Relatório Final do Projecto PIDDAC nº 842 / 2002

Influência da época do ano sobre a congelabilidade do sémen de bode da raça Serrana e a sua capacidade fertilizante in vivo e in vitro

Período 2002 – 2004

Responsável: João Pedro de Sousa Santa-Clara Barbas Equipa: AEM Horta, CM Marques, MC Baptista, MI Vasques, RD Mascarenhas, RM Pereira, SC, Gonçalves

Departamento de Reprodução Animal Estação Zootécnica Nacional

Instituto Nacional de Investigação Agrária e das Pescas

Vale de Santarém Março 2005

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Influência da época do ano sobre a congelabilidade do sémen de bode da raça Serrana e a sua

capacidade fertilizante in vivo e in vitro.

Relatório Final do Projecto PIDDAC nº 842, EZN – INIAP.

JP Barbas, AEM Horta, CM Marques, MC Baptista, MI Vasques, RD Mascarenhas, RM Pereira, SC Gonçalves

Equipa de Investigação

Código Nome Categoria ETI Total

8365 António Eduardo Monteiro Horta Inv Coord 0.60

14245 Carla Maria F.C.V. Marques Inv Aux 0.60

29480 João Pedro S. S-C. Barbas Inv Aux 0.75

47310 Maria da Conceição C. Baptista Inv Aux 0.60

56429 Maria Irene A. M. R. Vasques Inv Aux 0.60

72520 Ramiro Doutel Mascarenhas Inv Prin 0.45

73650 Rosa Maria L.N. Pereira Inv Aux 0.45

77240 Sandra Cavaco Gonçalves Inv Aux 0.60 Localização Este projecto foi realizado no Departamento de Fisiologia e Reprodução Animal da Estação Zootécnica Nacional localizada no Vale de Santarém. As IA decorreram em explorações de associações de criadores nos concelhos de Santarém, Rio Maior, Alcanena, Torres Novas e Lourinhã. Cooperação com outras instituições:

As acções de congelação de sémen de bode e fertilização “in vitro” de oócitos foram

efectuadas na Estação Zootécnica Nacional. As acções de IA com sémen refrigerado e congelado foram realizadas em efectivos de associados da ACORO (Associação de Criadores de Caprinos e Ovinos do Ribatejo e Oeste) e da ACRO (Associação de Criadores de Gado do Oeste). Cooperação com Faculdade de Medicina Veterinária - UTL, para optimização das técnicas de avaliação seminal in vitro.

Início : Janeiro de 2002 Fim: Dezembro de 2004

1. Objectivos

O objectivo deste projecto prende-se com o estudo da variação sazonal da produção e qualidade espermática do bode de raça Serrana e sua influência na congelabilidade do sémen. Esta influência sazonária será avaliada ao longo do ano com o objectivo de identificar as

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melhores épocas para proceder à congelação de sémen nesta raça caprina. Paralelamente serão comparados os resultados reprodutivos obtidos após inseminação artificial (IA) com sémen refrigerado e congelado na época reprodutiva tradicional (Primavera) e a capacidade fertilizante in vitro de sémen congelado utilizando oócitos de caprino, obtidos de ovários recolhidos no matadouro. Após identificação dos melhores períodos para a congelação do sémen de caprino, as IA com sémen congelado serão realizadas com o sémen de melhor qualidade. Sem o desenvolvimento da técnica de congelação de sémen e conhecimento das suas características qualitativas após o processo de congelação/descongelação, não poderá ser implementada com sucesso a utilização da técnica de IA com sémen congelado. Esta técnica é indispensável para facilitar o maneio reprodutivo dos rebanhos, a selecção, o melhoramento genético, a difusão do progresso genético e a conservação dos recursos genéticos nomeadamente sémen e embriões. A IA é também indispensável para a troca de material genético entre populações de cabras. O sucesso de um programa de IA depende de um indispensável conhecimento da tecnologia de recolha, processamento e armazenamento do sémen, bem como da identificação das épocas de melhor produção espermática. A utilização desta técnica permitirá aumentar a produção de leite, carne e pelo. Este projecto irá identificar as melhores épocas para proceder à congelação do sémen e permitir a utilização dos melhores ejaculados nos programas de IA. 2. Parâmetros seminais no sémen fresco e descongelado 2.1. Metodologia 2.1.1. Processamento do sémen fresco e congelado

As colheitas de sémen são efectuadas ao longo do ano utilizando o método de recolha com vagina artificial numa cabra ovariectomizada com estro induzido. Após a recolha, o sémen é colocado num banho-maria mantido a 30 ºC procedendo-se à sua imediata avaliação macroscópica (volume e cor) e microscópica, nomeadamente as mobilidades massais, a mobilidade individual (MI) classificada de acordo com a % de espermatozóides móveis com movimentos progressivos e rectílineos, a % de espermatozóides vivos e mortos e % de formas anormais referenciando a sua origem (cabeça, peça intermédia e cauda). A metodologia utilizada na avaliação destes parâmetros seminais encontra-se descrita detalhadamente em várias publicações (Barbas et al, 2001, 2002, 2004). Resumidamente a mobilidade massal é avaliada numa gota de sémen fresco puro sobre platina aquecida, sendo classificada numa escala de de 0 a 5 de acordo com o vigor dos movimentos de onda dos spz. A MI é classificada em valor percentual (0-100 %) numa gota de sémen diluído (1/100) em soro fisiológico. A % de spz vivos é determinada por contagem do nº de spz não corados cerca de 3-4 horas após a realização de um esfregaço utilizando como corante vital a eosina-nigrosina. O mesmo esfregaço é utilizado para contagem do nº de spz normais e anormais. Estes valores são expressos em valor percentual sendo as formas anormais referenciadas à sua origem nomeadamente cabeça, peça intermédia e cauda. A observação dos esfregaços e realizada com objectiva de imersão utilizado 1000 aumentos. A concentração é determinada no sémen diluído (1/400) por contagem do nº de spz/ ml, num espectrofotómetro calibrado para a espécie caprina utilizando um comprimento de onda 550 nanómetros.

2.1.2 Processamento e congelação de sémen

O processo de recolha e avaliação do sémen foi anteriormente descrito. Igualmente são destinados à congelação os ejaculados que em fresco possuam mobilidades massais ≥3, MI ≥ 65 % e concentrações > 2 mil milhões de spz/ml . O sémen recolhido é processado e congelado de

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acordo com o protocolo descrito por Evans e Maxwell (1990) e FAO (1993). Após a recolha, o sémen é suspenso numa solução de Krebs-Ringer-Phosphate (solução de lavagem) contendo glucose. A suspensão obtida será centrifugada para extracção do plasma seminal (lavagem). Torna-se conveniente fazer duas lavagens de plasma seminal.

Resumidamente a lavagem do plasma seminal inclui as seguintes etapas: a) Preparação da solução de Krebs-Ringer-Phosphate (FAO, 1993) na véspera da sua

utilização. b) Temperaturas de trabalho: A temperatura do laboratório de tecnologia do sémen é mantida

estabilizada a 25 ºC. Depois da recolha do sémen, o tubo colector é colocado num banho-maria à temperatura de 30 Cº. Seguidamente adiciona-se a solução de lavagem que é mantida à mesma temperatura. A 1ª, e a 2ª centrifugação e a adição da 2ª solução de lavagem são realizadas à temperatura ambiente (25 ºC). Após a 2ª centrifugação e eliminação do sobrenadante o diluidor de congelação mantido à temperatura ambiente é adicionado ao sémen de modo a obter a concentração espermática pretendida.

c) Diluição e centrifugação: Após a recolha do sémen determina-se a concentração espermática e o nº de spermatozóides totais do ejaculado obtido, multiplicando o volume pela concentração espermática. O ejaculado é diluído com a solução de lavagem (Krebs-Ringer-Phosphate) de modo a obter uma concentração de 400 milhões de espermatozóides/ml da suspensão a centrifugar. O tubo de recolha é colocado a centrifugar durante 15 minutos a 500-600 g. Depois da centrifugação o sobrenadante é retirado acrescentando-se igual volume de solução de lavagem. Seguidamente é efectuada nova centrifugação durante 15 minutos. O sobrenadante é retirado sendo adicionado o diluidor de congelação numa só etapa (Evans e Maxwell, 1990) de modo a obter uma concentração de 800 milhões de spz/ml, pois pretende-se a obtenção de doses de sémen com 200 milhões de spz totais.

d) Preparação para a congelação: Adiciona-se o volume de diluidor (preparado de véspera) de congelação (Evans e Maxwell, 1990) necessário para acertar a concentração de espermatozóides por dose utilizada na IA (200 milhões). Para efectuar a diluição numa só etapa, o sémen é diluído à temperatura de 30 ºC com o diluidor definitivo (congelação) que tem glicerol (6-8 %), o agente crioprotector mais adequado, e gema de ovo (3-4 %) como protectora da integridade das membranas (Evans e Maxwell, 1990). O diluidor de congelação contém tris e ácido cítrico para tamponização do diluidor, glucose como substracto energético e uma associação de antibióticos (penicilina-estreptomicina) para inibir o desenvolvimento microbiano.

e) Refrigeração do sémen destinado à congelação e respectivo processo - Após a diluição do sémen efectuada a 30 ºC, o sémen é armazenado em palhinhas (0,25 ml) tipo Cassou, de cores diferentes, de acordo com os bodes utilizados na mesma sessão de trabalho. Após o enchimento das palhinhas estas são introduzidas dentro de uma proveta (inserida num copo com água à mesma temperatura) colocada numa bancada de refrigeração mantida a 4 ºC onde irá decorrer a refrigeração gradual do sémen durante um tempo aproximado de 3,5-4 horas. Decorrida a refrigeração controla-se a % de espermatozóides móveis antes de iniciar o processo da congelação propriamente dito. Na congelação do sémen de carneiro e de bode o método de congelação em duas etapas não tem vantagens comparativamente à congelação realizada com uma só etapa, daí este ser preferencial, devido à simplicidade e menor manuseamento do sémen antes da congelação (Evans e Maxwell, 1990).

f) Congelação - A congelação das palhinhas é efectuada utilizando um equipamento designado por “Floating Semen Freezing Rack” (Minutub GnbH & Co, KG, Germany). Resumidamente este equipamento é composto por uma caixa de aço inoxidável com cerca de 1 m2, um “rack” duplo do mesmo material aonde são dispostas transversalmente as mini-palhinhas que está ligado a 4 flutuadores (2 de cada lado, unidos por uma barra transversal) que contêm várias aberturas permitindo a entrada do azoto líquido (vertido previamente na caixa metálica) e

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uma caixa de esferovite com cerca 95 x 49 x 35 cm onde é inserida esta estrutura. O processo de congelação devido à acção dos vapores de azoto líquido pode ser dividido nas seguintes etapas: 1) As palhinhas refrigeradas a 4 ºC são dispostas transversalmente no rack metálico através de pinças metálicas mantidas à mesma temperatura. É possível regular a altura das palhinhas relativamente ao nível de azoto líquido (vertido previamente na caixa metálica) afinando a altura de fixação do rack nas caixas flutuadoras. 2) Na caixa de aço inoxidável colocada dentro da caixa de esferovite é vertido azoto líquido até atingir no mínimo 7 cm de altura. Seguidamente o rack, manuseado através de duas pinças metálicas é disposto no interior da caixa metálica. 3) A caixa de esferovite é tapada. As palhinhas dispostas no rack encontram-se a uma altura de cerca de 4 cm relativamente ao nível do azoto líquido detectando-se a esse nível uma temperatura aproximada de -120 ºC. No decurso da congelação o azoto líquido vai penetrando pelas aberturas das caixas flutuadoras permitindo que no final do processo de congelação que dura no mínimo 20 minutos as palhinhas fiquem submersas no azoto. 4) Finalmente as palhinhas são cuidadosamente retiradas e armazenadas nos respectivos canisteres dos contentores aonde permanecem até posterior utilização.

g) Avaliação do sémen descongelado - A apreciação da aptidão dos espermatozóides para suportar o processo de congelação/descongelação é realizada 24 horas mais tarde, retirando uma palhinha do contentor de armazenamento para um copo de vidro com água a 37-38 ºC durante 50 segundos. Seguidamente são cuidadosamente secas e o seu conteúdo é diluído em soro fisiológico (1 ml) contido em tubos de ensaio mantidos no banho-maria à mesma temperatura. Depois de uma breve agitação dos tubos num “vortex” é avaliado a % de espermatozóides móveis, e realiza-se um esfregaço com eosina-nigrosina destinado a avaliar a % de spz vivos e % de formas anormais. A comparação destes parâmetros seminais no sémen fresco e descongelado constituem objectivos do nosso projecto. No SD são realizados testes de endosmose aos 5, 25 e 40 minutos após a descongelação, de acordo com metodologia anteriormente publicada (Ferreira et al., 2001, Brito, 2004). Resumidamente, é diluído 0,1 ml de sémen descongelado em 1 mL de solução hipósmótica (100 mOsm) . O tubo de ensaio é mantido em banho-Maria a 37 ºC . Aos 5, 25 e 40 minutos , sobre uma lâmina a 37 ºC , juntam-se uma gota do conteúdo do tubo de ensaio e uma gota de glutaraldeído a 2%, fazendo-se um esfregaço que é observado 3-4 horas mais tarde. Este esfregaço é observado ao microscópio de contraste de fase, com uma objectiva de imersão (1000 X). Consideram-se endosmoses positivas os spz que apresentam a cauda total ou parcialmente enrolada e endosmoses negativas os spz que não apresentam a cauda enrolada. Os resultados são expressos percentualmente.

