Centro Federal de Educação Tecnológica de Química de Nilópolis – Unidade Rio de Janeiro

Relatório de Microbiologia: Manobras Assépticas e Manipulação de

Microrganismos

Rio de Janeiro, 28 de março de 2008.Alunas: Adriana de Menezes Lima N°: 01.

Elizana de Azevedo Silva N°: 06. Thays Cristine dos Santos Vieira N°: 15.

Turma: QM 171.Professoras: Carolina e Lidiane.Disciplina: Microbiologia.

Manobras Assépticas e Manipulação de Microrganismos

Introdução Teórica:

Na natureza encontramos várias espécies de microrganismos (bactérias, fungos, algas e protozoários) convivendo no mesmo ambiente. Para estudar as propriedades de um determinado microrganismo em particular, deve-se primeiramente isolá-lo em cultura pura, ou seja, uma cultura isenta de todos os demais tipos de organismos, onde todas as células na população sejam idênticas (originárias de uma mesma célula parental). Então, algumas manobras assépticas tiveram que ser utilizadas nesse tipo de laboratório, que foram as seguintes: ao chegar ao laboratório o ambiente em que se vai trabalhar deve estar o mais limpo possível, quanto mais livre de microrganismos, melhor para a obtenção de um bom resultado no experimento, para garantir um ambientes limpo deve primeiramente lavar as mãos com detergente e álcool, após lavar as mãos e incluindo também os antebraços, deve-se limpar toda a bancada, onde será feito o trabalho, com álcool preferencialmente iodado.

A presença de um bico de bunsen na bancada é, também, indispensável para criar uma zona estéril onde na qual será efetuado todo o experimento, para diminuir ainda mais o risco de contaminação do nosso trabalho.

E, além de seguirmos as manobras assépticas devemos preparar meios de cultura ideais para atendermos a necessidade de reprodução de nossos microrganismos, pois, assim como nós, eles precisam de condições apropriadas pra sua vida, crescimento e reprodução. E os ingredientes necessários para o crescimento de microrganismos podem ser supridos por um sistema vivo, como um hospedeiro animal ou vegetal, uma cultura de células, ou por uma mistura de todos os nutrientes requeridos juntos em um sistema artificial, denominado meio de cultura. Os meios de cultura contém os materiais nutrientes para o cultivos dos diferentes microrganismos. Estes meios podem ser preparados no próprio laboratório com pós desidratados, ou adquiridos prontos no comércio em placas de Petri ou tubos de ensaio. Estes meios podem ser em caldo (líquido) ou ágar (sólido). Os meios líquidos são úteis para a obtenção de relativa grande biomassa de microrganismos e revelação de provas bioquímicas, mas não permitem a separação de dois ou mais microrganismos de espécies diferentes em uma população mista, não possibilitando a observação de algumas características específicas dos microrganismos, como a morfologia de suas colônias. Fez-se para o nosso microrganismo, que é a bactéria Staphylococcus aureus, então, esses dois tipos de meios. E um deles pode ser descrito através do esquema abaixo:

Técnica de esgotamento por estrias: através de uma alça ou agulha de semeadura esgota-se o material por meio de estrias na superfície do meio.

Nosso microrganismo, a bactéria Staphylococcus aureus é uma das espécies patogénicas mais comum juntamente com a Escherichia coli, causando, por exemplo, doenças como foliculite, osteomielite e endorcadite. Ela faz parte do gênero Estafilococos (gr. staphyle, uva) que são cocos Gram-positivos, imóveis,agrupados em massas irregulares ou em cachos de uva. Aeróbios ou anaeróbios facultativos, catalase positivos. Fermentam a glicose com produção de ácido, tanto em aerobiose, como em anaerobiose, e nisso se diferenciam dos microrganismos do gênero Micrococcus, que só fermentam em aerobiose.

