relatório hibridização in situ
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Relatório de disciplinaTRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
Centro Tecnológico
Programa de Pós Graduação em Engenharia Ambiental
Biodinâmica Ambiental
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU (FISH)
Gustavo Tonon
Raphael Zanelato Barbosa
Florianópolis - SC
2015
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1 INTRODUÇÃOProblemas ambientais estão cada vez mais em destaque atualmente.
Desenvolvimento tecnológico aliado a crescimento populacional acarreta em
maior demanda em recursos naturais, que quando mal utilizados podem vir a
ocasionar impactos negativos. Nesse contexto, há a necessidade de que se
criem mecanismos de controle e minimização, como leis e normas ambientais,
e tecnologias sustentáveis.
Quando considerado manutenção da qualidade dos recursos hídricos
surgem os sistemas de tratamento de esgoto. Grande parte dos sistemas
instalados ao redor do mundo utilizam de processos biológicos, e dentre os
parâmetros operacionais comumente analisados para o controle de eficiência
em tratamento do efluente está a análise da microfauna envolvida.
Os principais tipos de microrganismos envolvidos no tratamento de
efluentes são bactérias, algas, protozoários e metazoários, sendo que a maior
porcentagem é de bactérias. Dentro do domínio das bactérias existem
diferentes gêneros que desempenham diferentes funções nos diversos tipos de
tratamento. Como exemplos podemos citar as nitrosomonas que
desempenham o papel de nitrificação em ambientes aeróbios.
Em questões de engenharia, muito se desenvolveu nos últimos anos,
porém em relação a estrutura e função das comunidades microbiológicas
pouco se sabe (Wagner e Amman,1997). Dessa forma, a aproximadamente 30
anos atrás surgiu a técnica fluorescence in situ hybridization (FISH). É uma
técnica de biologia molecular eficaz para identificação de microorganismos que
se tornou muito popular em tratamento de esgoto.
2 BIOLOGIA MOLECULAR A biologia molecular começou a ser estudada em meados dos anos
50. Ela apresenta preocupação peculiar com o estudo das características
genéticas passadas hereditariamente. A genética também estuda dessa forma,
mas em um nível celular, enquanto que a biologia molecular é um estudo em
nível molecular, com foco especial no estudo da estrutura e função do material
genético e seus produtos de expressão, as proteínas. Ela investiga as
interações entre os diversos sistemas celulares, incluindo a relação
entre DNA, RNA e síntese proteica. Podendo estudar mais a fundo essas
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características, a biologia molecular tem grande importância na fabricação de
remédios e outras soluções para saúde.
A biologia molecular tem sido amplamente utilizada como ferramenta
de caracterização microbiológica, utilizando técnicas qualitativas e quantitativas
para a identificação de espécies específicas ou grupos funcionais relacionados
à remoção de poluentes.
Algumas dessas técnicas são a PCR ou Polymerase Chain Reaction,
que é uma técnica de grande versatilidade que permite obter múltiplas cópias
de um segmento de DNA. O PCR também é usado para introduzir locais de
restrição e mutações pontuais ou para identificar um fragmento particular de
DNA numa biblioteca de cDNA;
A DGGE ou eletroforese em gel com gradiente desnaturante, no qual
DNA, RNA e proteínas são separados segundo o seu tamanho, numa matriz
usando um campo eléctrico aplicado. O DNA ou o RNA é separado, e faz com
que a amostra migre través de um gel de agarose. As proteínas são separadas
de acordo com o seu tamanho, usando electroforese em gel de acrilamida ou
podem ser separadas segundo a sua carga eléctrica usando focagem
isoeléctrica (MUYZER, 1999);
Segundo Carvalho (2010), o método de sequenciamento de DNA
consiste na adição de didesoxirribonucleotídeos. Didesoxirribonucleotídeos são
nucleotídeos modificados e que impedem o crescimento de um fragmento de
DNA em replicação pela DNA polimerase após sua adição. Já o
pirosequenciamento, consiste na captação da emissão de luz causada pela
adição de uma luciferase, acoplada à polimerização do DNA previamente
fragmentado e aderido a microesferas, com o uso de sequências adaptadoras;
O método de FISH ou hibridização in situ, que usa sondas
fluorescentes complementares de sequências específicas de RNA ribossômico
(RNAr) das células-alvo. Esse último é um método histoquímico que permite a
visualização, identificação, enumeração e localização simultânea de micro-
organismos in situ, sem a necessidade de cultivos celulares (NISHIO, 2010).
3 ASPECTOS GERAIS DO FISHA aplicação de métodos moleculares como o FISH, clonagem, DGGE
tem levado a um maior entendimento de processos microbiológicos que
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ocorrem em um reator biológico. Os métodos permitem a análise da dinâmica
populacional e a identificação de espécies responsáveis pela degradação do
sistema de tratamento de esgoto (AKARSUBASI et al., 2005).
As análises de identificação direta e estudo da diversidade microbiana
são normalmente realizadas no RNAr 16S. A análise do RNAr 16S é o método
mais utilizado para estudo filogenético de microrganismos pois este gene é
encontrado em todas as células vivas, ocorre em elevado número de cópias e é
muito estável (NEUFELD; MOHN, 2006).
FISH é um método histoquímico que permite a identificação de
microorganismos in situ . É um método que consiste na visualização direta em
microscópios ópticos fluorescentes. Também permite que sequências de
ácidos nucleicos sejam examinadas no interior de células sem alterar sua
morfologia ou integridade de seus compartimentos. Com isso, há a combinação
da precisão da genética molecular com a informação visual do microscópio
ótico (AMANN; FUCHS; BEHRENS, 2001).