2.2. Resultados da avaliação do sémen

Este trabalho foi realizado no Departamento de Reprodução da Estação Zootécnica Nacional tendo início em Março de 2002. Nos primeiros 6 meses decorreu o treino dos bodes de raça Serrana e a afinação das técnicas de recolha e processamento de sémen fresco que seguidamente serão descritas. Os bodes foram mantidos num estábulo anexo ao Laboratório de Tecnologia do Sémen sendo alimentados com fenos de aveia/ervilhaca, silagem de milho e concentrado comercial. Neste período foram igualmente ensaiados os diluidores destinados à congelação do sémen, designadamente a sua composição e concentração dos constituintes e as técnicas de refrigeração e congelação propriamente ditas. Neste estudo que decorreu até Dezembro de 2004, foram utilizados sete bodes em bom estado sanitário e condição corporal, mas nem todos os animais foram utilizados durante todo o período de ensaio. As colheitas de sémen destinadas à execução deste projecto tiveram início em Novembro de 2002, e foram

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realizadas sempre que possível quinzenalmente. Foram utilizados 218 ejaculados para avaliação estatística de resultados. Ejaculados que não tivessem boa qualidade para serem processados foram rejeitados. As variáveis independentes estudadas foram a época do ano, o factor bode e a interacção época x bode. No sémen fresco (SF) foram avaliados o volume (ml), a concentração espermática (spz x 106), a MI (%), a % de spz vivos e a % de formas anormais referenciando a sua origem designadamente cabeça, peça intermédia (PI) e cauda que foram as variáveis dependentes na análise estatística. Nos 7 bodes utilizados e considerando as 4 estações do ano, não foram apreciados estatisticamente os resultados quando o número de ejaculados por época do ano e por bode foram ≤ 3. 2.2.1 Resultados globais das características seminais

Os resultados médios dos parâmetros seminais em SF são apresentados no quadro 1, a

variação média ao longo das épocas é apresentada no quadro 2 e por bodes no quadro 3. No sémen descongelado (SD) foram realizados testes de endosmose aos 5, 25 e 40

minutos após a respectiva descongelação. Os resultados médios dos parâmetros seminais em 218 ejaculados descongelados são apresentados no quadro 5. Paralelamente foram apreciadas as quebras de resultados do SD relativamente ao SF relativamente à MI (Difmi), % de spz vivos (Difvivos) e % de spz normais (Difnormais) por época do ano (Quadro 6) e por bode (Quadro 7). A variação média dos parâmetros seminais no SD ao longo das épocas do ano apresenta-se no quadro 6.

Foram apreciadas as correlações estatísticas (Pearson) entre os parâmetros seminais no SF, SD e SF vs SD (Quadro 4, Quadro 8 e Quadro 9). Na análise estatística de resultados foram realizadas análises de variância simples (Anova) e multivariada (Manova) e o teste de comparações múltiplas (LSD) recorrendo ao programa Statistica (StatSoft, Inc., 1995).

Quadro 1: Resultados globais médios no sémen fresco

Interv de Confiança N Média -95 % +95 %

Min. Max DP

VOLUME (ml) 218 1,09 1,04 1,15 0,30 2,50 0,42

CONCEN (x106) 214 4037,1 3848,7 4225,8 1460,0 11827,9 1399,1

MI (%) 218 65,1 64,4 65,8 50,0 75,0 5,4

VIVOS (%) 216 72,2 70,8 73,6 37,0 90,0 10,4

NORMAIS (%) 216 81,1 80,1 82,1 53,0 94,0 7,5

CABE (%) 216 9,3 8,6 9,9 0,0 29,0 4,8

PI (%) 216 5,2 4,6 5,7 0,0 20,0 4,1

CAUDA (%) 216 4,4 3,9 5,0 0,0 22,0 4,3

No quadro 2 são apresentadas os valores médios das características seminais no SF ao longo do ano, verificando-se que os volumes dos ejaculados e a % de spz normais foram significativamente superiores no Verão e no Outono comparativamente às restantes épocas do ano que não foram diferentes entre si (gráfico 1). A % de spz normais foi significativamente superior no Outono e no Verão. Nesta estação não houve diferenças comparativamente às restantes épocas do ano. Não foi observada uma variação anual da MI, concentração, % de spz vivos , % de anomalias na cabeça e da cauda dos espermatozóides. A % de anomalias da PI foi

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significativamente inferior no Outono e no Verão, não diferindo as restantes épocas do ano entre si (gráfico 1). Quadro 2. Médias globais dos parâmetros do sémen fresco ao longo das estações do ano

O I P V Variáveis n x ± dp n x ± dp n x ± dp n x ± dp

Volume F=15,26;P<0,001

104 1,20±0,39 a 41 0,86±0,36 b 21 0,73±0,43 b 52 1,20±0,38 a

MI F=1,0; P<0,39 104 65,27±5,1 41 64,15±4,86 21 64,29±5,98 52 65,88±5,94

Concentração F=1,81;P<0,145

100 4202,03 ±1356,92

41 4162,96 ±1330,77

21 3903,33 ±1516,66

52 3675,39 ±1450,52

Vivos F=0,42; P<0,74 102 72,87±10,09 41 72,39±9,26 21 70,67±8,39 52 71,33±12,41

Normais F=4,87;P<0,003

102 82,83±6,35a 41 78,38±8,79b 21 78,19±6,95b 52 80,98±8,02ab

Cabeça F=2,52; P<0,06

102 8,96±4,37 41 8,32±3,96 21 8,71±4,26 52 10,79±6,17

PI F=14,26; P<0,001 102 4,01±3,14 a 41 7,26±4,69 b 21 8,67±5,23 b 52 4,44±3,29 a

Cauda F=1,11; P<0,35 102 4,25±4,08 41 5,51±5,62 21 4,43±4,72 52 3,98±3,35

Gráfico 1. Médias globais (± interv. conf.) dos parâmetros do sémen fresco com variações significativas ao longo das estações do ano (volume, normais e anomalias da PI)

V O I P

EPOCA

70

75

80

85

Spz

Nor

mai

s (%

)

0

5

10

15

20

Ano

mal

ias

da P

I (%

)

NORMAIS(L) PI(R)

V O I P

EPOCA

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

Vol

ume

(mL)

No quadro 3 e são apresentados os valores médios individuais dos 7 bodes relativamente aos parâmetros seminais no SF. Foram observadas variações individuais significativas em todos os parâmetros seminais exceptuando a MI (P=0,08). O volume médio do ejaculado foi significativamente superior no bode 223, verificando-se que três bodes apresentavam volumes idênticos e superiores a 1 ml (142, 602 e 711). Nestes dois últimos bodes (602 e 711) foram observadas as concentrações espermáticas mais altas que não foram diferentes do bode 223, notando-se uma grande variação entre bodes. Os bodes 5, 107, 223 e 711 apresentaram maiores % de spz vivos enquanto os bodes 131, 142, 223 e 602 tiveram a maior % de spz normais.

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Quadro 3. Médias individuais por bode dos parâmetros do sémen fresco

5 107 131 142 223 602 711 Bode /

Variáveis n x ± dp n x ± dp n x ± dp n x ± dp n x ± dp n x ± dp n x ± dp

Volume F=7,77;P<0,001

57 0,98 ± 0,37a

13 0,80 ± 0,33 a

50 1,02 ± 0,38ab

20 1,29 ± 0,38c

13 1,63 ± 0,40d

12 1,04 ± 0,41abc

53 1,16 ± 0,41bc

Concentração F=7,90; P<0,001

57 3666,47 ± 1077,35a

13 3457,80 ± 902,96a

50 3551,06 ± 1174,03a

20 3736,91 ± 280,45ab

13 4561,77 ± 714,92bc

10 5449,00 ± 968,87c

51 4783,33 ± 1172,48c

MI F=1,90; P<0,081

57 65,61 ± 5,67

13 66,92 ± 4,35

50 63,2 ± 6,04

20 64,5 ± 4,26

13 65,38 ± 3,80

12 67,33 ± 3,55

53 65,58 ± 5,23

Vivos F=2,88; P<0,01

57 73,05 ±10,94bc

13 76,35 ± 9,39bc

48 68,31 ± 11,29a

20 69,60 ± 9,3 ab

13 76,04 ± 7,93bc

12 78,29 ± 9,06c

53 72,44 ± 9,07bc

Normais F=3,73; P<0,002

57 81,46 ± 7,09b

13 86,0 ± 5,60c

48 82,04 ± 5,61bc

20 81,90 ± 6,82bc

13 84,23 ± 5,64bc

12 81,29 ± 4,33abc

53 77,52 ± 9,68a

Cabeça F=2,31; P<0,034

57 9,16 ± 4,74ab

13 10,0 ± 6,27ab

48 10,6 ± 4,35b

20 10,6 ± 6,51b

13 7,92 ± 5,91ab

12 10,21 ± 3,82ab

53 7,57 ± 3,72a

PI F=8,81; P<0,001

57 6,39 ± 3,93 bc

13 1,69 ± 1,49a

48 3,90 ± 2,76a

20 3,2 ± 2,26ab

13 3,31 ± 2,25a

12 3,96 ± 2,47a

53 7,39 ± 5,14c

Cauda F=9,26; P<0,001

57 2,72 ± 2,49a

13 2,31 ± 2,21a

48 3,45 ± 2,61a

20 4,3 ± 3,76a

13 4,54 ± 2,63a

12 4,54 ± 4,83a

53 7,72 ± 5,96b

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Os bodes 711 e 5 apresentaram maiores % de anomalias da PI. A maior % de anomalias da cauda foi observada no bode 711 e da cauda, fazendo parte do grupo de bodes que apresentaram menor % de anomalias da cabeça.

No quadro 4 apresentam-se as correlações entre os parâmetros seminais medidos no sémen fresco. De destacar a correlação negativa do volume com a mobilidade e vitalidade espermáticas, e positiva com as anomalias da cabeça (P<0,05). A concentração correlacionou-se positivamente com a mobilidade, vitalidade e anomalias da cauda e negativamente com as anomalias da cabeça (P<0,05). A mobilidade, vitalidade e normalidade espermáticas correlacionaram-se positivamente entre si, sendo a correlação entre a mobilidade e a vitalidade a mais elevada (r=0,72; P<0,05). Os spz vivos correlacionaram-se negativamente com as anomalias da cauda (P<0,05). Os spz normais correlacionaram-se negativamente com todas as anomalias estudadas (P<0,05), como era expectável. Quadro 4: Correlações entre os parâmetros seminais no sémen fresco (n=212, a itálico P<0,05)

VOLUME CONC MI VIVOS NORMAIS CAB PI CAU VOLUME 1,00 ,12 -,23 -,24 -,07 ,14 -,12 ,09 CONC 1,00 ,21 ,20 -,02 -,19 ,09 ,21 MI 1,00 ,72 ,39 -,30 -,20 -,13 VIVOS 1,00 ,39 -,38 -,11 -,13 NORMAIS 1,00 -,45 -,64 -,61 CAB 1,00 -,14 -,20 PI 1,00 ,37 CAU 1,00

No quadro 5, são apresentadas as médias globais de todos os parâmetros avaliados no

sémen descongelado. Quadro 5: Resultados globais médios no sémen descongelado Intervalo de Confiança

N Média -95 % +95 % Min Max DP MI 218 38,4 37,3 39,4 10,0 55,0 8,1 VIVOS 218 44,5 43,0 46,0 12,0 69,0 11,3 NORMAIS 218 64,9 63,8 66,0 40,0 84,0 8,3 CABE 218 26,8 25,7 27,9 5,0 49,0 8,1 PI 218 2,4 2,0 2,8 0,0 20,0 3,0 CAUDA 218 5,8 5,1 6,4 0,0 30,0 4,9 EPOS5 206 39,2 37,6 40,8 11,0 69,0 11,6 EPOS25 206 41,6 40,0 43,3 10,5 71,0 12,0 EPOS40 206 40,7 38,9 42,6 10,0 79,0 13,2 Difmi 218 -26,8 -27,8 -25,7 -50,0 -10,0 7,8 Difvivos 216 -27,7 -29,4 -26,0 -60,0 0,0 12,8 Difnormais 216 -16,2 -17,5 -15,0 -45,0 0,0 9,2

No quadro 6 são apresentados a variação dos parâmetros seminais no SD ao longo das

estações do ano. Não foram observadas diferenças entre épocas do ano nos seguintes parâmetros : MI (%), % de spz vivos e normais, Epos40, Difmi e Difvivos. Foram observadas variações significativas nos seguintes parâmetros: % de anomalias da cabeça, PI e cauda, Epos5, Epos25 e Difnormais (Gráfico 2).