E, atualmente esse gênero é composto por cerca de 27 espécies, sendo algumas freqüentemente associadas a uma ampla variedade de infecções decaráter oportunista, em seres humanos e animais. As principais espécies de estafilococos encontrados em seres humanos são os Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus saprophyticus. O S. epidermidis é encontrada primariamente como residente da pele, tendo um baixo potencial patogênico, assim como o S. saprophyticus, que faz parte da microbiota normal da região periuretral do homem e da mulher e da pele. Ao contrário, o S. aureus é um patógeno em potencial e pode ser encontrado na região da nasofaringe e também nas fossas nasais.

Objetivos:

Reconhecer a importância da utilização de manobras assépticas na manipulação de microrganismos, no preparo do meio de cultura para o crescimento dos mesmos.

Materiais e Reagentes:

6 Placas de Petri5 Tubos de Ensaio com Tampa1 Erlenmeyer (250 mL)1 Becher (500 mL)1 Alça Bacteriológica1 Pipeta (5 mL)4 Cotonetes Estéreis Bico de BunsenTela de AmiantoTripé

Ágar Nutritivo

Caldo Nutritivo- extrato de carne: 3,0 g/L- peptona de carne: 5,0 g/L- pH a 25°C: 7,0

Staphylococcus aureus

Procedimentos:

Manobras Assépticas:

Primeiramente, higienizaram-se as mãos e a bancada com álcool iodado, a fim de reduzir a carga microbiana do local de trabalho. E trabalhou-se, todo o tempo, nas proximidades do Bico de Bunsen, na chamada zona estéril.

E, para comprovar a teoria de que estamos circundados por microrganismos, fez-se uma experiência da seguinte forma: pegou-se uma placa de petri como meio de cultivo estéril e dividiu-se a área da placa em quatro partes. Então, com o cotonete estéril, recolheu-se o material microbiológico do jaleco, do perfex, do couro cabeludo e da saliva; paras que servissem, separadamente, como inóculos nas quatro áreas do meio de cultura.

Preparo dos Meios de Cultura:

Meio sólido – Pesou-se ...g do meio ágar nutritivo em um erlenmeyer de 250 mL. Dilui-se essa massa em 100 mL de água destilada. Aqueceu-se o sistema em um bico de bunsen para melhor solubilização do ágar em água. Esterilizou-se o meio, a partir disso, distribuiu-se assepticamente o ágar nutritivo em 5 placas de petri, já esterilizadas. Incubou-se as placas para confirmação de esterilidade.

Meio líquido – Pesou-se 0,2g do meio caldo nutritivo em um becher de 500 mL. Dilui-se essa massa em 25 mL de água destilada. Aqueceu-se o sistema em um bico de bunsen para que ocorresse a solubilização do meio. Com o auxilio de uma pipeta, distribuiu-se 5 mL de meio em cada tubo de ensaio. Tampou-se apropriadamente os tubos. Esterilizou-se os meios em auto-clave.

Inoculação dos Meios de Cultura Puros:

Utilizou-se o microrganismo Staphylococcus aureus para inocular tanto o meio sólido, quanto o meio liquido.

Meio sólido – Trabalhou-se na zona estéril. Flambou-se ao rubro uma alça bacteriológica. Abriu-se o tubo de ensaio que continha o microrganismo, flambou-se a boca do mesmo. Com a alça bacteriológica, retirou-se uma alíquota do meio que continha os microrganismos. Flambou-se novamente a boca do tubo e o tampou. Abriu-se a placa de petri, aplicou-se a carga de microrganismo em uma pequena região da placa. Flambou-se a alça novamente para diminuir a carga microbiana. Com essa mesma alça, espalhou-se, com movimentos de zigue-zague, a bactéria pela superfície do meio. Incubou-se as placas em estufa.