O principio básico do FISH é o alinhamento básico da sonda com a
sequência alvo, para a posterior observação em microscopio epifluorescente.
Entende-se por sonda, uma sequência de oligonucleotídeos complementares e
específicos marcados com substâncias fluorescentes os quais se anelarão ao
alvo. Há duas possíveis marcações das sondas, a direta e a indireta. O
processo mais utilizado, por ser mais rápido e de fácil execução, é a marcação
direta. Um ou mais fluorocromos são diretamente conjugados às sondas que se
ligam nas regiões 5’ ou 3’ do alvo. A marcação indireta pode aumentar a
sensibilidade ligando uma molécula de digoxigenina à sonda (AMANN; FUCHS;
BEHRENS, 2001).
A técnica pode ser utilizada para identificar uma célula individualmente,
entretanto a identificação de somente uma célula não é comum. Amman,
Ludwig e Schleifer (1995) a visualização de menos de 103 células por cm2 pode
se tornar tendiosa mostrando a necessidade de concentrar a amostra para
análise. Abaixo está uma imagem representativa de como é a visualização das
colônias pelo microscópio.
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Figura 1-Células hibridizadas para análise de bactérias em um RBSG com as sondas
NSO190(Todas BOA beta) (A), NEU (Nitrossomonas sp.)(B) e PAO651(Accumulibacter)(C).
O FISH apresenta vantagem de ser uma técnica rápida, simples e
acurada de detecção de bactérias e archeas. Além disso, outra vantagem da
técnica é que o RNAr 16S contem informações da relação entre os
microrganismos epodem ser distinguidas de diferentes populações
independente da atividade. Porém, uma de suas limitações é a não
acessibilidade de todas as regiões alvos do RNAr 16S às sondas Amman,
Ludwig e Schleifer (1995), e também as sondas falham em emitir uma
intensidade detectável de fluorescência.
4 PROCEDIMENTO DE FISH O procedimento de hibridização in situ é relativamente simples. As
amostras contendo os micro-organismos são fixadas para proteger o RNA da
degradação de RNAses endógenas e permeabilizadas com etanol 70% para
permitir que as sondas penetrem na célula. A etapa de hibridização dura
aproximadamente 4 horas, à 37ºC e em um incubador comum. Após a
hibridização é feita a lavagem para remoção do excesso de sondas. A amostra
é então analisada, utilizando um microscópio de fluorescência comum.
Utilizando um número maior de sondas no ensaio, assegura-se um alto nível de
sensibilidade e especificidade, minimizando a possibilidade de falsos negativos.
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CONLCUSÃO A hibridização in situ, tem uma grande variedade de aplicações dentro
de diferentes campos de investigação, como mapeamento genético, toxicologia
molecular, ecologia microbiana, diagnóstico de doenças e em estações de
tratamento de água. Apesar da alta especificidade e sensibilidade dessa
técnica, podem ocorrer erros, como os falsos-positivos, levando a resultados
equivocados. Assim sendo, ela deve ser analisada minuciosamente, realizando
testes prévios com amostras-controle positivas e negativas.
REFERENCIASARKASUBASI, A.T.; INCE,O.; KIRDAR,B.;OZ,N.A.; ORHON, D.; CURTIS, T.
P.; HEAD, I.M.;INCE, B. K. Effect of wastewater composition on archael
population diversisty. Water research, v.39, p.1576-1584, 2005.
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Figura 2 - Principais etapas da hibridização fluorescente in situ.
AMANN, R.; FUCHS, B. M.; BEHRENS, S. The identification of microorganisms
by fluorescence in situ hybridization. Current Opinion in Biotechnology, v. 12, p.
231-236, 2001.
AMANN, R. I.; LUDWIG, W.; SCHLEIFER, K.-H. Phylogenetic identification and
in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiological
Reviews, v. 59, n. 1, p. 143-169, 1995.
ASTBURY, W. T., Molecular Biology or Ultrastructural Biology, Department of
Biomolecular Structure, University of Leeds. Disponível em
http://www.nature.com/nature/journal/v190/n4781/abs/1901124a0.html
CARVALHO, M. C. da C. G., SILVA, D. C. G., Sequenciamento de DNA de
nova geração e suas aplicações na genômica de plantas. Cienc. Rural [online].
2010, vol.40, n.3, pp. 735-744. ISSN 0103-8478. Disponível em
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103-
84782010000300040&lng=pt&nrm=iso&tlng=pt
NEUFELD, J. D.; MOHN, W.W. Assessment of microbial phylogenetic diversity
based on environmental nucleic acids. In: STACKERBRANDT, E. (Ed.).
Molecular identification, systematics, and population structure of prokaryotes.
Heidelberg: Springer-Verlag, 2006. p. 220-259.
NEVES, S.M.N., GUEDES, R.M.C., Hibridização in situ fluorescente: princípios
básicos e perspectivas para o diagnóstico de doenças infecciosas em medicina
veterinária. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.79, n.4, p.627-632, dez., 2012.
NISHIO, S. R., Avaliação da comunidade microbiana procarionte através de
técnicas moleculares – FISH, PCR/DGGE e sequenciamento em sistemas
artificiais de redução de cargas: ênfase ao estudo de lagoa de estabilização
facultativa. Dissertação de Doutorado. São Paulo, 2010.
MUYZER, G. DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural
ecosystems. Netherlands Institute for Sea Research, 1999.
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WAGNER, M. AND AMANN, R. Molecular Techniques for Determining
Microbial Community Structures in Activated Sludge. IAWQ Scientific and
Technical Report , 1997.
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