdina, producido por P. aeruginosa (adaptada

de Cornelis, 2013).

Figura 25. Estructura química de algunos biosurfactantes lipopéptidos producidos.

ix

Figura 26. Estructura química de algunos biosurfactantes glicolípidos y biosurfactantes

poliméricos producidos.

Figura 27. Síntesis de ramnolípidos en P. aeruginosa. Las enzimas marcadas en verde

muestran la síntesis de dDTP-L-ramnosa, mientras que las marcadas en morado, son las

responsables de la síntesis de mono- y dirramnolípidos (adaptada de Zhang et al., 2012).

Figura 28. Regulación génica de la producción de ramnolípidos en P. aeruginosa. Las

líneas verdes indican activación, mientras que las líneas rojas indican represión. Los

interrogantes representan hipótesis de regulación (Reis et al., 2011).

Figura 29. Etapas de formación de biofilm en P. aeruginosa: 1, Etapa planctónica; 2,

Fijación bacteriana; 3, Adhesión a la superfície; 4, Proliferación de matriz extracelular; 5,

Maduración; 6, Dispersión del biofilm (adaptada de Karaguler et al., 2017).

Figura 30. Implicaciones de los ramnolípidos en la formación y desarrollo de biofilm en

P. aeruginosa: A, Fijación; B, adhesión; C, proliferación; y D, dispersión. Las estrellas rojas

simbolizan los ramnolípidos (Nickzad & Déziel, 2014).

MATERIAL Y MÉTODOS

Figura 31. Test sinérgico de doble disco positivos para la detección de: A, BLEE; B, MBL;

y C, AmpC inducible.

Figura 32. Representación gráfica del transposón Tn402-like, marcando con flechas los

cebadores utilizados para su amplificación: A, Tn402-TniA-R; B, Tn402-TniB-F; C,

Tn402-TniB-F1; D, Tn402-TniB-R; E, Tn402-TniC-F; F, Tn402-TniC-F1; G, Tn402-TniC-R.

Figura 33. Esquema descriptivo de los pasos seguidos para la obtención y análisis de la

secuenciación masiva de las cepas de Pseudomonas spp. seleccionadas.

Figura 34. Rectas de regresión empleadas para el cálculo de la cuantificación de

piocianina en las cepas de P. aeruginosa.

RESULTADOS

Figura 35. Porcentaje de resistencia a los distintos antibióticos antipseudomónicos

testados en este estudio, detectados en los 330 aislados de Pseudomonas sp. de los

distintos orígenes. Leyenda: PIP, piperacilina; TZP, piperacilina-tazobactam; ATM,

aztreonam; FEP, cefepime; CAZ, ceftazidima; IPM, imipenem; MEM, meropenem; DOR,

x

doripenem; NET, netilmicina; TOB, tobramicina; GEN, gentamicina; AMK, amikacina; CIP,

ciprofloxacino; CST, colistina.

Figura 36. Porcentaje de resistencia a los 14 antibióticos testados en los aislados de

P. aeruginosa de los distintos orígenes. La leyenda de colores es la siguiente: animales

sanos (rojo), niños (verde) y alimentos (azul). Nótese que el máximo valor del eje Y fue

10%, puesto que los porcentajes de resistencia fueron muy bajos. Leyenda: PIP,

piperacilina; TZP, piperacilina-tazobactam; ATM, aztreonam; FEP, cefepime; CAZ,

ceftazidima; IPM, imipenem; MEM, meropenem; DOR, doripenem; NET, netilmicina; TOB,

tobramicina; GEN, gentamicina; AMK, amikacina; CIP, ciprofloxacino; CST, colistina.

Figura 37. Gel de PFGE de algunos aislados de P. putida, P. aeruginosa, P. gessardii y

P. fulva de animales sanos. El recuadro marca algunos aislados que presentaron un

patrón indistinguible. M representa el marcador de peso molecular.

Figura 38. Gel de PFGE de algunos aislados de P. aeruginosa de niños. El recuadro marca

aquellos aislados que presentaron un patrón indistinguible. M representa el marcador

de peso molecular.

Figura 39. Gel de PFGE de algunos aislados de P. putida, P. mendocina y P. aeruginosa de

alimentos vegetales. El recuadro marca algunos aislados que presentaron un patrón

indistinguible. M representa el marcador de peso molecular.

Figura 40. Dendrograma de las 76 cepas de P. aeruginosa de los tres orígenes: animales

sanos, niños y alimentos vegetales.

Figura 41. Árbol filogenético de máxima verosimilitud, relacionando las 76 cepas de P.

aeruginosa de los tres orígenes.

Figura 42. Estructura de los integrones de clase 1 detectados en las cepas de

Pseudomonas spp.: A, Pseudomonas spp. Ps656; B, P. fluorescens Ps658; C, P. fragi Ps662;

D, P. fluorescens Ps689 y Ps693.

Figura 43. Comparación entre el gen oprD completo de la cepa de referencia

P. aeruginosa PAO1 (GenBank nº AE004091) con el gen oprD truncado con la secuencia

de inserción ISPa1635 (GenBank nº: MH050332), de la cepa Ps884.

xi

Figura 44. Secuencia nucleotídica del gen oprD truncado por la secuencia de inserción

ISPa1635 de la cepa Ps884, de alimentos vegetales (GenBank nº: MH050332). En verde,

secuencia de oprD; en gris, la secuencia de inserción ISPa1635; en azul, las secuencias

repetidas (IRL, RRL); en verde, las “target site duplication”; en morado, la secuencia de

transposasa.

Figura 45. Proteínas de membrana extraídas por SDS-PAGE. El rectángulo verde marca

la proteína OprD estudiada; las flechas rojas marcan la ausencia de esta porina, tanto en

la cepa mutante como en la cepa Ps884 (patrón L). El marcador de peso molecular usado

fue de la marca Precision plus protein dual color standards (BioRad).

Figura 46. Comparación entre el gen lasR completo de la cepa de referencia P. aeruginosa

PAO1 (GenBank nº AE004091) de los genes lasR truncados por distintas secuencias de

inserción: A, Ps893 (gen truncado); B, Ps519 (IS1394); C, Ps852 (ISPa91); D, Ps796

(ISPre2); E, Ps845 (IS1411).

Figura 47. Expresión de genes de virulencia importantes en cinco cepas de P. aeruginosa

con ST155. La línea roja punteada simboliza el valor de la expresión de la cepa de

referencia P. aeruginosa PAO1 (2-ΔΔCt = 1).