Meio líquido – Flambou-se ao rubro uma alça bacteriológica. Abriu-se o tubo de ensaio que continha Staphylococcus aureus e flambou-se a boca do mesmo. Com o auxilio da alça bacteriológica, retirou-se essa bactéria. Pegou-se o tubo com o meio de cultura puro, flambou-se a boca do tubo e transferiu-se a carga bacteriológica para esse recipiente. Flambou-se novamente a boca do tubo e o fechou. Incubou-se as placas em estufa.

Após uma semana de incubação, observou-se o crescimento das colônias.

Resultados e Discussão

1- Resultados de Inoculação de Microorganismos Existentes no:

a) Jaleco, Perfex e Saliva – As colônias ficaram muito parecidas e, aparentemente, estavam misturadas. E ficaram com aspecto de alguns rajados amarelados, manchas amarelo claro-bege.

b) Cabelo - Essas colônias ficaram com um aspecto de pontos amarelados de forma, aparentemente, definida.

2- Resultados dos Meios de Cultura Preparados Através de Manobras Assépticas:

Preparou-se, como já citado, cinco placas com meio de cultura e, após uma semana, obteve-se o seguinte resultado: duas placas não foram contaminadas e três placas foram contaminadas.

As placas que foram contaminadas continham regiões esbranquiçadas, que representam as colônias de microorganismos que não foram identificados.

3- Resultados da Prática de Manipulação de Microorganismos:

Para essa prática, como já descrito, usaram-se as duas placas não contaminadas da prática, a cima citada, e mais duas placas não contaminadas, cedidas pela professora, contendo o mesmo meio de cultura das que foram preparadas pelo grupo; e mais cinco tubos de ensaio, contendo meio líquido. Esses, meios foram preparados para inoculação da bactéria Staphylococcus aureus. Obtiveram-se dois resultados perto do satisfatório, como mostrados nas duas últimas placas abaixo, e houve crescimento do microrganismo, satisfatoriamente, em todos os cinco tubos de ensaio.

Nas fotos acima mostradas, pode-se perceber que na primeira placa de petri ocorreu apenas uma “aglomeração” das colônias da bactéria, pois, esses microrganismos não foram bem dispersos pelo meio de cultura, como o ocorrido na terceira placa de petri. E, obteve-se, na segunda, placa um resultado pouco satisfatório, como também, na terceira placa de petri. Pois, naquele caso, os microorganismos poderiam ter sido melhor espalhados e ocupado, assim, uma maior área no meio de cultura e de uma forma mais isolada(no caso da terceira placa de petri); para atingirem o objetivo e o ideal da prática.

Para resolver a falha cometida na terceira placa de petri, a quantidade de microrganismos inoculados no meio deveria ser menor e eles tinham que ser distribuídos de forma mais organizada na placa, e, com isso, evitar a aglomeração de colônias, que não ficaram isoladas como o necessário.

É importante dizer que esses isolamentos de colônias, no meio de cultura, fizeram-se necessários para se ter certeza de que naquele meio só ocorreu o crescimento do microrganismo de interesse.

Já nas fotos dos tubos de ensaio, observam-se, no fundo dos tubos, precipitados brancos, que são os microrganismos que cresceram nesse meio, satisfatoriamente.

As fotos mostradas a seguir servem de exemplo para um correto isolamento de microrganismos.

Macromorfologia de cinco morfotipos de bactérias isoladas de espinheira-santa - fotos retiradas do site: genetica.bio.ufpr.br/posgraduacao/teses/pileggi.pdf

Conclusão:

Sendo, assim, com os resultados obtidos, pode-se concluir que estamos cercados por microrganismos que podem vir a afetar, negativamente, nossos experimentos e materiais. E, essa contaminação, se não previamente diagnosticada, poderá causar, uma falsa análise, um falso laudo. Por isso, também, é necessário obedecer todas aquelas manobras assépticas citadas.

Bibliografia:

www.fop.unicamp.br/microbiologia/aulas/estafilococos.pdf - acessado em 25/03/2008

http://www.fop.unicamp.br/microbiologia/aulas/isolamento.pdf - acessado em 27/03/2008