- 9 -

Quadro 6. Médias globais dos parâmetros do sémen descongelado ao longo das estações do ano

O I P V Variáveis n x ± dp n x ± dp n x ± dp n x ± dp

MI F=0,13; P<0,94

104 38,03 ±8,13

41 38,44 ± 7,90

21 39,00 ± 7,21

52 38,69 ± 8,72

Vivos F=1,87; P<0,13

104 43,0 ± 11,89

41 47,80 ± 10,49

21 45,55 ± 9,28

52 44,61 ± 11,09

Normais F=1,42; P<0,24

104 64,09 ± 8,05

41 64,05 ± 8,23

21 66,71 ± 8,35

52 66,46 ± 8,84

Cabeça F=6,26;P<0,001

104 28,96 ± 7,27c

41 24,78 ± 9,10ab

21 22,07 ± 7,51a

52 26,04 ± 8,0ab

PI F=5,02;P<0,002

104 1,79 ± 1,87 a

41 3,44 ± 4,03 bc

21 3,9 ± 4,88c

52 2,23 ± 2,77 ab

Cauda F=2,85;P<0,038

104 5,16 ± 4,18a

41 7,27 ± 7,01c

21 7,31 ± 5,11c

52 5,1 ± 3,90a

Epos5 F=3,39; P<0,02

96 37,09 ±11,37a

41 43,77 ± 11,99b

21 40,31 ±13,17ba

48 38,93 ± 9,90a

Epos25 F=3,93;P<0,009

96 39,74 ±11,57a

41 46,96 ± 12,52c

21 42,76 ±11,64abc

48 40,24 ± 11,52ab

Epos40 F=2,55; P<0,06

96 39,16 ±12,55

41 45,10 ± 13,30

21 43,36 ± 15,17

48 39,02 ± 12,80

Difmi F=0,67; P<0,57

104 -27,24 ± 7,50

41 -25,71 ± 8,13

21 -25,29 ± 7,63

52 -27,19 ±8,42

Difvivos F=2,38; P<0,07

102 -30,03 ±12,07

41 -24,59 ± 11,21

21 -25,12 ± 12,34

52 -26,72 ±13,62

Difnormais F=6,36;P<0,001

102 -18,87 ±8,20a

41 -14,33 ±9,18bc

21 -11,48 ±8,92bc

52 -14,52 ±9,65b

Gráfico 2 – Médias globais (± interv conf) dos parâmetros do sémen descongelado com variações significativas ao longo das estações do ano (anomalias da cabeça, PI e cauda, difnormais e EPOS5 / EPOS25)

V O I P

EPOCA

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

Per

cent

agem

CABE PI CAUDA DIFNORM

V O I P

EPOCA

32

34

36

38

40

42

44

46

48

50

52

54

Per

cent

agem

EPOS5 EPOS25

- 10 -

Quadro 7. Médias individuais (bode) dos parâmetros do sémen descongelado

5 107 131 142 223 602 711 Variáveis n x ± dp n x ± dp n x ± dp n x ± dp n x ± dp n x ± dp n x ± dp

MI F=5,85;P<0,001

57 41,54 ± 6,7bc

13 44,23 ± 7,34c

50 35,18 ± 8,87a

20 41,15 ± 7,03bc

13 35,46 ± 4,14a

12 35,17 ± 6,9a

53 36,9 ± 8,2a

Vivos F=5,50;P<0,001

57 47,33 ±10,77b

13 42,5 ± 11,24ab

50 39,12 ± 12,27a

20 41,53 ± 8,9a

13 38,70 ±11,40a

12 49,7 ±11,09b

53 48,51 ± 8,9 b

Normais F=0,882;P<0,55

57 66,46 ± 7,43

13 63,31 ± 6,7

50 63,75 ± 7,78

20 64,6 ± 8,62

13 67,23 ± 8,96

12 63,33 ± 12,27

53 64,6 ± 8,87

Cabeça F=3,45; P<0,003

57 26,21 ± 7,67b

13 30,92 ± 7,51c

50 28,92 ± 8,74bc

20 29,25 ± 7,06bc

13 27,0 ± 8,58bc

12 28,0 ± 9,64bc

53 23,24 ± 6,86a

PI F=1,52; P<0,17

57 2,58 ± 3,72

13 2,0 ± 1,73

50 1,77 ± 1,8

20 1,9 ± 3,75

13 1,38 ± 1,19

12 3,08 ± 3,15

53 3,22 ± 1,8

Cauda F=5,18;P<0,001

57 4,58 ± 4,39a

13 3,77 ± 3,22a

50 5,56 ± 3,38a

20 4,25 ± 3,92a

13 4,0 ± 2,94a

12 5,58 ± 3,96a

53 8,71 ± 6,61b

Epos5 F=6,82;P<0,001

57 45,45 ± 9,94d

13 38,69 ±12,63 bc

49 36,42 ± 10,61bc

19 36,29 ± 9,97bc

12 31,83 ±12,02ab

9 27,5 ± 12,17 a

47 39,84 ± 10,77 c

Epos25 F=5,25;P<0,001

57 46,14 ±11,36e

13 45,58 ± 7,84de

49 38,98 ± 13,07bcd

19 37,68 ± 9,63bc

12 34,08 ± 9,68b

9 30,06 ± 11,2a

47 43,44 ± 11,09cde

Epos40 F=4,71;P<0,001

57 45,99 ±12,80d

13 40,81 ± 10,31bcd

49 37,18 ± 14,53b

19 38,11 ± 9,34bc

12 32,75 ±10,77b

9 29,88 ± 9,96a

47 43,24 ± 12,34cd

Difmi F=4,87;P<0,001

57 -24,07 ± 6,96b

13 -22,69 ± 7,88b

50 -28,02 ± 6,76a

20 -23,35 ±7,40b

13 -29,92 ± 6,0a

12 -32,17 ± 7,47a

53 -28,72 ± 8,71a

Difvivos F=3,12; P<0,006

57 -25,72 ± 11,0cd

13 -33,85 ± 14,80ab

48 -29,66 ± 13,27bc

20 -28,03 ±14,55bcd

13 -37,35 ±12,45a

12 -28,63 ± 9,88bcd

53 -23,93 ± 11,95d

Difnormais F=3,25;P<0,004

57 -15,00 ± 8,79b

13 -22,69 ± 8,76a

48 -18,57 ± 9,53a

20 -17,25 ±8,90ab

13 -17,00 ± 9,0ab

12 -17,96 ± 11,8ab

53 -12,92 ± 7,50b

- 11 -

A % de anomalias da cabeça no Outono foi superior relativamente às restantes épocas do ano. A % de anomalias da PI e da cauda foi mais alta na Primavera e no Inverno e menor no Outono e Verão. A % de Epos5 e Epos25 foi mais alta no Inverno e na Primavera, não variando as restantes épocas entre si. A % de difnormais foi superior no Outono relativamente às restantes épocas do ano que não foram diferentes entre si. Esta maior quebra deve-se a um aumento da % de spz normais no sémen fresco no Outono e não a uma menor percentagem no sémen descongelado. No Inverno e na Primavera foi observada a maior % de endosmoses positivas, coincidindo com a menor % de anomalias da cabeça (I, P, V).

No quadro 7 são apresentadas as variações individuais em todos os bodes dos parâmetros seminais no SD. Não foram observadas variações individuais na % de spz normais e de anomalias na PI. Verificou-se que a MI foi melhor em três animais (5, 107 e 142), sendo a % de spz vivos mais alta também no bode 5 e em dois outros animais (107, 602 e 711). O bode 711 apresentou a menor e a maior % de anomalias da cabeça e da cauda respectivamente. Os bodes 5, 107 e 711 apresentaram os melhores resultados nas endosmoses positivas observadas, destacando-se o bode 5 na Epos5 relativamente a todos os animais. A apreciação da aptidão a congelação pode ser avaliada pelas quebras de mobilidade individual, % de spz vivos e normais do SD comparativamente ao SF. Observamos que os bodes 5, 107 e 142 apresentaram as menores quebras de MI, e que as quebras da % de spz vivos e normais foram menores nos bodes 5, 602 e 711. Após a observação dos registos dos parâmetros seminais no SD pensamos que o bode 5 revelou a melhor aptidão para a produção de sémen congelado tendo o bode 142 igualmente bom desempenho.

No quadro 8 apresentam-se as correlações entre os parâmetros medidos no sémen descongelado. Os spz móveis, vivos e normais, apresentam correlações positivas e significativas entre si. As endosmoses positivas medidas aos 40 minutos, correlacionaram-se positivamente com a mobilidade, vitalidade e normalidade espermáticas (P<0,05). Embora com correlações mais baixas, as endosmoses dos 5 e dos 25 minutos, correlacionaram-se positivamente com a motilidade e a vitalidade (P<0,05). Quanto maiores as quebras havidas no número de spz móveis, vivos e normais devido ao processo de congelação, menores são as percentagens de spz móveis, vivos e normais encontradas no sémen descongelado (-0,77, -0,64 e -0,63, respectivamente; P<0,05). A percentagem de spz normais correlacionou-se negativamente com a percentagem de anomalias da cabeça, da peça intermédia e da cauda (P<0,05), como seria de esperar. As endosmoses positivas medidas aos 25 e 40 minutos, correlacionaram-se negativamente com as anomalias da cabeça (P<0,05). As anomalias da cabeça correlacionaram-se negativamente com as da peça intermédia e da cauda (P<0,05), apresentando estas duas uma correlação positiva entre si (P<0,05). Quadro 8: Correlações entre os parâmetros seminais no sémen descongelado (n=206, a itálico P<0,05)

MI VIVOS NORM CAB PI CAU EPOS5

EPOS25

EPOS40

Q MI

Q VI

Q NO

MI 1,0 ,55 ,32 -,27 -,05 -,05 ,30 ,33 ,42 -,77 -,27 -,17 VIVOS 1,0 ,43 -,38 -,07 -,02 ,16 ,24 ,32 -,30 -,64 -,32 NORM 1,0 -,67 -,24 -,41 ,06 ,09 ,16 -,06 -,16 -,63 CAB 1,0 -,35 -,33 -,16 -,25 -,27 ,11 ,19 ,71 PI 1,0 ,35 ,14 ,15 ,06 -,05 -,04 -,14 CAU 1,0 ,09 ,16 ,15 -,04 ,01 ,01 EPOS5 1,0 ,66 ,63 -,32 -,13 -,13 EPOS25 1,0 ,75 -,28 -,15 -,19 EPOS40 1,0 -,34 -,17 -,18 QMI 1,0 ,46 ,17 QVI 1,0 ,36 QNO 1,0

- 12 -

No quadro 9 apresentam-se as correlações entre os parâmetros seminais do SF e do SD. Todos os parâmetros homólogos apresentaram correlações positivas e significativas entre o SF e o SD, destacando-se a MI e as anomalias da peça intermédia e da cauda (0,37, 0,43 e 0,52, respectivamente). As correlações não homólogas entre os spz móveis, vivos e normais do SF e SD são positivas e significativas, exceptuando-se as dos normais em sémen fresco. As correlações significativas entre os parâmetros não homólogos do SF e SD estão de acordo com os resultados esperados, exceptuando-se as anomalias da peça intermédia e da cauda em fresco com as anomalias da cabeça no SD, que são negativas relativamente ao esperado. Quadro 9. Correlações entre parâmetros seminais do sémen fresco e descongelado (n=216; itálico: P<0,05; negrito: variáveis homólogas)

MID VID NORD CABD PID CAUD MIF ,37 ,39 ,38 -,27 -,13 -,11 VIF ,24 ,31 ,25 -,21 -,10 -,00 NORF ,13 ,08 ,34 ,12 -,43 -,45 CABF -,13 -,14 -,17 ,18 ,06 -,05 PIF -,01 ,01 -,14 -,25 ,43 ,35 CAUF -,07 ,03 -,26 -,17 ,26 ,52

As correlações das endosmoses medidas no SD com os parâmetros seminais do SF foram

geralmente baixas e não significativas. Contudo, as endosmoses do SD aos 40 minutos apresentaram uma correlação significativa com a MIF e VIF (r=0,14, P<0,05).

A congelação de sémen provoca um decréscimo normalmente significativo no valor dos parâmetros seminais do sémen congelado. No gráfico 3 são representadas as interacções época x tipo de sémen na MI, % de spz vivos e normais e no gráfico 4 as correspondentes interacções sobre as anomalias da cabeça, PI e cauda. Em todas estas variáveis foi observado um efeito específico do sémen congelado na diminuição significativa dos parâmetros seminais referidos.