Figura 48. Secuencias nucleotídicas del gen crpP en las cepas de P. aeruginosa ST155,

respecto al gen de referencia encontrado en el plásmido pUM505. En amarillo se marcan

las bases nucleotídicas idénticas al gen de referencia; en azul se marcan las bases

nucleotídicas distintas al gen de referencia.

Figura 49. Secuencias aminoacídicas de la proteína CrpP de P. aeruginosa ST155,

respecto a la proteína de referencia encontrada en el plásmido pUM505. En amarillo se

marcan los aminoácidos idénticos a la proteína de referencia; en azul y rosa se marcan

las mutaciones aminoacídicas respecto a la proteína de referencia.

Figura 50. Comparación de las cepas de P. aeruginosa ST155 con el plásmido pUM505,

marcando los genes de relevancia. Se usó el programa BLAST Ring Image Generator

(BRIG).

Figura 51. Secuencia nucleotídica del gen lasI de la cepa de referencia P. aeruginosa

PAO1 comparada con las secuencias del gen de las cepas Ps764, Ps839 y Ps892. La zona

morada marca los cebadores utilizados para amplificar este gen mediante PCR.

xii

Figura 52. Mapa de calor representando resistoma y viruloma descritos en las cepas de

P. aeruginosa ST155, obtenido por GraphPad 7.0. Los cuadrados blancos marcan la

ausencia de gen/proteína. El asterisco (*) marca las proteínas truncadas.

Figura 53. Porcentaje de producción de biomasa y actividad metabólica en biofilm en las

9 cepas de P. aeruginosa de animales sanos. La línea roja punteada simboliza el

porcentaje de la cepa de referencia P. aeruginosa PAO1.

Figura 54. Porcentaje de producción de biomasa y actividad metabólica en biofilm en las

30 cepas de P. aeruginosa de niños. La línea roja punteada simboliza el porcentaje de la

cepa de referencia P. aeruginosa PAO1.

Figura 55. Porcentaje de producción de biomasa y actividad metabólica en biofilm en las

37 cepas de P. aeruginosa de alimentos vegetales. La línea roja punteada simboliza el

porcentaje de la cepa de referencia P. aeruginosa PAO1.

Figura 56. Niveles de producción de biomasa medidos con cristal violeta (CV), y

actividad metabólica medida con FDA (FDA), de las 76 cepas de P. aeruginosa, de los tres

orígenes. La línea roja punteada indica el porcentaje de la cepa de referencia

P. aeruginosa PAO1 (100%).

Figura 57. Porcentaje de producción de piocianina y piorrubina en las 9 cepas de

P. aeruginosa de animales sanos. La línea roja punteada simboliza el porcentaje de la cepa

de referencia P. aeruginosa PAO1.

Figura 58. Porcentaje de producción de piocianina y piorrubina en las 30 cepas de

P. aeruginosa de niños. La línea roja punteada simboliza el porcentaje de la cepa de

referencia P. aeruginosa PAO1.

Figura 59. Porcentaje de producción de piocianina y piorrubina en las 37 cepas de

P. aeruginosa de alimentos vegetales. La línea roja punteada simboliza el porcentaje de

la cepa de referencia P. aeruginosa PAO1.

Figura 60. Niveles de producción de piocianina y piorrubina, de las 76 cepas de

P. aeruginosa, divididos por origen. La línea roja punteada indica el porcentaje de la cepa

de referencia P. aeruginosa PAO1.

Figura 61. Porcentaje de actividad elastasa en las 9 cepas de P. aeruginosa de animales

sanos. La línea roja punteada simboliza el porcentaje de la cepa de referencia

P. aeruginosa PAO1.

xiii

Figura 62. Porcentaje de actividad elastasa en las 30 cepas de P. aeruginosa de niños. La

línea roja punteada simboliza el porcentaje de la cepa de referencia P. aeruginosa PAO1.

Figura 63. Porcentaje de actividad elastasa en las 37 cepas de P. aeruginosa de alimentos

vegetales. La línea roja punteada simboliza el porcentaje de la cepa de referencia

P. aeruginosa PAO1.

Figura 64. Niveles de actividad elastasa de las 76 cepas de P. aeruginosa de diferentes

orígenes. La línea roja punteada indica el porcentaje de la cepa de referencia

P. aeruginosa PAO1.

Figura 65. Imágenes de halos de producción de biosurfactantes, de distintas cepas de

Pseudomonas spp., mediante el método de CTAB-MB agar.

Figura 66. Análisis de la curva de crecimiento y tensión superficial de las tres cepas de

Pseudomonas spp. seleccionadas para la producción de biosurfactantes. La línea azul

muestra la evolución de la tensión superficial (mN/m); mientras que la línea morada

indica el crecimiento bacteriano (UFC/mL).

Figura 67. Cromatogramas del biosurfactante producido por la cepa Ps799, obtenido a

partir del método HPLC-MS. Las flechas en rojo indican picos importantes de compuesto;

las flechas en verde, indican posibles congéneres de ramnolípidos.

Figura 68. Cromatogramas del biosurfactante producido por la cepa Ps542, obtenido a

partir del método HPLC-MS. Las flechas en rojo indican picos importantes de compuesto;

las flechas en verde, indican posibles congéneres de ramnolípidos.

Figura 69. Actividad antimicrobiana de los tres compuestos biosurfactantes obtenidos,

de las cepas de Pseudomonas spp. Ps542, Ps756 y Ps799. Las flechas muestran la

distancia de los halos de inhibición.

Figura 70. Árbol filogenético de máxima verosimilitud, de las 76 cepas de P. aeruginosa

de los tres orígenes. Uso de mapa de calor para mostrar los fenotipos de virulencia, como

la producción de biofilm (CV) y pigmentos, actividad elastasa y actividad metabólica en

biofilm (FDA). Realizado con los softwares IQTREE v.1.6.1 (Nguyen et al., 2015) y iTol

(Letunic & Bork, 2016).

xiv

Figura 71. Producción de biomasa (CV) y actividad metabólica (FDA) en biofilm,

comparando las 76 cepas de P. aeruginosa, clasificadas en “Humanos” (niños) y

“No-Humanos” (animales sanos y alimentos vegetales). Análisis estadístico realizado con

el software R Commander, y test de Mann-Whitney. Valores: ns, no significativo; *, p-

valor ≤ 0,05.

Figura 72. Producción de piocianina y piorrubina, y actividad elastasa, comparando las

76 cepas de P. aeruginosa, clasificadas en “Humanos” (niños) y “No-Humanos” (animales

sanos y alimentos vegetales). Análisis estadístico realizado con el software R

Commander, y test de Mann-Whitney. Valores: ns, no significativo; ***, p-valor ≤ 0,001.

ANEXOS

Figura S1. Cromatogramas obtenidos mediante HPLC-MS del biosurfactante producido

por la cepa P. mendocina Ps542.

Figura S2. Cromatogramas obtenidos mediante HPLC-MS del biosurfactante producido

por la cepa P. mendocina Ps799.

xv

LISTA DE TABLAS

INTRODUCCIÓN

Tabla 1. Categorías antimicrobianas y antibióticos empleados para definir los

microorganismos MDR, XDR y PDR en P. aeruginosa (Magiorakos et al., 2012).

Tabla 2. Clasificación de las beta-lactamasas (adaptado de Bush & Jacoby, 2010; Naas et

al., 2016).

Tabla 3. Perfiles de las carbapenemasas más importantes, según su perfil de hidrólisis y

su perfil de inhibición (adaptado de Queenan & Bush, 2007; Codjoe & Donkor, 2017).

Tabla 4. Variantes más frecuentes de los promotores Pc y P2, detectados en los

integrones de clase 1 (adaptada de Jové et al., 2010).

MATERIAL Y MÉTODOS

Tabla 5. Lista de alimentos vegetales recogidos, divididos según su lugar de origen.

Tabla 6. Lista de reactivos para la preparación de los medios de cultivo necesarios para

la identificación de bacterias productoras de biosurfactantes. Estas cantidades son para

1 L de medio de cultivo, ajustando el pH a 6,7.

Tabla 7. Carga de los discos de los 14 antibióticos empleados en los antibiogramas y

puntos de corte (mm) según CLSI (CLSI, 2016).

Tabla 8. Componentes empleados en la PCR y los volúmenes para preparar la mezcla de

reactivos.

Tabla 9. Secuencia nucleotídica de los cebadores empleados y programa de PCR, para la

amplificación del fragmento 16S rRNA.

Tabla 10. Componentes de KAPABYOSISTEMS empleados para la amplificación de genes

codificantes de MBL y Carbapenemasas de Clase A.

Tabla 11. Secuencia nucleotídica de los cebadores empleados y programa para la PCR

multiplex de MBL.

Tabla 12. Secuencia nucleotídica de los cebadores empleados y programa para la PCR

multiplex de Carbapenemasas de Clase A.

xvi

Tabla 13. Secuencia nucleotídica de los cebadores empleados y programa de PCR, para

la amplificación de las estructuras de los integrones de clase 1, 2 y 3.

Tabla 14. Secuencia nucleotídica de los cebadores empleados para la amplificación y

caracterización del entorno de los integrones de clase 1.

Tabla 15. Secuencia nucleotídica de los cebadores empleados y programa de PCR, para

la amplificación de los genes de virulencia estudiados.

Tabla 16. Componentes empleados en la qRT-PCR y los volúmenes de reactivos.

Tabla 17. Secuencia nucleotídica de los cebadores empleados y programa de PCR, para

determinar la expresión de los genes de virulencia estudiados.

Tabla 18. Secuencia nucleotídica, tamaño de amplicón y temperatura de hibridación de

los 7 genes housekeeping usados durante la técnica de PCR.

Tabla 19. Secuencia nucleotídica y tamaño de amplicón de los 7 genes housekeeping

usados durante la técnica de secuenciación.

Tabla 20. Condiciones y polimerasas empleadas, para la amplificación de los genes

housekeeping.

Tabla 21. Secuencia nucleotídica de los cebadores empleados y programa para la PCR.

RESULTADOS

Tabla 22. Especies de Pseudomonas aisladas, y muestras fecales de animales sanos de

las que procedían.

Tabla 23. Especies de Pseudomonas aisladas, y alimento vegetal del que procedían.

Tabla 24. Grupos de aislados con patrón de PFGE indistinguible, y selección de la cepa a

estudiar.

Tabla 25. Grupos de aislados con patrón de PFGE indistinguible, y selección de la cepa a

estudiar.

Tabla 26. Secuencias tipo identificadas en las 9 cepas de P. aeruginosa aisladas de

animales sanos.

Tabla 27. Secuencia alélica de las secuencias tipo ST1711 y ST1732, que muestran

cuatro cepas de P. aeruginosa.

xvii

Tabla 28. Secuencias tipo identificadas en las 30 cepas de P. aeruginosa aisladas de niños

sanos.

Tabla 29. Secuencia alélica de las secuencias tipo ST560 y ST671, que muestran cuatro

cepas de P. aeruginosa.

Tabla 30. Secuencias tipo identificadas en las 37 cepas de P. aeruginosa aisladas de

alimentos vegetales.

Tabla 31. Serotipos encontrados en las cepas de P. aeruginosa de los distintos orígenes.

Tabla 32. Alteraciones de la porina OprD encontradas en las 76 cepas de P. aeruginosa

analizadas.

Tabla 33. Patrones aminoacídicos observados en la porina OprD, y cepas de

P. aeruginosa según origen.

Tabla 34. Listado de virulotipos obtenidos en las distintas cepas de P. aeruginosa, en los

diferentes orígenes.

Tabla 35. Clasificación de las cepas de P. aeruginosa según el virulotipo identificado.

Tabla 36. Características de las cepas de P. aeruginosa ST155 seleccionadas.

Tabla 37. Valores de la cuantificación relativa (medido en cantidad relativa, 2-ΔΔCt) de

genes de virulencia importantes, en cinco cepas de P. aeruginosa con ST155, en

comparación con la cepa P. aeruginosa PAO1.

Tabla 38. Estudio de resistencia a fluoroquinolonas en las cepas de P. aeruginosa ST155.

Tabla 39. Cambios aminoacídicos en las proteínas de resistoma y viruloma de las cepas

de P. aeruginosa ST155.

Tabla 40. Cepas de Pseudomonas spp. de distintos orígenes, seleccionadas para seguir el

estudio de producción de biosurfactantes.

Tabla 41. Medida de la tensión superficial (mN/m) de los sobrenadantes diluidos en

caldo NB, de las cepas de Pseudomonas spp. seleccionadas para el estudio.

Tabla 42. Ramnolípidos producidos por la cepa P. aeruginosa Ps756, detectados en el

sobrenadante, e identificados mediante HPLC-MS.

xviii

Tabla 43. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI, mg/mL) y Concentración Mínima

Bactericida (CMB, mg/mL) de los biosurfactantes estudiados, en las cepas control.

Tabla 44. Genes responsables en la síntesis de biosurfactantes identificados en el

genoma de P. mendocina.

ANEXOS

Tabla S1. Muestras recogidas de animales sanos.

Tabla S2. Muestras de niños.

Tabla S3. Muestras recogidas de alimentos vegetales.