Gráfico 3. Interacção entre a época e o tipo de sémen, para a MI, Vivos e Normais

Interacção Época x SémenBarras verticais = 0,95 int. conf.

Sémen Fresco

V O I P30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

Per

cent

agem

Sémen Descongelado

V O I P

MI VI NORM

Normais: F[3,426]=3,86; P<0,01

- 13 -

Gráfico 4. Interacção entre a época e o tipo de sémen, para as anomalias da cabeça, peça intermédia e cauda

Interacção Época x SémenBarras verticais 0,95 int. conf.

Sémen Fresco

V O I P-5

0

5

10

15

20

25

30

35Fo

rmas

ano

rmai

s (%

)

Sémen Descongelado

V O I P

CAB PI CAUDA

Cabeça: F[3,426]=5,18; P<0,002

PI: F[3,426]=2,57; P<0,05

A interacção entre a época do ano e tipo de sémen (sémen fresco e descongelado), foram

significativas para os spz normais (gráfico 3) e para a % de anomalias da cabeça e da PI (gráfico 4). Nos gráficos 5 e 6 são apresentadas as interacções entre o bode e tipo de sémen, que foram significativas para a MI, Vivos e anomalias da PI. Nas restantes variáveis (normais, anomalias da cabeça e da cauda) observou-se um efeito específico da congelação no decréscimo dos resultados. Gráfico 5. Interacção entre o bode e o tipo de sémen, para a MI, Vivos e Normais

Interacção Bode x SémenBarras verticais = 0,95 int. conf.

Sémen Fresco

5 107 131 142 223 602 71120

30

40

50

60

70

80

90

100

Per

cent

agem

Sémen Descongelado

5 107 131 142 223 602 711

MI VI NORM

MI: F[6,422]=3,15; P<0,005

VI: F[6,420]=2,16; P<0,05

- 14 -

Gráfico 6. Interacção entre o bode e o tipo de sémen, para as anomalias da cabeça, peça intermédia e cauda

Interacção Bode x SémenBarras verticais = 0,95 int. conf.

Sémen Fresco

5 107 131 142 223 602 711-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40Fo

rmas

ano

rmai

s (%

)

Sémen Descongelado

5 107 131 142 223 602 711

CAB PI CAUDA

PI: F[6,420]=2,97; P<0,008

2.2.2. Variação das características seminais em função da época e do bode (Interacções)

a) Sémen fresco

A interacção entre a época do ano (O, I, P e V) e o bode não foi possível ser estudada para todas as épocas com todos os animais. A análise multivariada (Statsoft, Inc, 1995) para avaliar a interacção época x bode, incluindo todas as estações só foi possível estudar em 3 animais. Foi observado um efeito específico significativo da época sobre o volume e % de anomalias da PI. O volume médio dos ejaculados foi superior no Outono e Verão comparativamente às restantes épocas do ano que não foram diferentes. A % de anomalias da PI foi superior na Primavera e no Inverno comparativamente às restantes épocas que não foram diferentes (Quadro 10). Quadro 10. Efeitos específicos da época (4 épocas x 3 bodes)

O I P V Variáveis n x ± dp n x ± dp n x ± dp n x ± dp

Volume F=18; P<0,001

64 1,21 ± 0,31 a 38 0,86 ± 0,36 b 21 0,73 ± 0,43 b 37 1,15 ± 0,35 a

PI F=7,8; P<0,001 62 4,76 ± 3,47 a 38 7,47 ± 4,71 b 21 8,67 ± 5,23 b 37 4,91 ± 3,52 a

No quadro 11 são apresentados os efeitos específicos significativos do bode sobre o

volume, concentração, spz normais e % de anomalias da cabeça, PI e cauda. No bode 5 o volume do ejaculado foi menor. No bode 711 foram observadas maiores concentrações espermáticas e %

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de anomalias da cauda e menor % de spz normais. Nos bodes 5 e 131 foram observados maiores % de anomalias da cabeça, tendo este último a menor % de anomalias da PI. Quadro 11. Efeitos específicos do bode (3 bodes x 4 épocas)

5 131 711 Variáveis n x ± dp n X ± dp n x ± dp

Volume F=5,17; P<0,006

57 0,98± 0,37 a 50 1,02 ± 0,38ab 53 1,16 ± 0,41b

Concentração F=14,08; P<0,001

57 3666,47± 1077,35a

50 3551,06± 1174,03a

51 4783,33± 1172,48b

Normais F=3,27; P<0,041 57 81,46± 7,09b 48 82,04 ± 5,61b 53 77,52± 9,68a

Cabeça F=4,80; P<0,009 57 9,16± 4,74ab 48 10,60± 4,35b 53 7,57 ± 3,72a

PI F=9,74; P<0,001 57 6,4 ± 3,93b 48 3,90 ± 2,76a 53 7,39± 5,14b

Cauda F=16,00; P<0,001 57 2,72± 2,49a 48 3,45± 2,61a 53 7,72± 5,95b

Foram observadas interacções significativas época x bode para a MI, % de spz vivos e de

anomalias da cauda (Quadro 12). Neste quadro são apresentadas as variações entre bodes em cada estação do ano bem como a variação estacional de cada bode ao longo do ano. Quadro 12. Interacções significativas entre a época e o bode no sémen fresco

MI Vivos Cauda Época Bodes n x ± dp n X ± dp n x ± dp

OUT

5 131 711

24 22 18

66,5 ± 4,3 a2 62,3 ± 6,3 b1

65,4 ± 5,3 ab12

24 20 18

74,6 ± 10,3 a1 66,8 ± 9,4 b12 71,8 ± 10,9 ab1

24 20 18

2,0 ± 1,6 a1 3,1 ± 1,8 a1 9,0 ± 4,7 b2

INV

5 131 711

14 9

15

65,0 ± 5,2 a12 65,0 ± 4,3 a12 63,3 ± 5,2 a1

14 9

15

72,5 ± 11,9 a1 76,7 ± 8,4 a3 71,0 ± 7,1 a1

14 9

15

2,6 ± 1,7 a1 3,4 ± 2,1 a1 9,8 ± 7,2 b2

PRIM

5 131 711

5 8 8

60,0 ± 7,9 a1 66,9 ± 5,3 b2 64,4 ± 4,2 ab1

5 8 8

65,0 ± 4,7 a1 71,5 ± 9,5 a23 73,4 ± 8,1 a1

5 8 8

3,4 ± 3,1 a1 4,3 ± 4,5 a1 5,3 ± 6,0 a1

VER 5 131 711

14 11 12

66,8 ± 6,7 a2 60,9 ± 6,3 b1 69,4 ± 4,0 a2

14 11 12

73,9 ± 12,2 a1 61,9 ± 13,8 b1 74,5 ± 9,6 a1

14 11 12

3,8 ± 3,7 a1 3,6 ± 2,7 a1 4,8 ± 4,7 a1

Interacção 160 F[6;148]=3,52 P<0,027

158 F[6;146]=2,56 P<0,021

158 F[6;146]=2,68 P<0,016

Letras diferentes = diferenças entre bodes dentro de cada época Números diferentes = diferenças entre épocas para o mesmo bode

- 16 -

Época x Bode (MI): F(6, 148)=3,5154, p=,00279

Barras Verticais = 0,95 interv conf

V O I P

EPOCA

52

54

56

58

60

62

64

66

68

70

72

74

76

Mob

ilida

de In

divi

dual

(%)

BODE 5 BODE 131 BODE 711

Época x Bode (Vivos): F(6, 146)=2,5604, p=,02184

Barras Verticais = 0,95 interv conf

V O I P

EPOCA

50

55

60

65

70

75

80

85

90

VIV

OS

(%)

BODE 5 BODE 131 BODE 711

Época x Bode (Cauda): F(6, 146)=2,6803, p=,01695

Barras Verticais = 0,95 interv conf

V O I P

EPOCA

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

Ano

mal

ias

da C

auda

(%)

BODE 5 BODE 131 BODE 711

Gráfico 7. Interacção época x bode para a mobilidade individual Gráfico 8. Interacção época * bode para os espermatozóides vivos Gráfico 9. Interacção época * bode para as anomalias da cauda

- 17 -

Nos gráficos 7, 8 e 9 são apresentadas, respectivamente, as interacções significativas época x bode para a MI, % de spz vivos e de anomalias da cauda, no sémen fresco. Relativamente à MI, no Inverno não foram detectadas variações significativas entre bodes contrariamente às restantes épocas do ano. As diferenças entre bodes foram mais evidentes no Verão e na Primavera. Nos três bodes analisados, houve dois (5 e 711) que apresentaram um comportamento semelhante detectando-se um decréscimo significativo da MI entre o Verão e a Primavera subsequente. Contrariamente no bode 131 observou-se um acréscimo da MI entre o Verão e a Primavera, registando-se variações significativas entre estas duas estações.

No Inverno e na Primavera não houve variações individuais relativamente à % de spz vivos. O bode 5 apresentou uma variação anual semelhante à MI, isto é um decréscimo da % de spz vivos entre o Verão e Primavera, embora não significativa devido à grande dispersão de resultados. No bode 131 observou-se um aumento significativo da % de spz vivos entre o Verão e o Inverno (tal como observado na MI) seguido de um decréscimo gradual até à Primavera. No bode 711 não foram observadas variações significativas ao longo do ano. As diferenças individuais observadas na MI e % de spz vivos durante o Verão dependem do bode 131.

Os bodes 5 e 131 apresentam uma variação anual idêntica relativamente à % de anomalias da cauda. No Verão e na Primavera não foram observadas variações entre bodes relativamente à % de anomalias da cauda contrariamente ao verificado na MI e % de spz vivos. As variações individuais encontradas no Outono e Inverno dependem do bode 711.

b) Sémen descongelado

A interacção entre a época do ano (O, I, P e V) e o bode não foi possível ser estudada para todas as épocas com todos os animais. A análise multivariada (Statsoft, Inc, 1995) para avaliar a interacção época x bode, incluindo todas as estações só foi possível estudar em 3 animais. Foi observado um efeito específico da época sobre a % de spz normais, % de anomalias da cabeça e da PI, Difnormais, e Epos aos 5 e 25 minutos após a descongelação. No Inverno, Primavera e Verão a % de spz normais foi semelhante, existindo diferenças entre o Verão e o Outono. No Inverno e na Primavera foi detectada maior % de anomalias da PI, verificando-se no Outono a maior % de Difnormais e anomalias da cabeça. As endosmoses positivas aos 5 e 25 minutos apresentaram os valores mais elevados no Inverno e na Primavera não havendo diferenças nas restantes épocas (Quadro 13). Quadro 13. Efeitos específicos da época no sémen descongelado

O I P V Variáveis n x ± dp n x ± dp n x ± dp n x ± dp

Normais F=3,18; P<0,03

64 63,22 ± 7,8a 38 64,29± 8,03ab 21 66,71±8,35ab 37 67,81±7,79b

Cabeça F=5,85;P<0,001 64 29,08±6,98b 38 24,05 ± 8,78a 21 22,07 ± 7,51 a 37 25,22±7,78a

PI F=5,92;P<0,001 64 1,86 ± 1,93a 38 3,63 ± 4,13 b 21 3,91 ± 4,88 b 37 1,81 ± 1,50a

Difnormais F=5,94;P<0,001 62 -18,91±7,81a 38 -13,99± 8,85b 21 -11,48± 8,92b 37 -13,15±8,77b

Epos5 F=3,19; P<0,03 59 39,98±10,00a 38 44,93± 11,61b 21 40,31±13,17ab 35 38,14± 9,83a

Epos25 F=3,86; P<0,01 59 41,89±11,3a 38 48,25± 12,07b 21 42,76±11,64ab 35 39,3±12,55a

- 18 -

Foram observados efeitos significativos dos bodes na MI, % de vivos, anomalias da cabeça, PI e cauda, Difmi, Difnormais e Epos5 (Quadro 14). Globalmente o bode nº 5 apresentou melhores características seminais no SD comparativamente aos restantes. Resumindo apresentou maior MI, , Epos5 e menores quebras relativamente ao SF na MI (Difmi). Os restantes bodes (131 e 711) apresentaram um comportamento semelhante nalgumas variáveis exceptuando as anomalias da PI e da cauda que foram superiores no bode 711. Quadro 14. Efeitos específicos do bode no sémen descongelado

5 131 711 Variáveis n x ± dp n X ± dp n x ± dp

MI F=3,2; P<0,043

57 41,54±6,77a 50 35,18 ± 8,87b 53 36,87 ± 8,21b

Vivos F=6,51; P<0,002

57 47,33±10,7b 50 39,12± 12,27a 53 48,51± 8,89b

Cabeça F=4,76; P<0,001 57 26,21±7,67a 50 28,92 ± 8,74a 53 23,24± 6,86b

PI F=5,06; P<0,007 57 2,58±3,72ab 50 1,77 ± 1,80a 53 3,22± 3,29b

Cauda F=4,75; P<0,01 57 4,58 ± 4,39a 50 5,56 ± 3,38a 53 8,71± 6,61b

Difmi F=4,32; P<0,02

57 -24,07±6,96a 50 -28,02± 6,76b 53 -28,72± 8,71b

Difnormais F=4,30; P<0,02 57 -15,0± 8,79a 48 -18,57± 9,53b 53 -12,92± 7,50a

Epos5 F=5,99; P<0,003

57 45,45±9,94a 49 36,42± 10,61b 47 39,84±10,77b

Foram observadas interacções significativas época x bode sobre a MI, vivos, normais

(Quadro 15), anomalias da PI e endosmoses positivas aos 25 e 40 minutos após a descongelação (Quadro 15-A).