Tabla S4. Caracterización de las 178 cepas de Pseudomonas spp. de los tres orígenes

estudiados.

Tabla S5. Caracterización de las 76 cepas de Pseudomonas aeruginosa de los tres

orígenes estudiados.

Tabla S6. Caracterización del fenotipo de virulencia de las 76 cepas de Pseudomonas

aeruginosa de los tres orígenes estudiados.

Tabla S7. Genes responsables de la producción de biosurfactantes, usados para la base

de datos.

RESUMEN

xxi

RESUMEN

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista, con gran versatilidad

metabólica y extraordinaria habilidad para crecer en distintos nichos ecológicos.

P. aeruginosa es uno de los mayores responsables de infecciones nosocomiales,

caracterizado por su resistencia a antibióticos y su gran arsenal de factores de virulencia.

Existen múltiples estudios evaluando la relación resistencia a antibióticos-virulencia en

cepas clínicas; mientras que los trabajos realizados con Pseudomonas de muestras no-

clínicas son nulos o incompletos.

Por ello, los dos primeros objetivos de esta tesis fueron estudiar la prevalencia de

Pseudomonas en muestras fecales de animales sanos y de niños y en alimentos vegetales;

así como determinar su fenotipo de resistencia a agentes antipseudomónicos. La

prevalencia de Pseudomonas en animales (n=704) y en niños (n=477) fue de 6,5 y 6,7%,

respectivamente; mientras que en alimentos vegetales (n=145) fue de 53,1%. De los 330

aislados obtenidos, P. putida y P. aeruginosa predominaron entre las 20 especies

detectadas. El 44,8% de los aislados de Pseudomonas spp. mostró resistencia al menos a

uno de los antibióticos testados, destacando aztreonam (41,5%). El fenotipo de

multirresistencia se detectó en cuatro aislados (1,2%). P. aeruginosa se aisló en 6,3% de

las muestras de niños, en 0,8% de animales y en 17,9% de alimentos vegetales;

caracterizadas por su alto porcentaje de sensibilidad antimicrobiana (93,1%).

El tercer objetivo fue tipificar molecularmente los aislados de Pseudomonas spp.,

observándose una alta diversidad clonal mediante PFGE. No se detectaron patrones

relacionados entre cepas de distintos orígenes. En las 76 cepas de P. aeruginosa, el

serotipo O:6 fue el más frecuente (38%) y también se observó una elevada diversidad

clonal (70 patrones de PFGE). Entre las 55 secuencias tipo (ST) detectadas por MLST, 14

de ellas fueron nuevas, y algunos clones (como ST244, ST252, ST253, ST277, ST395 y

ST1033) se repitieron entre las cepas aisladas de niños y de alimentos vegetales. Destaca

la presencia de clones intercontinentales, como ST155, ST244, ST252, ST274 y ST395,

entre las cepas de P. aeruginosa de los distintos orígenes.

El estudio de los mecanismos de resistencia a carbapenémicos también fue objetivo

de esta tesis. Ningún aislado presentó un fenotipo carbapenemasa; sin embargo, las

cepas de P. aeruginosa mostraron un gran polimorfismo en la proteína OprD (13

patrones). Se detectó la secuencia de inserción ISPa1635 truncando el gen oprD

(GenBank MH050332) en una de las cepas resistentes a imipenem.

xxii

El quinto objetivo fue estudiar la presencia de factores de virulencia, la producción de

biofilm, pigmentos y la actividad elastasa en cepas de P. aeruginosa. El 80,2% de

P. aeruginosa presentó el genotipo exoU-/exoS+; mientras que el genotipo exoU+/exoS-,

asociado a una elevada citotoxicidad, se detectó en el 17,1% (9 cepas de niños y 4 de

alimentos vegetales). Seis P. aeruginosa aisladas de animales sanos carecían de los genes

codificantes de los efectores del Sistema de Secreción Tipo 3 y de los genes exoA y rhlC,

pero ninguna de estas seis cepas amplificó el gen de la exolisina ExlA, descrito

recientemente. Todas las cepas de P. aeruginosa portaban los genes lasA, lasB, aprA,

rhlAB, rhlI y rhlR. Los genes lasI y lasR no amplificaron en tres cepas que pertenecían al

clon ST155. Se detectaron secuencias de inserción (ISPre2, IS1411, ISPa91 y IS1394)

truncando el gen lasR (GenBank MH050329, MH050330, MH050331, MG815635,

respectivamente) en cuatro cepas de P. aeruginosa. La producción de biofilm, piocianina

y piorrubina, así como la actividad elastasa fue superior a la cepa de referencia PAO1 en

el 92, 64, 67 y 76% de las cepas de P. aeruginosa, respectivamente.

El sexto objetivo fue estudiar el genoma completo de las cepas de P. aeruginosa

pertenecientes al clon ST155. Se observaron distintos mecanismos de resistencia

intrínsecos y alteraciones en sus bombas de expulsión activa; así como la presencia de la

isla de patogenicidad del plásmido pUM505 que contiene el gen crpP, descrito

recientemente. Las variantes de CrpP detectadas en estas P. aeruginosa, mostraban

mutaciones en las posiciones catalíticas implicadas en la inactivación del ciprofloxacino

(identidad 94-99%) y una localización cromosómica.

Los últimos objetivos fueron detectar y caracterizar los biosurfactantes producidos

por Pseudomonas spp. El 97,3% de las cepas de P. aeruginosa y el 32% de las cepas no

aeruginosa, principalmente P. putida y P. mendocina, mostraron producción de

biosurfactantes mediante el método CTAB-MB agar. Los tres biosurfactantes purificados

de dos P. mendocina y una P. aeruginosa mostraron actividad antimicrobiana frente a

S. aureus (rango CMI: 0,21-3,38 mg/mL) y P. aeruginosa (0,11-0,42 mg/mL). Los

ramnolípidos de P. aeruginosa se asociaron probablemente a la producción de RhlAB y

RhlC; mientras que queda pendiente de resolver la caracterización estructural y genética

de los biosurfactantes de P. mendocina.

Esta tesis, aporta datos de gran importancia en epidemiología, resistencia a

antibióticos y virulencia de Pseudomonas de origen no-clínico con aplicación en salud

humana, salud animal y seguridad alimentaria. Y a su vez, la detección de biosurfactantes

con actividad antimicrobiana constituye una importante herramienta biotecnológica de

aplicación industrial y medioambiental.

xxiii

ABSTRACT

Pseudomonas aeruginosa is an opportunist pathogen, with great metabolic versatility

and extraordinary ability to grow in different ecological niches. P. aeruginosa is one of

the main responsible of nosocomial infections, characterised by their antimicrobial

resistance and virulence factors. There are multiple studies evaluating the antibiotic

resistance-virulence relationship in clinical strains; whereas researches on non-clinical

Pseudomonas are scarce or incomplete.