Não foram observadas variações individuais entre bodes na Primavera, todavia no Outono todos os bodes foram diferentes relativamente à MI. No Verão e no Inverno foram igualmente registadas variações entre bodes encontrando-se o bode 5 entre os melhores. Este animal tal como o bode 711 não apresentaram variações estacionais da MI. No bode 131 registou-se um aumento significativo da MI entre o Verão e o Inverno e um decréscimo significativo entre a Primavera e o Verão.

No Inverno e na Primavera não foram detectadas variações entre bodes relativamente à % de spz vivos. No bode 5 não foram observadas variações estacionais, verificando-se no bode 711 um decréscimo significativo da MI do Verão para o Outono, não sendo observadas diferenças nas restantes épocas. No bode 131 observou-se um aumento significativo do Outono para o Inverno não sendo diferentes as restantes épocas do ano. Nos bodes 5 e 131 as variações estacionais da % de spz vivos foram semelhantes à da MI, exceptuando o decréscimo significativo entre a Primavera e o Verão observado na MI que não teve correspondência na % de spz vivos.

- 19 -

Quadro 15. Interacções significativas época x bode, no sémen descongelado

MI Vivos Normais Época Bodes n x ± dp n X ± dp n x ± dp

OUT

5 131 711

24 22 18

42,75±4,3 a1 31,09±7,9 b1 37,11 ± 8,5 c1

24 22 18

49,35 ± 10,7 a1 34,32 ± 12,4 b1 45,75± 7,4 a1

24 22 18

67,17 ± 7,5 a1 60,36 ± 6,9 b1 61,44 ± 7,7 b1

INV

5 131 711

14 9

15

42,07 ± 7,8 a1 39,11 ± 6,0 ab23 34,47 ± 8,4 b1

14 9

15

49,32 ± 10,3 a1 44,89 ± 11,5 a2 49,43± 10,8 a1

14 9

15

66,3 ± 5,7 a1 67,0 ± 6,7 a2 60,8 ± 9,6 b1

PRIM

5 131 711

5 8 8

36,6 ± 3,9 a1 43,0 ± 4,2 a2 36,5 ± 9,8 a1

5 8 8

42,40 ± 7,3 a1 44,69 ± 10,9 a2 48,38± 8,9 a1

5 8 8

57,8 ± 7,8 a2 68,9 ± 6,7 b2

70,1 ± 6,7 b2

VER 5 131 711

14 11 12

40,71 ± 9,3 a1 34,45 ± 10,6 b13 39,75 ± 6,2 ab1

14 11 12

43,64 ± 11,7 ab1

39,95 ± 10,9 a12 51,58 ± 8,1 b1

14 11 12

68,5 ± 7,6 ab1 64,1 ± 8,7 a12 70,4 ± 6,3 b2

Interacção 160 F[6;148]=3,59 P<0,0024

160 F[6;148]=2,07 P<0,06

160 F[6;148]=4,44 P<0,0004

Em todas épocas do ano foram observadas variações individuais na % de spz normais. No bode 5 foi observado um decréscimo da % de spz normais durante a Primavera e um aumento durante o Verão, ambos significativos não havendo diferenças nas restantes épocas do ano. No bode 131 foi observado entre o Verão e a Primavera um aumento significativo da % de spz normais, com particular incidência durante o Inverno, não sendo registadas variações nas restantes períodos. No bode 711 foram registados decréscimos significativos durante o Outono, seguidos de aumentos durante Primavera não sendo registadas variações nas restantes épocas.

Não foram observadas variações individuais na % de anomalias da PI durante o Verão e o Inverno. As maiores diferenças foram detectadas durante a Primavera entre o bode 5 e os restantes animais. No bode 5 verificou-se um aumento significativo de anomalias da PI durante a Primavera e um decréscimo durante o Verão. No bode 711 observou-se um aumento significativo da anomalias durante o 2º semestre do ano não havendo diferenças nas restantes épocas. No bode 131 não foram observadas variações estacionais na % de anomalias da PI.

No Outono e no Inverno foram observadas variações individuais nas endosmoses positivas aos 25 minutos após a descongelação. Nos bodes 5 e 131 foram registados aumentos significativos das Epos25 durante o Inverno. No bode 5 observou-se um decréscimo significativo das Epos25 durante a Primavera e no 131 durante o Verão. No bode 711 não foram observadas variações estacionais das Epos25.

Nos três bodes avaliados os resultados das Epos40 foram semelhantes aos observados nas Epos25. No bode 5 foi registado um aumento significativo durante o 2º semestre, particularmente durante o Outono e um decréscimo na Primavera. No bode 131 foi observado um decréscimo significativo da Epos40 no Verão, não sendo observadas variações no bode 711.

- 20 -

Quadro 15-A. Interacções significativas época x bode, no sémen descongelado

PI Epos25 Epos40 Época Bodes n X ± dp n X ± dp n x ± dp

OUT

5 131 711

24 22 18

1,1 ± 0,9 a1 1,7 ± 2,1 ab1 3,0 ± 2,3 b12

24 21 14

45,3 ± 10,2 a1 35,8 ± 10,9 b1 45,2 ± 10,5 a1

24 21 14

47,7 ± 11,6 a1 31,1 ± 8,8 b1 45,0 ± 11,0 a1

INV

5 131 711

14 9

15

3,6 ± 4,6 a2 2,8 ± 2,2 a1 4,2 ± 4,6 a2

14 9

15

55,2± 10,6 a2 46,4 ± 10,7 a2 42,9 ± 11,6 b

14 9

15

53,2 ± 13,0 a1 44,1 ± 8,6 ab23 41,0 ± 13,3 b1

PRIM

5 131 711

5 8 8

8,0 ± 7,9 a3 1,4 ± 0,9 b1 3,8 ± 3,6 b12

5 8 8

40,1 ± 6,7 a1 46,5 ± 12,7 a2 40,7 ± 13,2 a1

5 8 8

37,4 ± 6,7 a2 48,2 ± 18,3 a 3

42,3 ± 15,6 a1

VER 5 131 711

14 11 12

2,1 ± 1,0 a12 1,3 ± 1,1 a1 1,9 ± 2,1 a1

14 11 10

40,7 ± 10,5 a1 33,6 ± 15,2 a1 44,0 ± 10,7 b1

14 11 10

38,9 ± 11,9 a2 35,1 ± 18,5 a 12 45,0 ± 11,1 a1

Interacção 160 F[6;148]=2,84

P<0,012

153 F[6;141]=2,48

P<0,03

153 F[6;141]=3,55

P<0,003

Nos gráficos 10-15 estão representadas as interacções significativas época x bode no sémen descongelado.

- 21 -

Época x Bode (MI): F(6, 148)=3,5856, p=,00240Barras verticais = 0,95 interv conf

V O I P

EPOCA

25

30

35

40

45

50

55

Mob

ilida

de In

divi

dual

(%)

BODE 5 BODE 131 BODE 711

Época x Bode (Vivos): F(6, 148)=2,0713, p=,05993

Barras verticais = 0,95 interv conf

V O I P

EPOCA

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Spz

Viv

os (%

)

BODE 5 BODE 131 BODE 711

Época x Bode (Normais): F(6, 148)=4,4362, p=,00037

Barras verticais = 0,95 interv conf

V O I P

EPOCA

45

50

55

60

65

70

75

80

Spz

Nor

mai

s (%

)

BODE 5 BODE 131 BODE 711

Gráfico 10. Interacção época x bode para a mobilidade individual Gráfico 11. Interacção época x bode para os espermatozóides vivos Gráfico 12. Interacção época x bode para a % de spz normais

- 22 -

Época x Bode (PI): F(6, 148)=2,8378, p=,01208Barras verticais = 0,95 interv conf

V O I P

EPOCA

-2

0

2

4

6

8

10

12

Ano

mal

ias

da P

I (%

)

BODE 5 BODE 131 BODE 711

Época x Bode (EPOS25): F(6, 141)=2,4855, p=,02572

Barras verticais = 0,95 interv conf

V O I P

EPOCA

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

End

osm

oses

pos

itiva

s ao

s 25

min

(%)

BODE 5 BODE 131 BODE 711

Época x Bode (EPOS40): F(6, 141)=3,5573, p=,00260

Barras verticais = 0,95 interv conf

V O I P

EPOCA

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

End

osm

oses

pos

itiva

s ao

s 40

min

(%)

BODE 5 BODE 131 BODE 711

Gráfico 13. Interacção época x bode para as anomalias da peça intermédia Gráfico 14. Interacção época x bode para a EPOS25 Gráfico 15. Interacção época x bode para a EPOS40

- 23 -

3. Inseminação Artificial (IA)

No decurso do projecto foram inseminados 9 efectivos de criadores de raça Serrana

(ACORO e da ACRO) com sémen refrigerado de bodes existentes no Departamento de Reprodução Animal que foram utilizados no estudo da variação anual das características seminais do SF e SD atrás apresentado. Nos dois últimos anos do projecto foi possível inseminar um efectivo de raça Serrana com SD. Resumindo foram inseminadas 251 cabras com SR e 45 cabras com SD. Paralelamente colaborámos com a DRAALG e a DRABI na inseminação de 650 cabras das raça Algarvia, Serrana e Charnequeira com sémen refrigerado durante os três anos em que decorreu o projecto. 3.1 Refrigeração de sémen para Inseminação Artificial (IA)

Após a avaliação macroscópica e microscópica anteriormente descrita, só os ejaculados com mobilidades massais ≥3, MI ≥ 65 % e concentrações > 2 mil milhões de spz/ml são utilizados para IA. Os ejaculados com estas características são diluídos após prévia determinação da concentração com um diluidor à base de leite de vaca desnatado (FAO, 1993) contendo glucose e uma mistura de antibióticos (penicilina e estreptomicina) de modo a obter uma concentração de 800 milhões de spz/ml. Após esta etapa os tubos colectores contendo o sémen diluído são colocados num termos a que é adicionada uma ampola de ácido acético glacial (15 ºC), sendo substituída ao fim de 30 minutos. O processo de refrigeração (15 ºC) fica completo ao fim de duas horas devendo o sémen ser utilizado nas três horas seguintes. Previamente ao enchimento das palhinhas (0,25 ml) são retiradas alíquotas de sémen e feita nova observação ao microscópio para verificar se está apto a ser utilizado. 3.2 Sincronização do estro e IA com sémen refrigerado

A sincronização do estro das cabras que foram inseminadas foi efectuada com esponjas vaginais impregnadas com 45 mg de FGA (acetato de fluorogestona) durante 11 dias. Ao nono dia foram administradas 500 UI (i.m) de eCG e 100 µg de cloprostenol (análogo da PGF2α). Estas cabras apresentaram um bom estado sanitário e condição corporal e tiveram um comportamento reprodutivo normal na época de reprodução anterior. A IA foi realizada por via cervical nas 256 cabras entre as 42-44 horas após a remoção das esponjas vaginais (Rev) sem prévia detecção do estro utilizando uma dose de sémen contendo 200 milhões de spz totais. A época de IA decorreu na época reprodutiva tradicional (Primavera) entre 27 de Abril e 20 de Maio. Cerca de 14 dias após a IA, os bodes das respectivas explorações foram colocados no rebanho durante cerca de 45 dias permitindo a cobrição de animais que não tivessem ficado gestantes após a IA. Foram avaliados os parâmetros reprodutivos fertilidade (cabras paridas/cabras inseminadas), fecundidade (crias nascidas/cabras inseminadas) e prolificidade (crias nascidas/partos). Também avaliamos estes parâmetros reprodutivos por bode e por exploração.

3.3 Resultados reprodutivos após IA com sémen refrigerado No programa de IA com sémen refrigerado foram utilizados 8 bodes nas 251 cabras inseminadas de criadores associados da Acoro e da Acro. No quadro 16, são apresentados os parâmetros reprodutivos globais após a IA, bem como os resultados reprodutivos por bode utilizado. Globalmente a fertilidade, fecundidade e prolificidade foram respectivamente 60,2 %,

- 24 -

106 % e 176 % respectivamente. Foram observadas variações significativas entre bodes relativamente a estes parâmetros reprodutivos. Quadro 16. Parâmetros reprodutivos (%) obtidos após IA com sémen refrigerado em cabras Serranas (análise estatística pelo teste U de Mann-Whitney)

Bodes IA (n) Partos Crias Fertilidade Fecundidade Prolificidade 5 79 38 59 48,1a 75,0a 155,3a

106 11 5 10 45,50ab 91,0abc 200,0bc 107 25 19 41 76,0bc 164d 216,0c 131 31 26 48 83,9c 155,0cd 185,0b 142 40 25 48 62,5abc 120bcd 192,0bc 223 9 4 7 44,4ab 78,0ab 175,0abc 602 26 13 18 50,0ab 69,2a 139,0a 711 30 21 35 70,0bc 117,0bc 167,0ab

Global 251 151 266 60,2 106,0 176,1

Neste programa de IA com sémen refrigerado os bodes 107 e 131 apresentaram as fertilidades e fecundidades mais elevadas, não havendo grandes variações de fertilidade nos restantes bodes. A prolificidade apresentou menores variações embora fossem registados valores mais elevados nos bodes 106, 107 e 142. Procurou-se correlacionar a fertilidade após inseminações artificiais usando sémen refrigerado, com a qualidade do sémen expresso pela mobilidade individual, spz vivos e spz normais. Dos 7 bodes utilizados nas IA só foi possível usar 3 animais (5, 131 e 711), a partir das médias obtidas em ejaculados recolhidos na mesma época das IA (Primavera). Nestes animais não foram observadas diferenças significativas naqueles parâmetros seminais.

Foram observadas correlações positivas entre a MI (r=0,82), vivos (r=0,999) e normais (r=0,795) com a fertilidade. Contudo, somente a correlação entre a percentagem de spz vivos e a fertilidade foi significativa (p<0,05; gráfico 16). Gráfico 16 – Regressão da percentagem de espermatozóides vivos com a fertilidade, utilizando sémen fresco colhido na Primavera de 3 bodes.

Fertilidade = -262,9 + 5,1805 * Vivosr = ,99960 (p<0,05)

59 60 61 62 63 64 65 66 67 68

Spz vivos (%)

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

Ferti

lidad

e (%

)

95% int conf

- 25 -

3.4 Sincronização do estro e IA com sémen descongelado

O protocolo de sincronização do estro, o momento de IA e a concentração de espermatozóides por dose foi idêntico ao utilizado na IA com sémen refrigerado. Foram descongeladas 1-2 palhinhas de cada ejaculado como anteriormente referimos. Só foram utilizados ejaculados contendo pelo menos 35 % de spz móveis cinco minutos após a descongelação. O sémen destinado á IA foi transportado no respectivo contentor. Após a descongelação realizada em banho-maria a 37 ºC durante 50 segundos, as palhinhas foram cuidadosamente secas, recortada a extremidade selada com álcool polivinílico e introduzidas no respectivo “pistolet”, procedendo-se de imediato à IA das cabras anteriormente sincronizadas. Na exploração em que foi possível inseminar com SD foi utilizado o sémen de um bode. No 1º ensaio de IA, esta foi realizada em Novembro por decisão do criador. No segundo ano a IA foi realizada em Maio, sendo utilizado o sémen de outro bode. Nas 45 cabras inseminadas com SD de 2 bodes não foram observadas variações significativas nos parâmetros reprodutivos cujos resultados médios foram respectivamente 27 % (fertilidade), 56 % (fecundidade) e 208 % (prolificidade) (Quadro 18). No bode 5 a prolificidade foi numericamente superior ao bode 131, mas sem significância (P=0,08). Quadro 18. Parâmetros reprodutivos (%) obtidos após IA com sémen congelado em cabras Serranas

Bode IA (n) Partos Crias Fertilidade Fecundidade Prolificidade5 23 5 12 22,0 52,2 2,4

131 22 7 13 32,0 59,1 1,86 Global 45 12 25 27,0 56,0 2,08

4. Estudos sobre a fertilidade in vitro com sémen descongelado

Os parâmetros clássicos de classificação espermática, estudados de forma subjectiva por microscopia óptica, são insuficientes para predizer a fertilidade nos machos domésticos, uma vez que poucos deles apresentam uma correlação significativa com a fertilidade in vivo. Quantos mais parâmetros forem utilizados, mais acurada será esta avaliação. Uma vez que a fertilização é um processo em que o sémen executa várias funções, parece lógico combinar diferentes testes de avaliação da fertilização para se obter uma melhor correlação entre eles e a fertilidade in vivo. O objectivo deste projecto seria, numa primeira fase, implementar em Portugal a técnica de produção in vitro (IVP) de embriões caprinos, comparando a fertilidade in vitro do sémen de vários bodes congelado em duas épocas diferentes (Outono e Inverno) e, numa segunda fase, correlacionar estes parâmetros de fertilidade in vitro com os de fertilidade in vivo após inseminação artificial.

Nesta vertente do projecto deparámos com uma grande dificuldade na obtenção de ovários a partir de cabras abatidas nos matadouros regionais. Por outro lado, os resultados desanimadores obtidos com o nosso sistema de produção (IVP) na espécie ovina, levaram-nos a contactar, em Janeiro de 2004, a equipa francesa de produção in vitro de embriões em pequenos ruminantes, do Departamento de Fisiologia da Reprodução e dos Comportamentos (INRA), Nouzilly, Tours, chefiada pelo Professor Yves Cognié. A sua colaboradora, Dra. Nati Poulin, veio a Portugal para demonstrar no nosso laboratório a sua técnica de produção in vitro de embriões ovinos e caprinos, com a qual tem obtido bastante sucesso em França.

Enquanto a implementação da técnica decorria ainda entre nós, foram enviadas para aquele Departamento de Fisiologia em França várias palhinhas de sémen de bode. Os resultados

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de fertilização in vitro que referimos a seguir foram enviados pela Dra. Nati Poulin, de acordo com o seu sistema de produção de embriões caprinos e ovinos (Cognié et al., 2003). 4.1. Metodologia a) Colheita de ovários e aspiração de oócitos

Os ovários foram transportados até ao laboratório numa solução fosfato-salina tamponizada da Dulbecco (PBS) entre os 30 a 35ºC, a que se adicionou antibiótico (0,05 mg ml-1 sulfato de kanamicina). À chegada ao laboratório os ovários foram lavados, primeiro com água tépida, depois com soro fisiológico, mantendo-se em banho-maria a 35ºC durante todo o processo de aspiração. Aspiraram-se os oócitos a partir de folículos superiores a 2 mm de diâmetro com agulha de 19,5 G adaptada a uma bomba de vácuo (pressão de 20 mm de Hg), utilizando-se meio de aspiração constituído por TCM 199 (Tissue Culture Médium, com sais de Earle, L-glutamina e 25 mM ml-1 de Hepes), suplementado com 2µl mL-1 de heparina e 4µl mL-1 de gentamicina. A este meio foi ainda adicionado 0,5g ml-1 de albumina sérica bovina (BSA; Fracção V), para evitar a aglutinação dos oócitos à parede do tubo de recolha. A taxa de colheita na cabra é de 1 a 2 oócitos de boa qualidade por ovário.

O líquido folicular recolheu-se em tubos de 50 ml onde se haviam colocado 5ml do meio referido anteriormente. Com a bomba de vácuo, a aspiração não demora mais que 10 minutos. Os oócitos foram seleccionados à lupa para poços em caixas de Petri contendo meio igual ao anterior, mas sem heparina (meio TCM 199 com sais de Earle, L-glutamina e 25 mM mL-1 de Hepes, suplementado com 4µl mL-1 de gentamicina). Depois de várias passagens neste meio, os oócitos lavados foram admitidos no processo seguinte de maturação in vitro.

b) Maturação in vitro de oócitos ovinos

Apenas se seleccionaram para a fase de maturação os oócitos que apresentaram citoplasma uniformemente granuloso, sem sinais de atrésia nas células do cumulus e da granulosa que os envolvem. O meio de maturação é um meio definido constituído por TCM 199 sem HEPES com bicarbonato, suplementado com estradiol (E2, 200 ng mL-1), cisteamina (100 µM, De Matos et al., 1999; Cognié et al., 2002) e um factor de crescimento, EGF (Epidermal Growing Factor, 10ng mL-1), estes últimos responsáveis pelo aumento da competência nuclear e citoplasmática de oócitos em ovinos e caprinos (Cognié et al., 2003). O meio é colocado em caixas de 4 poços (500 µl de meio/poço para cada grupo de 50 a 70 oócitos) e é estabilizado durante 1 hora na estufa a 38,5ºC com 5% de CO2 e máxima humidade antes de receber os oócitos. A maturação realizou-se na incubadora nas mesmas condições durante 24 horas.

c) Descongelação e capacitação dos espermatozóides

Previamente à fase de fertilização dos oócitos maturados, o sémen congelado foi sujeito a descongelação, centrifugação por gradientes de Percoll e capacitação in vitro. A centrifugação do sémen com gradientes de densidade (Percoll, 45%/90%) parece ser superior a outros procedimentos quando se utiliza sémen descongelado para fertilização in vitro (Rho et al., 2001). Consequentemente, 1 ml de Percoll a 90% (19 ml de Percoll a 100% com 1 ml de cloreto de sódio a 9%) foi colocado suavemente, sem misturar, no fundo de um tubo cónico de 15 ml contendo já 1 ml de Percoll a 45% Este gradiente foi preparado adicionando 500µl de Percoll a 90% com 500 µl de meio SOF (Synthetic Oviductal Fluid ou fluido tubárico sintético, Takahashi e First, 1992) sem BSA (Meio 1), suplementado com 2,35 mg HEPES mL-1 e 4 µl mL-1 de gentamicina. O conteúdo de duas palhinhas de sémen, descongelado em água a 37ºC durante 30

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segundos, foi então depositado directamente na superfície deste gradiente, previamente equilibrado durante 1 hora em estufa a 39ºC com 5% de CO2 e máxima humidade. Após a centrifugação a 900 g durante 10 minutos, rejeitou-se o sobrenadante, determinou-se a concentração do eluato na câmara de Neubauer e calculou-se a diluição de modo a obter uma concentração de 1x107 spz mL-1 no meio de capacitação. O meio de capacitação é constituído por SOF sem BSA, suplementado com 10% de soro de cabra em cio, 10 µg mL-1 de heparina e 4 µL mL-1 de gentamicina. Os espermatozóides incubaram durante 15 a 30 minutos neste meio em estufa a 39ºC com 5% de CO2 e máxima humidade. d) Fertilização in vitro

Os oócitos maturados foram desnudados das células do cumulus por pipetagens

sucessivas em meio SOF com BSA sem gentamicina. Após a passagem por quatro banhos sucessivos neste mesmo meio, os oócitos lavados foram colocados em grupos de 40 a 50 dentro de poços com 450 µl de meio de fertilização, constituído por meio SOF sem BSA com 10% soro de cabra em cio e 4 µL mL-1 de gentamicina. A este meio adicionaram-se 50 µl da diluição de espermatozóides preparada como é referenciado na alínea anterior, de modo a obter uma concentração final de 1x106 spz mL-1. A fertilização in vitro realizou-se em caixas de 4 poços cobertos com 350 µl de óleo mineral em estufa a 39ºC com 5% de CO2 e máxima humidade. A taxa de clivagem (%) foi determinada às 24 e 48 horas após a inseminação correspondendo à razão entre o número de oócitos que se encontram na fase de 2 ou mais células e o total de oócitos inseminados.

e) Desenvolvimento embrionário in vitro

Após 18 horas de contacto com os espermatozóides, os possíveis zigotos foram de novo

lavados por pipetagens sucessivas em poços com meio SOF com BSA sem gentamicina e colocados em grupos de 25 embriões dentro de gotas de 25 µl do mesmo meio, cobertas por 700 µl de óleo mineral, onde continuaram o seu desenvolvimento em estufa a 39ºC com 5% CO2, 5% de O2 e 90% de N2. Às 48 horas após a fertilização adicionaram-se 10% de soro de ovelha em cio ao meio SOF, até ao dia 8-9 de desenvolvimento. A taxa de desenvolvimento embrionário foi dada pela razão entre o número de zigotos em fase de mórula, jovem blastócito, blastócito, blastócito expandido e blastócito eclodido aos dias 5,6,7 e 8 de cultura e o número de oócitos clivados às 48 horas após a fertilização. A taxa de eclosão obtém-se pela percentagem de blastócitos eclodidos em oócitos clivados às 48 horas.

4.2. Resultados

Foram fertilizados in vitro 736 oócitos com sémen pertencente a dois bodes de raça

Serrana (nº711 e nº131). Dos 736 oócitos referidos, um total de 363 foi inseminado com sémen congelado no Outono (bode nº711: n=235 e bode nº131: n=128) e 373 com sémen congelado no Inverno (bode nº711: n=237; bode nº131: n=136). Este estudo realizou-se em quatro (bode nº711) e duas (bode nº131) sessões. As diferenças entre grupos foram analisadas por análise de variância (ANOVA, Statistica), sendo os resultados expressos pelas médias ± desvio padrão (dp).