The first two objectives of this thesis were to study the Pseudomonas prevalence in

faecal samples of healthy animals and children, and in food vegetables; and to determine

their antimicrobial resistance phenotype. The Pseudomonas prevalence in healthy

animals (n=704) and children (n=477) was 6.5 and 6.7%, respectively; whereas it was

53.1% in food vegetables (n=145). P. putida and P. aeruginosa were the most

predominant species among the 20 detected in the 330 recovered isolates. Forty-five per

cent of Pseudomonas spp. isolates were resistant to at least one of the antibiotics tested;

and the highest percentage was to aztreonam (41.5%). The multidrug-resistance

phenotype was detected in four isolates (1.2%). P. aeruginosa was isolated in 6.3% of

children samples, 0.8% of healthy animals, and 17.9% of food vegetables; characterised

by their high antimicrobial susceptibility percentage (93.1%).

The third objective was to analyze the molecular typing of Pseudomonas isolates. The

PFGE analysis showed a high clonal diversity among Pseudomonas spp. isolates. No

related patterns were detected among strains from different origins. Regarding the 76

P. aeruginosa strains, the O:6 serotype was the most predominant (38%), and a high

clonal diversity was also observed (70 PFGE patterns). Among the 55 detected sequence

types (ST), 14 of them were new ST, and some clones (such as ST244, ST252, ST253,

ST277, ST395 and ST1033) were repeated in strains from children and food vegetables.

Highlight the presence of intercontinental clones, such as ST155, ST244, ST252, ST274

and ST395, among the P. aeruginosa strains of different origins.

The study of carbapenem-resistance mechanisms was other objective of this thesis.

None of the isolates presented a carbapenemase phenotype; however, P. aeruginosa

strains showed a great polymorphism in the OprD protein (13 patterns). The insertion

sequence ISPa1635 was observed truncating the oprD gene (GenBank MH050332) in an

imipenem-resistant strain.

The fifth objective was to study the presence of virulence markers, the biofilm and

pigments production, and the elastase activity in P. aeruginosa strains. The exoU-/exoS+

xxiv

genotype was detected in 80.2% of P. aeruginosa strains, while the exoU+/exoS- genotype,

associated to high cytotoxicity, was amplified in 17.1% (9 strains from children and 4

from food vegetable). Six P. aeruginosa strains from healthy animals lacked the Type 3

Secretion System (exoU, exoS, exoY, exoT), exoA and rhlC genes; however, none of these

strains amplified the recently described ExlA exolysin gene (exlA). All P. aeruginosa

strains amplified the lasA, lasB, aprA, rhlAB, rhlI and rhlR genes. Three strains belonging

to clone ST155, lacked lasI and lasR genes. Insertion sequences (ISPre2, IS1411, ISPa91

and IS1394) were detected truncating the lasR gene (GenBank MH050329, MH050330,

MH050331, MG815635, respectively) in four P. aeruginosa strains. Biofilm, pyocyanin

and pyorubin production, and elastase activity were higher in 92, 64, 67 and 76% of

P. aeruginosa strains, respectively, than in the reference strain P. aeruginosa PAO1.

The sixth objective was to analyze the complete genome of P. aeruginosa strains

belonging to clone ST155. Different intrinsic resistance mechanisms and alterations in

the efflux pumps were detected; as well as the presence of the pUM505 pathogenicity

island, containing the crpP gene, recently described. The crpP variants showed mutations

at the catalytic positions responsible for the ciprofloxacin inactivation (94-99% of

identity), and were chromosomally located.

The last objectives were to detect and characterize the biosurfactants production in

Pseudomonas spp. Biosurfactant production was detected, by the CTAB-MB agar method,

in 97% of P. aeruginosa strains and in 32% of no-aeruginosa strains, mainly P. putida and

P. mendocina. The three biosurfactants extracted and purified from two P. mendocina and

one P. aeruginosa strains showed antimicrobial activity against S. aureus (CMI: 0.21-3.38

mg/mL) and P. aeruginosa (0.11-0.42 mg/mL). P. aeruginosa biosurfactants were

rhamnolipids, probably associated to RhlAB and RhlC rhamnosiltransferases.

P. mendocina biosurfactant structures and their genetic association remain unidentified.

This thesis provides data of great importance in epidemiology, antimicrobial

resistance and virulence in non-clinical Pseudomonas, with application in human health,

animal health and food safety. Additionally, the detection of biosurfactants with

antimicrobial activity constitutes an important biotechnological tool for industrial and

environmental application.

INTRODUCCIÓN

In t roducc ión

3

1. El género Pseudomonas

La bacteria Pseudomonas abarca un amplio género perteneciente a la clase

γ-Proteobacteria, orden Pseudomonadales y familia Pseudomonadaceae. Migula, en 1894

fue el primer investigador en proponer este nombre (Palleroni, 2010).

Etimológicamente, “Pseudomonas” significa “falsa unidad”, del griego “pseudo” que

significa “falso”, y “monas” que significa “unidad simple”. Actualmente, a este género

pertenecen unas 270 especies distintas, según el Approved Lists of Bacterial Names

(http://www.bacterio.net/pseudomonas.html), y se clasifican en 7 grupos distintos

basados en su secuencia 16S rRNA (grupo P. syringae; grupo P. chlororaphis; grupo

P. fluorescens; grupo P. putida; grupo P. stutzeri; grupo P. aeruginosa y grupo

P. pertucinogena) (Anzai et al., 2000; Peix et al., 2018) (Figura 1).

En general, las bacterias de este género son bacilos Gram negativos rectos o

ligeramente curvados, de entre 1,5 a 5 µm de longitud y un diámetro de entre 0,5 y

1,0 µm; no formadoras de esporas, no fermentadoras de azúcares, móviles gracias a los

flagelos polares, catalasa positivas y aerobias estrictas, aunque algunas veces pueden

usar los nitratos como fuente alternativa de electrones, permitiéndoles crecer en

anaerobiosis. Los aislados de Pseudomonas son oxidasa positiva, excepto las especies

P. luteola y P. oryzihabitans. Este género bacteriano suele crecer de forma rápida, y en un

amplio rango de temperatura, entre 20°C y 42°C, aunque su temperatura óptima oscila

entre los 30°C y 37°C. Son capaces de dividirse bajo distintas condiciones ambientales.