Independentemente das épocas de colheita do sémen, o bode nº711 apresenta uma taxa de clivagem às 24 horas significativamente superior à do bode nº131 (39,89%±11,68% vs. 25,26%±7,12%, respectivamente, P<0,05), o mesmo não se verificando às 48 horas (Quadro 19).

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Quadro 19. Taxas de clivagem às 24 e 48 horas após a fertilização in vitro de oócitos caprinos com sémen de dois bodes independentemente da sua época de congelação.

Bode (nº)

Oócitos Insem. (n)

Oóc. cliv. (24 h) (n)

Clivagem (24 h)(%)

Oóc. Cliv. (48 h) (n)

Clivagem (48h) (%)

711 472 185 39,89±11,68ª 389 84,34±9,75ª

131 264 68 25,26 ± 7,12b 212 80,69±10,13ª Sobrescritos diferentes na mesma coluna, indicam diferenças significativas (P<0,05)

No Quadro 20 verificamos que, independentemente do bode considerado, não existem

diferenças significativas entre as taxas de clivagem às 24 horas da totalidade dos oócitos fertilizados com sémen dos dois bodes quando congelado no Outono (bodes nº711 e nº131, n=363) e no Inverno (bodes nº711 e nº131, n=373) (39,64%±15,91% vs. 30,39%±5,57%, respectivamente, P>0,05).

Quadro 20. Taxas de clivagem às 24 horas após a fertilização in vitro de oócitos caprinos com sémen de dois bodes congelados em épocas diferentes.

OUTONO INVERNO Bode (nº)

Oócitos Insem (n)

Oóc. cliv. (24 h) (n)

Clivagem (24 h) (%)

Oócitos Insem (n)

Oóc. cliv. (24 h) (n)

Clivagem (24 h) (%)

711 (n=4) 235 113 48,00±10,98a1 237 72 31,78±4,70ª2

131 (n=2) 128 30 22,91±8,01 b1 136 38 27,60±8,10a1

Total 363 143 39,64±15,91 1 373 110 30,39±5,57 1 Sobrescritos diferentes indicam diferenças significativas (P<0,05; letras para colunas e números para linhas).

Por outro lado, verificamos que a taxa de clivagem às 24 horas após a inseminação com o

sémen do bode nº711 congelado no Outono é significativamente superior à obtida quando se utiliza sémen do mesmo bode congelado no Inverno (48,00%±10,985% vs. 31,78%±4,70%, P<0,05). Aquele bode mostra-se superior ao bode nº131 no Outono (48,00%±10,985% vs. 22,91%±8,01%, respectivamente, P<0,05). Não existem diferenças significativas entre o sémen do bode nº131 congelado no Outono e no Inverno.

Como verificamos no Quadro 21, não existem diferenças significativas entre as épocas de Outono e de Inverno quanto às taxas de clivagem às 48 horas da totalidade dos oócitos fertilizados com o sémen dos dois bodes (83,34±9,71vs. 82,91±10,37, respectivamente, P>0,05). Também não existem diferenças às 48 horas nas taxas de clivagem entre o mesmo bode nas duas épocas ou entre bodes diferentes nas duas épocas.

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Quadro 21. Taxas de clivagem às 48 horas após a fertilização in vitro de oócitos caprinos com sémen de dois bodes congelados em duas épocas diferentes.

OUTONO INVERNO Bode

Oócitos

Insem. (n) Oóc. cliv. (48h) (n)

Clivagem (48h) (%)

Oócitos insem. (n)

Oóc. cliv. (48 h) (n)

Clivagem (48 h) (%)

711 (n=4) 235 203 87,04±5,71 237 186 81,65±13,04

131 (n=2) 128 96 75,96±14,49 136 116 85,42±2,95

Total 363 299 83,34±9,71 373 302 82,91±10,37 Comparações entre animais na mesma época e entre épocas para o mesmo animal: P>0,05

Quanto ao desenvolvimento embrionário, e independentemente da época de congelação

do sémen, o bode nº711 apresenta taxas de produção de embriões (embriões/oócitos clivados) aos dias 6, 7 e 8 de cultura significativamente superiores às do bode nº131 (Quadro 22).

Quadro 22. Taxas de produção de embriões aos dias 6, 7 e 8 de cultura in vitro (D6, D7, D8) e taxas de embriões eclodidos após inseminação dos oócitos com sémen de dois bodes (independentemente da época de congelação do sémen).

Bode (nº)

Embriões D5 (%)

Embriões D6 (%)

Embriões D7 (%)

Embriões D8 (%)

Embriões Eclodidos (%)

711 (n=4) 20,04± 9,91 51,61±12,11a 53,50± 11,56a 49,86±8,57ª 60,47±16,62ª

131 (n=2) 6,79 ±9,43 21,87± 10,59b 31,36±13,14b 27,84±17,69b 42,63±45,08ª

Sobrescritos diferentes na mesma coluna, indicam diferenças significativas (P<0,05).

No Quadro 23, considerando as duas épocas e os dois animais, verificamos que apenas quando se utiliza sémen de Outono a taxa de produção de embriões do bode nº711 é significativamente superior à do bode nº131 ao dia 6 de cultura in vitro (58,08%± 11,42% vs 14,70± 3,81, respectivamente, P< 0.05). Na época de Inverno estas taxas não são diferentes significativamente. Para o mesmo bode, não existem também diferenças significativas entre épocas.

Quadro 23. Taxas de produção de embriões ao dia 6 (D6) de cultura in vitro após inseminação dos oócitos caprinos com sémen de dois bodes congelado em duas épocas do ano.

OUTONO INVERNO Bode (nº)

Oócitos clivados

Emb.D6 (n)

Emb D6 (%)

Oócitos clivados

Emb. D6 (n)

Emb D6 (%)

711 (n=4) 131 76 58,08± 11,42ª1 159 75 47,30±12,59ª1

131 (n=2) 48 7 14,70± 3,81b1 58 17 29,05± 10,77ª1

Sobrescritos diferentes na mesma coluna, indicam diferenças significativas (P<0,05); números indicam comparações entre épocas diferentes para o mesmo animal

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Independentemente do factor individual, verificamos que não existem diferenças significativas entre as épocas de Outono e Inverno, quanto às taxas de embriões produzidos pelo conjunto dos dois bodes (nº711 e nº131) aos dias 5, 6, 7 e 8 de cultura in vitro e às taxas de embriões eclodidos. 4.2.1. Fertilidade in vivo vs. fertilidade in vitro Correlacionaram-se os valores no sémen descongelado da MI, % de Vivos, % de Normais, e das endosmoses aos 5, 25 e 40 minutos, com as taxas de clivagem (24 e 48 h), de blastocistos em D8 e de embriões eclodidos. Utilizaram-se, para cada um destes parâmetros, as médias obtidas em dois bodes (131 e 711) no Outono e Inverno. Só foram observadas correlações significativas entre as endosmoses aos 25 (r=0,96) e 40 (r=0,98) minutos com a taxa de clivagem embrionária às 48 horas. Nestes dois animais, também se observou uma correlação significativa das endosmoses aos 25 minutos com a mobilidade individual (r=0,96) e com as anomalias da cabeça (r=-0,96). Entre os dois bodes estudados (711/131), houve uma relação directa entre a fertilidade in vivo obtida a partir de inseminações com sémen refrigerado colhido na Primavera (ratio entre bodes: 0,83) e a fertilização in vitro obtida a partir das clivagens às 48 horas usando sémen congelado colhido no Inverno (ratio entre bodes: 0,92). Não houve diferenças significativas entre as fertilidades in vitro e in vivo, em ambos os bodes (p>0,05). Não se verificaram diferenças entre bodes, quer in vivo quer in vitro (p>0,05). Quadro 24. Fertilidades in vivo (% partos por inseminações) e in vitro (% de clivagens às 48 horas) nos bodes 131 e 711.

Bodes IA (n)

Partos (n)

Fertilidadein vivo (%)

Oócitos inseminados

Clivados às 48 h

Fertilidade in vitro (%)

131 31 26 83,9 68 58 85,3

711 30 21 70,0 237 186 78,5 Razão: 711/131

0,83 0,92

Fertilidades entre linhas e colunas: p>0,05 (qui quadrado com correcção de Yates) Gráfico 17. Fertilidades in vivo e in vitro nos bodes 131 e 711

85,3

78,5

83,9

70

Bode 131 Bode 71150

55

60

65

70

75

80

85

90

Ferti

lidad

e in

viv

o e

cliv

agen

s às

48h

in v

itro

(%)

in vitro in vivo

p>0,05

p>0,05

p>0,05

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4.3. Conclusões

Estes resultados são provisórios, dado que faltam ainda realizar sessões de fertilização in vitro com sémen de ambos os bodes referidos, assim como de outros bodes cujo sémen tem vindo a ser congelado nas duas épocas de Outono e de Inverno.

Os dados parecem sugerir para já que, nos caprinos de raça Serrana, existem diferenças na capacidade de fertilização in vitro do sémen congelado/descongelado, apenas nas primeiras 24 horas após a inseminação, variação esta que se manifesta de animal para animal, na mesma época e entre épocas. O bode de raça Serrana nº711 tem uma maior taxa de clivagem, que se manifesta significativamente até às 24 horas após a inseminação, quando o seu sémen é congelado no Outono em relação ao bode nº131 da mesma raça, na mesma época. Por outro lado, o sémen daquele bode congelado no Inverno apresenta taxas de clivagem in vitro às 24 horas inferiores às de Outono. Também no Outono, o bode nº711 mostrou-se superior ao nº131 quanto às taxas de produção de embriões ao dia 6 de cultura. Entre os dois bodes estudados (711/131), houve uma relação directa entre a fertilidade in vivo obtida a partir de inseminações com sémen refrigerado colhido na Primavera (ratio entre bodes: 0,83) e a fertilização in vitro obtida a partir das clivagens às 48 horas usando sémen congelado colhido no Inverno (ratio entre bodes: 0,92). 5. Objectivos vs Realização Não foi possível concretizar todos os objectivos pretendidos. A implementação da tecnologia de congelação de sémen de bode foi no entanto alcançada, após as muitas afinações que esta técnica exigiu. Congelou-se sémen de bode ao longo do ano, embora o sémen de alguns bodes não demonstrasse aptidão para a congelação. A situação complicou-se quando, por limitações logísticas, não foi possível ter em estudo mais de 6 bodes simultaneamente durante os ensaios. O treino dos bodes para a obtenção de sémen por vagina artificial também não foi fácil, pois estes animais são naturalmente “desconfiados”, decidindo algumas vezes não saltar/ejacular, o que veio atrasar o início da realização dos trabalhos. A existência de maior número de bodes disponíveis para a recolha de sémen teria enriquecido a realização deste trabalho. Só foi possível realizar 2 ensaios de IA com sémen congelado durante a vigência do projecto, pois os criadores disponíveis preferiam a realização de IA com sémen refrigerado (SR) devido aos bons resultados obtidos em anos anteriores. Os resultados obtidos com SD parecem-nos promissores, havendo criadores que se disponibilizaram a utilizá-lo, desde que os encargos financeiros com a sua realização sejam suportados pelo projecto. Relativamente à avaliação da capacidade de fertilização in vitro de oócitos caprinos com sémen de bode descongelado, o problema nuclear foi a recolha de oócitos caprinos a partir de ovários de animais abatidos em matadouro. Esta dificuldade deveu-se à inexistência de ovários disponíveis nos matadouros, pois só algumas cabras de refugo são abatidas de um modo esporádico, sendo o abate dirigido principalmente a animais impúberes na altura do Natal e Páscoa. Esta situação quase inviabilizou a testagem in vitro do sémen de bodes, não fosse a excelente colaboração de uma investigadora francesa, a Dra Nati Poulin, a qual se prontificou a realizar alguns testes de fertilização no laboratório de produção in vitro de embriões caprinos e ovinos, do Departamento de Fisiologia da Reprodução e dos Comportamentos (INRA), Nouzilly, Tours, chefiada pelo Professor Yves Cognié.