Se le considera un género ubicuo, ya que pueden encontrarse en ecosistemas tanto

acuáticos como terrestres (Silby et al., 2011), creciendo en lugares como suelos, aguas,

artículos de limpieza, combustible, alimentos, animales, plantas, etc. Eso es debido a que

presentan una importante versatilidad, tanto metabólica como fisiológica, que les lleva a

una rápida colonización y dispersión en distintos hábitats, ya sean terrestres o acuáticos

(Palleroni, 1992) (Figura 2). Además, las especies pertenecientes a este género pueden

presentar resistencia a antibióticos, desinfectantes, detergentes, metales pesados y

solventes orgánicos (Lanini et al., 2011).

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Figura 1. Árbol filogenético de máxima verosimilitud de las últimas especies del género

Pseudomonas descritas, basado en el análisis de los genes 16S rRNA, gyrB, rpoB y rpoD

(Peix et al., 2018).

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Es frecuente encontrar distintas especies de Pseudomonas en alimentos, tanto en

alimentos cárnicos (Estepa et al., 2015) como en vegetales (Allydice-Francis & Brown,

2012). Algunos productos frescos pueden presentar microorganismos ambientales no

patógenos (Aserse et al., 2013), pero durante su crecimiento o procesado, pueden

contaminarse con bacterias patógenas o comensales procedentes del ser humano. Esta

contaminación suele darse por el contacto directo con el suelo de cultivo, incluso con la

aplicación de biofertilizantes (Ben Said et al., 2015; Van Hoek et al., 2015). Así, las frutas

y vegetales que crecen cerca del suelo, y que no requieren proceso de preparación, son

aquellas que más posibilidades tienen de contaminación (Berger et al., 2010). Sin

embargo, también son frecuentes las contaminaciones en comercios por la incorrecta

manipulación humana (Van Hoek et al., 2015) o las contaminaciones cruzadas. En esta

línea, investigaciones del grupo de Correa (Correa et al., 1991) observaron un 19% de

prevalencia de cepas de P. aeruginosa procedentes de vegetales frescos recogidos en un

hospital oncológico, habiéndolos desinfectado previamente con hipoclorito al 1%

(Kominos et al., 1972).

Figura 2. Rango funcional y ambiental del género Pseudomonas spp. (Silby et al., 2011).

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Las especies de este género presentan la capacidad de producir colonias de distinta

morfología y/o pigmentos. Un ejemplo es el fenotipo mucoide que presentan algunas

especies, sobre todo en aislados de P. aeruginosa de muestras de pacientes con fibrosis

quística. Por otro lado, presentan la capacidad de formar biofilm tanto en superficies

biológicas como fómites, un mecanismo que les proporciona una importante ventaja

frente a la acción de los antibióticos y otras presiones medioambientales.

Algunas especies de Pseudomonas presentan la capacidad de producir pigmentos

como mecanismo de virulencia. Estos pigmentos son fluorescentes bajo luz ultravioleta

de longitud de onda baja (254 nm), sobre todo cuando crecen en medios con bajo

contenido en hierro. El pigmento fluorescente más frecuente es la pioverdina, que

proporciona un color amarillo-verdoso. La piocianina, por otro lado, es un pigmento no

fluorescente de color azul-verdoso producido por la mayoría de cepas de P. aeruginosa;

la piorrubina, de color rojo similar al óxido; la oxiclororafina, de color naranja

encontrado en P. clororaphis y la clororafina, de color verde, descrito también en

P. clororaphis. Muchos de estos pigmentos actúan como sideróforos en los sistemas

bacterianos de captación de hierro (Meyer et al., 2002).

El principal patógeno de la familia Pseudomonadaceae es P. aeruginosa, responsable

de múltiples infecciones nosocomiales graves, como neumonía, infecciones del tracto

urinario o sepsis (Lister et al., 2009; Lee et al., 2013). Aunque las especies P. putida,

P. stutzeri, P. fluorescens, P. mendocina o P. fulva también son responsables de infecciones

en humanos (Nseir et al., 2011; Liu et al., 2014; Hardjo Lugito et al., 2015; Liu et al., 2015),

pueden encontrarse en el medioambiente. Asimismo, también se han dado casos clínicos

aislados, como el caso de una sepsis causada por la especie P. oryzihabitans (Owusu et

al., 2017), especie que ha sido descrita como saprófita, aislada normalmente en cultivos

de arroz, suelos y aguas estancadas (Silva, 2015). Por otro lado, este género no solo

infecta al ser humano, sino también es capaz de producir infecciones en plantas (P.

syringae) y/o insectos (P. entomophila) (Silby et al., 2011).

Sin embargo, también existen especies con potencial biotecnológico. Es el caso de

P. putida, y sus propiedades biodegradativas. Su genoma suele ser algo más grande que

el de otras especies (6 Mb), y como su género indica, es capaz de vivir en múltiples

ambientes. Esta especie bacteriana tiene la propiedad de sintetizar y/o degradar una

amplia variedad de compuestos metabólicos que posteriormente pueden servir en el

ámbito biotecnológico o agrario (Silby et al., 2011). De igual manera ocurre con la especie

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P. fluorescens, estudiada por sus propiedades que llevan al control del crecimiento de

algunas plantas (Haas & Défago, 2005).

Los estudios de poblaciones microbianas se han centrado durante los últimos años en

comprender la evolución y epidemiología de las enfermedades infecciosas, estudiando

para ello los patógenos responsables. Sin embargo, son escasos los estudios

epidemiológicos sobre el género Pseudomonas en muestras no clínicas (Levin et al., 1999;

Spratt & Maiden 1999).

1.1 Pseudomonas aeruginosa

La especie más importante de este género bacteriano es P. aeruginosa. Esta bacteria

fue aislada por primera vez en 1872 por Schroeter, a partir de muestras ambientales

(Palleroni, 1984). Debido a que algunas de sus colonias presentan una pigmentación de

color azul-verdoso, la denominación de la especie deriva de la palabra “aerugo” que

significa “óxido de cobre” y “osus”, adjetivo que indica abundancia (Viedma et al., 2012).

P. aeruginosa es un bacilo Gram negativo aerobio, catalasa y oxidasa positiva, no

fermentadora de lactosa y glucosa y metabólicamente versátil, capaz de crecer a

temperaturas de entre 4°C y 42°C. Por otro lado, es bien conocida por presentar un

genoma adaptativo, de entre 5,5 y 7 Mb, el cual le permite colonizar una amplia variedad

de nichos ecológicos (Freschi et al., 2015), como suelos, hábitats marinos y plantas. Sin

embargo, la capacidad de crecer en lugares húmedos con nutrientes mínimos, hace que

sea un problema importante a nivel hospitalario y alimentario. Puede ser causa de

infecciones relacionadas con instrumental quirúrgico, como catéteres, estetoscopios,

drenajes, etc., al que se adhiere formando un biofilm difícil de eliminar (Lister et al.,

2009). Es capaz de migrar por el ambiente y llegar a causar infecciones tanto en el ser

humano, como en animales, ya sean salvajes o domésticos (Pirnay, 2009). En este caso,

puede causar otitis, infecciones del tracto urinario en perros, mastitis en ganado vacuno,

endometritis en caballos y neumonía hemorrágica en visones o zorros (Kidd et al., 2011;

Salomonsen et al., 2013). Además, también se puede encontrar fuera del ambiente

clínico, como en piscinas, tubos de agua caliente, líquido de lentillas o cosméticos (Lister

et al., 2009; Abidi et al., 2013). Por otro lado, esta especie bacteriana no suele encontrarse

en la microbiota de individuos sanos o animales, pero el tracto gastrointestinal es el lugar

de colonización más común, entre un 2,6 a 24% de prevalencia, seguido de la piel, faringe,

fosas nasales o axilas, con una tasa de detección que oscila entre el 2 y el 10% (Lister et

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al., 2009; Estepa et al., 2014; Valenza et al., 2015). Sin embargo, la tasa de colonización

aumenta en individuos inmunosuprimidos u hospitalizados, particularmente aquellos

que pasan largos periodos de hospitalización. Por otro lado, debemos reconocer que las

cepas no clínicas de P. aeruginosa procedentes de animales y ambiente han tenido mucha

menos atención en comparación con las clínicas, de ahí que no se hayan hecho grandes

análisis genómicos de éstas (Szmolka et al., 2012).

La colonia típica suele ser alargada y plana con el centro elevado, aunque existen

numerosas variantes morfológicas (sobre todo cuando crecen formando biofilm),

después de que dichas cepas hayan estado expuestas a estrés medioambiental, por la

presencia de antibióticos, o durante infecciones crónicas de las vías respiratorias.

Además, el cultivo presenta un olor característico a uva (Henry & Speert, 2011). Las

variantes de la morfología colonial presentan además alteraciones fenotípicas respecto

a la resistencia a antibióticos, movilidad, expresión de genes de virulencia, adherencia y

formación de biofilm. La generación de estas variantes contribuye a la persistencia y

éxito como patógeno de P. aeruginosa. Por otro lado, un fenotipo comúnmente observado

es el mucoide, como consecuencia de la sobreproducción del polisacárido alginato, sobre

todo en aislados procedentes de muestras de vías respiratorias de pacientes con fibrosis

quística, y se correlaciona con las infecciones crónicas en estos pacientes (May et al.,

1991).

P. aeruginosa presenta dos características muy importantes, que hacen de esta

bacteria un patógeno peligroso: la resistencia intrínseca a antibióticos, y la producción

de mecanismos de virulencia. Esta especie presenta una elevada resistencia intrínseca a

varias familias de antibióticos y una extraordinaria capacidad de adquirir nuevos

mecanismos de resistencia, tanto por mutaciones cromosómicas como por transferencia

horizontal. Es por esta razón que es muy complicado encontrar alternativas terapéuticas

(Juan & Oliver, 2010). Por otro lado, tiene la capacidad de expresar y producir distintos

factores de virulencia, como mecanismos asociados a células (lipopolisacáridos, pili o

flagelos) o factores de secreción (elastasas, proteasas, exotoxinas o exopolisacáridos),

entre otros. Algunos de estos mecanismos se regulan gracias a un mecanismo de

densidad celular llamado Quorum Sensing (QS), responsable de la coordinación de genes

de virulencia, entre otros numerosos genes, los cuales pueden servir como dianas para

nuevos tratamientos antibacterianos (Balasubramanian et al., 2012). Asimismo, cabe

destacar que el tipo de infección que puede causar P. aeruginosa (aguda/crónica), es

independiente de su genotipo, pero está relacionado con el huésped y el estilo que adopta

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la bacteria en el momento de la colonización. Así, en infecciones agudas predomina un

estilo planctónico, mientras que, durante las infecciones crónicas, desempeña un papel

importante el estilo de vida sésil (Valentini et al., 2018).

2. Resistencia a los antibióticos

Un Antibiótico es una sustancia química producida por un microorganismo, que

desarrolla una actividad antimicrobiana, y puede ser natural o semisintético. Un

Antimicrobiano, es un término que abarca aquellos compuestos obtenidos de forma

natural o biosintética, así como los diseñados totalmente en el laboratorio (Paredes &

Roca, 2004). Asimismo, para aclarar conceptos, en este estudio se hablará de antibióticos

para referirse a ambos compuestos. Por otro lado, se denomina Resistencia a

Antibióticos (AMR) a la capacidad que presentan los microorganismos de resistir a la

acción de uno o más agentes antimicrobianos. El aumento de resistencia a estos

compuestos se está observando a nivel mundial.

Las enfermedades infecciosas son una importante causa de mortalidad a nivel global,

y desde que se descubrió la penicilina en 1928, se han ido descubriendo y sintetizando

nuevos antibióticos, como tratamiento para estas enfermedades. Sin embargo, el

aumento de su uso y abuso, tanto a nivel clínico como en agricultura y veterinaria, tanto

con fines terapéuticos o profilácticos, o como promotores de crecimiento (práctica

prohibida en la Unión Europea desde 2006), ha provocado que la resistencia a

antibióticos se haya convertido en un problema emergente a nivel mundial. Esta acción

es una importante amenaza para la salud pública y la seguridad del paciente, lo que

conlleva a un aumento de los costes y fallos en los tratamientos. La Organización Mundial

de la Salud (OMS), así como otras organizaciones, estimaron que las infecciones causadas

por bacterias resistentes podrían causar la muerte de cerca de 10 millones de personas

en el año 2050, superando incluso las muertes por cáncer (O’Niell, 2014. Review on

Antimicrobial Resistance, 2014).