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6. Cooperações

Para a realização deste projecto mantivemos colaborações com a Associação dos Criadores do Ribatejo e Oeste (ACORO) e com a Associação de Criadores de Reprodutores do Oeste (ACRO). Foram realizadas cooperações com França, designadamente através da realização de um estágio no Laboratório de Congelação de Sémen da Unidade Experimental de Inseminação Caprina e Ovina (INRA) sob a orientação do Professor Bernard Leboueuf. Foi igualmente possível receber a visita da Investigadora Nati Poulain do Centro de Recherches de Tours, que tem prestado um excelente contributo na realização de ensaios de fertilização “in vitro” de oócitos caprinos com o objectivo de testar a fertilidade dos bodes. 7. Encargos financeiros O orçamento programado (39 294 €) foi concretizado em 93%, permitindo a realização das acções de investigação previstas. O relatório financeiro foi elaborado pela Repartição Financeira da EZN. 8. Estágios

Este projecto permitiu a realização de 1 estágio de licenciatura a uma aluna Curso de Medicina Veterinária da Universidade Técnica de Lisboa e 3 estágios intercalares do Curso de Medicina Veterinária da Universidade de Évora. No decurso deste projecto tivemos a oportunidade de realizar um estágio no Laboratório de Congelação de Sémen da Unidade Experimental de Inseminação Caprina e Ovina (INRA) sob a orientação do Professor Bernard Leboeuf. 9. Publicações Barbas, J., Horta, A, Marques, C., Baptista, M., Vasques, M., Mascarenhas, R., Pereira, R. E

Gonçalves, S. (2005). Influência da época do ano sobre a congelabilidade do sémen de bode da raça Serrana e a sua capacidade fertilizante in vivo e in vitro. Relatório Final do Projecto PIDDAC nº 842, EZN – INIAP.

Barbosa, A (2003). Produção Animal, Tecnologia de Sémen, Controlo do Ciclo Éstrico e Inseminação Artificial em Pequenos Ruminantes. Estágio intercalar para obtenção da licenciatura em Medicina Veterinária pela Universidade de Évora.

Brito, A (2004). Avaliação da Qualidade do Sémen Fresco e Descongelado em Bodes de Raça Serrana no Outono e no Inverno. Estágio curricular para obtenção da licenciatura em Medicina Veterinária pela Faculdade de Medicina Veterinária de Lisboa (UTL).

Lopes, F. (2004). Tecnologia do Sémen e Inseminação Artificial em Pequenos Ruminantes. Estágio intercalar para obtenção da licenciatura em Medicina Veterinária pela Universidade de Évora.

Soudo, A. (2003). Reprodução Controlada em Pequenos Ruminantes: Tecnologia do sémen, Controlo do Ciclo Éstrico e Inseminação Artificial. Estágio intercalar para obtenção da licenciatura em Medicina Veterinária pela Universidade de Évora.

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10. Referências bibliográficas Barbas, J.; Baptista, C. e Horta, A. (2002). Comparação entre dois métodos de congelação de sémen de carneiros

Merino Regional e Serra da Estrela ao longo do ano. Livro de Actas, 100 anos da Sociedade Portuguesa de Ciências Veterinárias, 473-474, Oeiras, Taguspark, 10 a12 de Outubro.

Barbas, J.; Mascarenhas, R.; Horta, A.; Tavares, H.; Cannas-Serra, C.; Cardigos, L.; Moura, R. e Cannas Simões, J.P (2004). Influência do diluidor, época e exploração nos resultados da IA em ovelhas de raça Saloia. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias, 99 (549), 59-63.

Barbas, J.; Sousa, J.; Ferreira, G.; Baptista, C. e Horta, A. (2001). Variação anual das caracteristicas seminais de carneiros Merino Regional e Serra da Estrela em sémen fresco. X Congresso de Zootecnia, “Progressos Zootécnicos nos Países de Língua Oficial Portuguesa. EZN, Vale de Santarém. Revista Portuguesa de Zootecnia, 8(1), 312-323.

Brito, A (2004). Avaliação da Qualidade do Sémen Fresco e Descongelado em Bodes de Raça Serrana no Outono e no Inverno. Estágio curricular para obtenção da licenciatura em Medicina Veterinária pela Faculdade de Medicina Veterinária de Lisboa (UTL).

Cognié, Y., Baril, G., Poulin, N., Mermillod, P. (2003). Current status of embryo technologies in sheep and goat. Theriogenology, 59:171-188.

Cognié, Y., Poulin, N., Mermillod, P. (2002). Cysteamine improves in vitro goat oocyte maturation in defined medium. Proc.18Th Mtg assoc. Eur. Trans Emb (AETE), 154 (abstract).

De Matos, D.G., Furnus, C.C., Moses D.F., Martinez, A.G., Matkovic, M. (1996). Stimulation of glutathione synthesis of in vitro matured bovine oocytes and its effects on embryo development and freezability. Molec. Reprod. Dev., 45: 451-457.

Evans, G. e Maxwell, W., 1990. Inseminacion Artificial de Ovejas e Cabras. Editorial Acribia, S. A. Zaragosa (España).

FAO, 1993. Manuel de formation pour l’ insemination artificielle chez les ovins et les caprins. Étude FAO Production Et Santé Animales, nº 83.

Ferreira, G. ; Sousa, J., Barbas, J. e Horta, A. (2001). Teste de endosmose (Host) em sémen de caprinos da raça Serrana. III Congresso Ibérico de Reprodução Animal. Fundação Cupertino de Miranda, Porto, 5-8 de Julho. Livro de Resumos, 559-604.

Sousa, J.; Barbas, J.; Ferreira, G.; e Horta, A. (2001). Variação anual das características seminais em bodes de raça Serrana. X Congresso de Zootecnia, “Progressos Zootécnicos nos Países de Língua Oficial Portuguesa. EZN, Vale de Santarém. Revista Portuguesa de Zootecnia, 8(1), 297-311.

StatSoft, Inc., 1995. Statistica for Windows (computer program manual). Tulsa, OK: Statsoft, Inc., 2325 East 13 th Street, Tulsa, OK, 74104, USA.

Takahashi, T., First, N.L. (1992). In vitro development of bovine one-cell embryo: influence of glucose, lactate, pyruvate, amino acids and vitamins Theriogenology, 37: 963-978.

11. Resumo

O objectivo deste projecto prende-se com o estudo da variação sazonal da produção e qualidade espermática do bode de raça Serrana e sua influência na congelabilidade do sémen. Paralelamente serão comparados os resultados reprodutivos obtidos após inseminação artificial (IA) com sémen refrigerado e congelado na época reprodutiva tradicional (Primavera) e a capacidade fertilizante in vitro de sémen congelado utilizando oócitos de caprino, obtidos de ovários recolhidos no matadouro.

Foram utilizados 7 bodes de raça Serrana na recolha de sémen pelo método da vagina artificial. Foram destinados à congelação os ejaculados que em fresco tivessem mobilidade massal ≥4, MI≥ 65 % e concentração de 2 x 109/ml de espermatozóides (spz). O sémen recolhido foi processado e congelado de acordo com o protocolo descrito por Evans e Maxwell (1990). A congelação das palhinhas foi realizada em vapores de azoto líquido utilizando um equipamento designado por “Floating Semen Freezing Rack”.

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Utilizaram-se 218 ejaculados para avaliação estatística dos resultados (SF). As variáveis independentes estudadas foram a época do ano, o bode e a interacção época x bode. Foi observado um efeito da época do ano sobre o volume e a % de spz normais. O volume dos ejaculados no Verão e no Outono foi superior às restantes épocas do ano que não foram diferentes entre si. A % de anomalias da PI foi inferior no Outono e Verão não sendo diferentes das restantes épocas. Não foi observado uma variação estacional sobre a MI, concentração, % de spz vivos, % de anomalias da cabeça e cauda. Foi observada uma variação individual na MI. A mobilidade, vitalidade e normalidade espermática correlacionaram-se positivamente entre si, sendo a correlação entre a mobilidade e a vitalidade a mais elevada (r=0,72; P<0,05). Os spz vivos correlacionaram-se negativamente com as anomalias da cauda (P<0,05).

No sémen congelado (SD) foram observadas variações estacionais na % de anomalias da cabeça, PI, cauda, Epos5, Epos25 e Difnormais. A % de difnormais foi superior no Outono relativamente às restantes épocas do ano, que não foram diferentes entre si. Esta maior quebra deve-se a um aumento da % de spz normais no sémen fresco no Outono e não a uma menor percentagem no sémen descongelado. Por outro lado, a menor % de endosmoses positivas aos 5 e 25 minutos no Outono, parece ser devida ao aumento das anomalias da cabeça verificada nesta época. No SD não foram observadas variações individuais na % de spz normais e anomalias da PI, variando os restantes parâmetros seminais. Os spz móveis, vivos e normais, apresentam correlações positivas e significativas entre si. As endosmoses positivas medidas aos 40 minutos, correlacionaram-se positivamente com a mobilidade, vitalidade e normalidade espermáticas (P<0,05).

As correlações das endosmoses medidas no SD com os parâmetros seminais do SF foram geralmente baixas e não significativas. Contudo, as endosmoses do SD aos 40 minutos apresentaram uma correlação significativa com a MIF e VIF (r=0,14, P<0,05).

A análise multivariada para avaliar a interacção época x bode, incluindo todas as estações só foi possível estudar em 3 animais. No SF foi observado um efeito específico significativo da época sobre o volume e % de anomalias da PI. O volume médio dos ejaculados foi superior no Outono e Verão comparativamente às restantes épocas do ano que não foram diferentes. A % de anomalias da PI foi superior na Primavera e no Inverno comparativamente às restantes épocas que não foram diferentes. No SF foram observados efeitos específicos do bode sobre o volume, concentração, spz normais e % de anomalias da cabeça e interacções significativas época x bode para a MI, % de spz vivos e anomalias da cauda.

No semén congelado (SD) foi observado um efeito específico da época sobre a % de spz normais, anomalias da cabeça e da PI, Difnormais, e Epos aos 5 e 25 minutos após a descongelação. Foram observados efeitos significativos dos bodes na MI, % de vivos, anomalias da cabeça, PI e cauda, Difmi, Difnormais e Epos5 e interacções significativas época x bode sobre a MI, vivos, normais, anomalias da PI e endosmoses positivas aos 25 e 40 minutos após a descongelação.

No programa de IA com sémen refrigerado foram inseminadas 251 cabras Serranas, utilizando 8 bodes. Globalmente, a fertilidade, fecundidade e prolificidade foram 60,2 %, 106 % e 176 % respectivamente, existindo variações significativas entre bodes relativamente a estes parâmetros reprodutivos. Em três dos bodes utilizados na IA com sémen refrigerado (SR) existiam registos de avaliação dos ejaculados que nos permitiram correlacionar estes parâmetros com a fertilidade, sendo determinadas correlações positivas entre a MI (r=0,82), vivos (r=0,999) e normais (r=0,795) com a fertilidade. Contudo, somente a correlação entre a percentagem de spz vivos e a fertilidade foi significativa (p<0,05). Nas 45 cabras inseminadas com SD de 2 bodes não foram observadas variações significativas nos parâmetros reprodutivos cujos resultados médios foram 27 % (fertilidade), 56 % (fecundidade) e 208 % (prolificidade).

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O objectivo da avaliação da capacidade de fertilização in vitro de oócitos caprinos com sémen de bode descongelado seria, numa primeira fase, implementar em Portugal a técnica de produção in vitro (IVP) de embriões caprinos e, numa segunda fase, correlacionar estes parâmetros de fertilidade in vitro com os de fertilidade in vivo após inseminação artificial. A dificuldade na obtenção de ovários a partir de cabras abatidas nos matadouros regionais levou ao pedido de colaboração da equipa francesa de produção in vitro de embriões em pequenos ruminantes, do Departamento de Fisiologia da Reprodução e dos Comportamentos (INRA), Nouzilly, Tours. Independentemente da época de recolha do sémen, o bode nº711 apresenta uma taxa de clivagem às 24 horas significativamente superior à do bode nº131 (39,89%±11,68% vs. 25,26%±7,12%, respectivamente, P<0,05), diferença que não se mantém às 48 horas. A taxa de clivagem às 24 horas após a fertilização com sémen do bode nº711 congelado no Outono é significativamente superior à obtida com o sémen do mesmo bode congelado no Inverno (48,00%±10,985% vs. 31,78%±4,70%, P<0,05). Quanto ao desenvolvimento embrionário, e independentemente da época de congelação do sémen, o bode nº711 apresenta taxas de produção de embriões aos dias 6, 7 e 8 de cultura significativamente superiores às do bode nº131 (P< 0,05). No Outono, o bode 711 produziu significativamente maior percentagem de embriões ao dia 6 que o bode 131 na mesma época (58,08%±11,42% vs. 14,70%, respectivamente, P< 0,05), diferença que se não manifestou no Inverno entre os mesmos animais. Para o mesmo bode não existem diferenças entre épocas para este parâmetro in vitro. Foram observadas correlações significativas entre as endosmoses aos 25 (r=0,96) e 40 (r=0,98) minutos com a taxa de clivagem às 48 horas nos dois machos referidos. Nestes dois animais, também se observou uma correlação significativa das endosmoses aos 25 minutos com a mobilidade individual (r=0,96) e com as anomalias da cabeça (r=-0,96). Não houve diferenças significativas entre as fertilidades in vitro e in vivo, em ambos os bodes (p>0,05). Não se verificaram diferenças entre bodes, quer in vivo quer in vitro (P>0,05).