En el entorno hospitalario, la resistencia a los antibióticos es un tema muy delicado,

sobre todo considerando las infecciones nosocomiales. Este problema puede acarrear un

aumento de la morbi- y mortalidad, diagnósticos erróneos y un incremento de los costes

terapéuticos. La Sociedad Americana de Enfermedades Infecciosas empezó a referirse a

aquellos patógenos responsables de enfermedades nosocomiales como patógenos

ESKAPE. Éste es un acrónimo que recoge las especies bacterianas de importancia clínica:

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Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter

baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter (Santajit & Indrawattana, 2016),

caracterizadas por poseer importantes mecanismos de resistencia. A raíz de esta

temática, años atrás, el ECDC y el Centro para la Prevención y el Control de Enfermedades

(CDC) decidieron crear una nomenclatura para estandarizar las categorías dentro del

nivel de resistencia presentado por algunas bacterias, como organismos MDR

(multirresistentes), XDR (extensivamente resistentes) y PDR (panrresistentes)

(Magiorakos et al., 2012). Los expertos decidieron aplicar estas definiciones para una

serie de bacterias concretas, S. aureus, Enterococcus spp., Enterobacteriaceae,

P. aeruginosa y A. baumanii, algunas englobadas en los patógenos ESKAPE. Las

definiciones son las siguientes:

MDR: microorganismo que no presenta sensibilidad a uno o más antibióticos dentro

de tres o más categorías antimicrobianas.

XDR: microorganismo que no presenta sensibilidad a uno o más antibióticos en todas

excepto en dos o menos categorías antimicrobianas.

PDR: microorganismo que no presenta sensibilidad a ninguno de los antibióticos

empleados.

La Tabla 1 presenta las categorías antimicrobianas descritas y los antibióticos

empleados en el tratamiento de P. aeruginosa, para llevar a cabo su clasificación.

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Tabla 1. Categorías antimicrobianas y antibióticos empleados para definir los

microorganismos MDR, XDR y PDR en P. aeruginosa (Magiorakos et al., 2012).

Categoría antimicrobiana Agente antimicrobiano

Aminoglucósidos Gentamicina

Tobramicina

Amikacina

Netilmicina

Carbapenémicos antipseudomónicos Imipenem

Meropenem

Doripenem

Cefalosporinas antipseudomónicas Ceftazidima

Cefepime

Fluoroquinolonas antipseudomónicas Ciprofloxacino

Levofloxacino

Penicilinas antipseudomónicas + inhibidores de

beta-lactamasas

Ticarcilina-ácido clavulánico

Piperacilina-tazobactam

Monobactámicos Aztreonam

Ácidos fosfónicos Fosfomicina

Polimixinas Colistina

Polimixina B

A comienzos del 2017, la OMS publicó una lista con las bacterias más prioritarias en

la búsqueda de nuevos antibióticos y tratamientos para combatirlas. Dividió la lista en

tres categorías: Prioridad 1 (crítica), 2 (elevada) y 3 (media). La bacteria P. aeruginosa

resistente a carbapenémicos figura en el apartado de Prioridad 1, por debajo de

A. baumanii (WHO, 2017). Por otro lado, el ECDC publicó los últimos datos de resistencia

a antibióticos en P. aeruginosa en Europa. El 13,7% de los aislados presentan resistencia

a al menos tres categorías antimicrobianas, mientras que el 5,5% presenta resistencia a

todos los antibióticos antipseudomónicos (ECDC, 2016). La Figura 3 muestra la

resistencia a distintas categorías antimicrobianas de P. aeruginosa en Europa en 2016.

Figura 3. Distribución de resistencia a distintas familias de antimicrobianos en P. aeruginosa en 2016. A, carbapenémicos; B, ceftazidima; C,

piperacilina-tazobactam; D, aminoglucósidos; E, fluoroquinolonas (ECDC, 2016).

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2.1 Mecanismos de acción a los antibióticos

De manera general, los antibióticos se clasificaron según el efecto que ejercían sobre

los microorganismos en bactericidas, que ejercen una acción letal para la bacteria, y

bacteriostáticos, que inhiben el crecimiento bacteriano, de forma que cuando se

suspende el tratamiento, la bacteria podría volver a proliferar. Sin embargo, un

antibiótico puede llegar a tener los dos efectos, dependiendo de la concentración que se

alcance en la diana terapéutica o la afinidad que tenga hacia ésta. Así, los beta-lactámicos

y aminoglucósidos son bactericidas; macrólidos, tetraciclinas y cloranfenicol presentan

efecto bacteriostático; mientras que fluoroquinolonas y algunos aminoglucósidos son

concentración-dependiente (Paredes & Roca, 2004; Calvo & Martínez-Martínez, 2009;

Kapoor et al., 2017).

Desde el punto de vista molecular, los antibióticos ejercen su efecto y acción en las

siguientes estructuras o funciones bacterianas (Figura 4):

Figura 4. Mecanismos de acción de los antibióticos en la célula bacteriana.

Inhibición de la síntesis de pared bacteriana: la ausencia de esta estructura

condiciona la destrucción del microorganismo. Los antibióticos ejercen su acción

cuando la bacteria se encuentra en estado de crecimiento activo. La síntesis de la

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pared celular se desarrolla en tres etapas, y los compuestos pueden actuar en cada

una de ellas: etapa citoplasmática, donde se sintetizan los precursores del

peptidoglicano; el transporte a través de la membrana, y la organización final de la

estructura del peptidoglicano, que se desarrolla en la parte más externa de la pared.

Los beta-lactámicos son un ejemplo.

Alteración de la membrana citoplasmática: desempeña un papel muy importante

en la difusión y transporte activo de moléculas. Los compuestos que alteran su

estructura modifican la permeabilidad de la membrana, inhibiendo el paso de iones o

moléculas clave para el metabolismo celular. Las polimixinas son un ejemplo.

Inhibición de la síntesis proteica: ésta puede darse en las distintas fases de la

síntesis de proteínas. Estos compuestos pueden unirse a las subunidades 30S y 50S

de los ribosomas, como los aminoglucósidos, tetraciclinas, cloranfenicol, macrólidos

y oxazolidinonas.

Bloqueo de la síntesis de ácidos nucleicos: podría inhibirse la replicación del DNA,

la transcripción, o la síntesis de metabolitos esenciales para este paso. Las quinolonas,

por ejemplo, inhiben la DNA girasa (topoisomerasa II) y la topoisomerasa IV. Otro

ejemplo es la rifampicina, que inhibe la transcripción.

Bloqueo de mecanismos de resistencia: son los llamados inhibidores de beta-

lactamasas. Carecen de actividad, pero se unen a estas enzimas bloqueando su acción

sobre los antibióticos. Son ejemplos el ácido clavulánico, tazobactam y sulbactam.

Bloqueo de la síntesis de factores metabólicos: como las sulfamidas, que inhiben

la incorporación de ácido paraaminobenzoico (PABA), evitando así la síntesis de ácido

fólico.

Es de relevante importancia que las bacterias Gram negativas muestran una mayor

resistencia que las Gram positivas, debido a que presentan una membrana externa

rodeando la pared de peptidoglicano. Esta membrana es una importante barrera frente

a algunos antibióticos, donde además se encuentran distintas porinas que permiten la

difusión pasiva de algunas micromoléculas (Calvo &